Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67716

⸱

1 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Medical Genetics, Oregon Health & Science University, 2Department of Molecular Microbiology and Immunology, Oregon Health & Science University, 3Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten raport szczegółowo opisuje zlokalizowany sposób wstrzyknięcia wektorów AAV za pośrednictwem miednicy nerkowej w celu skutecznego i bezpiecznego przeniesienia genu do nerki myszy.

Streszczenie

Rozwój skutecznych narzędzi i metod in vivo do dostarczania genów do nerki jest kluczowy dla postępów w podstawowych badaniach nerek i terapii genowej chorób nerek. Ponadto, rosnąca świadomość monogenicznych chorób nerek, napędzana zaawansowanymi testami genetycznymi, podkreśla potencjał terapii genowej w leczeniu, a nawet wyleczania trudnych do wyleczenia genetycznych chorób nerek. Pod tym względem, wektory adeno-stowarzyszonych wirusów (AAV) zyskują coraz większą uwagę jako solidna platforma dla dostarczania genów in vivo; jednak najskuteczniejsza i najbezpieczniejsza metoda dostarczania genów za pomocą wektorów AAV do każdego terapeutycznie istotnego typu komórek w nerce nie została jeszcze w pełni ustalone. W niniejszym opracowaniu szczegółowo opisano metodę powolnego wstrzyknięcia wstecznego wektorów AAV do miedniczki nerkowej (RP), a także zademonstrowano jej wysoki potencjał do transdukcji mysich nerek, gdy używa się odpowiednio dobranych kapsyd AAV. Co więcej, pokazano, że ta metoda jest skuteczna nie tylko dla standardowych wektorów AAV oczyszczanych ultrawirówką w chlorku cezu (CsCl AAV), ale również dla ultrafiltrowanych wirówkowo wektorów AAV (CU AAV) w minipreps, które mogą być przygotowane szybko i prosto za pomocą technik, które nie wymagają specjalistycznej znajomości wektorów AAV. Jako przykład, niniejsze badanie pokazuje, że powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów CsCl i CU AAV-KP3 prowadzi do solidnej transdukcji cewek bliższych w nerce myszy bez widocznej szkody dla tkanki, w przeciwieństwie do wcześniej zgłaszanych podejść hydrodynamicznych, które nieuchronnie prowadzą do uszkodzenia tkanki. Zatem niniejsze badanie podkreśla, że powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wybranych wektorów pochodnych kapsyd AAV jest skuteczną i bezpieczną metodą dostarczania genów do nerki. Ta metoda będzie miała zastosowanie w szerokim spektrum badań nerek, włączając badania terapii genowej. Zastosowanie minipreps wektorów CU AAV znacznie zwiększy wydajność i poprawi efektywność czasu i kosztów potrzebnych do generowania danych wstępnych i uzyskiwania kluczowych wniosków.

Wprowadzenie

Skuteczne i bezpieczne metody dostarczania genów do nerki u małych i dużych zwierząt eksperymentalnych stanowią kluczowe możliwości dla rozwoju podstawowych badań nad nerkami i rozpoznawania innowacyjnych podejść terapeutycznych. Ustanowienie takich metod jest szczególnie istotne dla terapii genowej różnych chorób nerek. Ostatnie osiągnięcia w dziedzinie klinicznych badań genetycznych ujawniły wyższą częstość występowania zespołów nerek monogenicznych niż wcześniej szacowano, co dotyczy około 30% pacjentów z przewlekłymi chorobami nerek (CKD)1. CKD charakteryzuje się progresywnym uszkodzeniem nerek, prowadzącym ostatecznie do niewydolności nerek, bez naprawdę skutecznych terapii modyfikujących przebieg choroby. Dializa i przeszczepianie nerek są obecnie dostępnymi leczeniami; jednak mają ograniczenia, które znacząco pogarszają jakość życia pacjentów z CKD2. Dlatego terapia genowa, klinicznie sprawdzone potężne podejście do leczenia chorób genetycznych, zwróciła na siebie znaczną uwagę w ostatnich latach jako nowa droga do skutecznego leczenia genetycznych chorób nerek prowadzących do CKD3,4,5,6. Takie podejście może bezpośrednio zwrócić się przeciwko pierwotnym przyczynom chorób i potencjalnie zaoferować leczenie.

Mimo stałych postępów w tej dziedzinie, dostarczanie genów do nerek pozostaje znaczącym wyzwaniem zarówno w badaniach jak i w ustawieniach terapeutycznych. Skuteczne ukierunkowanie komórek nerkowych z terapeutycznymi genami jest trudne z powodu złożonej struktury narządu i unikalnych barier fizjologicznych, w tym bariery filtracji kłębuszkowej, która składa się z komórek śródbłonka kłębuszkowego, błony podstawnej kłębuszka i wypustek stopy kłębuszkowych. Różne strategie zostały zbadane dla dostarczania genów ukierunkowanych na nerki, w tym bezpośrednie wstrzyknięcie do kory nerkowej (RC)7,8, wstrzyknięcie do tętnicy nerkowej (RA)9,10,11, wstrzyknięcie do żyły nerkowej (RV)12,13,14, wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej (RP)15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 i wstrzyknięcie dożylne (IV)19,26,27,28,29,30 wirusowych lub niewirusowych wektorów dostarczania genów, a także dostarczania kwasów nukleinowych przy użyciu ultradźwięków i mikrobąbelek31,32. Te podejścia wykazały różne poziomy efektywności transdukcji lub wyników funkcjonalnych, często dając niekonsekwentne wyniki, które są trudne do pogodzenia (przejrzane w odniesieniach3,33,34,35). Dostarczanie genów do nerek jest nadal nierozwinięte, co sprawia, że porównywanie wektorów systemów i metodologii jest trudne. Jednak metody dostarczania zlokalizowanych, które ułatwiają podawanie wysoce skoncentrowanych środków bezpośrednio do nerki, ogólnie osiągnęły lepsze wyniki niż układowe wstrzyknięcia dożylne. Ponadto, wektory adeno-skojarzonego wirusa (AAV), z ich solidnymi profilami bezpieczeństwa i udowodnionym doświadczeniem klinicznym36,37, były najczęściej badane i są uważane za wiodącą opcję dla przeniesienia genów do nerek.

Typowe serotypy AAV i inżynieryjne kapsydy wykazały efektywną transdukcję komórek mezangialnych i mezenchymalnych w nerkach po wstrzyknięciu dożylnym u myszy28,30,38. Warto zauważyć, że ostatnie badania wykazały, że dożylne podawanie AAV9 może skutecznie transdukować stopy kłębuszkowe w mysich modelach zespołu nerczycowego i zespołu Alporta, choć ten efekt nie jest obserwowany w zdrowym narządzie38,39, oraz że dożylne podawanie inżynieryjnego kapsydu AAV2 może wyłącznie ukierunkować komórki śródbłonka kłębuszkowego zarówno w zdrowych jak i zapalnych nerkach u myszy40. Historycznie, przewody nerkowe były trudne do transdukcji drogą dożylną. Jednak niedawno odkryto, że wstrzyknięcie do miedniczki nerkowej wybranych kapsyd

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach opisane tutaj zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Wykorzystywania w Oregon Health & Science University (OHSU) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami w OHSU. W niniejszym badaniu zastosowano 8-tygodniowe myszy samce C57BL/6J. Reaktancje i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Produkcja wektora AAV przez transfekcję plazmidem wolnym od adenowirusów

  1. Kultura komórek nerki embrionalnej człowieka (HEK) 293 w pożywce Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/L) uzupełnione o 10% łożyskowe surowica wołowa (FBS), 1% Penicillin and Streptomycin Mix oraz 1 mM L-glutamina, w inkubatorze 37 °C z 5% dwutlenkiem węgla (CO2).
  2. W dniu -2 (48 godzin przed transfekcją) zasiej 4 x 106 komórek HEK 293 na kolbę T225 w 40 mL pożywki opisanej w punkcie 1.1. Osiąga się ~95% konfluencji w dniu 0.
    UWAGA: Skalę kultury można dostosować w zależności od zastosowania. W przypadku miniprzygotowania AAV (krok 2), przygotuj odpowiednią liczbę kolb w oparciu o docelową tytuł i stężenie wektora, mając na uwadze, że proces oczyszczania zazwyczaj powoduje utratę materiału w wysokości około 50%. Aby osiągnąć >6 x 1012 vg/mL wektorów AAV9 i AAV-KP3 do wstrzyknięcia RP u myszy w dawce 3 x 1011 vg/mysz w 50 µL roztworu wektora, zaleca się co najmniej 2 kolby. W przypadku produkcji wektorów AAV na większą skalę, takich jak AAV wektorów oczyszczonych gradientem gęstości CsCl (AAV CsCl), zazwyczaj stosuje się 25 lub więcej kolb.
  3. Dzień 0: Transfekcja DNA plazmidowego
    1. Przygotowanie do transfekcji
      1. Upewnij się, że komórki osiągnęły ~95% konfluencji.
      2. Podgrzej DMEM uzupełnione o 1% Penicillin and Streptomycin Mix i 1 mM L-glutamina, ale bez FBS (czyli pożywka wolna od surowicy) w kąpieli wodnej 37 °C.
      3. Pozwól roztworowi liniowego polietyleniminu (PEI) osiągnąć temperaturę pokojową.
    2. Przygotowanie mieszaniny DNA plazmidowego
      1. Wymieszaj plazmidy (15 µg każdy z pAAV-CAG-tdTomato, pRepCap i pHelper) w 1 mL buforu fosforanowego bez CaCl2 lub MgCl2 w sterylnych mikroprobówkach 1,5 mL. Łączna ilość DNA wynosi 45 µg/kolba.
        UWAGA: Można zignorować objętości roztworów DNA plazmidowego, jeśli są minimalne. Jednak zaleca się dostosowanie objętości, jeśli łączna objętość roztworu wynosi ≥225 µL. Sekwencje plazmidów użytych w tym badaniu są dostępne w Pliku uzupełniającym 1.
    3. Transfekcja PEI
      1. Dodaj 90 µL roztworu PEI (1 mg/mL) do 1 mL PBS i wymieszaj z mieszanką PBS-DNA plazmidowego (przygotowaną jak wyżej) w 50 mL polipropylenowej probówce. Końcowa objętość wynosi około 2 mL (5% objętości pożywki kulturalnej).
      2. Vorteksuj probówki przez 5 s i krótko przekręć je w wirówce, aby zebrać płyn na dnie probówek.
    4. Pozostaw w temperaturze pokojowej na 15 min, aby utworzyć kompleksy DNA plazmidowego-PEI.
    5. Po zakończeniu 15-minutowej inkubacji dodaj 40 mL przegrzanego pożywka wolna od surowicy przygotowanej w punkcie 1.3.1.2 do kompleksów DNA plazmidowego-PEI. Objętość wynosi około 42 mL.
    6. Zamień pożywkę kulturalną w kolbie T225 na kompleksy DNA plazmidowego-PEI zawierające pożywkę wolną od surowicy opisane w punkcie 1.3.4.
    7. Utrzymuj komórki w tym medium transfekcyjnym do momentu zbioru w dniu 5 (nie jest wymagana zmiana pożywki).
    8. W dniu 2 obserwuj komórki transfekowane plazmidem wyrażającym białka fluorescencyjne (np. pAAV-CAG-tdTomato) pod mikroskopem fluorescencyjnym odwróconym, aby ocenić skuteczność transfekcji plazmidowej.
      UWAGA: Warunki opisane powyżej zwykle dają skuteczność transfekcji przekraczającą 70%. Możliwe są pewne zmiany morfologiczne (np. wydłużenie komórek), prawdopodobnie z powodu środowiska wolnego od surowicy.
    9. W dniach 3 do 5 kontynuuj hodowlę transfekowanych komórek w inkubatorze 37 °C z 5% CO2.
    10. W dniu 5 zebraj zarówno komórki, jak i zawierające wirusa medium do 50 mL polipropylenowej probówki.
    11. Przechowuj próbki w -80 °C do momentu użycia.

2. Oczyszczanie wektorów AAV przez wirowania ultrafiltracją wirową (AAV miniprzygotowanie)

  1. Roztwież zamrożoną próbkę z kr

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niedawny badanie zidentyfikowało małą podzbiór kapsydów AAV, który wykazuje znaczące zwiększenie transdukcji nerek w porównaniu z AAV9 po wstrzyknięciu RP38. Zidentyfikowany podzbiór obejmuje AAV-KP3, chimeryczny kapsyd AAV wygenerowany przez DNA shuffling41. Dlatego AAV-KP3 został wybrany do wstrzyknięcia RP w tym badaniu, obok AAV9 jako punktu odniesienia. Wektor AAV9-CAG-tdTomato (AAV9) i wektor AAV-KP3-CAG-tdTomato (KP3) zostały wyprodukowane w komórkach HEK293 metodą t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

To raport zawiera szczegółową instrukcję powolnej wstrząśnięcia wstecznego do wstrzyknięć do miedniczki nerkowej wektorów AAV jako metody podanej lokalnie do dostarczenia genów do nerki myszy. Jednym z kluczowych kroków dla bezpiecznego przeprowadzenia wstrzyknięcia do miedniczki nerkowej jest ustawienie szybkości wstrzyknięcia wektorów AAV, aby uniknąć uszkodzenia parenchymy wstrzykniętej nerki. W poprzednim raporcie na temat hydrodynamicznego wstrzyknięcia do miedniczki nerkowej, 100 µL roztworu DNA plasmidowego został...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

H.N. otrzymuje tantiemy z technologii związanych z AAV na licencji Takara Bio Inc. i Capsigen Inc., pełni rolę konsultanta dla firm biotechnologicznych, jest współzałożycielem Capsigen Inc. i posiada udziały w Capsigen Inc. oraz Sphere Gene Therapeutics.

Podziękowania

Dziękujemy Guangping Gao i James M. Wilson za dostarczenie nam pomocniczego plazmidu AAV9 oraz Katji Pekrun i Mark A. Kay za pomocniczy plazmid AAV-KP3.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.45 μm PVDF syringe filterMilliporeSigmaSLHVR33RS
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific05-408-129
15 mL polypropylene tubeCorning352097
16% paraformaldehyde (PFA)Electron Microscopy Sciences15710
250 mL centrifuge bottleFisher Scientific055641S24
2F Silicone tubingSai Infusion TechnologiesSIL-2-50 
25G butterfly needleMedex Supply26708
2-methylbutaneMilliporeSigmaMX0760
2x qPCR reaction bufferFisher Scientific43-676-59Power SYBR Green PCR Master Mix
30G needleBecton-Dickinson & Co305106
50 mL polypropylene tubeCorning430291
5-0 monofilament sutureEthiconY463G
5 M NaClLonza51202
6-0 absorbable sutureEthiconJ489G
7.5% Mini-PROTEAN TGX Precast
Protein Gels, 10-well, 30 µL		Bio-Rad4561023
Amersham ImageQuant 800 Western
Blot Imaging System (Cytiva)		Cytiva29459405
Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL tubeMillipore SigmaUFC910024
Anti-aquaporin 2 (AQP2) antibodyAbcamab199975A marker for collecting duct cells
Anti-Na-K-2Cl cotransporter 2
(NKCC2) antibody		StressMarq BiosciencesSPC-401A marker for thick ascending limb
cells
Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647
antibody		Jackson ImmunoResearch111-605-144
Anti-Wilms Tumor 1 (WT1) antibodyAbcamab89901A marker for podocytes
Beckman Coulter OptiSeal Tube,
Polypropylene, 29.9 mL		Fisher ScientificNC9691210
Beckman Coulter OPTISEAL TUBESFisher ScientificNC9611575
BenzonaseSigma-Aldrich1016970001
Bovine serum albumin (BSA)Sigma-Aldrich5470
Centrifugal ultrafiltration tubeMilliporeSigmaUFC9100Amicon 100 kDa MWCO, 15 mL
Ceramic bead tubeFisher Scientific15-340-154
Cesium chlorideSigma-AldrichC3032-1KG
Clamp applying forcepsFine Science Tools00071-14
Closed-loop heat padStryker Medical8002-062-012
Cotton-tipped applicatorPuritan806-WC
Cover glassFisher Scientific12-541B
Cryostat microtomeTanner ScientificTN50
Curved forcepsFine Science Tools11052-10
Curved-type micro vessel clipKleinert-Kutz65145Clamp for the renal artery and renal
vein
Dialysis cassetteFisher ScientificPIA52976
DNA extraction kitQiagen57704QIAamp MinElute Virus Spin Kit
D-SorbitolSigma-AldrichS6021-1KG
Dulbecco's Modified Eagle Medium-
high glucose		Corning15-013-CVDMEM-high glucose (4.5 g/L)
EDTAFisher Scientific15-575-020
EthanolDecon Laboratories2716GEA
Fetal bovine serum (FBS)VWR89510-186
Gas-tight glass syringeHamilton1710 TLL
Glutaraldehyde solutionSigma-AldrichG6257
Heat therapy pumpKent ScientificHTP-1500
HEPESSigma AldrichH4034-100G
Hoechst 33342InvitrogenH3570
HomogenizerFisher Scientific15-340-163
Human embryonic kidney (HEK) 293
cells		Agilent240073
Ice bucketFisher Scientific07-210-104
Infusion syringe pumpHarvard Apparatus70-4507
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-10
L-glutamineFisher Scientific25030-081
Liquid blocker penTed Pella22309
Lotus tetragonolobus lectin (LTL)-
Fluorescein		Vector LaboratoriesFL-1321-2A marker for proximal tubules
Magnesium chloride (MgCl2)MilliporeSigmaM1028
MeloxicamVetOneNDC 86136-012-10Analgesic
Microscope glass slideFisher Scientific12-550-15
Mounting mediumSouthernBiotech0100-01
Needle holderFine Science Tools12501-13
OCT compoundSakura Finetek4583
Ophthalmic ointmentBausch & LombNDC 24208-313-34
PE-10 polyethylene tubeBD427401Inner diameter: 0.28 mm
Penicillin & Streptomycin MixFisher Scientific15140-122
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific10010-049
Plastic cryomoldSakura Finetek4566
Poloxamer 188 Non-ionic Surfactant
(10%)		Fisher Scientific24-040-032
Polyethylene Glycol 800

Bibliografia

  1. Groopman, E. E., et al. Diagnostic utility of exome sequencing for kidney disease. N Engl J Med. 380 (2), 142-151 (2019).
  2. Hussien, H., Apetrii, M., Covic, A. Health-related quality of life in patients with chronic kidney disease. Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res. 21 (1), 43-54 (2021).
  3. Peek, J. L., Wilson, M. H. Cell and gene therapy for kidney disease. Nat Rev Nephrol. 19 (7), 451-462 (2023).
  4. Khare, V., Cherqui, S. Targeted gene therapy for rare genetic kidney diseases. Kidney Int. 106 (6), 1051-1061 (2024).
  5. Medaer, L., Veys, K., Gijsbers, R. Current status and prospects of viral vector-based gene therapy to treat kidney diseases. Hum Gene Ther. 35 (5-6), 139-150 (2024).
  6. Tavakolidakhrabadi, N., Ding, W. Y., Saleem, M. A., Welsh, G. I., May, C. Gene therapy and kidney diseases. Mol Ther Methods Clin Dev. 32 (4), 101333(2024).
  7. Miyazaki, M., Yamashita, T., Miyazaki, T., Taira, H., Suzuki, A. Gene delivery to renal tubular epithelial cells using adeno-associated virus vector in domestic cats. Res Vet Sci. 87 (3), 408-412 (2009).
  8. Qi, Y. F., et al. Comparison of the transduction efficiency of tyrosine-mutant adeno-associated virus serotype vectors in kidney. Clin Exp Pharmacol Physiol. 40 (1), 53-55 (2013).
  9. Takeda, S., et al. Successful gene transfer using adeno-associated virus vectors into the kidney: Comparison among adeno-associated virus serotype 1-5 vectors in vitro and in vivo. Nephron Exp Nephrol. 96 (4), e119-e126 (2004).
  10. Zhong, F., et al. Protein S Protects against Podocyte Injury in Diabetic Nephropathy. J Am Soc Nephrol. 29 (5), 1397-1410 (2018).
  11. Chen, S., et al. Gene delivery in renal tubular epithelial cells using recombinant adeno-associated viral vectors. J Am Soc Nephrol. 14 (4), 947-958 (2003).
  12. Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: Conclusion of a comparative study. Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).
  13. Wang, P., et al. Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway. Sci Transl Med. 10 (462), eaat2039(2018).
  14. Haddad, G., et al. Renal AAV2-mediated overexpression of long non-coding RNA H19 attenuates ischemic acute kidney injury through sponging of microRNA-30a-5p. J Am Soc Nephrol. 32 (2), 323-341 (2021).
  15. Asico, L. D., et al. Nephron segment-specific gene expression using AAV vectors. Biochem Biophys Res Commun. 497 (1), 19-24 (2018).
  16. Chung, D. C., et al. Adeno-associated virus-mediated gene transfer to renal tubule cells via a retrograde ureteral approach. Nephron Extra. 1 (1), 217-223 (2011).
  17. Ito, K., et al. Adeno-associated viral vector transduction of green fluorescent protein in kidney: Effect of unilateral ureteric obstruction. BJU Int. 101 (3), 376-381 (2008).
  18. Konkalmatt, P. R., et al. Renal rescue of dopamine D2 receptor function reverses renal injury and high blood pressure. JCI Insight. 1 (8), e85888(2016).
  19. Rubin, J. D., Nguyen, T. V., Allen, K. L., Ayasoufi, K., Barry, M. A. Comparison of gene delivery to the kidney by adenovirus, adeno-associated virus, and lentiviral vectors after intravenous and direct kidney injections. Hum Gene Ther. 30 (12), 1559-1571 (2019).
  20. Saito, S., et al. rAAV6-mediated miR-29b delivery suppresses renal fibrosis. Clin Exp Nephrol. 23 (12), 1345-1356 (2019).
  21. Shen, X., et al. Transparenchymal renal pelvis injection of recombinant adeno-associated virus serotype 9 vectors is a practical approach for gene delivery in the kidney. Hum Gene Ther Methods. 29 (6), 251-258 (2018).
  22. Wang, J. N., et al. Inhibition of METTL3 attenuates renal injury and inflammation by alleviating TAB3 m6A modifications via IGF2BP2-dependent mechanisms. Sci Transl Med. 14 (640), eabk2709(2022).
  23. Woodard, L. E., et al. Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo. Sci Rep. 7, 44904(2017).
  24. Woodard, L. E., et al. Hydrodynamic renal pelvis injection for non-viral expression of proteins in the kidney. J Vis Exp. (131), e56324(2018).
  25. Yadav, M. K., Yoo, K. W., Atala, A., Lu, B. Lentiviral vector mediated gene therapy for type Dent disease ameliorates Dent disease-like phenotypes for three months in CIC-5 null mice. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 149-166 (2022).
  26. Hillestad, M. L., Guenzel, A. J., Nath, K. A., Barry, M. A. A vector-host system to fingerprint virus tropism. Hum Gene Ther. 23 (10), 1116-1126 (2012).
  27. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  28. Ikeda, Y., Sun, Z., Ru, X., Vandenberghe, L. H., Humphreys, B. D. Efficient gene transfer to kidney mesenchymal cells using a synthetic adeno-associated viral vector. J Am Soc Nephrol. 29 (9), 2287-2297 (2018).
  29. Williams, R. M., et al. Mesoscale nanoparticles selectively target the renal proximal tubule epithelium. Nano Lett. 15 (4), 2358-2364 (2015).
  30. Lang, J. F., Toulmin, S. A., Brida, K. L., Eisenlohr, L. C., Davidson, B. L. Standard screening methods underreport AAV-mediated transduction and gene editing. Nat Commun. 10 (1), 3415(2019).
  31. Koike, H., et al. An efficient gene transfer method mediated by ultrasound and microbubbles into the kidney. J Gene Med. 7 (1), 108-116 (2005).
  32. Ishida, R., et al. Kidney-specific sonoporation-mediated gene transfer. Mol Ther. 24 (1), 125-134 (2016).
  33. Davis, L., Park, F. Gene therapy research for kidney diseases. Physiol Genomics. 51 (9), 449-461 (2019).
  34. Rubin, J. D., Barry, M. A. Improving molecular therapy in the kidney. Mol Diagn Ther. 24 (4), 375-396 (2020).
  35. Huang, S., et al. Application of ultrasound-targeted microbubble destruction-mediated exogenous gene transfer in treating various renal diseases. Hum Gene Ther. 30 (2), 127-138 (2019).
  36. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 18 (5), 358-378 (2019).
  37. Wang, J. H., Gessler, D. J., Zhan, W., Gallagher, T. L., Gao, G. Adeno-associated virus as a delivery vector for gene therapy of human diseases. Signal Transduct Target Ther. 9 (1), 78(2024).
  38. Furusho, T., et al. Enhancing gene transfer to renal tubules and podocytes by context-dependent selection of AAV capsids. Nat Commun. 15 (1), 10728(2024).
  39. Ding, W. Y., et al. Adeno-associated virus gene therapy prevents progression of kidney disease in genetic models of nephrotic syndrome. Sci Transl Med. 15 (708), eabc8226(2023).
  40. Wu, G., et al. Adeno-associated virus-based gene therapy treats inflammatory kidney disease in mice. J Clin Invest. 134 (17), e174722(2024).
  41. Pekrun, K., et al. Using a barcoded AAV capsid library to select for clinically relevant gene therapy vectors. JCI Insight. 4 (22), e131610(2019).
  42. Grimm, D., et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol. 82 (12), 5887-5911 (2008).
  43. Shen, S., et al. Engraftment of a galactose receptor footprint onto adeno-associated viral capsids improves transduction efficiency. J Biol Chem. 288 (40), 28814-28823 (2013).
  44. Dalkara, D., et al. In vivo-directed evolution of a new adeno-associated virus for therapeutic outer retinal gene delivery from the vitreous. Sci Transl Med. 5 (189), 189ra176(2013).
  45. Gomes, M. M., Wang, L., Jiang, H., Kahl, C. A., Brigande, J. V. A rapid, cost-effective method to prepare recombinant adeno-associated virus for efficient gene transfer to the developing mouse inner ear. Methods Mol Biol. 1427, 43-57 (2016).
  46. Powers, J. M., Chang, X. L., Song, Z., Nakai, H. A Quantitative dot blot assay for AAV titration and its use for functional assessment of the adeno-associated virus assembly-activating proteins. J Vis Exp. (136), e56766(2018).
  47. Adachi, K., Enoki, T., Kawano, Y., Veraz, M., Nakai, H. Drawing a high-resolution functional map of adeno-associated virus capsid by massively parallel sequencing. Nat Commun. 5, 3075(2014).
  48. Lu, Z. Y., et al. Constitutive and conditional gene knock-out mice for the study of intervertebral disc degeneration: Current status, decision considerations, and future possibilities. JOR Spine. 6 (1), e1242(2023).
  49. Kaspar, B. K., et al. Adeno-associated virus effectively mediates conditional gene modification in the brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (4), 2320-2325 (2002).
  50. Werfel, S., et al. Rapid and highly efficient inducible cardiac gene knock-out in adult mice using AAV-mediated expression of Cre recombinase. Cardiovasc Res. 104 (1), 15-23 (2014).
  51. Jinek, M., et al. A Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  52. Wang, X., Huang, X., Fang, X., Zhang, Y., Wang, W. CRISPR-Cas9 system as a versatile tool for genome engineering in human cells. Mol Ther Nucleic Acids. 5 (11), e388(2016).
  53. Ueki, K., et al. Establishment of pancreatic -cell-specific gene knock-out system based on CRISPR-Cas9 technology with AAV8-mediated gRNA delivery. Diabetes. 72 (11), 1609-1620 (2023).
  54. Marichal-Gallardo, P., et al. Single-use capture purification of adeno-associated viral gene transfer vectors by membrane-based steric exclusion chromatography. Hum Gene Ther. 32 (17-18), 959-974 (2021).
  55. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. J Virol Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  56. Chen, S. H., et al. A simple, two-step, small-scale purification of recombinant adeno-associated viruses. J Virol Methods. 281, 113863(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wektory AAVretrogradny wtrysk nerkowyterapia genowa nerektransdukcja kanalików proksymalnychAAV w CsClAAV w CUmodele chorób nerektransdukcja in vivo
Skuteczne i bezpieczne dostarczenie genów do nerki myszy poprzez powolne wstrzyknięcie wsteczne do miedniczki nerkowej wektorów adeno-stowarzyszonych wirusów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.