Kwantyfikacja zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster w celu oceny nadmiernych fenotypów pielęgnacyjnych

Summary

Metoda przedstawiona tutaj polega na ręcznym dodawaniu adnotacji do materiału filmowego pozyskanego z Drosophila melanogaster pod kątem określonych zachowań pielęgnacyjnych. Pozwala to na ilościowe określenie zarówno liczby napadów pielęgnacji, jak i całkowitego czasu spędzonego na pielęgnacji w celu oceny nietypowych fenotypów samodzielnej pielęgnacji.

Abstract

Obserwowalne zmiany w stereotypowym uwodzeniu są stosowane translacyjnie w organizmach modelowych. Zmiany te są reprezentatywne dla patologii, które wywołują podobne odchylenia w ludzkim zachowaniu; na przykład nadmierna pielęgnacja działa jako wskaźnik obsesyjnych i kompulsywnych zachowań obecnych w stanach takich jak zespół Tourette'a lub zaburzenie obsesyjno-kompulsywne. Przedstawiony test pielęgnacji pozwala na ocenę nieprawidłowych fenotypów samopielęgnacji u Drosophila melanogaster. Muchy są rejestrowane przez okres 10 minut, a nagrania te są obserwowane i opisywane na ślepo pod kątem wcześniej zdefiniowanych zachowań pielęgnacyjnych. Miary ilościowe zarówno częstotliwości zabiegów pielęgnacyjnych, jak i czasu spędzonego na samodzielnej pielęgnacji można uzyskać, ręcznie dodając adnotacje do materiału filmowego. Test jest stosunkowo niedrogi, wymaga niewielu materiałów, które nie są jeszcze dostępne w środowiskach laboratoryjnych, i można go łatwo dostosować do specyficznych potrzeb danego badania mającego na celu obserwację pielęgnacji. Ponadto niski poziom umiejętności potrzebnych do przeprowadzenia testu, w porównaniu z metodami zautomatyzowanymi opartymi na informatyce, sprawia, że protokół dobrze nadaje się dla małych laboratoriów i studentów. Szczegółowo omawiamy kroki wymagane do wykonania tego testu i jego obecne ograniczenia.

Introduction

Drosophila melanogaster jest dobrze znanym organizmem modelowym w badaniach behawioralnych i neurobiologicznych, dostarczającym wglądu w mechanizmy napędzające analogiczne zachowania ludzkie. Samopielęgnacja w tym organizmie jest wysoce regulowanym i dobrze zdefiniowanym zachowaniem, podążającym za stereotypowymi wzorcami, które łatwo od siebie odróżnić¹. Poszczególne zachowania pielęgnacyjne wykazywane przez muchę można ogólnie sklasyfikować według regionu anatomicznego², najłatwiej zdefiniować jako tylny lub przedni. Pielęgnacja Drosophila początkowo skupi się na odcinku przednim, a następnie przejdzie do końca tylnego³. W typowych warunkach muchy wykazują zachowania pielęgnacyjne w celu utrzymania czystości (np. poprzez usuwanie kurzu) i występują w odpowiedzi na ekspozycję na potencjalnie szkodliwe bodźce zewnętrzne, takie jak drobnoustroje chorobotwórcze⁴.

Nieprawidłowości w zachowaniu uwodzenia, szczególnie spontaniczne obsesyjne uwodzenie, były używane w różnych systemach modelowych jako wskaźnik obsesyjnego i/lub kompulsywnego zachowania. Wyniki badań translacyjnych obserwujących obsesyjne zachowania pielęgnacyjne u organizmów takich jak gryzonie, ptaki i psy dały wgląd w warunki wywołujące podobne kompulsywne zachowania u ludzi⁵. Należą do nich stany takie jak trichotillomania, zaburzenie obsesyjno-kompulsywne i zespół Tourette'a⁶. Nadmierne zachowania związane z pielęgnacją zostały również wykorzystane jako punkt odniesienia w ocenie fenotypów behawioralnych w modelach podobnych warunków neurorozwojowych u Drosophila melanogaster. Obsesyjne zachowania pielęgnacyjne zaobserwowano w modelach muchowych zespołu kruchego chromosomu X (FSX) i związanego z nim zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD). Nadmierna spontaniczna pielęgnacja występuje w przypadku mutacji dfmr1, ortologa genu związanego z ASD i FSX FMR1⁷. Istnieje również zauważalna zmiana w rozkładzie pielęgnacji między tylnymi i przednimi końcami u tych mutantów⁸. Zmiany te są interpretowane jako odzwierciedlenie obsesyjnych i kompulsywnych zachowań skoncentrowanych na ciele wykazywanych przez niektórych pacjentów z tymi schorzeniami. Korzystając z opisanego tutaj testu uwodzenia, zaobserwowaliśmy zachowania pielęgnacyjne u much po powaleniu za pośrednictwem RNAi genu Drosophila Atg8a wytwarzanego przez komercyjnie dostępne sterowniki GAL4 i linie UAS-RNAi⁹ .

Ta metoda polega na ręcznym dodawaniu adnotacji do nagrań z muchami pod kątem określonych zachowań związanych z pielęgnacją. Wcześniejsze badania mające na celu ocenę zachowań związanych z uwodzeniem, takie jak te wykorzystujące metody pośrednie, takie jak barwniki, chociaż skuteczne w ilościowym określaniu skuteczności pielęgnacji, nie pozwalają na pomiar czasu trwania lub częstotliwości pielęgnacji¹⁰. Test ten pozwala jednak na ilościowe określenie częstotliwości i czasu trwania pielęgnacji Drosophila, zarówno ogólnie, jak i według regionu anatomicznego. Opisana tutaj metoda ma pewne zalety w porównaniu z obecnymi metodami automatycznymi, ponieważ można ją łatwo modyfikować i może być przeprowadzana przez osoby bez zaplecza obliczeniowego. Dysponując sprzętem łatwo dostępnym w większości laboratoriów, przedstawiamy opłacalny sposób oceny obecności nadmiernego fenotypu samooczyszczania (patrz Tabela Materiałów). To sprawia, że metoda jest łatwo dostępna głównie dla instytucji licencjackich i można ją łatwo dostosować do środowisk szkoleniowych lub laboratoriów dydaktycznych.

Protocol

UWAGA: Przegląd protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1.

1. Przygotowanie do filmowania

1. Umieść cztery trzydołkowe naczynia obok siebie na białej powierzchni, przykrywając każdą szklanym szkiełkiem.
2. Umieść kamerę (w tym przypadku system Raspberry Pi, ale wystarczy dowolna kamera zdolna do nagrywania wideo w wysokiej rozdzielczości) nad naczyniami.
   1. Sprawdź, czy wszystkie naczynia są w kadrze i są ostre.
   2. Sprawdź, czy na szkiełkach nie ma odblasków, które ograniczą widoczność much w naczyniu. Wyeliminuj odblaski, dostosowując położenie płyty lub przyciemniając światła w przestrzeni nagrywania.
   3. Użyj wysokiej rozdzielczości (minimum 1920 x 1080 pikseli), aby dokładnie zobrazować kończyny muchy.
3. Zaznacz położenie naczyń i kamery na stole, na którym odbywa się nagrywanie.
   UWAGA: Ograniczy to czas spędzony na kroku 2 w przyszłym korzystaniu z urządzenia. Wykonywanie testów w tym samym czasie i w tej samej przestrzeni ograniczy zmienność zachowania w oparciu o czynniki wykraczające poza zamierzone manipulacje.
4. Lekko znieczul 4-9 dniowe muchy zimnem na bloku lodu pokrytym parafilmem i ręcznikiem papierowym (znieczulenie CO₂ będzie miało znaczący wpływ na zachowanie).
   1. Przyłóż muchy do bloku, a po znieczuleniu przenieś muchy do komór obserwacyjnych tak szybko, jak to możliwe, za pomocą pędzla.
      UWAGA: Ten transfer powinien nastąpić tak szybko, jak to możliwe, ponieważ nadmierna ekspozycja na znieczulenie jakiegokolwiek rodzaju może negatywnie wpłynąć na muchy.
5. Umieść pojedynczą muchę w każdym dołku.
6. Pozwól plikom zaaklimatyzować się w nowym środowisku przez 30 minut po znieczuleniu. Po tym momencie nie dotykaj ani nie przeszkadzaj studniom zawierającym muchy, ponieważ dodatkowe czynniki stresogenne wpłyną na zachowanie.

2. Nagrywanie much

1. Po 30-minutowej aklimatyzacji nagraj muchy za pomocą kamery.
2. Użyj kamery Raspberry Pi przepuszczonej przez PiSpy¹¹ do zbierania danych behawioralnych.
   UWAGA: Oprogramowanie jest bezpłatne i dostępne na GitHub (https://github.com/gpask/PiSpy), a system Pi można łatwo skonfigurować za mniej niż 300 USD. Inne kamery, jeśli są już dostępne, również wystarczą do nagrywania materiału
3. Rozpocznij nagrywanie za pomocą liczby Pi za pomocą następującego przepływu poleceń.
   1. Otwórz terminal i wpisz cd PiSpy. Następnie wpisz python3 PiSpy.py, wprowadź żądaną długość nagrania i wprowadź żądaną liczbę klatek na sekundę. Wybierz żądaną rozdzielczość i kliknij przycisk Szybkie przechwytywanie.
   2. Użyj funkcji podglądu kamery, aby upewnić się, że muchy są ostre i wystarczająco widoczne.
4. Nagrywaj muchy przez 10 minut z zalecaną liczbą klatek na sekundę 24 kl./s i zapisz plik (PiSpy automatycznie zapisuje w folderze wideo).

3. Analiza wideo (Rysunek 2)

1. Aby przeanalizować wideo, zaimportuj plik do oprogramowania Elan 6.8¹².
   UWAGA: To oprogramowanie, choć pierwotnie opracowane dla łoju psycholingwistycznego do szczegółowego opisywania filmów i dogłębnej analizy zachowań związanych z uwodzeniem
2. Przypisz każdy wiersz, jak pokazano poniżej, aby ręcznie dodać adnotacje do materiału filmowego poszczególnych osób.
   1. Zrób to za pomocą następującego przepływu poleceń: Poziom > Dodaj nowy poziom > Wpisz lokalizację w naczyniu na Nazwa poziomu > Dodaj.
3. W zależności od potrzeb badania, zanotuj i określ ilościowo różne specyficzne zachowania (pielęgnacja z przodu i z tyłu, chodzenie, spanie i stanie).
   1. Twórz adnotacje, wykonując poniższe czynności.
      1. Kliknij dwukrotnie warstwę, do której chcesz dodać adnotację. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przeciągnij kursor wzdłuż wybranego poziomu przez okres, w którym wyświetlany jest pojedynczy atak pielęgnacyjny. Kliknij lewym przyciskiem myszy, wybierz opcję Nowa adnotacja i kliknij dwukrotnie nowo podświetlony okres. Wpisz skrót zachowania wyświetlanego w tym punkcie czasu.
   2. Obserwuj filmy powoli, przewijaj je myszą i dodawaj adnotacje. Powiększ pojedynczy obszar lotu podczas adnotacji, aby zapobiec fałszywej identyfikacji zachowań. Mogą one obejmować stukanie w krawędź szklanki przez rozporek lub przesuwanie nóg, co początkowo może wyglądać jak pielęgnacja.
4. Gdy film zostanie całkowicie opisany, uzyskaj zestawienie każdego zachowania. Upewnij się, że w filmach jest używany ten sam skrót lub adnotacja, aby korzystać z tej funkcji.
   UWAGA: Elan 6.8 poda liczbę wystąpień danego zachowania, całkowity czas trwania zachowań oraz średni czas spędzony na każdym zachowaniu.
   1. Zdefiniuj napady pielęgnacyjne jako 2 sekundy nieprzerwanej pielęgnacji. Zidentyfikuj każde zaobserwowane zachowanie w następujący sposób. Zdefiniuj parametry dla obszarów anatomicznych przed przeprowadzeniem testu.
      1. Pielęgnacja przednia: Zidentyfikuj pielęgnację wykonywaną w przedniej części ciała muchy jako pielęgnację przednią.
         UWAGA: To zachowanie prawie zawsze będzie obejmowało ruch pocierania przedniej części, takiej jak głowa lub trąba, przednimi dwiema nogami muchy.
      2. Pielęgnacja tylna: Zidentyfikuj pielęgnację wykonywaną na przednim i tylnym końcu ciała muchy jako pielęgnację tylną.
         UWAGA: Dodatkowo dla uproszczenia skrzydła zostały włączone do tylnej części. To zachowanie prawie zawsze będzie obejmowało ruch pocierania centralnym i najbardziej tylnym zestawem nóg w locie. Dobrym wskaźnikiem, że ma miejsce pielęgnacja tylna, będzie to, że na pierwszy rzut oka mucha może wyglądać tak, jakby brakowało jej najbardziej tylnych nóg, jak pokazano na Rysunek 2D.

Results

Ten test generuje dane ilościowe mierzące czas i częstotliwość zachowań związanych z uwodzeniem na podstawie opisanego materiału filmowego. Reprezentatywny obraz konfiguracji i sposobu definiowania zachowań jest przedstawiony w Rysunek 2. Biorąc pod uwagę subiektywizm wprowadzany przez analizę wideo, wszystkie adnotacje do filmów powinny być zaślepione dla badacza przeprowadzającego analizę.

Ta metoda została użyta do oceny roli, jaką gen Drosophila A...

Discussion

Ogólnie rzecz biorąc, ten łatwy do wykonania i opłacalny test pozwala na solidną charakterystykę zachowań pielęgnacyjnych Drosophila melanogaster . Technika ta daje wgląd w częstotliwość, czas spędzony na angażowaniu się i anatomiczny rozkład dużej liczby wcześniej zidentyfikowanych zachowań pielęgnacyjnych. Dobrym wskaźnikiem, że pielęgnacja będzie miała miejsce lub jest w toku, są zmiany w ułożeniu nóg, w szczególności podniesienie dowolnej z 6 nóg. Zwrócenie uwagi na zachowania po ruchu nóg może pomóc w ident...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Karta Micro SD 16 GB	Adafruit	1294	Do użycia przy wprowadzaniu wyświetlacza systemu operacyjnego
	Adafruit	3578	Wystarczy dowolny wyświetlacz, który można podłączyć za pomocą HDMI lub elastycznego
Linia Drosophila Atg8a-RNAi UAS	Bloomington Stock Center	34340	Linia używana w danych reprezentatywnych
Sterownik Drosophila Ok6	Nie dotyczy		Linia używana w reprezentatywnych danych
Szkiełka szklane	Fisher Scientific	12-550-A3	Utrzymuje muchy w osłonie
Radiatory	Adafruit		Zapobiega przegrzaniu komputera
Obiektyw	Adafruit	4563	Używany tylko z kamerą HD
PiCamera	Adafruit	4561	Zastosowano tutaj wersję HD, ale w ramach ograniczeń budżetowych można użyć standardowej kamery
Raspberry pi 4	Adafruit	4292	Computer PiSpy jest uruchomiony na
Ribbion	Adafruit	1648	Do użycia w podłączaniu komponentów SB kamery i wyświetlacza
Etui	Adafruit	4301	Chroni komputer
Płyta punktowa	Fisher Scientific	S99406	Wersje Pyrex były już dostępne do naszego użytku, ale wystarczą również naczynia do hodowli komórkowych lub plastikowe płytki punktowe
Statyw	Best Buy	6355959	Do zawieszenia i ustawienia kamery wystarczy dowolne urządzenie zdolne do tego
Zasilacz USB C	Adafruit	1995	Dostarcza zasilanie do komputera