Artykuł metodologiczny

Charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z płynów biologicznych

DOI:

10.3791/67699

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1North Texas Eye Research Institute, University of North Texas Health Science Center, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of North Texas Health Science Center, 3Department of Pharmacology and Neuroscience, University of North Texas Health Science Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj demonstrujemy metodę charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) pobranych z płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina, ludzi. Skaner stosowany w tej metodzie jest w stanie wykryć fenotyp, wielkość i całkowitą liczbę cząstek EV z 1 μl próbki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) to struktury, które są wytwarzane z komórek i uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport biomolekuł z jednej komórki do drugiej. Wykazano, że pojazdy elektryczne pokonują krótkie i dalekie odległości w organizmie i są specyficzne dla tkanki. EV znajdują się nie tylko w tkankach, ale można je również znaleźć w praktycznie wszystkich płynach ustrojowych, takich jak łzy, ślina, płyn mózgowo-rdzeniowy, krew itp. Mimo że EV można pobrać nieinwazyjnie ze łez i śliny, jednorazowo można zebrać tylko małe objętości, co może powodować problemy z uzyskaniem wystarczającej ilości EV do analizy białek. Skaner omawiany w tym artykule jest analizatorem nanocząstek, który zapewnia rozwiązanie tego problemu, pozwalając nam scharakteryzować i zbadać fenotyp, rozmiar i całkowitą liczbę cząstek EV już od 1 μl płynu biologicznego. Protokół ten poszerzy wiedzę na temat EV z małych objętości próbek, które są trudne do pobrania od pacjentów. Może to zwiększyć komfort pacjentów i potencjalnie zidentyfikować nowe cele terapeutyczne dla szeregu chorób i zaburzeń.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komórki komunikują się z sąsiednimi komórkami poprzez różne mechanizmy sygnalizacyjne, w tym uwalnianie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV), które odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej. EV uczestniczą w komunikacji międzykomórkowej, przekazując ładunek genetyczny, taki jak DNA, RNA i białka, z jednej komórki do drugiej1,2,3,4,5. Obecnie istnieją trzy kategorie EV: egzosomy, mikropęcherzyki i ciała apoptotyczne, które charakteryzują się wielkością. Egzosomy są najmniejsze, o średnicy 30-150 nm6,7,8, i są utworzone z systemu błon endosomalnych 9,10,11 (Rysunek 1). Mikropęcherzyki są większe niż egzosomy, ponieważ mieszczą się w zakresie od 100 do 1000 nm12,13,14 i wystają z błony komórkowej11,12,13 (Rysunek 1). Ciała apoptotyczne są największymi EV i mieszczą się w zakresie od 1000 do 5000 nm12,14,15, a także wypuszczają z błony plazmatycznej12,16,17 (Rysunek 1). Oprócz rozmiaru, EV można klasyfikować na podstawie innych cech biofizycznych, które obejmują gęstość, markery molekularne, takie jak CD63, CD81, CD9, a także mechanizm biogenezy18. EV mogą pokonywać krótkie odległości między sąsiednimi komórkami i duże odległości w całym ciele19,20,21,22,23. EV można znaleźć w płynach biologicznych, takich jak krew24,25,26, mózgowy płyn rdzeniowy27,28,29, tears30,31,32, and saliva33,34,35, żeby wymienić tylko kilka.

Do tej pory ultrawirowanie jest jedną z najbardziej znanych metod izolowania EV od próbek36,37,38. Ta metoda wymaga wielu rund wirowania i ultrawirowania, które można przeprowadzić, zwiększając prędkość w celu odizolowania EV od komórek i szczątków komórek. Metodę tę można rozpocząć od niskiej prędkości z komórkami peletowymi, po których nastąpi średnia prędkość w celu wyeliminowania większych pęcherzyków, a na koniec etap ultrawirowania do granulowania EVs18. Chociaż ultrawirowanie jest uważane za najlepszą metodę izolacji, nadal istnieją pewne ograniczenia, ponieważ zmienia morfologię klasy EVs39,40,41. Inną techniką stosowaną do izolowania EV jest cytometria przepływowa, która podkreśla zalety oceny wielu punktów czasowych i końcowych oraz wysokoprzepustowej analizy pojedynczej EV. Jednak ograniczenia cytometrii przepływowej obejmują między innymi zatykanie porów i słabe sygnały. Innym stosowanym podejściem jest wirowanie gradientowe, w którym wykorzystuje się materiały o różnej gęstości do odwirowania za pomocą pojazdów elektrycznych i umożliwia lepszą separację pojazdów elektrycznych w porównaniu z ultrawirowaniem. Chociaż technika ta poprawia separację, jest pracochłonna, czasochłonna i może prowadzić do znacznych strat próbki. Dodatkowo wytrącanie i filtracja mogą być również stosowane do izolowania pojazdów elektrycznych. Obie te techniki są proste i szybkie, ale obie mogą prowadzić do zanieczyszczenia próbki. Chociaż istnieje kilka technik izolowania EV, każda z nich ma swoje zalety i ograniczenia, które są wymienione poniżej (Tabela 1) 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55, 56,57,58,59,60,61, 62,63,64,65,66,67.

Po wyizolowaniu EV, można przeprowadzić testy molekularne w celu scharakteryzowania EV. Western blot jest powszechnym testem do poszukiwania ekspresji białek powierzchniowych i ładunkowych68,69,70 a reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest używana do ekspresji miRNA71,72,73 dla EVs74,75,76. Testy te są sprawdzone i mogą przynieść intrygujące wyniki. Ograniczeniem tych metod jest to, że wymagają one dużej ilości białek lub RNA z EV, aby uzyskać odczyt77, co jest problemem w przypadku próbek o małej objętości lub stężeniu EV.

Analizator nanocząstek omawiany w tym artykule pozwala użytkownikowi przezwyciężyć wiele ograniczeń określonych w Tabeli 1 i Tabeli 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90. Metoda ta nie wymaga stosowania technik izolacji, co pomoże przezwyciężyć zmniejszoną wydajność pojazdów elektrycznych. Metoda ta pozwala również użytkownikowi na analizę białek powierzchniowych i ładunkowych, całkowitej liczby EV i wielkości EV z objętości próbki wynoszącej zaledwie 1 μl. Odbywa się to za pomocą chipów tetraspaniny dostarczonych przez firmę, która wykorzystuje mikromacierz przeciwciał z przeciwciałami tetraspaninowymi, CD63, CD81 i CD9, do identyfikacji EV w roztworze, jak pokazano na rysunku 2. Przeciwciała fluorescencyjne potwierdzają obecność EV, a także zapobiegają zniekształceniu wyników przez cząstki zanieczyszczające.

Ogólnym celem tej techniki jest zapewnienie mniej czasochłonnej metody analizy EVs, jak również analizy EVs z małej objętości próbki. Korzystanie z tego analizatora nanocząstek pozwala użytkownikom analizować wielkość, całkowitą liczbę cząstek i białka powierzchniowe już od 1 μl próbki, co jest idealne dla płynów biologicznych, takich jak łzy i ślina.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane badania były zgodne z Deklaracją Helsińską. Pisemna zgoda została uzyskana od każdego uczestnika przed włączeniem go do badania. Otrzymano zgodę Institutional Review Board (IRB) od Szpitala Uniwersyteckiego w Aarhus (1-10-72-77-14) i Dean McGee Institute (1576837-2) zgodnie z wytycznymi federalnymi i instytucjonalnymi. Przed przetworzeniem wszystkie próbki łez i śliny zostały pozbawione elementów pozwalających na identyfikację. Wszystkie badania zostały zrecenzowane i zatwierdzone przez Regionalną Komisję Rewizyjną Regionalnego Instytucjonalnego Teksasu (#2020-030). Poniższy protokół jest zgodny ze wszystkimi wytycznymi i został zatwierdzony, jak wspomniano powyżej.

1. Dzień 1: Przygotowanie próbki i inkubacja

  1. Zbierz próbkę (próbki) płynu biologicznego, tj. łzy i ślinę od osoby (osób) lub rozmroź próbkę (próbki) z zamrażarki.
    1. Łzy: Zbieraj łzy biernie z łąkotki bocznej za pomocą szklanej rurki kapilarnej.
      1. Umieść szklaną rurkę kapilarną na dolnej powiece, uważając, aby nie dotknąć rogówki.
      2. Zbierz objętość 10 μl łez w ciągu 10 minut.
      3. Łzy należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Ślina: Zbierz ślinę z biernej śliny w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml
      1. Pozwól dawcy zgromadzić ślinę w ustach.
      2. Poproś dawcę, aby ślinił się do probówki z lejkiem.
      3. Ślinę należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Umieścić chip(y) tetraspaniny na płycie do mycia wiórów na 15 minut przed dodaniem próbek, aby mogły osiągnąć temperaturę pokojową. Umieszczając wióry w studzience, upewnij się, że cyfry znajdują się na spodzie skierowanym do góry i że wióry nie dotykają bocznych ścianek studni (studzienek).
  3. Zapisz numer identyfikacyjny i numer chipa w notebooku, aby śledzić chip(y).
  4. Podłącz uniwersalną magistralę szeregową (USB) dołączoną do zestawu, a następnie rozpakuj i zapisz folder z powiązanym numerem zestawu w wyznaczonym przez siebie obszarze.
  5. Odpipetować 99 μl roztworu B w probówce o pojemności 1,5 ml.
  6. Dodać 1 μl płynu biologicznego do probówki o pojemności 1,5 ml przygotowanej w poprzednim kroku.
  7. Zakręć rurkami.
  8. Pobrać 70 μl roztworu z kroku 1.6 i odpipetować na chipie tetraspaniny.
  9. Umieść folię na płycie do mycia wiórów, aby zapobiec parowaniu próbki.
  10. Inkubować przez 16 godzin w temperaturze pokojowej (RT) na stole bez wibracji.

2. Dzień 2: Mycie wiórów

  1. Włącz pralkę do frytek.
  2. Usuń folię z kroku 1.9 z płyty.
  3. Umieść płytkę w myjce wiórów, upewniając się, że zatrzasnęła się na swoim miejscu, i zamknij pokrywę.
    UWAGA: Płyta nie będzie się łatwo przesuwać, jeśli zostanie prawidłowo zablokowana na swoim miejscu.
  4. Naciśnij opcję CW-TETRA v0 na podkładce wiórów.
  5. Wybierz rząd początkowy i liczbę rzędów do umycia.
  6. Naciśnij przycisk Kontynuuj na pralce do wiórów.
  7. Podczas mycia chipa(ów) należy przygotować roztwór blokujący zawierający przeciwciała w probówce w następujący sposób:
    1. Przygotuj 300 μl roztworu blokującego na chip.
    2. Dodać 0,6 μl lub każde przeciwciało na chip (odwirować i odwirować przeciwciała przed dodaniem do roztworu blokującego)
    3. Vortex roztwór blokujący + koktajl przeciwciał.
      UWAGA: Przykryj roztwór blokujący + koktajl przeciwciał ze światła, aby zapewnić stabilność przeciwciał. Należy tego dokonać w dniu użytkowania.
  8. Gdy myjka do chipsów zaćwierka, dodaj 250 μl roztworu blokującego + koktajlu przeciwciał na wierzch chipsów.
  9. Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj.
    UWAGA: Myjka do wiórów wykona teraz 1-godzinną inkubację wraz z kilkoma dodatkowymi rundami mycia i płukania.
  10. Gdy myjka do wiórów zacznie ćwierkać, zdejmij płytkę do mycia wiórów i przesuń wiór(y) w górę rampy.
  11. Umieść płytkę z powrotem w myjce wiórów, upewniając się, że zatrzasnęła się na swoim miejscu. Zamknij pokrywę i naciśnij Kontynuuj.
  12. Gdy myjka do wiórów zakończy program, wyjmij płytkę i umieść wiór(y) na ręczniku papierowym. Zakryj wiór(y) przed światłem.

3. Dzień 2: Skanowanie chipa (chipów)

  1. Włącz skaner i otwórz oprogramowanie do skanowania.
    UWAGA: Skaner zostanie poddany samokontroli, aby wskazać, czy występują błędy lub czy skanowanie można kontynuować.
  2. Wybierz opcję Zapisz folder i wybierz lokalizację, w której chcesz zapisać pliki.
  3. Wybierz ChipFile Folder i wybierz folder zapisany w kroku 1.4.
  4. Wybierz opcję rozwijaną, aby wybrać każdy chip i zlokalizować go w pozycji chipa na uchwycie. Powtórz ten krok dla wszystkich chipów, które muszą zostać zeskanowane.
  5. Włącz fluorescencję, klikając trzy kwadraty poniżej pozycji chipa. Kwadraty zmienią kolor odpowiednio na żółty, niebieski i czerwony.
  6. Zdejmij pokrywę uchwytu, naciskając pokrywę w dół i pociągnij ją.
  7. Umieść wiór(y) na uchwycie, upewniając się, że są mocno zamocowane.
  8. Załóż z powrotem pokrywę uchwytu, umieszczając kołki w otworach, dociśnij i przesuń pokrywę, aby zablokować ją na miejscu.
  9. Umieść uchwyt na scenie, upewniając się, że zatrzasnął się na swoim miejscu.
  10. Wybierz opcję Scan Chips (Skanuj elementy).
  11. Wybierz przycisk OK.
  12. Gdy stage całkowicie przesunie się do maszyny, zamknij drzwi.
    UWAGA: Skanowanie pojedynczego chipa zajmuje około 12 minut.
  13. Gdy program zakończy skanowanie chipów, otwórz drzwi, aby wysunąć stage sprawdź, czy skanowanie się powiodło.
    1. Jeśli skanowanie zakończyło się pomyślnie, wyrzuć chip(y) i umieść następny zestaw chipów na uchwycie lub włóż pusty uchwyt na scenę. Następnie wyjdź z oprogramowania i wyłącz urządzenie po zakończeniu.
    2. Jeśli skanowanie się nie powiodło, spójrz na kod błędu i popraw błąd.

4. Przetwarzanie danych

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy.
  2. Wybierz opcję Wstępne skanowanie danych i wybierz folder, w którym znajduje się skan z kroku 3.2 dnia 2.
  3. Wybierz pozycję Dalej.
  4. Oznacz chip(y) w kolumnie Sample Name (Nazwa próbki) nazwą próbki, klikając komórkę i wpisując identyfikator próbki.
  5. Następnie oznacz tetraspaniny w kolumnie Nazwa kanału. Czerwony = CD63, zielony = CD81 i niebieski = CD9.
  6. Wybierz pozycję Dalej.
  7. Wybierz opcję Wysokie CV z grupy Select Spot, aby sprawdzić listę rozwijaną i wyłączyć wysokie CV dla każdego żetonu, wyłączając jedno lub dwa miejsca.
  8. Następnie wybierz pozycję Duża liczba i spróbuj wyłączyć ostrzeżenia o dużej liczbie.
    UWAGA: Niektóre próbki mogą mieć zbyt dużą liczbę, ale nadal można je analizować.
  9. Wybierz Wszystkie miejsca z menu rozwijanego, wybierz Montaż punktowy i wizualnie sprawdź każdy chip pod kątem deformacji lub zadrapań, które mogą być obecne.
  10. Wybierz pozycję Dalej.
  11. W kanale CD63 ustaw minimum na 300, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnio % uwzględnione; żółte komórki są w porządku i przejdź do kanału CD81. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 300 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.
  12. W kanale CD81 ustaw minimum na 300, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnio % uwzględnione; żółte komórki są w porządku i przejdź do kanału CD9. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 300 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.
  13. W kanale CD9 ustaw wartość minimalną na 400, aby pozbyć się czerwonych krwinek w wierszu Średnia % uwzględniona; żółte komórki są w porządku i przejdź do kroku 4.15. Jeśli ustawienie wartości minimalnej na 400 nie zmieni czerwonej komórki na żółtą lub białą, przejdź do kroku 4.14 w celu rozwiązania problemu.
  14. Rozwiązywanie problemów
    1. Zwiększa minimalną wartość o 100 jednostek.
    2. Jeśli krok 4.14.1 nie zadziałał, wybierz żeton w sekcji Wybierz żetony do pracy i wybierz żeton. Wybierz opcję Particle Count (Liczba cząstek) i wyłącz miejsca, które mają dużą liczbę cząstek. Wybierz opcję Intensywność/Rozmiar, wybierz opcję Wszystkie żetony i sprawdź, czy to rozwiąże problem.
    3. Jeśli krok 4.14.2 nie zadziałał, wybierz żeton w sekcji Wybierz żetony do pracy i wybierz żeton. Wybierz opcję Single-Chip Cutoffs (Odcięcia pojedynczego układu) i zwiększ wartość minimalną o 100 jednostek. Następnie wybierz opcję Wszystkie żetony, aby sprawdzić, czy czerwona komórka jest teraz żółta. Jeśli to nie zadziała, powtarzaj ten krok, aż komórka Średnia % uwzględniona zmieni kolor na żółty lub biały.
  15. Wybierz pozycję Dalej.
  16. Usuń zaznaczenie kanału wiadomości błyskawicznych.
  17. Ustaw wartość mapy cieplnej w prawym dolnym rogu, aby uwzględnić wszystkie cząstki, a następnie wybierz opcję Dodaj wykres do raportu.
    1. Dostosuj maksymalną liczbę w polu rozwijanym i ręcznie wprowadź wartość.
  18. Następnie wybierz menu rozwijane w górnej środkowej części w obszarze Sondy przechwytywania i wybierz CD63.
  19. Wybierz opcję Dodaj wykres do raportu, aby dodać całkowitą liczbę cząstek do raportu.
  20. Wybierz menu rozwijane w obszarze Tryb analizy, wybierz opcję Kolokalizacja i Dodaj wykres do raportu.
  21. Następnie wybierz pozycję Rozmiar, wybierz pozycję Zmień widok na Wykres, a następnie wybierz pozycję Dodaj wykres do raportu.
  22. Na koniec wybierz pozycję Obrazy i wybierz pozycję Dodaj wykres do raportu.
  23. Powtórz kroki 4.18–4.22 dla CD81 i CD9, upewniając się, że za każdym razem odznaczono kanał wiadomości błyskawicznych.
  24. Po dodaniu wszystkich elementów do raportu wybierz pozycję Eksportuj raport, upewnij się, że jest on zapisywany w odpowiednim pliku, a następnie wybierz pozycję Folder.
    UWAGA: Pliki i obrazy Excela zostały wygenerowane i mogą być teraz używane do dalszej analizy.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas analizy miejsc na chipach, dąż do optymalnej koncentracji EV, obserwując fluorescencyjnie oznaczone EV w kanałach CD63, CD81 i CD9, a kanał MIgG30,91 powinien pozostać, ponieważ jest to kanał kontrolny, jak widać na Rysunek 3A. CD81 zostanie zredukowany dla płynów biologicznych. Jeśli w kanałach CD63, CD81 i CD9 nie ma fluorescencji, oznacza to brak EV (Rysunek 3B). Uważaj, aby nie przesycić układu (Rysunek 3C). Utrudni to oprogramowaniu analizującemu obliczenie dokładności rozmiaru, całkowitej liczby cząstek i fenotypów pojazdów elektrycznych. Z miejsc o optymalnym stężeniu oprogramowanie analityczne będzie w stanie zmierzyć rozmiar (50-200 nm), całkowitą liczbę cząstek i ekspresję tetraspaniny w EV (Rysunek 4) i zostanie wyeksportowane do indywidualnych arkuszy kalkulacyjnych w celu dalszej analizy. Analiza tetraspaniny obejmie kolokalizację białek powierzchniowych na EV. Kolokalizacja będzie reprezentowana przez znak "/", na przykład "CD63/CD81". Nie oznacza to, że CD63 i CD81 są połączone; oznacza to, że zarówno CD63, jak i CD81 znajdują się na powierzchni EV.

Te wyniki dostarczą cennych informacji pomiędzy próbkami zdrowymi i chorymi. Będziemy w stanie określić, czy zdrowe lub chore próbki wytwarzają więcej EV, większych lub mniejszych EV oraz fenotyp EV. Każda lub wszystkie z tych cech mogą odgrywać rolę w biogenezie i/lub progresji choroby. Dzięki tym wynikom będziemy w stanie sprawdzić, czy występuje brak lub wzrost poziomu tetraspaniny, co może zapewnić wgląd w procesy komórkowe i powstawanie EV.

figure-results-1
Rysunek 1: Typy i rozmiary różnych pojazdów elektrycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat pokazujący, w jaki sposób chipy tetraspanin przechwytują i wykrywają EV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Optymalizacja stężeń EV. (A) Optymalna koncentracja pojazdów elektrycznych. (B) Wynik negatywny: brak pojazdów elektrycznych. (C) Przesycenie pojazdów elektrycznych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Dane generowane przez analizator nanocząstek. (A) Średnica EV mierzona w nanometrach. (B) Całkowita liczba cząstek stałych w pojazdach elektrycznych. (C) Fenotyp kolokalizowany EV. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

technikaZaletyOgraniczenia
UltrawirówkaWysoka czystość42,43Zmiany morfologii EV42,44
Jednorodność42,45Wymaga dużej objętości42,44,46
Funkcjonalność42,43Drogie42,43
Cytometria przepływowaOcena próbek w wielu punktach czasowych47Słaby sygnał48,49
Wiele punktów końcowych47,50Zatkane pory51
Wysokowydajna analiza pojedynczych pojazdówelektrycznych 52,53
Wirowanie w gradiencie gęstościWytwarzanie próbek o wysokiej czystości54Pracochłonne55,56
Różnorodność próbek55,57Czasochłonne55,58
Znaczne straty w plonach54
opad atmosferycznyProsty59,60Zanieczyszczenie36,44,61
Szybki61,62Niespecyficzne63
Wysoka wydajność44,59,62
Neutralne pH36
filtracjaProsty64 Egzosomy pułapkowe65
Szybki64Uszkadza duże pęcherzyki36
Niedrogi64Placek filtracyjny66,67
Zatykanie egzosomów65

Tabela 1: Zalety i ograniczenia technik izolacji EV. Lista różnych sposobów izolowania pojazdów elektrycznych, w tym ich zalety i ograniczenia.

technikaZaletyOgraniczenia
Dynamiczne rozpraszanie światłaPomiar cząstek o wielkości od 1 nm do 6 μM78 Nie nadaje się do pomiaru złożonych próbek egzosomów o dużym zakresie rozmiarów79
Dolna granica wynosi 10 nm i jest odpowiednia dla systemów monodyspersyjnych79 Nie jest w stanie odróżnić zanieczyszczonych białek od egzosomów79
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)Obserwuj morfologię egzosomów79,80 Skomplikowane przygotowanie próbek79
Obserwuj strukturę wewnętrzną81 Nie jest w stanie rozróżnić egzosomów na podstawie wielkości i kształtu z powodu przesadzonych sygnałów fluorescencyjnych82
Analiza śledzenia nanocząstekPomiar stężenia, wielkości i rozkładu wielkości egzosomów w zakresie od 10 nm do 2 μM78 Nie jest w stanie odróżnić EV od agregatów białkowych i innych zanieczyszczeń83
Szybkie przygotowanie i pomiar próbki78,84Drogi instrument NTA85
Próbki można odzyskać w postaci rodzimej84 Wrażliwy na wibracje85
Western Blot (WBs)potrafi analizować jakościowo i ilościowo białka markerowe79,86 Skomplikowane i czasochłonne79
Analiza egzosomów z pożywek do hodowli komórkowych79 Izolaty EV mogą zawierać lipoproteiny i inne zanieczyszczenia86
Cytometria przepływowaWyższa czułość i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości doCzasochłonne i pracochłonne z limitem wykrywalności 400 nm79,88
Odróżnianie barwionych egzosomów od pojemników87
Wymagane niskie stężenie próbki79 Sygnały optyczne utrudniają dokładność i rozdzielczość88
Widok egzologicznyZmierz tetraspaniny (CD9, CD63 i CD81) na egzosomach89 Nie mierzy większych rozmiarów EV75
Mierzy białka ładunku EV90

Tabela 2: Zalety i ograniczenia technik charakteryzacji EV.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest upewnienie się, że osiągnięte zostanie optymalne stężenie pojazdów elektrycznych. Musi być wystarczająca liczba pojazdów elektrycznych, aby uzyskać odczyt, ale nie za dużo pojazdów elektrycznych, które przesycą chip. Najlepszym sposobem na określenie optymalnego stężenia EV jest wykonanie serii optymalizacyjnej z 1 μl próbki i sprawdzenie, czy stężenie wymaga korekty. Kolejnym krytycznym krokiem jest sprawdzenie, czy w próbce znajduje się duża ilość resztek komórkowych, które można określić, przeglądając duże kawałki na chipach w oprogramowaniu analizującym. Jeśli próbka zawiera resztki komórek, proste odwirowanie lub przefiltrowanie próbki powinno rozwiązać ten problem.

Dodatkowym, kluczowym krokiem jest upewnienie się, że wióry nie dotykają ścian studni i unikanie kontaktu ze środkową częścią wióra (wiórów) podczas umieszczania ich na rampie. Skaner będzie odczytywał z kwadratu na środku chipa, dlatego ważne jest, aby unikać dotykania tego obszaru kleszczami, aby zapobiec zakłóceniu pracy pojazdów elektrycznych.

Metoda ta ma pewne ograniczenia, takie jak niewystarczające stężenie EV do wykrycia przez instrument. Stężenie można poprawić, susząc próbkę lub używając rurki koncentratora. Innym ograniczeniem jest to, że oprogramowanie analityczne mierzy tylko EV w zakresie 50-200 nm, wykluczając niektóre mikropęcherzyki i wszystkie ciała apoptotyczne z pomiarów wielkości75.

Istnieje wiele sposobów izolacji (Tabela 1 42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52, 53,54,55,56,57,58, 59,60, 61,62,63,64,65,66,67) i analizować EV (Tabela 2 78,79,80,81,82,83,84,85,86,87,88,89,90), a obecnym złotym standardem izolacji EV jest ultrawirowanie 36,37,38 w celu granulowania komórek do testów takich jak Western Blots 68,69,70 i PCR 71,72,73,74,75,76. Chociaż protokół ten działa dobrze w przypadku dużych próbek 42,44,46, uzyskanie płynów biologicznych może być trudne, a często można pobrać tylko niewielką objętość próbek na raz, co nie jest idealne do ultrawirowania. W przeciwieństwie do tego, korzystanie z tego analizatora nanocząstek pozwala użytkownikowi generować cenne dane, takie jak rozmiar, całkowita liczba cząstek i fenotyp EV, w zaledwie 1 μl próbki, co czyni go idealnym dla płynów biologicznych. Będziemy mogli poszerzyć wiedzę na temat EV z niewielkich objętości próbek, które są trudne do pobrania, co może zwiększyć komfort pacjenta i być może znaleźć potencjalne cele terapeutyczne dla różnych chorób i zaburzeń.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować NIH za finansowanie (EY031316 i EY034714). Chcielibyśmy również podziękować UNTHSC i NTERI za przestrzeń laboratoryjną.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ChipWasher 100NanoViewEV-CW100 ChipWasher 100Wkłada, myje, płucze i suszy chipsy tetraspaninowe. Ten obecny model nie jest już dostępny. Cena w momencie zakupu: $9,995.00 
Oprogramowanie ExoView AnalyzerNanoViewN/AAnalizuje informacje o chipie i tworzy pliki Excela do dalszej analizy. Nie jest już dostępny.
ExoView R100NanoViewEV-R100Służy do skanowania chipów tetraspaniny na 3 długościach fal. Ten obecny model nie jest już dostępny. Cena w momencie zakupu:  $110,000.00
Oprogramowanie ExoView ScannerNanoViewN/ASkanuje chipy na 3 różnych długościach fal. Nie jest już dostępny.
Zestawy ludzkiej tetraspaninyUnchainedLabs EV-TETRA-CZawiera 8 chipów tetraspaniny, roztwór do inkubacji, roztwór blokujący, przeciwciało CD63, przeciwciało CD81, przeciwciało CD9, roztwór A, roztwór B, USB i pokrywę płytki.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Radler, J., Gupta, D., Zickler, A., Andaloussi, S. E. Exploiting the biogenesis of extracellular vesicles for bioengineering and therapeutic cargo loading. Mol Ther. 31 (5), 1231-1250 (2023).
  3. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 113961(2021).
  4. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  5. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  6. Zhang, H., et al. Exosome-induced regulation in inflammatory bowel disease. Front Immunol. 10, 1464(2019).
  7. Barzin, M., et al. Application of plant-derived exosome-like nanoparticles in drug delivery. Pharm Dev Technol. 28 (5), 383-402 (2023).
  8. Zhou, C., et al. Stem cell-derived exosomes: emerging therapeutic opportunities for wound healing. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 107(2023).
  9. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), aau6977(2020).
  10. Mondal, J., et al. Hybrid exosomes, exosome-like nanovesicles and engineered exosomes for therapeutic applications. J Control Release. 353, 1127-1149 (2023).
  11. van Niel, G., D'Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  12. Paul, N., Sultana, Z., Fisher, J. J., Maiti, K., Smith, R. Extracellular vesicles- crucial players in human pregnancy. Placenta. 140, 30-38 (2023).
  13. Zaldivia, M. T. K., McFadyen, J. D., Lim, B., Wang, X., Peter, K. Platelet-derived microvesicles in cardiovascular diseases. Front Cardiovasc Med. 4, 74(2017).
  14. Tamasi, V., Nemeth, K., Csala, M. Role of extracellular vesicles in liver diseases. Life (Basel). 13 (5), 1117(2023).
  15. Fu, Y., et al. Emerging understanding of apoptosis in mediating mesenchymal stem cell therapy. Cell Death Dis. 12 (6), 596(2021).
  16. Santavanond, J. P., Rutter, S. F., Atkin-Smith, G. K., Poon, I. K. H. Apoptotic bodies: Mechanism of formation, isolation and functional relevance. Subcell Biochem. 97, 61-88 (2021).
  17. Yu, L., et al. Apoptotic bodies: bioactive treasure left behind by the dying cells with robust diagnostic and therapeutic application potentials. J Nanobiotechnology. 21 (1), 218(2023).
  18. Momen-Heravi, F., Getting, S. J., Moschos, S. A. Extracellular vesicles and their nucleic acids for biomarker discovery. Pharmacol Ther. 192, 170-187 (2018).
  19. Liu, Y. J., Wang, C. A review of the regulatory mechanisms of extracellular vesicles-mediated intercellular communication. Cell Commun Signal. 21 (1), 77(2023).
  20. Grange, C., Bussolati, B. Extracellular vesicles in kidney disease. Nat Rev Nephrol. 18 (8), 499-513 (2022).
  21. Cocucci, E., Meldolesi, J. Ectosomes and exosomes: shedding the confusion between extracellular vesicles. Trends Cell Biol. 25 (6), 364-372 (2015).
  22. Iannotta, D. A. A., Kijas, A. W., Rowan, A. E., Wolfram, J. Entry and exit of extracellular vesicles to and from the blood circulation. Nat Nanotechnol. 19 (1), 13-20 (2024).
  23. Saint-Pol, J., Gosselet, F., Duban-Deweer, S., Pottiez, G., Karamanos, Y. Targeting and crossing the blood-brain barrier with extracellular vesicles. Cells. 9 (4), 851(2020).
  24. Alberro, A., Iparraguirre, L., Fernandes, A., Otaegui, D. Extracellular vesicles in blood: Sources, effects, and applications. Int J Mol Sci. 22 (15), 8163(2021).
  25. Nieuwland, R., Siljander, P. R. A beginner's guide to study extracellular vesicles in human blood plasma and serum. J Extracell Vesicles. 13 (1), e12400(2024).
  26. Thangaraju, K., Neerukonda, S. N., Katneni, U., Buehler, P. W. Extracellular vesicles from red blood cells and their evolving roles in health, coagulopathy and therapy. Int J Mol Sci. 22 (1), 153(2020).
  27. Li, C., et al. Cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles after spinal cord injury promote vascular regeneration via PI3K/AKT signaling pathway. J Orthop Translat. 39, 124-134 (2023).
  28. Deng, Y., et al. Phosphoproteome analysis of cerebrospinal fluid extracellular vesicles in primary central nervous system lymphoma. Analyst. 148 (15), 3594-3602 (2023).
  29. Hirschberg, Y., et al. Proteomic comparison between non-purified cerebrospinal fluid and cerebrospinal fluid-derived extracellular vesicles from patients with Alzheimer's, Parkinson's and Lewy body dementia. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12383(2023).
  30. Hefley, B. S., et al. Revealing the presence of tear extracellular vesicles in Keratoconus. Exp Eye Res. 224, 109242(2022).
  31. Cross, T., et al. RNA profiles of tear fluid extracellular vesicles in patients with dry eye-related symptoms. Int J Mol Sci. 24 (20), 15390(2023).
  32. Ma, H., et al. Metabolic signatures of tear extracellular vesicles caused by herpes simplex keratitis. Ocul Surf. 31, 21-30 (2024).
  33. Han, P., Bartold, P. M., Ivanovski, S. The emerging role of small extracellular vesicles in saliva and gingival crevicular fluid as diagnostics for periodontitis. J Periodontal Res. 57 (1), 219-231 (2022).
  34. Han, P., Li, X., Wei, W., Ivanovski, S. Saliva diagnosis using small extracellular vesicles and salivaomics. Methods Mol Biol. 2588, 25-39 (2023).
  35. Reseco, L., et al. Characterization of extracellular vesicles from human saliva: Effects of age and isolation techniques. Cells. 13 (1), 95(2024).
  36. Tiwari, S., Kumar, V., Randhawa, S., Verma, S. K. Preparation and characterization of extracellular vesicles. Am J Reprod Immunol. 85 (2), e13367(2021).
  37. Tomiyama, E., Fujita, K., Nonomura, N. Urinary extracellular vesicles: Ultracentrifugation method. Methods Mol Biol. 2292, 173-181 (2021).
  38. Xu, K., Jin, Y., Li, Y., Huang, Y., Zhao, R. Recent progress of exosome isolation and peptide recognition-guided strategies for exosome research. Front Chem. 10, 844124(2022).
  39. Brennan, K., et al. A comparison of methods for the isolation and separation of extracellular vesicles from protein and lipid particles in human serum. Sci Rep. 10 (1), 1039(2020).
  40. Gao, J., et al. Recent developments in isolating methods for exosomes. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1100892(2022).
  41. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  42. Ansari, F. J., et al. Comparison of the efficiency of ultrafiltration, precipitation, and ultracentrifugation methods for exosome isolation. Biochem Biophys Rep. 38, 101668(2024).
  43. Patel, G. K., et al. Comparative analysis of exosome isolation methods using culture supernatant for optimum yield, purity and downstream applications. Sci Rep. 9 (1), 5335(2019).
  44. Stam, J., Bartel, S., Bischoff, R., Wolters, J. C. Isolation of extracellular vesicles with combined enrichment methods. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1169, 122604(2021).
  45. Le Roy, A., et al. AUC and small-angle scattering for membrane proteins. Methods Enzymol. 562, 257-286 (2015).
  46. Chhoy, P., Brown, C. W., Amante, J. J., Mercurio, A. M. Protocol for the separation of extracellular vesicles by ultracentrifugation from in vitro cell culture models. STAR Protoc. 2 (1), 100303(2021).
  47. McDorman, K. S., Chan, C., Rojko, J., Satterwhite, C. M., Morrison, J. P. Chapter 7 - Special Techniques in Toxicologic Pathology. Haschek and Rousseaux's Handbook of Toxicologic Pathology (Third Edition). , Academic Press. (2013).
  48. Woud, W. W., et al. An imaging flow cytometry-based methodology for the analysis of single extracellular vesicles in unprocessed human plasma. Commun Biol. 5 (1), 633(2022).
  49. Gul, B., Syed, F., Khan, S., Iqbal, A., Ahmad, I. Characterization of extracellular vesicles by flow cytometry: Challenges and promises. Micron. 161, 103341(2022).
  50. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-based screening using high-throughput flow cytometry. Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).
  51. Safford, H. R., Bischel, H. N. Flow cytometry applications in water treatment, distribution, and reuse: A review. Water Res. 151, 110-133 (2019).
  52. Kobayashi, H., et al. Precise analysis of single small extracellular vesicles using flow cytometry. Sci Rep. 14 (1), 7465(2024).
  53. Welsh, J. A., et al. A compendium of single extracellular vesicle flow cytometry. J Extracell Vesicles. 12 (2), e12299(2023).
  54. Carnino, J. M., Lee, H. Extracellular vesicles in respiratory disease. Adv Clin Chem. 108, 105-127 (2022).
  55. Sun, Y., Sethu, P. Low-stress microfluidic density-gradient centrifugation for blood cell sorting. Biomed Microdevices. 20 (3), 77(2018).
  56. Strachan, B. C., Xia, H., Voros, E., Gifford, S. C., Shevkoplyas, S. S. Improved expansion of T cells in culture when isolated with an equipment-free, high-throughput, flow-through microfluidic module versus traditional density gradient centrifugation. Cytotherapy. 21 (2), 234-245 (2019).
  57. Malvezzi, H., Sharma, R., Agarwal, A., Abuzenadah, A. M., Abu-Elmagd, M. Sperm quality after density gradient centrifugation with three commercially available media: a controlled trial. Reprod Biol Endocrinol. 12, 121(2014).
  58. Sun, Y., Sethu, P. Microfluidic adaptation of density-gradient centrifugation for isolation of particles and cells. Bioengineering (Basel). 4 (3), 67(2017).
  59. Karttunen, J., et al. Precipitation-based extracellular vesicle isolation from rat plasma co-precipitate vesicle-free microRNAs. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1555410(2019).
  60. De Sousa, K. P., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles and future directions in diagnosis and therapy. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 15 (1), e1835(2023).
  61. Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  62. Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Curr Protoc Cell Biol. 88 (1), e110(2020).
  63. Konoshenko, M. Y., et al. Isolation of extracellular vesicles from biological fluids via the aggregation-precipitation approach for downstream miRNAs detection. Diagnostics (Basel). 11 (3), 384(2021).
  64. Drozdz, A., et al. Low-vacuum filtration as an alternative extracellular vesicle concentration method: A comparison with ultracentrifugation and differential centrifugation. Pharmaceutics. 12 (9), 872(2020).
  65. Akbar, A., Malekian, F., Baghban, N., Kodam, S. P., Ullah, M. Methodologies to isolate and purify clinical grade extracellular vesicles for medical applications. Cells. 11 (2), 186(2022).
  66. Chen, J., et al. Review on strategies and technologies for exosome isolation and purification. Front Bioeng Biotechnol. 9, 811971(2021).
  67. Helling, A., et al. Investigation of microbial cell deformability by filter cake compressibility using ultrafiltration membranes. Colloids Surf B Biointerfaces. 185, 110626(2020).
  68. Bagci, C., et al. Overview of extracellular vesicle characterization techniques and introduction to combined reflectance and fluorescence confocal microscopy to distinguish extracellular vesicle subpopulations. Neurophotonics. 9 (2), 021903(2022).
  69. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  70. van Maanen, J. C., et al. A combined western and bead-based multiplex platform to characterize extracellular vesicles. Tissue Eng Part C Methods. 29 (11), 493-504 (2023).
  71. Xu, D., et al. MicroRNAs in extracellular vesicles: Sorting mechanisms, diagnostic value, isolation, and detection technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 948959(2022).
  72. Lee, H., He, X., Le, T., Carnino, J. M., Jin, Y. Single-step RT-qPCR for detection of extracellular vesicle microRNAs in vivo: a time- and cost-effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (4), L742-L749 (2020).
  73. Kim, J. A., et al. Small RNA sequencing of circulating small extracellular vesicles microRNAs in patients with amyotrophic lateral sclerosis. Sci Rep. 13 (1), 5528(2023).
  74. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  75. Silva, A. M., et al. Quantification of protein cargo loading into engineered extracellular vesicles at single-vesicle and single-molecule resolution. J Extracell Vesicles. 10 (10), e12130(2021).
  76. Salunkhe, S., Basak Dheeraj, M., Chitkara, D., Mittal, A. Surface functionalization of exosomes for target-specific delivery and in vivo imaging, tracking: Strategies and significance. J Control Release. 326, 599-614 (2020).
  77. Silva, A. K. A., et al. Development of extracellular vesicle-based medicinal products: A position paper of the group "Extracellular Vesicle translatiOn to clinicaL perspectiVEs - EVOLVE France". Adv Drug Deliv Rev. 179, 114001(2021).
  78. Gurunathan, S., Kang, M. H., Jeyaraj, M., Qasim, M., Kim, J. H. Review of the isolation, characterization, biological function, and multifarious therapeutic approaches of exosomes. Cells. 8 (4), 307(2019).
  79. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  80. Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  81. Pisitkun, T., Shen, R. F., Knepper, M. A. Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (36), 13368-13373 (2004).
  82. Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. Extracellular vesicles: Composition, biological relevance, and methods of study. Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).
  83. Kowkabany, G., Bao, Y. Nanoparticle tracking analysis: An effective tool to characterize extracellular vesicles. Molecules. 29 (19), 4672(2024).
  84. Li, H. Metastatic characteristics of SY86B human gastric carcinoma in athymic nude mice. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 10 (6), 421-423 (1988).
  85. Zhao, Z., Wijerathne, H., Godwin, A. K., Soper, S. A. Isolation and analysis methods of extracellular vesicles (EVs). Extracell Vesicles Circ Nucl Acids. 2, 80-103 (2021).
  86. Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends Biotechnol. 38 (10), 1066-1098 (2020).
  87. van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
  88. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. J Extracell Vesicles. 4, 25530(2015).
  89. Breitwieser, K., et al. Detailed characterization of small extracellular vesicles from different cell types based on tetraspanin composition by ExoView R100 platform. Int J Mol Sci. 23 (15), 8544(2022).
  90. An, H. J., Cho, H. K., Song, D. H., Kee, C. Quantitative analysis of exosomes in the aqueous humor of Korean patients with pseudoexfoliation glaucoma. Sci Rep. 12 (1), 12875(2022).
  91. Hefley, B. S., McKay, T. B., Hutcheon, A. E. K., Ciolino, J. B., Karamichos, D. Corneal epithelial-stromal constructs to study differences associated with diabetes mellitus. Exp Eye Res. 248, 110100(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesBiological FluidsEV BiomarkersNanoparticle AnalyzerTetraspanin ChipTear SamplesNon Invasive BiomarkersFluorescence DetectionCD63 CD81 CD9Disease Monitoring

Powiązane artykuły