Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

unerwienie ludzkich organoidów jelitowych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67702

⸱

17 stycznia 2025

 ,  , 
1Program in Children's Regenerative Medicine, Department of Pediatric Surgery, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston

W tym artykule

Podsumowanie

Organoidy jelitowe człowieka muszą być unerwione, aby lepiej oddać strukturę i funkcję rodzimego ludzkiego jelita. W tym miejscu przedstawiamy jedną z metod włączania jelitowego układu nerwowego do tych konstruktów.

Streszczenie

Złożoność cytoarchitektury i funkcji jelit stanowi poważne wyzwanie dla stworzenia bioinżynieryjnego jelita cienkiego. Techniki generowania ludzkich organoidów jelitowych (HIO) przypominających ludzkie jelito cienkie zostały już wcześniej opisane. HIO zawierają nabłonek i mezenchymę, ale brakuje im innych krytycznych składników funkcjonalnego jelita, takich jak jelitowy układ nerwowy (ENS), komórki odpornościowe, naczynia krwionośne i mikrobiom. Dwie niezależne grupy badawcze opublikowały odrębne metody unerwiania HIO za pomocą ENS. W tym miejscu omawiamy unikalną metodę włączania ENS do bioinżynieryjnego jelita cienkiego pochodzącego z HIO, które wykorzystuje składniki tych wcześniejszych raportów do optymalizacji tożsamości komórek progenitorowych, a także czasu rozwoju.

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC) są różnicowane tak, aby niezależnie generować HIO i jelitowe komórki grzebienia nerwowego (ENCC) poprzez czasową regulację markerów różnicowania przez okres kilku dni zgodnie z opublikowanymi protokołami. Gdy HIO osiągną stadium sferoidalne środkowego odcinka jelita grubego (około 8 dnia), sferoidy ENCC dnia 15-21 są dysocjowane, hodowane wspólnie z HIO i zawieszane w przezroczystych trójwymiarowych (3D) kropelkach macierzy błony podstawnej. Kokultury HIO + ENCC są utrzymywane in vitro przez 28-40 dni przed przeszczepieniem do >9-tygodniowych myszy z niedoborem odporności w celu dalszego rozwoju i dojrzewania. Przeszczepione HIOs (tHIOs) z ENS można zebrać 4-20 tygodni później. Metoda ta integruje elementy z dwóch wcześniej opublikowanych technik, wykorzystując ENCC wygenerowane z hPSC i współhodując je z HIO na wczesnym etapie rozwoju, aby zmaksymalizować ekspozycję na wczesne sygnały rozwojowe, które prawdopodobnie przyczynią się do powstania bardziej dojrzałej morfologii jelit.

Wprowadzenie

Ludzkie jelito cienkie jest złożonym, wielowarstwowym organem, który pełni wiele istotnych funkcji, takich jak trawienie, wchłanianie składników odżywczych, regulacja płynów, funkcja bariery immunologicznej i ruchliwość. Liczne choroby kliniczne, takie jak zespół krótkiego jelita, enteropatie lub zaburzenia motoryki, charakteryzują się krytycznym zmniejszeniem masy jelitowej lub zakłóceniami normalnej fizjologii prowadzącymi do znacznej zachorowalności i śmiertelności1,2,3,4. Obecne opcje leczenia często obejmują operację usunięcia dysfunkcyjnego jelita kosztem zmniejszenia długości jelita, a tym samym zmniejszenia zdolności funkcjonalnej pozostałego jelita5. Istnieje zapotrzebowanie na terapie regeneracyjne, które mają charakter addytywny, zwiększając funkcjonalną pojemność jelit i przywracając funkcje jelit w sposób, którego obecne paradygmaty terapeutyczne nie są w stanie osiągnąć.

Bioinżynieryjne jelito cienkie jest obiecującym rozwiązaniem tych wyzwań. Ludzkie organoidy jelitowe (HIO) pochodzące z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) są jednym z materiałów wyjściowych dla bioinżynieryjnego jelita cienkiego. W 2011 roku Spence i wsp. po raz pierwszy poinformowali o udanym stworzeniu nowoczesnych HIO z linii hPSC, w tym zarówno linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych H1, jak i H9 (hESC), jak i wielu ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC)6,7. Ich protokół obejmował starannie zaplanowaną serię inkubacji z określonymi czynnikami wzrostu, aby naśladować rozwój jelit ludzkiego płodu. Aktywina A, cząsteczka sygnałowa TGFβ, napędza różnicowanie hPSC w kierunku losu endodermalnego, a następnie ukierunkowany wzór tylny z Wnt / FGF. W tych warunkach hPSC samoorganizują się, tworząc sferoidy jelitowe zawierające spolaryzowany nabłonek i mezenchym. Hodowla 3D w macierzy błony podstawnej pozwala na dodatkowy rozwój, w wyniku którego powstają organoidy z wewnętrznym światłem, inwolucje nabłonka przypominające kosmki i samoregenerujące się nisze komórek progenitorowych w strukturach przypominających krypty.

Chociaż HIO wygenerowane przy użyciu tego oryginalnego protokołu z 2011 roku strukturalnie przypominają jelito rodzime, brakuje im zdolności do generowania neuronów lub gleju jelitowego układu nerwowego (ENS). W 2017 roku dwa główne artykuły opisały podobne, ale odmienne metody unerwiania HIO. Komórki progenitorowe ENS (jelitowe komórki grzebienia nerwowego, ENCC) mogą pochodzić z hPSC. W hodowli ENCC tworzą neurosfery 3D, które w odpowiednich warunkach mogą różnicować się w neurony jelitowe i glej. Workman i Mahe i in. zmodyfikowali istniejący protokół, aby uzyskać ENCC z hPSC i potraktowali je pożywką wzbogaconą w FGF, a następnie kwasem retinowym przez 2 dni w celu posterioryzacji i promowania losu nerwu błędnego8,9. Neurosfery dnia 6 inkubowano przez kolejne 4 dni bez RZS, a następnie migrowane komórki pobrano po oddzieleniu enzymatycznym. Około 20 000-50 000 ENCC agregowano z wczesnymi sferoidami jelita środkowego jelita grubego, a te sferoidy jelitowe wysiewane przez ENCC hodowano in vitro w przezroczystej macierzy błony podstawnej 3D przez 28 dni, aż do wszczepienia in vivo do torebki nerkowej myszy z niedoborem odporności przez 6-10 tygodni. Uzyskany HIO + ENS wykazał znaczne dojrzewanie składników nabłonkowych i mezenchymalnych, a także struktur neuroglejowych podobnych do zwojów, aczkolwiek z niższą gęstością ciała komórek niż jelito natywne, brakiem pewnych klinicznie istotnych podtypów neuronów (tj. neuronów CHAT-dodatnich w HIO + ENS po przeszczepie) i ogólnymi cechami podobnymi do płodu.

W tym samym roku, Schlieve i in. opublikowali alternatywną metodę polegającą na mieszance 40-60 nienaruszonych neurosfer ENCC dnia 15 z bardziej dojrzałymi HIO w momencie przeszczepu in vivo do sieci myszy z niedoborem odporności przez 3 miesiące bez wcześniejszej kokultury in vitro10. Ich konstrukty, zwane ENCC-HIO-TESI (jelito cienkie inżynierii tkankowej), wydawały się zawierać bardziej dojrzały fenotyp ENS niż HIO + ENS Workmana i Mahe'a z większą różnorodnością podtypów neuronalnych i neuronabłonkowymi połączeniami synaptycznymi nieobserwowanymi w HIO + ENS. Co ważne, ENCC użyte w eksperymentach Schlieve'a zostały uzyskane za pomocą innej metody, opisanej wcześniej przez Fattahi et al.11. Krótko mówiąc, hPSC (zarówno hESC, jak i hiPSC) uległy indukcji grzebienia nerwowego w pożywkach wzbogaconych w FGF2. Komórki te były również leczone RZS w celu ustalenia jelitowego losu nerwu błędnego, ale przez 5 dni (dni 6-11), co stanowi wzrost w porównaniu z 2 dniami Workmana i Mahe'a (dzień 4-5). W 2019 roku Barber i in. opublikowali poprawioną wersję protokołu Fattahi, w tym bardziej szczegółowy opis warunków hodowli i przejście na zdefiniowane podłoża podstawowe w celu zmniejszenia niespójności i odzwierciedlenia zmieniających się preferencji hodowli komórkowych w tamtym czasie12.

Nasza metoda unerwiania HIO, opisana szczegółowo poniżej, zawiera elementy zarówno protokołu Workman/Mahe, jak i Schlieve. Podczas gdy ENS w ENCC-HIO-TESI Schlieve'a wydawał się bardziej dojrzały z większą różnorodnością neuronalną i integracją neuroglejową, obie metody z powodzeniem zintegrowały funkcjonalny ENS z HIO, wykazując zmiany w ekspresji transkrypcji przewodu pokarmowego. HIO + ENS Workmana i Mahe'a indukował zwiększoną ekspresję kilku genów związanych z jelitowymi komórkami macierzystymi i rozwojem komórek nabłonkowych, które nie uległy zmianie w ENCC-HIO-TESI. Jednym z możliwych wyjaśnień tych różnic są różne punkty czasowe, w których ENCC i HIO zostały połączone między protokołami. Nasze laboratorium zaobserwowało, że wczesna kokultura powoduje zwiększoną ekspresję wielu genów zaangażowanych w różnicowanie nabłonkowe i mezenchymalne, a czas kokultury wpływa na różnorodność komórek nabłonka (dane niepublikowane). Możliwe, że wcześniejsza ekspozycja prekursorów ENS na rozwijające się HIO i odwrotnie daje czas na jeszcze niezdefiniowane przesłuchy sygnałowe, które promują różnorodność nabłonka i inne wczesne procesy rozwojowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Linia H9 ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) pochodzi z WiCell (Madison, WI), a wszystkie eksperymenty z udziałem hESC zostały zatwierdzone przez Komitet Nadzoru nad Komórkami Macierzystymi UTHealth Houston (SCRO) (protokół #SCRO-23-01). W przypadku tego protokołu wszystkie odniesienia do powlekanych płyt lub studzienek odnoszą się do tych przygotowanych z matrycą 3D membrany podstawnej zakwalifikowaną do hESC.

1. Przygotowanie hodowli komórkowej

UWAGA: Nasze laboratorium używa hESC H9, ale wiele linii hPSC zostało z powodzeniem wykorzystanych przez inne laboratoria do generowania HIOs i ENCC, w tym H9 hESCs9,10,12, H1 hESCs9, linia hESC UCSF412, oraz wiele linii hiPSC, takich jak WTC1112, WTC11 AAVS1-CAG-GCaMP6f9, WTC109,10, WTC10 PHOX2B het (+/Y14X)9, oraz WTC10 PHOX2B null (Y14X/Y14X)9.

  1. Przygotować płytkę 6-dołkową, pokrywając każdą żądaną studzienkę matrycą membrany podstawnej 3D rozcieńczoną w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych (współczynnik rozcieńczenia i instrukcje przygotowania znajdują się w karcie danych materiału). Pokryj każdą pożądaną studzienkę 1 ml na studzienkę i inkubuj w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc do zastygnięcia przed posiewem komórek.
    UWAGA: Ten protokół może być uzupełniony o komórki z tylko jednego dołka lub skalowany w razie potrzeby. Zalecamy pokrycie co najmniej trzech studzienek, aby rozpocząć dodatkowe przechodzenie i konserwację niezróżnicowanych hPSC.
    Ważne jest, aby podczas pracy utrzymywać niską temperaturę matrycy błony podstawnej, ponieważ większość matryc zaczyna polimeryzować w temperaturze pokojowej. Studzienki powlekane nadają się do użytku do 2-3 tygodni przy przechowywaniu w temperaturze 37 °C. Przechowywać w odpowiednim rozcieńczalniku, aby pokryć całą studzienkę, aby zapobiec wysychaniu powłoki.
  2. Rozmrozić hPSC (najlepiej o niskiej liczbie pasaży) poprzez krótkie wirowanie w ciepłej łaźni wodnej. Pod kapturem z przepływem laminarnym ponownie zawiesić jedną fiolkę z komórkami w 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi (Tabela 1). Odessać rozcieńczalnik z jednego wcześniej pokrytego dołka w naczyniu 6-dołkowym bezpośrednio przed posiewem komórek, a następnie przenieść całe 2 ml zawieszonych komórek do powlekanej studzienki. W celu utrzymania niezróżnicowanych hPSC (określanych jako płytki podtrzymujące) inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i zmieniać pożywkę co drugi dzień z 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi na basenik.
  3. Przejdź komórki, gdy osiągną 70-80% zbieżności. Zassać pożywkę od strony studzienki, nie naruszając komórek. Dodaj 1 ml odczynnika do dysocjacji komórek macierzystych o temperaturze pokojowej do studzienki i odessaj go w ciągu 1 minuty, pozostawiając cienką warstwę płynu na komórkach. Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Czekanie, aż komórki przekroczą 80% konfluencji do przejścia, może spowodować problemy z przedwczesnym różnicowaniem, co zmniejszy wydajność na kolejnych etapach.
  4. Dodaj 1 ml ciepłego podłoża z komórek macierzystych na dołek i postukaj w bok płytki, aby usunąć kolonie. Delikatnie pipetować media za pomocą mikropipety P1000 z końcówką pipety o szerokiej ustach (patrz Tabela materiałów), aby rozbić kolonie, jednocześnie minimalizując uszkodzenia komórek.
    UWAGA: Podczas rozcierania zawiesiny komórkowej zaleca się rozbijanie dużych skupisk komórek, ale pozostawienie mniejszych skupisk nienaruszonych. Nie zaleca się osiągania zawiesiny jednokomórkowej, ale raczej dążenie do mniejszej liczby, mniejszych kolonii rozmieszczonych równomiernie w całej studni.
  5. Odessać rozcieńczalnik z uprzednio pokrytego dołka do naczynia 6-dołkowego i dodać 2 ml ciepłej pożywki z komórek macierzystych. Przenieś żądaną objętość zawiesiny komórkowej do tej studzienki, aby utrzymać kolonie hPSC, zmieniając pożywkę co drugi dzień z 2 ml pożywki z komórek macierzystych na studzienkę.
    UWAGA: Nasze laboratorium zazwyczaj przenosi objętości od 50 do 150 μl, aby umożliwić pasażowanie płytek konserwacyjnych hPSC raz w tygodniu. Głośność ta może się różnić w zależności od konkretnej linii hPSC i numeru przejścia, a zatem może wymagać regulacji. Użyj pozostałych komórek, aby zainicjować generowanie ENCC (sekcja 2) lub generowanie HIO (sekcja 3). Nowo rozmrożone hPSC powinny być pasażowane co najmniej dwa razy przed przejściem do generacji ENCC lub generacji HIO.

2. Generowanie ENCC

UWAGA: Nasza metoda generowania ENCC jest ściśle zgodna z tą opisaną przez laboratorium Fattahi i używaną przez Schlieve et al.10. Używamy nieco zmodyfikowanej wersji opcji protokołu B poprzez sekcje "Indukcja grzebienia nerwowego jelitowego (ENC) (dni 0-12)" i "Formacja sferoidalna ENCC (dzień 12-15)" w Barber et al.10,12.

  1. Odessać rozcieńczalnik z uprzednio pokrytego dołka do nowego naczynia 6-dołkowego i dodać 2 ml ciepłej pożywki z komórek macierzystych. Przenieś 850 μl zawiesiny komórek hPSC z kroku 1,5 do tego samego dołka (zwykle stosunek pasażacji 5:6).
  2. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co drugi dzień z 2 ml pożywki z komórkami macierzystymi na dołek, aż zbieg osiągnie 60-80%. Następnie płyta jest gotowa do rozpoczęcia indukcji ENC.
  3. Indukcja ENC
    1. Dzień 0. Odessać pożywkę z boku studzienki i dodać 2 ml ciepłej pożywki Cocktail A (Tabela 1). Powrót do inkubatora na 48 godzin.
    2. Dzień 2. Odessać pożywkę Cocktail A od strony studzienki i zastąpić 2 ml ciepłej pożywki Cocktail B (Tabela 1). Powrót do inkubatora na 48 godzin.
    3. Dzień 4. Zassać pożywkę Cocktail B z boku studzienki i zastąpić 2 ml świeżej, ciepłej pożywki Cocktail B. Powrót do inkubatora na 48 godzin.
    4. Dni 6-12. Odessać pożywkę Cocktail B z boku studzienki i zastąpić 2 ml ciepłej pożywki Cocktail C (Tabela 1). Wrócić do inkubatora i zastąpić pożywkę 2 ml świeżego, ciepłego koktajlu C co 48 godzin, aż do zakończenia indukcji ENC w dniu 12,
      UWAGA: Na tym etapie linie ENC mogą być potwierdzone przez analizę ekspresji genów, jak opisano przez Barber et al.12.
  4. Tworzenie sferoidów ENCC
    1. Dzień 13. Odsysać pożywkę Cocktail C z boku studni. Dodać 1 ml ciepłego odczynnika enzymatycznego do oddzielania komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Postukaj w bok płytki, aby usunąć komórki i przenieś zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml za pomocą końcówki pipety o szerokich ustach. Przemyć studzienkę 1 ml pożywki dla komórek grzbietu nerwowego (NCC) (Tabela 1) i dodać popłuczyny do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Odwirować zawiesinę komórkową w stożkowej probówce o pojemności 15 ml o stężeniu 300 × g przez 1 minutę. Odessać supernatant. Delikatnie zawiesić osad w 2 ml ciepłego podłoża NCC.
    3. Dodać zawieszone komórki do nowego, niepowlekanego dołka na płytce o bardzo niskim poziomie wiązania i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 48 godzin.
    4. Dni 15-21. Monitoruj wzrost sferoidów ENCC i wymieniaj pożywkę na 2 ml świeżej, ciepłej pożywki NCC co 48 godzin
      UWAGA: Wymiany podłoża należy wykonywać ostrożnie, aby uniknąć uszkodzenia lub zassania sferoid ENCC. Najlepiej osiągnąć to, obracając płytkę ruchem okrężnym, aby skupić sferoidy w środku studzienki, a następnie zasysając media z krawędzi studzienki.
      Tworzenie sferoidów ENCC jest zwykle zakończone do 15 dnia, chociaż dopuszczalne jest hodowanie ich do 21 dnia, aby dostosować się do idealnego czasu kokultury ze sferoidami środkowego jelita tylnego.

3. Generacja HIO (faza sferoidalna środkowego jelita tylnego)

UWAGA: Nasza metoda generowania HIO jest zasadniczo taka sama, jak oryginalny protokół opisany szczegółowo przez McCrackena i in. oraz innych z laboratoriów Spence'a i Wellsa6,7. Proces ten przebiega w dwóch fazach: ostatecznej indukcji endodermy (DE) i tworzenia sferoidów w jelicie tylnym.

  1. Przygotowanie do generacji HIO
    1. Przygotować 24-dołkową płytkę, pokrywając każdą pożądaną studzienkę matrycą membrany podstawnej 3D rozcieńczoną w odpowiednim pożywce do hodowli komórkowych (współczynnik rozcieńczenia i instrukcje przygotowania znajdują się w karcie charakterystyki materiału). Pokryć każdą żądaną studzienkę 500 μl na studzienkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 1 godzinę lub przez noc do zastygnięcia przed posiewem komórek.
      UWAGA: Ważne jest, aby podczas pracy utrzymywać niską temperaturę matrycy membrany podstawnej, ponieważ większość matryc zaczyna polimeryzować w temperaturze pokojowej. Studzienki powlekane nadają się do użytku przez okres do 2-3 tygodni, jeśli są przechowywane w temperaturze 37 °C. Przechowywać w ilości wystarczającej do pokrycia całej studzienki, aby zapobiec wysychaniu powłoki.
      Zaplanuj pokrycie 6 dołków 24-dołkowej płytki na każdy 1 studzienkę z 6-dołkowych płytek konserwacyjnych hPSC opisanych powyżej. Współczynnik ten można dowolnie skalować w górę.
    2. Zassać rozcieńczalnik ze wszystkich wcześniej pokrytych studzienek w naczyniu 24-dołkowym. Dodać wystarczającą ilość ciepłej pożywki z komórek macierzystych do zawiesiny komórek hPSC z kroku 1.5 i rozprowadzić 500 μl do każdej studzienki (np. jeśli 850 μl zawiesiny komórek hPSC pozostało po przejściu płytki podtrzymującej hPSC, to w przypadku 6 dołków płytki 24-dołkowej zmieszać 2,150 μl ciepłej pożywki z komórek macierzystych z 850 μl zawiesiny komórek hPSC z etapu 1.5, i 500 μL rozprowadzane w każdym z 6 dołków).
      UWAGA: Ponieważ zazwyczaj przepuszczamy płytki konserwacyjne hPSC o objętościach 50-150 μl, zwykle mamy do dyspozycji objętości 850-950 μl dla tego etapu. Zatem objętość hPSC na studzienkę w płytce 24-dołkowej wynosi około 150 μL/studzienkę.
      Po umieszczeniu nowo przygotowanej 24-dołkowej płytki w inkubatorze, delikatnie poruszaj płytką w przód iw tył (z północy na południe i ze wschodu na zachód), aby rozprowadzić komórki tak równomiernie, jak to możliwe na dnie studzienki.
    3. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zmieniaj pożywkę co drugi dzień z 500 μl pożywki z komórkami macierzystymi na studzienkę, aż konfluacja osiągnie 50-70%. Następnie płyta jest gotowa do rozpoczęcia indukcji DE.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby komórki nie osiągnęły >70% konfluencji przed indukcją DE, ponieważ wyższa konfluencja niekorzystnie wpływa na gęstość endodermy i morfogenezę jelita tylnego w kolejnych etapach. Idealnie, komórki osiągają około 50-70% konfluencji po 24-48 godzinach przy określonych proporcjach przejścia.
  2. Indukcja DE
    1. Dzień 1. Gdy hPSC osiągną 50-70% konfluencji, należy całkowicie odessać pożywkę komórek macierzystych z każdej studzienki i zastąpić 500 μl ciepłej pożywki DE dnia 1 (Tabela 1) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
    2. Dzień 2. Zassać DE dnia 1 i zastąpić 500 μl ciepłej pożywki dnia 2 DE (tabela 1) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
    3. Dzień 3. Odessać DE dnia 2 i zastąpić 500 μl ciepłej pożywki dnia 3 DE (tabela 1) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny.
  3. Formacja sferoidów środkowego jelita tylnego
    1. Dni 4-8. Całkowicie odessać pożywkę z każdej studzienki i zastąpić 500 μl ciepłej pożywki dla jelita środkowego (MHGM, tabela 1) na studzienkę. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Powtarzaj ten krok codziennie do dnia 8, kiedy to sferoidy środkowego jelita grubego są gotowe do pobrania i kohodowli (sekcja 4).

4. Współhodowla sferoidów środkowego odcinka jelita grubego z ENCC

UWAGA: Graficzne podsumowanie tej sekcji znajduje się w Rysunek 1.

  1. Przygotowanie zawiesiny ENCC
    1. Zebrać sferoidy ENCC z dnia 15-21 z kroku 2.4.4., ostrożnie wyjmując pożywkę ze studzienki, unikając zasysania sferoid przy użyciu metody wirowej opisanej w uwadze dotyczącej tego etapu.
    2. Dodać 1 ml ciepłego odczynnika enzymatycznego do oddzielania komórek do studzienki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    3. Postukać w bok płytki, aby kontynuować dysocjację sferoid i rozcierać za pomocą mikropipety P1000 z końcówką o szerokim otworze, delikatnie pipetując w górę i w dół, aby rozbić grudki komórek, aż mieszanina stanie się jednorodna.
    4. Przenieść zawiesinę ENCC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj studzienkę 1 ml ciepłej pożywki NCC (patrz Tabela 1), aby zebrać pozostałe komórki i dodać je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    5. Odwirować zawiesinę komórkową o masie 300 × g przez 1 minutę. Odessać supernatant za pomocą sterylnej końcówki pipety.
    6. Za pomocą końcówki do pipety z szeroką szyjką ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml ciepłego podłoża NCC. Obliczyć stężenie zawiesiny ENCC za pomocą hemacytometru lub licznika komórek.
  2. Połączenie zawieszenia ENCC ze sferoidami środkowego odcinka jelita tylnego
    1. Zebrać sferoidy środkowego jelita grubego ze wszystkich dołków płytki HIO za pomocą końcówki pipety z szeroką końcówką i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    2. Określ liczbę studzienek kokulturowych, które zostaną użyte w obrębie płytki 24-dołkowej. Staraj się umieścić na płytkach 10-30 sferoid środkowego odcinka jelita grubego i 50 000-100 000 ENCC na studzienkę dla kokultury.
      UWAGA: W praktyce często istnieje zależność jeden do jednego między liczbą studni ze zdrowymi sferoidami a ostateczną liczbą studzienek, które będą potrzebne do kokultury. Hemocytometr może być również wykorzystany do obliczenia stężenia zebranych sferoid środkowego odcinka jelita tylnego.
    3. Dodaj obliczoną objętość zawiesiny ENCC, aby dostarczyć 50 000-100 000 ENCC na planowaną studnię kokultury do stożkowej rurki ze sferoidami środkowego odcinka jelita tylnego. Delikatnie rozetrzeć końcówką pipety z szeroką końcówką, aby równomiernie wymieszać sferoidy środkowego jelita tylnego i ENCC.
    4. Odwirować przy 300 × g przez 1 minutę i ostrożnie zassać supernatant sterylną końcówką pipety. Używając końcówki pipety z szeroką formułą, ponownie zawiesić osad komórkowy w objętości zimnej, wolnej od fenolu (przezroczystej), o obniżonej wartości czynnika wzrostu, równej 30 μl na końcową studzienkę kokultury.
      UWAGA: Unikaj tworzenia się pęcherzyków w przezroczystej matrycy błony podstawnej podczas ponownego zawieszania, ponieważ są one trudne do usunięcia, utrudnią prawidłowe wchłanianie pożywki przez kokultury HIO+ENCC i ograniczą wizualizację kokultur HIO+ENCC w miarę ich wzrostu.
    5. Do środka każdej suchej studzienki odpipetować 30 μl kropli ponownie zawieszonych sferoid środkowego odcinka jelita grubego + ENCC w przezroczystej matrycy membrany podstawnej bez żadnych otaczających pożyw. Gdy wszystkie kropelki zostaną platerowane w dołkach, przykryj i odwróć płytkę. Inkubować odwróconą w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 min.
      UWAGA: Ten krok daje czas na odpadnięcie sferoid środkowego odcinka jelita grubego i ENCC od dna płytki i zawieszenie podczas polimeryzacji przezroczystej matrycy błony podstawnej 3D.
  3. Kokultura In Vitro HIO+ENS
    1. Dzień 0: Po polimeryzacji przezroczystej matrycy błony podstawnej przykryj każdą kroplę w 500 μl ciepłej pożywki HIO dnia 0-3 (patrz Tabela 1).
    2. Dzień 3: Ostrożnie zassać pożywkę HIO dnia 0-3 z boku studzienki, nie naruszając przezroczystej kropelki macierzy błony podstawnej. Zastąp pożywkę 500 μl ciepłym podłożem Day 3-14 HIO (patrz Tabela 1). Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze. Na tym etapie zmieniaj nośnik co 3-4 dni.
    3. Dni 7-14: W razie potrzeby kontynuuj wymianę pożywek HIO z dnia 3-14 i monitoruj wzrost.
  4. Dzielenie HIO
    1. Dzień 14: Zbadaj dokładnie każdą studzienkę pod mikroskopem i oceń, ile rozwijających się HIO + ENS znajduje się w każdej przezroczystej kropli matrycy błony podstawnej 3D.
    2. Przygotować probówki do mikrowirówek o pojemności 2 ml z 30 μl przezroczystej podstawnej matrycy membranowej i przechowywać je na lodzie.
    3. Pod okapem z przepływem laminarnym użyj drobnych kleszczyków, aby ostrożnie usunąć przezroczystą kroplę matrycy membrany podstawnej 3D za pomocą zawieszonego HIO+ENS. Delikatnie rozdzielić poszczególne HIO+ENS.
      UWAGA: Lupy chirurgiczne lub mikroskop preparacyjny mogą być bardzo pomocne na tym etapie, ale nie są absolutnie konieczne, ponieważ HIO są często bardzo widoczne gołym okiem.
    4. Umieść każdy izolowany HIO + ENS w jednej z przygotowanych probówek do mikrowirówek zawierających 30 μl przezroczystej matrycy membrany podstawnej, używając kleszczy lub końcówki do pipety z szeroką formułą.
      UWAGA: Stara, przezroczysta matryca membrany podstawnej 3D nie musi być na tym etapie upłynniana ani rozpuszczana. Jeśli to możliwe, unikaj zakłócania HIO, chociaż jeśli tak się stanie, może on nadal rosnąć w późniejszych etapach.
    5. Powtórz krok 4.2.5 dla podzielonego i ponownie pokrytego HIO+ENS. Po polimeryzacji przezroczystych kropelek błony podstawnej 3D dodaj 500 μl ciepłej, świeżej pożywki Day 3-14 HIO do każdej studzienki i inkubuj przez noc.
  5. Kontynuacja współpracy HIO+ENS
    1. Dzień 15: Ostrożnie zassać pożywkę HIO dnia 3-14 od strony studzienki. Wymień pożywkę na ciepłą pożywkę o pojemności 500 μl Day 15-28 HIO (patrz Tabela 1).
    2. Dzień 15-40: Kontynuuj wymianę pożywek HIO z dnia 15-28 w razie potrzeby co 3-4 dni i monitoruj wzrost HIO + ENCC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

ENS reguluje kluczowe funkcje dojrzałego jelita cienkiego, w tym perystaltykę, wchłanianie składników odżywczych, transport płynów oraz utrzymanie bariery nabłonkowej. Zatem celem unerwienia HIO jest wyposażenie tych konstruktów w elementy niezbędne do wykształcenia bardziej dojrzałych funkcji na wyższym poziomie. W tym celu nasze laboratorium bada specjalnie rozwój ENS w obrębie HIO, a także wyniki funkcjonalne na różnych etapach.

Ważne jest monitorowanie wzrostu, różnicowania i morfogenezy k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

HIO są używane jako system modelowy do rozwoju jelit człowieka od początku 2010 roku i od tego czasu stają się coraz bardziej złożone. Obecnie możliwe jest wyposażenie tych konstruktów w ENS, co daje nowe możliwości w badaniu prawidłowego rozwoju, które można zastosować do zrozumienia i lepszego leczenia wielu klinicznych jednostek żołądkowo-jelitowych.

Przeszczepienie in vivo
ENCC integrują się ze sferoidami środkowego odcinka jelita grubego i ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów, które mogliby ujawnić.

Podziękowania

Dziękujemy naszym licznym współpracownikom i mentorom, w tym Noah Shroyerowi, Michaelowi Helmrathowi, Jamesowi Wellsowi i Faranakowi Fattahi, którzy pozwolili nam odwiedzić swoje laboratoria i pomogli nam udoskonalić nasz protokół na przestrzeni lat. Chcielibyśmy również podziękować Chrisowi Mayhew i Amy Pitstick z Pluripotent Stem Cell Facility i Center for Stem Cell & Organoid Medicine (CuSTOM) w Cincinnati Children's Hospital Medical Center za zapewnienie naszemu laboratorium szkoleń, wskazówek i porad HIO. Badania te zostały sfinansowane przez Texas Medical Center Digestive Diseases Center Pilot/Feasibility grant grant (częściowo finansowany przez NIH/NIDDK P30DK056338) (Speer), NIDDK (NIH 1K08DK131326-01A1) (Speer), nagroda Men of Distinction (Speer) oraz Nagroda Przejściowa Amerykańskiego Towarzystwa Neurogastroenterologii i Motoryki (ANMS) (Speer).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x Roztwór aminokwasów endogennych (NEAA)ThermoFischer Scientific11140050
15 mL probówki stożkoweThermo Scientific12565269
AccutaseSTEMCELL Technologies07920"enzymatyczny odczynnik do odrywania komórek"
Suplement B-27 (50x), bez witaminy AThermoFischer Scientific12587010Dla ENCC
Suplement B-27 (50x), bez surowicyGibco17504044do
hemacytometru HIO Bright-LineHausser Scientific3120
Corning Costar Ultra-Low Attachment MicroplatesFisher Scientific07-200-601
Corning Flat-Bottom Plate 24-dołkowa, poddana obróbce TCVWR29442-044
Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 dołkówVWR29442-042
Essential 6 MediaThermo FischerA1516401
Essential 8 MediaThermo FischerA2858501Alternatywne podłoże z komórkami macierzystymi, stosowane do płytek ENCC. 
Kleszczyki z cienką końcówkąDumont11223-20
Forma Steri-Cycle i160Thermo Scientific50145522
Gibco Advanced DMEM/F12ThermoFischer Scientific12634-010
Gibco HEPES 1 MThermoFischer Scientific15630-080
Gibco Neurobasal MediumThermoFischer Scientific21103-049
Glutagro, 200 mM, 100xCorning25-015-CI
GlutamaxThermoFischer Scientific35050061
H9 ludzki ESCWicell Międzynarodowy Bank Komórek MacierzystychNie dotyczy
HyCloneTM FBS ZdefiniowanyVWR16777-002
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabGard NuaireNu-430-400
Matrigel GFR Podstawna membrana matrycowa, bez czerwieni fenolu, bez LDEVCorning356231"Przezroczysta matryca membrany podstawnej 3D"
Matrigel Matryca z kwalifikacją hESC, Corning bez LDEV354277"Matryca membrany podstawnej 3D"
MikropipetyEppendorf (100-1000, 20-200, 10-100, 2-20, 0,5-10, 0,1-2,5 uL)2231300008
mTeSR 1STEMCELL Technologies85850"Pożywka z komórkami macierzystymi"
Numer katalogowy obejmuje 5-krotny suplement, który należy dodać hurtowo z wyprzedzeniem.
Suplement N-2 (100x)Gibco17502048Dla suplementu HIO
N-2, CTS (systemy terapii komórkowej)Thermo FisherA1370701dla ENCC. Nieco inna formuła.
Mikroskop Nikon DS-Fi2 TS-100NikonTS100
Media kondycjonowane w nogginachCentrum Medyczne w Teksasie Centrum Chorób Trawiennych GEMS Rdzeń, podrdzeń enteroidowy/organoidowyNie dotyczy
penicyliny-streptomycyny (10 000 U/ml)ThermoFischer Scientific15140-122
Rekombinowaneludzkie systemy naprowadzania komórekGFH6-100
Rekombinowane ludzkie BMP-4Fisher Scientific314BP010
Rekombinowane ludzkie białko EGF, CFThermoFisher Scientific236-EG-200
Rekombinowane ludzkie białko FGF basic/FGF2 (146 aa)ThermoFischer Scientific233-FB-010
Rekombinowane ludzkie FGF-4Peprotech100-31
ReLeSRSTEMCELL Technologies5872"Odczynnik do dysocjacji komórek macierzystych"
Kwas retinowySIGMAR2625-50MG
Probówki do mikrofug bez rnazy, 2 mlThermo ScientificAM12425
RPMI 1640 MediumThermoFischer Scientific11875093
Pożywka kondycjonowana R-SpondinCentrum Medyczne w Teksasie Centrum Chorób Trawiennych GEMS Rdzeń, Enteroid/Organoid Sub-coreN/A
SB 431542, Tocris BioscienceFisher Scientific16-141-0
Wirówka Sorvall ST 16RThermo Scientific
Standard Końcówki do pipet z szerokim otworemVWR89049-166
Stemolecule Chir99021 w roztworzeStemgent04-0004-02
Sterylne końcówki do pipet z filtremVWR (1000uL, 200uL, 10uL)76322-154, 76322-150, 89174-520
Vitronectin XFStem Cell Technologies7180Alternatywna matryca membrany podstawnej 3D, stosowana do płyt ENCC. 
aktywiny A

Bibliografia

  1. Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. Short bowel syndrome: epidemiology and etiology. Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).
  2. Spencer, A. U., et al. Pediatric short bowel syndrome: redefining predictors of success. Ann Surg. 242 (3), discussion 409-412 403-409 (2005).
  3. Goulet, O., Pigneur, B., Charbit-Henrion, F. Congenital enteropathies involving defects in enterocyte structure or differentiation. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 56-57, 101784(2022).
  4. Koglmeier, J., Lindley, K. J. Congenital diarrhoeas and enteropathies. Nutrients. 16 (17), 2971(2024).
  5. Duggan, C. P., Jaksic, T. Pediatric intestinal failure. N Engl J Med. 377 (7), 666-675 (2017).
  6. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  7. McCracken, K. W., Howell, J. C., Wells, J. M., Spence, J. R. Generating human intestinal tissue from pluripotent stem cells in vitro. Nat Protoc. 6 (12), 1920-1928 (2011).
  8. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).
  9. Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23 (1), 49-59 (2017).
  10. Schlieve, C. R., et al. Neural crest cell implantation restores enteric nervous system function and alters the gastrointestinal transcriptome in human tissue-engineered small intestine. Stem Cell Rep. 9 (3), 883-896 (2017).
  11. Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
  12. Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
  13. Finkbeiner, S. R., et al. Transcriptome-wide analysis reveals hallmarks of human intestine development and maturation in vitro and in vivo. Stem Cell Rep. 4 (6), 1140-1155 (2015).
  14. Boyle, M. A., et al. In vivo transplantation of human intestinal organoids enhances select tight junction gene expression. J Surg Res. 259, 500-508 (2021).
  15. Finkbeiner, S. R., et al. Generation of tissue-engineered small intestine using embryonic stem cell-derived human intestinal organoids. Biol Open. 4 (11), 1462-1472 (2015).
  16. Mahe, M. M., Brown, N. E., Poling, H. M., Helmrath, M. A. In vivo model of small intestine. Methods Mol Biol. 1597, 229-245 (2017).
  17. McNeill, E. P., Gupta, V. S., Sequeira, D. J., Shroyer, N. F., Speer, A. L. Evaluation of murine host sex as a biological variable in transplanted human intestinal organoid development. Dig Dis Sci. 67 (12), 5511-5521 (2022).
  18. Singh, A., et al. Evaluation of transplantation sites for human intestinal organoids. PLoS One. 15 (8), e0237885(2020).
  19. Watson, C. L., et al. An in vivo model of human small intestine using pluripotent stem cells. Nat Med. 20 (11), 1310-1314 (2014).
  20. Cortez, A. R., et al. Transplantation of human intestinal organoids into the mouse mesentery: A more physiologic and anatomic engraftment site. Surgery. 164 (4), 643-650 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

jelitowy uk ad nerwowyunerwienie organoid wjelitowa grzebie neuralnapluripotencjalne kom rki macierzysteobrazowanie 3Dmacierz b ony podstawnejkokultura sferoid wmarkery neuronalnemarkery glejowe
unerwienie ludzkich organoidów jelitowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.