Artykuł metodologiczny

Oznaczanie czterech składników w systemie dostarczania nanocząstek lipidowych RNA za pomocą chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego

DOI:

10.3791/67711

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  ,  , 
1Shimadzu (China) Co., Ltd., 2Medical College of Fudan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj ustalamy metodę analizy ilościowej dla czterech składników systemu dostarczania RNA nanocząsteczek lipidowych (LNP) za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej połączonej z detektorem rozpraszania światła wyparnego (ELSD). Metoda charakteryzuje się dobrą separacją, wysoką czułością i wysoką wydajnością.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia metodę analizy składników nanocząstek lipidowych (LNP). LNP, służący jako kluczowy wektor dla leków opartych na RNA, składa się głównie z cholesterolu, PEG z modyfikacjami, lipidów jonizowalnych i lipidów pomocniczych. Składniki te wykazują słabą polarność, co prowadzi do silnej retencji i trudności w separacji przy użyciu chromatografii z odwróconymi fazami, a także brak wyraźnych właściwości absorpcji ultrafioletu. Aby sprostać temu wyzwaniu, system chromatografii cieczowej został sprzężony z detektorem rozpraszania światła wyparnego (ELSD). Dzięki systematycznemu dostosowywaniu typu kolumny chromatograficznej i optymalizacji programu elucji gradientowej fazy ruchomej, uzyskano szybką i całkowitą separację czterech krytycznych składników od linii podstawowej. Wykorzystanie najnowszej technologii ELSD znacznie zwiększyło czułość wykrywania i rozszerzyło zakres liniowy metody. Wyniki eksperymentalne wykazały, że w zakresie stężeń od 5 μg/ml do 250 μg/ml cztery składniki LNP wykazywały doskonałą liniowość ze współczynnikami korelacji większymi niż 0,999, a dokładność wahała się od 94,2% do 108,0%. W eksperymentach precyzyjnych względne odchylenia standardowe zarówno czasu retencji, jak i powierzchni piku dla roztworu wzorcowego 10 μg/ml wynosiły odpowiednio poniżej 0,1% i 2%. W przypadku stosowania tej metody do analizy różnych próbek LNP wszystkie składniki są z powodzeniem rozdzielane, a ich odpowiednia zawartość jest dokładnie określana ilościowo, co podkreśla solidną zdolność adaptacyjną tego podejścia analitycznego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanocząstka lipidowa (LNP) jest jednym z najbardziej zaawansowanych systemów dostarczania genów niewirusowych, głównie używanym do dostarczania leków kwasów nukleinowych, takich jak oligonukleotydy antysensowne, małe nukleotydy zakłócające, mRNA itp1,2,3. LNP składa się zazwyczaj z czterech składników: lipidów jonizowalnych, lipidów modyfikowanych glikolem polietylenowym (PEG), fosfolipidów i cholesterolu. Kluczowym składnikiem są jonizowalne lipidy, które są decydującym czynnikiem wpływającym na skuteczność dostarczania leków z kwasami nukleinowymi. Pozostałe trzy składniki mogą zwiększać stabilność LNP i zmniejszać rozpoznawanie układu odpornościowego4,5,6.

Różne proporcje czterech składników w LNP mogą znacząco wpłynąć na proces samoorganizacji nanocząstek, wpływając na właściwości takie jak skuteczność kapsułkowania aktywnego składnika farmaceutycznego (API), jego skuteczność dostarczania i szybkość uwalniania in vivo7,8,9. Dlatego konieczne jest ustalenie metody analizy ilościowej dla komponentów LNP, ułatwiając w ten sposób syntezę optymalnego systemu dostarczania LNP10,11.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest współczesną techniką analityczną szeroko stosowaną w analizie farmaceutycznej i jest ceniona ze względu na wysoką wydajność, czułość i możliwości automatyzacji. HPLC obejmuje między innymi różne detektory, w tym konwencjonalne detektory ultrafioletu (UV), a także detektory ogólnego przeznaczenia, takie jak detektory indeksu refrakcji (RID), detektory rozpraszania światła parnego (ELSD), detektory naładowanego aerozolu (CAD) i wysoce selektywne detektory częstotliwości radiowej (RF), między innymi12.

W przypadku analizy czterech składników LNP, które nie mają odrębnych grup absorbujących promieniowanie UV, a tym samym nie dają odpowiedzi w detektorach UV, rozważano użycie detektorów ogólnego przeznaczenia. Chociaż RID jest jedną z takich opcji, nie nadaje się do analizy gradientowej i oferuje stosunkowo niższą czułość w porównaniu z pozostałymi dwoma detektorami ogólnego przeznaczenia; W związku z tym nie został wybrany12. Co więcej, chociaż detektory CAD mogą pochwalić się wysoką czułością, ich zaporowy koszt sprawia, że są mniej atrakcyjne12.

W związku z tym, detektor ELSD został wybrany. Detektor ten posiada charakterystyczną opcję trybu wzmocnienia - tryb "szeroki" - który umożliwia jednoczesną analizę zarówno składników o wysokim stężeniu, jak i śladowych, zwiększając czułość i rozszerzając zakres liniowy.

Ten artykuł wykorzystuje system HPLC sprzężony z ELSD, osiągając efektywną separację i analizę ilościową czterech składników LNP poprzez optymalizację kolumn chromatograficznych, gradientową elucję faz ruchomych i inne warunki13.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie instrumentu

  1. Konfiguracja instrumentu
    1. Skonfiguruj system HPLC sprzężony z ELSD.
  2. Instalacja kolumny
    1. Zamontuj kolumnę chromatograficzną (C4-300; 150 mm × 4,6 mm średnicy wewnętrznej, 5 μm), zgodnie z kierunkiem strzałki na kolumnie, z jednym końcem podłączonym do wylotu automatycznego podajnika próbek, a drugim z wlotem ELSD.
  3. Przygotowanie fazy ruchomej
    1. Przygotować fazy ruchome: fazę A, 10 mM wodnego roztworu TEAA (pH = 7,0) i fazę B, 10 mM roztworu metanolu TEAA (pH = 7,0).
    2. Aby przygotować fazę A, dokładnie odważ 1,01 g trietyloaminy, rozpuść ją w 1000 ml wody, dobrze wymieszaj i dostosuj pH do 7,0 kwasem octowym.
    3. Aby przygotować fazę B, rozpuść 1,01 g trietyloaminy w 1000 ml metanolu, wymieszaj i dostosuj pH do 7,0 kwasem octowym.
  4. Edycja metody
    1. Włącz przełączniki zasilania dla każdego modułu LC-ELSD i uruchom oprogramowanie LabSolutions. Następnie otwórz okno Analiza w czasie rzeczywistym.
    2. Kliknij Plik i wybierz Nowy, aby utworzyć nowy plik metody. Zmodyfikuj czas zatrzymania LC w metodzie na 15 i kliknij przycisk Zastosuj do wszystkich czasów akwizycji.
    3. Następnie kliknij Pompa, aby zmodyfikować parametry pompy. Wybierz tryb analizy jako binarny gradient wysokiego ciśnienia (B.GE) i ustaw natężenie przepływu na 1,0 ml/min.
    4. Następnie ustaw początkowe stężenie pompy B (%B) na 80% i zmodyfikuj gradient fazy ruchomej: po 3 minutach %B wynosi 80%, po 4 minutach %B wynosi 85% od 5,5 min do 12 min, %B wynosi 100%, po 12,1 min, %B wraca do 80%.
    5. Następnie kliknij Piekarnik kolumnowy i ustaw temperaturę piekarnika na 55 °C. Na koniec kliknij ELSD, aby zmienić temperaturę rurki dryfującej na 40 °C. Zapisz metodę.
      UWAGA: Podsumowanie parametrów przedstawiono w tabeli 1.
  5. Uruchom i zrównoważ instrument.
    1. Kliknij Pobierz i uruchom, aby uruchomić i zrównoważyć instrument.

2. Przygotowanie roztworów wzorcowych i próbek

  1. Przygotowanie roztworów wzorcowych
    1. Dokładnie odważyć 10,0 mg czterech substancji wzorcowych składnika LNP oddzielnie, rozpuścić w 1 ml metanolu i wirować aż do całkowitego rozpuszczenia, aby uzyskać roztwory podstawowe o stężeniu 10 mg/ml dla każdego składnika.
    2. Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 μl każdego z czterech roztworów podstawowych do fiolki z próbką, a następnie dodać 600 μl metanolu. Dokładnie wymieszać, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni 1 o stężeniu 1000 μg/ml.
    3. Dokładnie przenieść 20 μl każdego z czterech roztworów podstawowych do fiolki z próbką, a następnie dodać 920 μl metanolu. Dokładnie wymieszać, aby przygotować zmieszany roztwór pośredni 2 o stężeniu 200 μg/ml.
    4. Następnie należy przygotować serię roztworów wzorcowych o stężeniach 5 μg/ml, 10 μg/ml, 20 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/mL, 200 μg/ml i 250 μg/ml przez seryjne rozcieńczanie zgodnie z tabelą 2.
  2. Przygotowanie próbek
    1. Za pomocą pipety dokładnie przenieść 100 μl próbki do fiolki z próbką, a następnie dodać 900 μl metanolu i dobrze wymieszać. W tym momencie należy upewnić się, że stężenie LNP w próbce jest rozcieńczone 10-krotnie, a LNP jest dysocjowany od leku kwasu nukleinowego.

3. Akwizycja danych

  1. Umieścić roztwory wzorcowe i roztwory próbek w automatycznym podajniku próbek chromatografu cieczowego.
  2. Kliknij Realtime Batch na pasku narzędzi asystenta w oknie Analiza w czasie rzeczywistym. Następnie kliknij przycisk Nowy w menu Plik, aby utworzyć nową tabelę wsadową.
  3. W tabeli partii wprowadź fiolkę#, nazwę tacy, plik danych oraz objętość iniekcji roztworu wzorcowego i próbki, a następnie wybierz plik metody zapisany w kroku 1.4. Kliknij Zapisz plik wsadowy w menu Plik, aby zapisać plik wsadowy.
  4. Poczekaj, aż ciśnienie chromatografu cieczowego i linia bazowa chromatogramu ustabilizują się. Następnie kliknij Rozpocznij partię w czasie rzeczywistym na pasku narzędzi asystenta, aby rozpocząć pobieranie danych.

4. Analiza danych

  1. Ustalanie krzywych kalibracyjnych
    1. Otwórz okno przeglądarki oprogramowania LabSolutions i przeciągnij dane roztworu wzorcowego do widoku wyników ilościowych, aby ustalić krzywą kalibracyjną. Następnie zmodyfikuj parametry przetwarzania danych. Kliknij Edytuj w widoku metody.
    2. W oknie Parametry integracji zmień wartość nachylenia na 10000. Następnie w Parametrach identyfikacji zmień metodę identyfikacji na Band i ustaw Domyślną przepustowość na 0,1 min.
    3. Następnie zmodyfikuj parametry ilościowe. Zmień metodę ilościową na Wzorzec zewnętrzny i ustaw # poziomu kalibracji na 7. Wybierz typ krzywej kalibracyjnej jako Wykładniczo. Następnie zmodyfikuj złożenie.
    4. Wprowadzić nazwy i stężenia roztworu wzorcowego czterech składników LNP. Kliknij dwukrotnie wierzchołek szczytu, aby zaktualizować czasy przechowywania. Na koniec kliknij Widok, aby zakończyć modyfikację parametrów przetwarzania danych.
    5. Zmodyfikuj typ próbki w widoku Wyniki ilościowe na Standardowy (punkt obliczeniowy). W zależności od stężeń ustaw poziomy roztworu wzorcowego od 1-7. Po ustaleniu krzywych kalibracyjnych kliknij Plik na pasku menu i zapisz plik metody.
  2. Analiza ilościowa próbek
    1. Przeciągnij dane próbek do widoku wyników ilościowych w oknie przeglądarki, w którym zostaną wyświetlone wyniki stężeń czterech składników LNP w próbkach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza roztworu wzorcowego LNP przy użyciu tej metody osiągnęła stopień separacji większy niż 1,5 dla czterech składników, realizując separację bazową. Ponadto nie zaobserwowano żadnych pozostałości w roztworach wzorcowych o wysokim stężeniu, jak pokazano na rysunku Rysunek 1. Krzywą kalibracyjną ustalono w zakresie stężeń od 5 do 250 μg/ml, wykazując współczynniki korelacji przekraczające 0,999, co wskazuje na szeroki zakres liniowy i doskonałą liniowość. Krzywa kalibracyjna jest zilustrow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie cztery składniki LNP wykazują stosunkowo słabą polaryzację. Podczas analizy przy użyciu kolumny C18 związki docelowe wykazują silną retencję w kolumnie, co prowadzi do poszerzenia piku fosfolipidów dla silnie zatrzymanych składników. Ponadto, po przeanalizowaniu roztworów o wysokim stężeniu, na szczycie kolumny C18 gromadzą się pozostałości, co może zagrozić dokładności oznaczania ilościowego. Chromatogram przedstawiono na rysunku 5.

Aby zoptymalizować m...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękuję firmom biofarmaceutycznym za dostarczenie próbek LNP do eksperymentu i dziękujemy firmie Shimadzu (Shanghai) Global Laboratory Consumables Co., Ltd za dostarczenie kolumny chromatograficznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kwas octowyANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc.CAEQ-4-000319-0050
BalanceShimadzu (Szanghaj) Global Laboratory Consumables Co., LtdAP135W
KolumnaShimadzu (Szanghaj) Global Laboratory Consumables Co., LtdShimNex WP C4(380-01235-74)
ELSDShimadzu (China) CO., LTDELSD-LT III(228-65900-46)
LabSolutions SoftwareShimadzu (Chiny) CO., LTD
LCShimadzu (Chiny) CO., LTDLC40D XR
MetanolANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc.CAEQ-4-003302-4000
Pipeta-100 i mikro; LShimadzu (Szanghaj) Globalne laboratoryjne materiały eksploatacyjne Co., Ltd00-NAR-100
Pipeta-1000 i mikro; LShimadzu (Szanghaj) Globalne Laboratoryjne materiały eksploatacyjne Co., Ltd00-NAR-1000
TEAANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc.CAEQ-4-012190-0250
System wody ultraczystejMillipore
ANPELLaboratory Technologies (Shanghai) Inc.Maszyna VM-B
Mieszalnik wirowy ZIQ7000T0C

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zong, Y., Lin, Y., Wei, T., Cheng, Q. Lipid nanoparticle (LNP) enables mRNA delivery for cancer therapy. Adv Mater. 35 (51), e2303261(2023).
  2. Vlatko, I., et al. Non-immunotherapy application of LNP-mRNA: Maximizing efficacy and safety. Biomedicines. 9 (5), 530(2021).
  3. Eygeris, Y., et al. Chemistry of lipid nanoparticles for RNA delivery. Acc Chem Res. 55 (1), 2-12 (2021).
  4. Sun, D., Lu, Z. R. Structure and function of cationic and ionizable lipids for nucleic acid delivery. Pharm Res. 40 (1), 27-46 (2023).
  5. Rebecca, L., et al. Lipid nanoparticle formulations for enhanced co-delivery of siRNA and mRNA. Nano Lett. 18 (6), 3814-3822 (2018).
  6. Maugeri, M., Nawaz, M., Papadimitriou, A. Linkage between endosomal escape of LNP-mRNA and loading into EVs for transport to other cells. Nat Commun. 10, 4333(2019).
  7. Renee, C., et al. The effects of PEGylation on LNP based mRNA delivery to the eye. PLoS One. 15 (10), e0241006(2020).
  8. Benedicto, E., et al. Optimization of phospholipid chemistry for improved lipid nanoparticle (LNP) delivery of messenger RNA (mRNA). Biomater Sci. 10 (2), 549-559 (2022).
  9. Kamanzi, A., et al. Quantitative visualization of lipid nanoparticle fusion as a function of formulation and process parameters. ACS Nano. 18 (28), 18191-18201 (2024).
  10. Melissa, P., et al. Optimization of lipid nanoparticles for the delivery of nebulized therapeutic mRNA to the lungs. Nat Biomed Eng. 5 (9), 1059-1068 (2021).
  11. Packer, M., et al. A novel mechanism for the loss of mRNA activity in lipid nanoparticle delivery systems. Nat Commun. 12 (1), 6777(2021).
  12. Snyder, L. R., Kirkland, J. J., Dolan, J. W. Introduction to Modern Liquid Chromatography. , John Wiley & Sons. Hoboken, NJ. (2010).
  13. Zhang, L. Z., et al. Effect of mRNA-LNP components of two globally marketed COVID-19 vaccines on efficacy and stability. NPJ Vaccines. 8 (1), 156(2023).
  14. Zhang, Y., Wang, X. Performance comparison of different ELSD detectors in pharmaceutical analysis. Anal Methods. 7 (12), 4800-4807 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanocz stki lipidoweanaliza sk adnik w LNPelucja gradientowarozdzia do linii bazowejwysokosprawna chromatografia cieczowakrzywa kalibracyjnametoda standardu zewn trznego

Powiązane artykuły