Artykuł metodologiczny

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

DOI:

10.3791/67715

⸱

31 stycznia 2025

 ,  ,  , 
1School of Earth, Environmental and Marine Sciences, University of Texas - Rio Grande Valley

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół wykrywa kluczowe geny obiegu metanu na mokradłach przybrzeżnych południowego Teksasu i wizualizuje ich rozmieszczenie przestrzenne, aby lepiej zrozumieć regulację metanu i jego wpływ na środowisko w tych dynamicznych ekosystemach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przybrzeżne mokradła są największym źródłem biotycznym metanu, gdzie metanogeny przekształcają materię organiczną w metan, a metanotrofy utleniają metan, odgrywając tym samym kluczową rolę w regulacji cyklu metanowego. Tereny podmokłe w południowym Teksasie, które są narażone na częste zjawiska pogodowe, wahania poziomu zasolenia i działalność antropogeniczną spowodowaną zmianami klimatu, wpływają na obieg metanu. Pomimo ekologicznego znaczenia tych procesów, obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu pozostaje niewystarczająco zbadany. Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy i zoptymalizowaliśmy metodę wykrywania genów związanych z metanogenami i metanotrofami, w tym mcrA jako biomarker metanogenów oraz pmoA1, pmoA2 i mmoX jako biomarkery metanotrofów. Ponadto badanie to miało na celu wizualizację przestrzennych i czasowych wzorców rozmieszczenia obfitości metanogenu i metanotrofu przy użyciu oprogramowania systemu informacji geograficznej (GIS) ArcGIS Pro. Integracja tych technik molekularnych z zaawansowaną wizualizacją geoprzestrzenną dostarczyła krytycznych informacji na temat przestrzennego i czasowego rozmieszczenia zbiorowisk metanogenu i metanotrofów na terenach podmokłych południowego Teksasu. W związku z tym metodologia ustanowiona w tym badaniu oferuje solidne ramy do mapowania dynamiki mikrobiologicznej na terenach podmokłych, pogłębiając naszą wiedzę na temat obiegu metanu w różnych warunkach środowiskowych i wspierając szersze badania nad zmianami ekologicznymi i środowiskowymi.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przybrzeżne tereny podmokłe są kluczowymi ekosystemami, które przyczyniają się do regulacji klimatu, ochrony różnorodności biologicznej i gospodarki wodnej poprzez procesy takie jak sekwestracja węgla, ewapotranspiracja i emisje metanu (CH4)1. Ekosystemy te, w tym zarówno słodkowodne, jak i słonowodne tereny podmokłe2, są wysoce produktywne i działają jako krytyczne strefy dla pochłaniania dwutlenku węgla (CO2) i wychwytywania materii organicznej ze środowisk lądowych i morskich3,4. Dynamiczne interakcje na tych terenach podmokłych stymulują produkcję i konsumpcję mikroorganizmów CH45, pozycjonując je jako jedno z największych naturalnych źródeł CH46. Jako drugi najważniejszy gaz cieplarniany, CH4 ma potencjał globalnego ocieplenia około 27-30 razy większy niż CO24,7,8,9, co sprawia, że badanie emisji CH4 z przybrzeżnych terenów podmokłych jest niezbędne w erze zmian klimatycznych. Na emisjęCH4 wpływają różne czynniki środowiskowe, w szczególności zasolenie, odgrywające kluczową rolę w procesach mikrobiologicznych10. Słodkowodne tereny podmokłe w znacznym stopniu przyczyniają się do emisji metanu w atmosferze ze względu na niższy poziom siarczanów, co ułatwia większą produkcję mikrobiologicznąCH4, podczas gdy słonowodne tereny podmokłe na ogół emitują mniejCH4 ze względu na wyższe stężenia siarczanów11,12,13.

Emisje CH4 z przybrzeżnych terenów podmokłych są zazwyczaj kontrolowane przez dwie grupy mikroorganizmów, znane jako metanogeny i metanotrofy14. Metanogeny wytwarzająCH4 w osadach beztlenowych poprzez rozkład substratów, takich jak mrówczan, octan, wodór lub związki metylowe, w procesie znanym jako metanogeneza15. Ważnym enzymem w tym szlaku jest metylokoenzym M reduktaza (MCR), ponieważ katalizuje ostatni i ograniczający szybkość etap metanogenezy15,16,17. Gen mcrA, który koduje podjednostkę alfa MCR, jest funkcjonalnym markerem, który można znaleźć we wszystkich archeonach metanogennych 18. Ponadto na przybrzeżnych terenach podmokłych strefa przejściowa siarczanowo-metanowa (SMTZ) tworzy się powyżej strefy metanogennej, gdzie metan dyfundujący w górę i siarczan poruszający się w dół zbiegają się i są zubożone19. W tej strefie beztlenowe archeony metanotroficzne (ANME) utleniają metan do dwutlenku węgla za pomocą enzymu MCR, podczas gdy bakterie redukujące siarczany (SRB) redukują siarczan do siarczku. SRB konkuruje z metanogenami pod względem wodoru i octanu, ograniczając produkcję metanu do wyczerpania siarczanu16,17.

Natomiast tlenowe bakterie metanotroficzne utleniają CH4 w środowisku tlenowym20, wykorzystując różne formy monooksygenazy metanu (MMO). Należą do nich monooksygenaza metanu w cząstkach stałych (pMMO), enzym zawierający miedź osadzony w błonie wewnątrzcytoplazmatycznej, oraz rozpuszczalna monooksygenaza metanu (sMMO), enzym zawierający żelazo znajdujący się w cytoplazmie. Jednak dla pMMO istnieją trzy operony genowe pmoCAB21; wśród nich gen pmoA jest najbardziej konserwatywny dla wszystkich metanotrofów. Istnieją dwa różne geny biomarkerów dla pmoA: pmoA1 i pmoA222. Ponadto, dla pełnego zrozumienia metanotrofów, gen mmoX jest używany jako narzędzie w biologii molekularnej do identyfikacji metanotrofów zawierających sMMO23. To rozróżnienie w szlakach metabolicznych i wymaganiach środowiskowych metanogenów i tlenowych metanotrofów podkreśla złożone interakcje mikrobiologiczne regulujące obieg metanu w przybrzeżnych ekosystemach podmokłych.

Mokradła Boca Chica (BC), produktywne środowisko słonowodne w południowym Teksasie, doświadczają wpływów pływowych z Zatoki Meksykańskiej (GOM), co prowadzi do zmiennych poziomów zasolenia powierzchni, szczególnie ze względu na bliskość hipersoli Laguna Madre24. To działanie pływowe, naprzemiennie przypływy i odpływy, powoduje wahania poziomu tlenu25, co może zmienić aktywność metanogenu i metanotrofu w osadach26. Natomiast przybrzeżne słodkowodne tereny podmokłe są uważane za znaczący punkt zapalny dla strumieni CH4 27. Przybrzeżne słodkowodne tereny podmokłe w południowym Teksasie, w tym Resaca Del Rancho Viejo (RV) i Lozano Banco (LB), oddalone od skutków pływów GOM, mają wyraźne zarządzanie hydrologiczne. RV doświadcza przepływów pulsacyjnych uzupełnianych przez wodę rzeczną podczas niskich poziomów wody, podczas gdy LB działa jako system przepływu offline bez takiej suplementacji. Ponadto RV i LB utrzymują niższy poziom zasolenia ze względu na wysoki zrzut sztucznie pompowanej słodkiej wody i bycie odpowiednio starorzeczem. Różne czynniki środowiskowe mogą znacząco wpływać na obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu. Jednak obieg metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu pozostaje obszarem, który nie został jeszcze dokładnie zbadany.

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) i PCR w czasie rzeczywistym (zwana również ilościowym PCR [qPCR]) reprezentują podstawowe i szeroko stosowane techniki wykrywania i ilościowego określania względnej obfitości określonych genów w próbkach środowiskowych. Techniki te w szczególności amplifikują docelowe regiony DNA, aby wskazać obecność i względną ilość genów związanych z cyklamiCH4, dostarczając wskaźników potencjalnego obiegu metanu. Niemniej jednak dostępność i skuteczność zestawów starterów PCR może być ograniczona przez różne czynniki hamujące w wyekstrahowanym DNA środowiskowym, na które wpływ mają typy środowisk28,29. W związku z tym badanie to głównie ustaliło optymalną metodę PCR do wykrywania obecności genów związanych z jazdą na rowerze CH4 na przybrzeżnych terenach podmokłych południowego Teksasu (Rysunek 1), a następnie zwizualizowano ich ilościowo określoną względną liczebność w tych ekosystemach. Wyniki tego badania można zastosować w innych regionach przybrzeżnych w celu lepszego zrozumienia cykli CH4 i dynamiki mikrobiologicznej w różnych ekosystemach przybrzeżnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Pobieranie próbek

  1. Próbki osadów należy pobierać za pomocą próbnika lub łopaty.
    UWAGA: Próbki pobrano z dwóch stacji trzech odrębnych przybrzeżnych terenów podmokłych w chłodnych (październik-luty, średnia temperatura wynosi 20 °C) i ciepłych (kwiecień-czerwiec, średnia temperatura wynosi 27 °C) sezonach 2023 i 2024. Próbnik do chwytania osadów został użyty, gdy próbki zostały pobrane z przybrzeżnych słodkowodnych terenów podmokłych (Rysunek 2), a łopata została użyta do przybrzeżnych mokradeł morskich pod wpływem pływów.
  2. Najpierw opuść próbnik do płytkiego zbiornika wodnego i pozwól mu opaść na powierzchnię osadu (w górnych 50 cm) pod własnym ciężarem, minimalizując zakłócenia struktury osadu, jak pokazano na Rysunek 2.
  3. Wyciągnij go ze słupa wody, gdzie głębokość wynosiła zwykle od 60 cm do 215 cm30, przenieś próbki osadu do woreczków strunowych i natychmiast przechowuj je w pojemniku na lód.
    UWAGA: Oczyść i umyj próbnik chwytakowy wodą dejonizowaną (DI) przed przejściem do kolejnych stacji.
  4. Wszystkie próbki należy natychmiast przechowywać w temperaturze -20 °C w laboratorium.
  5. W każdym miejscu pobierania próbek należy zmierzyć parametry jakości wód powierzchniowych, takie jak zasolenie i temperatura in situ, za pomocą wieloparametrowego miernika jakości wody.
    UWAGA: Sondy zostały przepłukane wodą dejonizowaną (woda DI) po użyciu w każdej stacji.

2. Ekstrakcja genomowego DNA

  1. Rozmrozić próbki w temperaturze pokojowej przed rozpoczęciem procedury ekstrakcji genomowego DNA.
  2. Przenieść około 500 mg próbek osadu do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 4 250 × g przez 3 minuty w celu usunięcia całej wody.
  3. Wyodrębnij genomowe DNA za pomocą zestawu do ekstrakcji DNA do gleby zgodnie z protokołem producenta31 z niewielką modyfikacją i natychmiast przechowuj w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zmiany zostały wprowadzone w celu zmniejszenia nadmiarowości i wydajnego przepływu pracy.
    1. Dodać do 500 mg próbki gleby do probówki zawierającej szklaną kulkę/ceramiczną kulę.
    2. Dodać 978 μl buforu fosforanowo-sodowego do próbki w probówce zawierającej kulkę/kulkę.
    3. Dodać 122 μl roztworu do lizy buforowej do próbki w probówce zawierającej kulkę/kulkę, aby rozpuścić zanieczyszczenia zewnętrzne.
    4. Homogenizować za pomocą homogenizatora z młynkiem perełkowym przy 5-krotności prędkości przez 20 s i powtórzyć 2x,
      UWAGA: W tym badaniu użyto homogenizatora młynka perełkowego, dlatego dostosowano prędkość obrotową.
    5. Odwirować mieszaninę przez 10 minut w temperaturze 14 000 × g.
    6. Przenieść supernatant do czystej probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml.
    7. Dodaj 250 μl roztworu do wytrącania białek (PPS), aby oddzielić rozpuszczone kwasy nukleinowe od szczątków komórkowych i matrycy lizy. Wymieszaj, odwracając rurkę 10x.
    8. Wirować przy 14 000 × g przez 5 minut, aby wytrącić osad, usuwając resztki komórkowe i matrycę lizy.
    9. Przenieść supernatant do czystej probówki do mikrowirówki o pojemności 15 ml.
    10. Dodać 1,0 ml zawiesiny matrycy wiążącej do supernatantu w probówce o pojemności 15 ml.
      UWAGA: Wstrząśnij zawiesiną Binding Matrix w celu ponownego zawieszenia przed jej dodaniem.
    11. Pozwól na związanie DNA z matrycą wiążącą, umieszczając probówki na rotatorze na 2 minuty.
    12. Umieść wszystkie probówki na stojaku i inkubuj przez 3 minuty, aby umożliwić osiadanie matrycy wiążącej.
    13. Po 3 minutach wyrzucić 750 μl i delikatnie wymieszać pozostały supernatant z osadem za pomocą pipety.
    14. Przenieść 750 μl mieszaniny do filtra wirującego i odwirować przy 14 000 × g przez 1 minutę. Opróżnij rurkę wychwytującą i użyj jej ponownie. Powtórz z pozostałą mieszanką.
    15. Dodać 500 μl przygotowanego roztworu myjącego (z dodatkiem odpowiedniej ilości etanolu) w celu dalszego rozpuszczenia zanieczyszczeń. Delikatnie zawiesić osad ponownie, wykorzystując siłę płynu z końcówki pipety.
    16. Wirować przy 14 000 × g przez 1 minutę w celu usunięcia zanieczyszczeń. Opróżnij rurkę wychwytującą i użyj jej ponownie.
    17. Odwirować ponownie w temperaturze 14 000 × g przez 2 minuty, nie dodając niczego.
    18. Wymień rurkę wychwytującą na nową, czystą rurkę wychwytującą i wysusz filtr wirowania na powietrzu przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    19. Dodać 50 μl wody wolnej od DNAzy (DES) i odwirować w stężeniu 14 000 × g przez 1 min.
      UWAGA: W tym protokole do elucji DNA użyto 50 μl DES, aby zapewnić optymalne odzyskiwanie i stabilność wyekstrahowanego środowiskowego DNA (eDNA).

3. Kwantyfikacja DNA

  1. Dodać 1 μl wyekstrahowanego DNA z 200 μl barwnika fluorescencyjnego do probówki o pojemności 0,5 ml i dokładnie wymieszać pipetując.
  2. Natychmiast owinąć probówkę folią aluminiową, aby światło nie mogło przeniknąć i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
  3. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru w trybie JEDNEGO stężenia DNA zgodnie z protokołem producenta.

4. Wykrywanie 16S rRNA, pmoA1 , pmoA2 , mmoX i mcrA metodą konwencjonalnego PCR

  1. Przed uruchomieniem konwencjonalnego PCR (cPCR) rozmrozić wszystkie próbki i odczynniki w wiaderku na lód.
  2. Rozcieńczyć wszystkie wyekstrahowane próbki eDNA do 10 ng/μL.
    UWAGA: Wykaz starterów znajduje się w Tabeli 1.
  3. Przygotować 25 μl mieszaniny reakcyjnej cPCR dla każdej próbki, w tym 12,5 μl 2x PCR Master mix, 0,5 μl starterów do przodu i do tyłu (10 μM) (patrz tabela 1 dla listy starterów), 1 μl 10 ng/μL eDNA i 10,5 μl wody wolnej od nukleaz.
    UWAGA: Przygotuj mieszankę wzorcową o objętości wystarczającej na jedną dodatkową próbkę, aby zminimalizować błędy pipetowania.
  4. Przeprowadzić reakcję cPCR zgodnie z protokołem składającym się z początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 95 °C przez 45 s, przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 30 s i końcowego przedłużenia w temperaturze 72 °C przez 5 m, przy różnej temperaturze wyżarzania dla różnych starterów (patrz tabela 1 dla temperatur wyżarzania różnych starterów stosowanych dla różnych genów).
    UWAGA: Dla genu mcrA, startery ML wykazały pożądane pasmo przy użyciu powolnej szybkości narastania 0,1 °C/s między etapami wyżarzania i wydłużania przez pierwsze pięć cykli32.
  5. Wizualizacja produktów cPCR w żelu agarozowym wstępnie wybarwionym bromkiem etydyny (EtBr).
    UWAGA: Użyj 2,5% żelu agarozowego do drabiny 50 pz i 0,9% żelu do drabiny 1 kb. Użyj 1x buforu TAE dla 2,5% żelu agarozowego i 0,5x buforu TAE dla żelu 0,9% agarozowego.

5. Wykrywanie pmoA1 , pmoA2 , mmoX i mcrA za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

UWAGA: Geny ukierunkowane na metanogeny i metanotrofy, takie jak obfitość pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA, zostały zaobserwowane przez qPCR przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym.

  1. Przygotuj wzorce dla każdego genu osobno, aby uzyskać krzywą wzorcową dla każdego genu.
    1. Amplifikuj docelowy gen za pomocą cPCR, używając próbek, które wytworzyły najjaśniejsze pasmo podczas elektroforezy żelowej każdego genu. Postępuj zgodnie z metodą i podstawami opisanymi w punkcie 4.
    2. Oczyścić amplifikowane produkty za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu i zmierzyć stężenie DNA zgodnie z metodą opisaną w sekcji 3 i przechowywać w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Podwielokrotność oczyszczonych wzorców przelać do oddzielnych probówek do dalszego wykorzystania.
    3. Oblicz kopie genów na podstawie zmierzonego stężenia DNA, korzystając ze strony internetowej do obliczania liczby kopii dla qPCR.
    4. Rozcieńczyć obliczoną liczbę kopii wzorca wodą wolną od nukleaz, aby przygotować każdy wzorzec, w zakresie od 108 do 102 kopii/μl, przed uruchomieniem qPCR.
    5. Przygotować krzywą wzorcową, używając trzech powtórzeń każdej liczby kopii, w tym kontroli ujemnej (NTC, brak matrycy DNA).
      UWAGA: Wartość R2 każdej krzywej standardowej była większa niż 0,99.
  2. Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR o pojemności 20 μl dla wszystkich próbek, wzorców i NTC. Przeprowadzić analizę qPCR w trzech powtórzeniach dla wszystkich próbek.
    1. Przed rozpoczęciem umieść wszystkie składniki reakcji, w tym główną mieszankę qPCR, startery, wodę wolną od nukleaz, wzorce i próbki, na stojaku na lód.
    2. Przygotować mieszaninę reakcyjną qPCR o objętości 20 μl dla każdej próbki, wzorca i NTC, zawierającą 10 μl mieszanki wzorcowej SYBR Green, 0,5 μl każdego z 10 μM starterów do przodu i do tyłu, 8 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl odpowiednio 10 ng/μl matrycy DNA lub wody wzorcowej lub DI.
      UWAGA: Użyj pokazanych zestawów starterów, aby uzyskać optymalne wyniki dla genów pmoA1 i mcrA w konwencjonalnym PCR dla qPCR (patrz Tabela 1). Aby zwiększyć dokładność, należy przeprowadzić każdą próbkę w trzech egzemplarzach. Poniższe kroki zapewniają skuteczną metodę przygotowania potrójnych próbek o łącznej objętości 60 μl na próbkę.
      1. Przygotować mieszaninę reakcyjną w celu połączenia mieszanki wzorcowej, starterów do przodu i do tyłu dla określonego genu oraz wody wolnej od nukleaz w probówce o pojemności 2 ml, z wyjątkiem matrycy DNA.
        UWAGA: Przygotować objętość mieszaniny reakcyjnej z uwzględnieniem błędu pipetowania. Na przykład, jeśli istnieją 24 próbki i 8 wzorców, oblicz całkowitą objętość dla 33 reakcji zamiast 32 reakcji, aby zminimalizować błędy pipetowania. W takim przypadku całkowita objętość wymagana do przeprowadzenia reakcji potrójnych byłaby następująca: 990 μl mieszaniny wzorcowej (33 próbki x 3 kontrpróby x 10 μl), 49,5 μl starterów wstępnych (33 próbki x 3 kontrpróby x 0,5 μl), 49,5 μl starterów odwróconych (33 próbki x 3 kontrpróby x 0,5 μl), i 792 μl wody wolnej od nukleaz (33 próbki x 3 kontrpróby x 8 μl).
      2. Przygotuj probówki PCR zgodnie z liczbą próbek i wzorcami.
      3. Dozować 57 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej do każdej probówki PCR.
        UWAGA: Aby przeprowadzić qPCR dla każdej próbki w trzech egzemplarzach, należy przygotować całkowitą objętość mieszaniny reakcyjnej wynoszącą 57 μl na próbkę (z wyłączeniem matrycy DNA, wzorca lub wody). Objętość ta zostanie równo podzielona na trzy studzienki na jedną próbkę, przy czym 19 μl zostanie przydzielonych do każdej studzienki.
      4. Do każdej probówki dodać 3 μl matrycy DNA, wody wzorcowej lub wolnej od nukleaz i wymieszać, delikatnie stukając w dno probówki.
        UWAGA: Całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej przygotowanej dla jednej próbki wynosiłaby teraz 60 μl w każdej probówce.
    3. Podwielokrotność 20 μl przygotowanej mieszaniny reakcyjnej z każdej probówki do wyznaczonych dołków 96-dołkowej płytki qPCR. Uszczelnij płytkę PCR samoprzylepną folią uszczelniającą do PCR za pomocą aplikatora.
    4. Odwirować szczelnie zamkniętą płytkę o masie 1 000 × g przez 1 minutę, aby zapewnić prawidłowe wymieszanie i wyeliminować wszelkie pęcherzyki w studzienkach.
  3. Umieść płytkę PCR w termocyklerze. Włącz maszynę qPCR, a następnie otwórz odpowiednie oprogramowanie, aby skonfigurować protokół.
    1. Ustaw protokół zgodnie z wytycznymi qPCR master mix. Stosować następujący protokół: 95 °C przez 10 minut, następnie 95 °C przez 15 s i stopień przedłużający w temperaturze 72 °C przez 30 s. Etap wyżarzania należy wykonać w temperaturze wyżarzania określonej dla odpowiednich podkładów w tabeli 1 przez 45 sekund. Przeprowadzić wszystkie serie qPCR przez 35 cykli.
    2. Ustawić 96-dołkową płytkę qPCR z wzorcami i NTC w tej samej konfiguracji, co płytka zawierająca próbkę.
  4. Użyj metody bezwzględnej krzywej standardowej kwantyfikacji, aby określić ilościowo amplifikowany produkt i liczbę kopii genu w każdej próbce33.

6. Wizualizacja genów obiegu metanu na mapie mokradeł południowego Teksasu

  1. Otwórz oprogramowanie systemu informacji geograficznej (GIS) ArcGIS Pro i zapisz plik projektu o nazwie Analizowany obszar w określonym folderze na komputerze.
  2. Kliknij Mapa w lewym górnym rogu | Mapa bazowa i wybierz opcję Teren z etykietami jako mapę bazową.
  3. Kliknij Zlokalizuj | Wyszukaj, a gdy otworzy się pasek wyszukiwania, zlokalizuj badany obszar, wpisując jego nazwę; Obszar się pojawi.
  4. Narysuj określony obszar za pomocą georeferencji.
    1. Kliknij Widok | Okienko katalogu z górnej warstwy.
    2. Kliknij dwukrotnie Folder w katalogu | Nazwa pliku.
    3. Kliknij prawym przyciskiem myszy plik geobazy (.gdb), a następnie kliknij Nowy | Zostaną wyświetlone opcje Klasa elementów i Utwórz klasę elementów.
    4. Wpisz pole Nazwa i alias i kliknij przycisk Zakończ u dołu.
    5. Kliknij Widok | Spis treści. Nazwa aliasu pojawi się w okienku Zawartość.
    6. Kliknij Edytuj z górnej warstwy | Utwórz. Otworzy się okienko Utwórz obiekty. Kliknij dwukrotnie alias w okienku Utwórz obiekty, a pojawi się opcja Konfiguruj informacje zwrotne o narzędziu.
    7. Wybierz Linie, a następnie naszkicuj linie na mapie, aby utworzyć zewnętrzną granicę analizowanego obszaru. Po zakończeniu kliknij dwukrotnie mapę.
  5. Zminimalizuj oprogramowanie GIS, a następnie otwórz arkusz kalkulacyjny. Wpisz nazwę próbki w pierwszej kolumnie, wprowadź szerokość geograficzną w drugiej kolumnie i długość geograficzną w trzeciej kolumnie. Następne cztery kolumny służą do przechowywania danych qPCR pmoA1, pmoA2, mmoX i mcrA.
  6. Zapisz plik w formacie CSV w dowolnym folderze na komputerze.
  7. Otwórz ponownie oprogramowanie GIS i kliknij opcję Dodaj dane | Dane punktu XY.
  8. Wybierz plik CSV z folderu na komputerze w polu Tabela wejściowa. Zmień nazwę pliku w wynikowej klasie elementów, a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby wyświetlić punkty próbkowania na mapie.
  9. Kliknij navpasek wyszukiwania u góry i wyszukaj Kriging.
  10. Wybrać plik stacji pobierania próbek, a następnie wybrać pmoA1.
  11. Kliknij przycisk Środowisko | wybierz pikietę próbkowania w obszarze Warstwa i maska | kliknij przycisk Uruchom.
  12. Postępuj zgodnie z protokołami wymienionymi w krokach 6.9, 6.10 i 6.11, aby utworzyć Kriging dla pmoA2, mmoX i mcrA dla całego badanego obszaru.
  13. Utwórz układ mapy.
    1. Kliknij Wstaw z górnej warstwy | Nowy układ i wybierz ANSI - Poziomo.
    2. Kliknij Ramkę mapy, wybierz mapę z Krigingiem i umieść wszystkie mapy w układzie, rysując prostokąt. Spowoduje to, że mapa będzie widoczna w układzie.
    3. Wybierz strzałkę północy i umieść ją w układzie, aby wskazać kierunek północny.
    4. Wybierz opcję Podziałka liniowa, aby wyświetlić skalę obszaru na mapie.
    5. Kliknij Legenda, aby wyświetlić legendy, a następnie umieść ją w układzie.
    6. Kliknij opcję Siatka i wybierz dowolną opcję czarnej siatki. Spowoduje to utworzenie siatki z szerokością i długością geograficzną i wyświetlenie jej w okienku zawartości z etykietą pozioma siatka etykietowa.
    7. Kliknij dwukrotnie czarną poziomą siatkę etykiet, a następnie wybierz Komponenty. Kliknij Znaczniki 1 i Siatka, a następnie usuń te komponenty, klikając znak krzyżyka po ich prawej stronie.
  14. Kliknij Udostępnij z górnej warstwy, a następnie kliknij Eksportuj układ. Wybierz typ pliku jako PDF, zapisz plik na komputerze za pomocą pola nazwy, ustaw rozdzielczość pionową na 500 DPI, a następnie kliknij przycisk Eksportuj, aby utworzyć plik PDF mapy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zrozumieć rozmieszczenie i obfitość genów związanych z cyklami CH4 (mcrA, pmoA1, pmoA2 i mmoX) na przybrzeżnych mokradłach południowego Teksasu, wyekstrahowane eDNA z każdej próbki zostało przeanalizowane metodą cPCR i qPCR. Uniwersalne startery dla każdego biomarkera zostały wybrane do przeprowadzenia cPCR z poprzednich badań (Tabela 1)22,34,35,

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przybrzeżne tereny podmokłe są uznawane za znaczące czynniki przyczyniające się do powstawania metanu w atmosferze, ważnego gazu cieplarnianego40 . Chociaż przeprowadzono badania nad strumieniem metanu i metanogenami na terenach podmokłych41,42,43, niewiele wiadomo na temat tego, jak metanotrofy działają w różnych środowiskach lub przy różnych praktykach zarządzania, zwłaszcza na terenach podmokłych o zmi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni członkom C-REAL za ich pomoc w obserwacji terenowej i analizach laboratoryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki do PCR 0,2 mlThermoFisher ScientificAB0620https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/AB0620?SID=srch-srp-AB0620
0,5 ml probówki do PCRPromegaE4941https://www.promega.com/products/biochemicals-and-labware/tips-and-accessories/0_5ml-pcr-tubes/?catNum=E4941
10 μ Końcówki LThermoFisher Scientific05-408-187Fisherbrand SureGrip Końcówki do pipet z systemem racked lub Reload Naturalny; 10μ L; |
Probówka wirówkowa Fisher Scientific 15 mlThermoFisher Scientific14-959-53Ahttps://www.fishersci.com/shop/products/falcon-15ml-conical-centrifuge-tubes-5/p-193301
200 μ L końcówkiThermoFisher Scientific05-408-190Fisherbrand SureGrip Końcówka do pipet z systemem racked lub Reload Naturalny; 200μ L; | Fisher Scientific
1000 μ L końcówkiThermoFisher Scientific02-707-402https://www.fishersci.com/shop/products/sureone-micropoint-pipette-tips-specific-standard-fit/02707402?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kUsQ9Lu0YIq5i4vWege
17qPdtxIYZyvmJH1cDo
ARuwereO1V4GLz9UaA
lDREALw_wcB& ef_id=C
j0KCQiApNW6BhD5ARI
sACmEbkUsQ9Lu0YIq5i
4vWege17qPdtxIYZyvmJ
H1cDoARuwereO1V4GLz
9UaAlDREALw_wcB:G:s
& ppc_id=PLA_goog_2175
7693617_171052169911_02
707402__715434303113_1555
377385658230343& ev_chn=sh
op& s_kwcid=AL!4428!3!71543430
3113!! g!2366517300713!& _source=1
Applied Biosystem Power SYBR Green Master Mix ThermoFisher Scientific4368577https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4368577
ArcGIS Pro Esrihttps://www.esri.com/en-us/arcgis/products/arcgis-pro/overview?srsltid=AfmBOopatJ4
JvHJfscHRcAaDx0Jz5_Jrl8l5
vYkkBvfOqE-uNSsMghN1
System CFX Duet do PCR w czasie rzeczywistym Pipetor jednokanałowy Bio-Rad12016265 https://www.bio-rad.com/en-us/product/cfx-duet-real-time-pcr-system?ID=97722926-9ed9-16a4-1d83-c92f587e427a
Corning Lambda plus
o objętości 0,5-10 μm; L		Sigma-AldrichCLS4071-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4071
Corning  Lambda  plus pojemność pipety jednokanałowej 100-1000  μ LSigma-AldrichCLS4075-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4075
Corning  Lambda  plus pojemność pipety jednokanałowej 20-200  μ LSigma-AldrichCLS4074-1EAhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cls4074
Zestaw spinowy FastDNA do glebyMP Biomedical116560200-CFhttps://www.mpbio.com/us/116560000-fastdna-spin-kit-for-soil-samp-cf?srsltid=AfmBOoqOxxGilzY3IHNIZR
ajegGTr9MoX1oMZUh
3dcbJqe0UvvukY128
Kopiowanie genów  kalkulatorElementarznaukowyhttps://scienceprimer.com/copy-number-calculator-for-realtime-pcr .
Wirówka stołowa szybkoobrotowaThermoFisher Scientific75004241https://newlifescientific.com/products/thermo-scientific-sorvall-st16-high-speed-benchtop-centrifuge-75004241?_source=1&gclid=Cj0KCQiApN
W6BhD5ARIsACmEbkVC_-cCIN9j
20TvYq8iDsBlUR5cPK_1_wN
OBEcjMdv-CYVoGCfeOLYaAv
enEALw_wcB
Mikrowirówka szybkoobrotowaVWR75838-336https://us.vwr.com/store/product/20546590/null
Rurka E z matrycą do lizy Rurka z kulką szklaną/ceramiczną Probówka
do mikrowirówekThermoFisher Scientific02-681-320https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/02681320?gclid=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACm
EbkWbG4_o3oUiGk
HJPU-_31-CuexDwQ
fmWPnfyhBOf2BHXsy
K3fFW1toaAgJbEALw_
wcB& ef_id=Cj0KCQiAp
NW6BhD5ARIsACmEb
kWbG4_o3oUiGkHJPU-
_31-CuexDwQfmWPnfy
hBOf2BHXsyK3fFW1toa
AgJbEALw_wcB:G:s& PPC
_id=PLA_goog_21757693
617_171052169911_0268
1320__715434303113_10
349826094968484711& EV
_chn=Sklep& s_kwcid=AL!4
428!3!715434303113!!! g!23
66517300713!& _source=1
PCR Master mix PromegaM7502https://www.promega.com/products/pcr/taq-polymerase/master-mix-pcr/?catNum=M7502
Quantiflour ONE PromegaE4871https://www.promega.com/products/rna-analysis/dna-and-rna-quantitation/quantifluor-one-dsdna-system/?_source=1&gbraid=0AAAAAD
_rg189yJTY3cxeVqMdu8RPx10
Ma& gclid=CjwKCAjwxNW2BhAk
EiwA24Cm9FUgViPNyWq7UfZL
VeeoroLAZ5JIP6w07RGK_4D0w
oZgAqf-G1XTmxoCxm8QAvD_B
wE& catNum=E4871
Fluorometr kwantowy PromegaE6150https://www.promega.com/products/microplate-readers-fluorometers-luminometers/fluorometers/quantus-fluorometer/?catNum=E6150
YSI Pro 2030YSI to marka ksylemu603174https://www.ysi.com/product/id-p2030/pro2030-kits
System dsDNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Xu, T., et al. Wetlands of international importance: Status, threats, and future protection. Int J Environ Res Public Health. 16 (10), 1818(2019).
  2. Corn, M. L. Deepwater Horizon oil spill: coastal wetland and wildlife impacts and response. , DIANE Publishing. (2010).
  3. Hendriks, I. E., Sintes, T., Bouma, T. J., Duarte, C. M. Experimental assessment and modeling evaluation of the effects of the seagrass Posidonia oceanica on flow and particle trapping. Marine Ecology Progress Series. 356, 163-173 (2008).
  4. Krause, S. J. E., Treude, T. Deciphering cryptic methane cycling: Coupling of methylotrophic methanogenesis and anaerobic oxidation of methane in hypersaline coastal wetland sediment. Geochimica et Cosmochimica Acta. 302, 160-174 (2021).
  5. Reddy, K. R., DeLaune, R. D., Inglett, P. W. Biogeochemistry of Wetlands: Science and Applications. , 2nd ed, CRC Press. (2022).
  6. La, W., et al. Sulfate concentrations affect sulfate reduction pathways and methane consumption in coastal wetlands. Water Research. 217, 118441(2022).
  7. Derwent, R. G. Global warming potential (GWP) for methane: Monte Carlo analysis of the uncertainties in Global Tropospheric Model predictions. Atmosphere. 11 (5), 486(2020).
  8. Potter, C., et al. Methane emissions from natural wetlands in the United States: Satellite-derived estimation based on ecosystem carbon cycling. Earth Interactions. 10 (22), 1-12 (2006).
  9. Understanding global warming potentials. , U.S. Environmental Protection Agency. https://www.epa.gov/ghgemissions/understanding-global-warming-potentials (2024).
  10. Wallenius, A. J., Dalcin Martins, P., Slomp, C. P., Jetten, M. S. M. Anthropogenic and environmental constraints on the microbial methane cycle in coastal sediments. Front Microbiol. 12, 631621(2021).
  11. Qu, Y., et al. Salinity causes differences in stratigraphic methane sources and sinks. Environmental Science and Ecotechnology. 19, 100334(2024).
  12. Vizza, C., West, W. E., Jones, S. E., Hart, J. A., Lamberti, G. A. Regulators of coastal wetland methane production and responses to simulated global change. Biogeosciences. 14 (2), 431-446 (2017).
  13. van Dijk, G., et al. Salinization lowers nutrient availability in formerly brackish freshwater wetlands; unexpected results from a long-term field experiment. Biogeochemistry. 143 (1), 67-83 (2019).
  14. Aronson, E., Allison, S., Helliker, B. R. Environmental impacts on the diversity of methane-cycling microbes and their resultant function. Front Microbiol. 4, 225(2013).
  15. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  16. Thauer, R. K. Biochemistry of methanogenesis: a tribute to Marjory Stephenson. Marjory Stephenson Prize Lecture. Microbiology (Reading). 144 (Pt 9), 2377-2406 (1998).
  17. Thauer, R. K. Anaerobic oxidation of methane with sulfate: on the reversibility of the reactions that are catalyzed by enzymes also involved in methanogenesis from CO2. Curr Opin Microbiol. 14 (3), 292-299 (2011).
  18. Friedrich, M. W. Methyl-coenzyme M reductase genes: Unique functional markers for methanogenic and anaerobic methane-oxidizing Archaea. Methods in Enzymology. 397, 428-442 (2005).
  19. Reeburgh, W. S. Oceanic methane biogeochemistry. Chem Rev. 107 (2), 486-513 (2007).
  20. Rasigraf, O., Schmitt, J., Jetten, M. S. M., Lüke, C. Metagenomic potential for and diversity of N-cycle driving microorganisms in the Bothnian Sea sediment. Microbiologyopen. 6 (4), e00475(2017).
  21. McDonald, I. R., Bodrossy, L., Chen, Y., Murrell, J. C. Molecular ecology techniques for the study of aerobic methanotrophs. Appl Environ Microbiol. 74 (5), 1305-1315 (2008).
  22. Tchawa Yimga, M., Dunfield, P. F., Ricke, P., Heyer, J., Liesack, W. Wide distribution of a novel pmoA-like gene copy among type II methanotrophs, and its expression in Methylocystis strain SC2. Appl Environ Microbiol. 69 (9), 5593-5602 (2003).
  23. Knief, C. Diversity and habitat preferences of cultivated and uncultivated aerobic methanotrophic bacteria evaluated based on pmoA as molecular marker. Front Microbiol. 6, 1346(2015).
  24. Huang, I. -S., et al. Preliminary assessment of microbial community structure of Wind-Tidal Flats in the Laguna Madre, Texas, USA. Biology. 9 (8), 183(2020).
  25. Wilding, T. K., Brown, E., Collier, K. J. Identifying dissolved oxygen variability and stress in tidal freshwater streams of northern New Zealand. Environ Monit Assess. 184 (10), 6045-6060 (2012).
  26. Roy Chowdhury, T., Mitsch, W. J., Dick, R. P. Seasonal methanotrophy across a hydrological gradient in a freshwater wetland. Ecological Engineering. 72, 116-124 (2014).
  27. Sun, Q. -Q., et al. Carbon dioxide and methane fluxes: Seasonal dynamics from inland riparian ecosystems, northeast China. Sci Total Environ. 465, 48-55 (2013).
  28. Lee, S., et al. Comparison and selection of conventional PCR primer sets for studies associated with nitrogen cycle microorganisms in surface soil. Appl Sci. 12 (20), 10314(2022).
  29. Bae, K. -S., et al. Development of diagnostic systems for wide range and highly sensitive detection of two waterborne hepatitis viruses from groundwater using the conventional reverse transcription nested PCR assay. J Virol Methods. 299, 114344(2022).
  30. Lecusay, D. Jr Assessment and Monitoring of Deltaic Wetlands and Fluvial Systems: Refining and Validating a Multimetric Index of Resaca Ecosystem Health. , The University of Texas Rio Grande Valley. (2021).
  31. FastDNA SPIN Kit for Soil (Cat No. 116560200). , MP Biomedicals. https://www.mpbio.com/media/productattachment/LS082019-EN-FastDNA-SPIN-Kit-for-Soil-116560200-Manual.pdf (2025).
  32. Luton, P. E., Wayne, J. M., Sharp, R. J., Riley, P. W. The mcrA gene as an alternative to 16S rRNA in the phylogenetic analysis of methanogen populations in landfill. Microbiology (Reading, England). 148 (Pt 11), 3521-3530 (2002).
  33. Changsoo, L., Jaai, K., Seung Gu, S., Seokhwan, H. Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli. J Biotechnol. 123 (3), 273-280 (2006).
  34. Harms, G., et al. Real-time PCR quantification of nitrifying bacteria in a municipal wastewater treatment plant. Environ Sci Technol. 37 (2), 343-351 (2003).
  35. Holmes, A. J., Costello, A., Lidstrom, M. E., Murrell, J. C. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related. FEMS Microbiol Lett. 132 (3), 203-208 (1995).
  36. Fuse, H., et al. Oxidation of trichloroethylene and dimethyl sulfide by a marine Methylomicrobium strain containing soluble methane monooxygenase. Biosci Biotechnol Biochem. 62 (10), 1925-1931 (1998).
  37. Springer, E., Sachs, M. S., Woese, C. R., Boone, D. R. Partial gene sequences for the A subunit of methyl-coenzyme M reductase (mcrI) as a phylogenetic tool for the family Methanosarcinaceae. Int J Syst Bacteriol. 45 (3), 554-559 (1995).
  38. Costello, A. M., Lidstrom, M. E. Molecular characterization of functional and phylogenetic genes from natural populations of methanotrophs in lake sediments. Appl Environ Microbiol. 65 (11), 5066-5074 (1999).
  39. Flores, E. A. Effects of Nutrient Enrichment on Mangrove and Saltmarsh Habitats. , The University of texas Rio Grande Valley. (2022).
  40. Minjie, H., Jordi, S., Xianyu, Y., Josep, P., Chuan, T. Patterns and environmental drivers of greenhouse gas fluxes in the coastal wetlands of China: A systematic review and synthesis. Environ Res. 186, 109576(2020).
  41. Bridgham, S. D., Cadillo-Quiroz, H., Keller, J. K., Zhuang, Q. Methane emissions from wetlands: biogeochemical, microbial, and modeling perspectives from local to global scales. Glob Chang Biol. 19 (5), 1325-1346 (2013).
  42. Liu, D. Y., Ding, W. X., Jia, Z. J., Cai, Z. C. Relation between methanogenic archaea and methane production potential in selected natural wetland ecosystems across China. Biogeosciences. 8 (2), 329-338 (2011).
  43. Ke, Z., et al. Methane emissions and methanogenic community investigation from constructed wetlands in Chengdu City. Urban Climate. 39, 100956(2021).
  44. Chowdhury, T. R., Dick, R. P. Ecology of aerobic methanotrophs in controlling methane fluxes from wetlands. Applied Soil Ecology. 65, 8-22 (2013).
  45. Maja, S., et al. Humic substances cause fluorescence inhibition in real-time polymerase chain reaction. Anal Biochem. 487, 30-37 (2015).
  46. Sanches, T. M., Schreier, A. D. Optimizing an eDNA protocol for estuarine environments: Balancing sensitivity, cost and time. PLOS ONE. 15 (5), e0233522(2020).
  47. Xia, Z., et al. Conventional versus real-time quantitative PCR for rare species detection. Ecol Evol. 8 (23), 11799-11807 (2018).
  48. Bourne, D. G., McDonald, I. R., Murrell, J. C. Comparison of pmoA PCR primer sets as tools for investigating methanotroph diversity in three Danish soils. Appl Environ Microbiol. 67 (9), 3802-3809 (2001).
  49. Juottonen, H., Galand, P. E., Yrjala, K. Detection of methanogenic Archaea in peat: comparison of PCR primers targeting the mcrA gene. Res Microbiol. 157 (10), 914-921 (2006).
  50. Lueders, T., Friedrich, M. W. Evaluation of PCR amplification bias by terminal restriction fragment length polymorphism analysis of small-subunit rRNA and mcrA genes by using defined template mixtures of methanogenic pure cultures and soil DNA extracts. Appl Environ Microbiol. 69 (1), 320-326 (2003).
  51. Vaksmaa, A., Jetten, M. S., Ettwig, K. F., Luke, C. McrA primers for the detection and quantification of the anaerobic archaeal methanotroph 'Candidatus Methanoperedens nitroreducens'. Appl Microbiol Biotechnol. 101 (4), 1631-1641 (2017).
  52. Ren, G., et al. Electron acceptors for anaerobic oxidation of methane drive microbial community structure and diversity in mud volcanoes. Environ Microbiol. 20 (7), 2370-2385 (2018).
  53. Goldberg, C. S., et al. Critical considerations for the application of environmental DNA methods to detect aquatic species. Methods in Ecology and Evolution. 7 (11), 1299-1307 (2016).
  54. McKee, A. M., Spear, S. F., Pierson, T. W. The effect of dilution and the use of a post-extraction nucleic acid purification column on the accuracy, precision, and inhibition of environmental DNA samples. Biological Conservation. 183, 70-76 (2015).
  55. Gohl, D. M., et al. Systematic improvement of amplicon marker gene methods for increased accuracy in microbiome studies. Nat Biotechnol. 34 (9), 942-949 (2016).
  56. Ballarini, A., Segata, N., Huttenhower, C., Jousson, O. Simultaneous quantification of multiple bacteria by the BactoChip microarray designed to target species-specific marker genes. PLOS ONE. 8 (2), e55764(2013).
  57. Le Mer, J., Roger, P. Production, oxidation, emission and consumption of methane by soils: A review. Eur J Soil Biol. 37 (1), 25-50 (2001).
  58. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Obfito metanogen wobfito metanotrof wrozk ad przestrzennyanaliza qPCRdetekcja cPCRArcGIS Progen mcrAgen pmoA1

Powiązane artykuły