Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67719

⸱

17 stycznia 2025

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of South Carolina

W tym artykule

Podsumowanie

Zaburzenia laminopatii często prowadzą do zmian w otoczce jądrowej, co może powodować pęcherzyki jądrowe i wycieki. W badaniu przedstawiono metodę immunofluorescencji do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA), zapewniając środki do oceny struktury i integralności jądra w komórkach ssaków.

Streszczenie

Blaszka jądrowa to sieć włókien leżących pod błoną jądrową, złożona z lamin i białek związanych z laminą. Odgrywa kluczową rolę w architekturze jądrowej, pozycjonowaniu porów jądrowych, regulacji ekspresji genów, organizacji chromatyny, replikacji DNA i naprawie DNA. Mutacje w genach biorących udział w ekspresji lub przetwarzaniu potranslacyjnym białek laminy skutkują zaburzeniami genetycznymi znanymi jako laminopatie. W szczególności mutacje w genach LMNA lub ZMPSTE24 mogą prowadzić do akumulacji niecałkowicie przetworzonych form laminy A, które zachowują grupy farnezylowe i metylowe, których nie ma w pełni przetworzonej laminie A. Te niecałkowicie przetworzone białka laminy A lokalizują się w wewnętrznej błonie jądrowej zamiast w blaszce jądrowej, w której znajduje się dojrzała lamina A. Nieprawidłowo zlokalizowane białka laminy głęboko zaburzają funkcję i strukturę jądra, często powodując pęcherzenie jądrowe. W ciężkich przypadkach może dojść do pęknięcia jądra, powodując utratę kompartmentacji i wyciek genomowego DNA do cytozolu. Nieprawidłową strukturę jądrową i utratę kompartmentalizacji można zidentyfikować za pomocą immunofluorescencji pośredniej (IF) na utrwalonych komórkach. Niniejsze badanie przedstawia taką metodę, wykorzystując specyficzne przeciwciała przeciwko białku laminy i dwuniciowemu DNA (dsDNA) do jednoczesnej wizualizacji otoczki jądrowej i DNA. Takie podejście umożliwia szybką ocenę integralności strukturalnej jądra i potencjalnego wycieku jądrowego DNA do cytozolu.

Wprowadzenie

Lamina jądrowa to sieć włókien znajdująca się pod błoną jądrową, składająca się z białek zwanych laminami. Lamina jądrowa odgrywa kluczową rolę w architekturze jądra, rozmieszczeniu porów jądrowych, regulacji ekspresji genów, organizacji chromatyny, replikacji DNA oraz naprawie DNA1,2,3. Mutacje w genach biorących udział w ekspresji białek lamin prowadzą do zaburzeń genetycznych nazywanych laminopatiami3.

Restrykcyjna dermopatia (RD) to ciężkie zaburzenie z grupy laminopatii, wywoływane głównie przez złożone mutacje heterozygotyczne, które tworzą przedwczesne kodony stop w genie ZMPSTE244, co prowadzi do braku metaloproteazy ZMPSTE24. Laminopatia ta charakteryzuje się pozłodziejowym opóźnieniem wzrostu, napiętą i sztywną skórą, małą jamą ustną, rzadkimi włosami oraz wadami mineralizacji kości1. Pacjenci z RD zazwyczaj nie przeżywają pierwszego tygodnia życia z powodu niewydolności oddechowej1. Dwa inne zaburzenia z grupy laminopatii, znane jako atypowy zespół progerii Hutchinsona-Gilforda (AT-HGPS) oraz dysplazja żuchwowo-akralna typu B (MAD-B), wiążą się z obniżoną ekspresją ZMPSTE24, prowadzą do skrócenia długości życia i wykazują podobieństwo do zaburzeń przyspieszonego starzenia5. Proteaza ZMPSTE24, której aktywność jest zaburzona w tych laminopatiach, odgrywa kluczową rolę w modyfikacji potranslacyjnej laminy A, będącej krytycznym elementem blaszki jądrowej. Niedobór ZMPSTE24 skutkuje akumulacją niecałkowicie przetworzonej, farnesylowanej formy laminy A, znanej jako prelaminy A2.

Schemat przetwarzania laminy A; stan prawidłowy a niedobór ZMPSTE24; ścieżka farnesylacji i metylacji.
Rysunek 1Przetwarzanie laminy A w warunkach prawidłowych kontrakomórki RD. Szlak przetwarzania laminy A w komórkach prawidłowych (po lewej) oraz zaburzone przetwarzanie laminy A w komórkach z RD lub niedoborem ZMPSTE (po prawej). Oznaczono grupy farnesylowe (Fa) i metylowe (Me). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Jak pokazano na Rysunku 1, w prawidłowym procesowaniu laminy A grupa farnesylowa (lipidowa) zostaje przyłączona do reszty cysteiny w pobliżu końca C-końcowego, po czym następuje proteolityczne odcięcie trzech aminokwasów z końca C-końcowego3,6. Następnie reszta cysteiny ulega metylacji. Te dwie modyfikacje umożliwiają ukierunkowanie prelaminy A do wewnętrznej błony jądrowej2. Następnie ZMPSTE24 przeprowadza reakcję cięcia, w wyniku której ostatnie 15 aminokwasów z końca C-końcowego, wraz z grupami farnesylowymi i metylowymi, zostaje usuniętych, tworząc dojrzałe białko Lamin A, które jest dostarczane do laminy jądrowej6,7,8. W przypadku RD, AT-HGPS oraz MAD-B ostatni etap procesowania nie zachodzi efektywnie, ponieważ metaloproteinaza ZMPSTE24 jest nieobecna lub nie jest w pełni funkcjonalna8,9. Prowadzi to do akumulacji prelaminy A, która pozostaje trwale sfarnesylowana i zmetylowana9. Grupy te powodują, że prelaminy A przylega do wewnętrznej błony jądrowej zamiast lokalizować się w laminie jądrowej, gdzie ostatecznie powinna znajdować się dojrzała lamina A, co przedstawiono na Rysunku 1. W związku z tym niedobór ZMPSTE ma głęboki wpływ na strukturę jądra oraz szereg funkcji jądrowych10,11,12,13,14,15. Zmiany w strukturze jądra mogą obejmować pęcherzykowanie jądra (blebbing), a nawet przerwanie błony jądrowej, co może prowadzić do wycieku DNA do cytozolu oraz przenikania cytozolu do jądra. Nieprawidłowy kształt jąder jest rzeczywiście cechą charakterystyczną dla laminopatii, podobnie jak wiele innych fenotypów wywołanych wadliwym procesowaniem prelaminy A16,17. Defekty laminy jądrowej prowadzą do wielu niekorzystnych skutków, w tym do błędnej lokalizacji białek kontroli jakości białek jądrowych oraz białek naprawy DNA w nukleoplazmie, co z kolei skutkuje licznymi zaburzeniami funkcji jądra18. Ważne jest opracowanie prostej techniki, która pomogłaby identyfikować i monitorować te cechy laminopatii, aby ułatwić badania nad rozwojem podejść terapeutycznych mających na celu łagodzenie fenotypów tych schorzeń. W przypadku myszy z laminopatiami wykazano, że eliminacja pęcherzykowania jądra koreluje z ogólną eliminacją fenotypów laminopatii16. Technika umożliwiająca monitorowanie integralności jądra w ludzkich komórkach mogłaby usprawnić badania nad potencjalnymi metodami leczenia zmierzającymi do eliminacji lub znacznej poprawy fenotypów chorobowych.

Pośrednia immunofluorescencja (IF) jest czułą i powszechnie stosowaną techniką, która wykorzystuje zarówno nieznakowane przeciwciało pierwotne, jak i znakowane fluorochromem przeciwciało wtórne rozpoznające przeciwciało pierwotne w celu wykrycia interesującego celu19. Metody IF mogą stanowić potężne narzędzie do wizualizacji specyficznych wewnątrzkomórkowych komponentów i struktur. Istnieje również możliwość, że więcej niż jedna cząsteczka przeciwciała wtórnego wejdzie w interakcję z przeciwciałem pierwotnym, co prowadzi do wzmocnienia sygnału19. Pośrednia IF jest wszechstronną techniką, która pozwala również na wykrycie wielu przeciwciał pierwotnych przy użyciu stosunkowo niewielkiego zestawu przeciwciał wtórnych, ponieważ przeciwciała wtórne są wytwarzane przeciwko domenie Fc przeciwciała pierwotnego, która jest konserwatywna w obrębie gatunków19.

Niniejszy artykuł opisuje pośrednią metodę immunofluorescencji (IF) do oceny pęcherzykowania jądrowego (blebbing) i wycieku DNA w komórkach z niedoborem ZMPSTE24, z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko dwuniciowemu DNA (dsDNA) oraz laminie B1 w celu wykrycia odpowiednio DNA i błony jądrowej. Aby zademonstrować użyteczność tego podejścia, procedurę zastosowano do linii komórkowej HeLa z wyłączoną ekspresją ZMPSTE24, a także do linii komórkowej HeLa wykazującej ekspresję ZMPSTE24, a następnie porównano wyniki dla obu linii komórkowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły dotyczące używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Umieścić w autoklawie co najmniej dziesięć kwadratowych szkiełek nakrywkowych i kleszczyków o wymiarach 22 mm x 22 mm przed nałożeniem komórek galwanicznych na szkiełka nakrywkowe.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Uzupełnione podłoża: Przygotuj 500 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 jednostkami/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
  2. Bufor do rozcieńczania przeciwciał (ADB): Rozpuścić 2 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 g żelatyny rybnej w 80 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Doprowadzić do 100 ml z PBS po rozpuszczeniu BSA i żelatyny rybnej.
  3. 1x PBS-Tween (PBS-T): Przygotuj 500 ml PBS i 0,5 ml Tween. Umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, aż Tween będzie można łatwo wymieszać z roztworem.

3. Hodowla pożądanych komórek

UWAGA: Komórki HeLa były hodowane w tym protokole do konfluencji w kolbie T75.

  1. Spryskaj sześć szkiełek nakrywkowych 70% etanolem i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu na niestrzępiącej się chusteczce. Umieść szkiełka nakrywkowe na sterylnej 6-dołkowej płytce za pomocą kleszczyków, po jednym szkiełku nakrywkowym na studzienkę.
  2. Dodaj 2 ml uzupełnionego DMEM do każdego dołka na płytce 6-dołkowej.
  3. Odessać pożywkę z komórek i umyć komórki, dodając 15 ml PBS do kolby, delikatnie obracając. Odessać PBS i dodać 2 ml trypsyny-EDTA (trypsyny).
    1. Pokryć komórki trypsyną i umieścić kolbę z powrotem w inkubatorze z wilgotnością o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 2 minuty, aby umożliwić oderwanie komórek od kolby.
  4. Dodaj 8 ml uzupełnionego DMEM do kolby, aby zebrać trypsynizowane komórki. Pipetuj kilka razy w górę i w dół, aby oddzielić zlepiające się komórki. Zebrać zawiesinę komórek do kolby i umieścić ją w probówce z polistyrenu o pojemności 15 ml.
  5. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
  6. Dodaj 500 000 komórek, kropla po kropli, bezpośrednio na każde z szkiełek nakrywkowych w płytce 6-dołkowej. Pozostawić komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 w wilgotnym inkubatorze.

4. Utrwalanie i przenikanie komórek

  1. Przygotuj 4% roztwór formaldehydu na świeżo przed użyciem: Dodaj 2 ml 37,5% roztworu formaldehydu do 18 ml PBS. Dokładnie wymieszaj.
  2. Przygotować roztwór do permeabilizacji na świeżo przed użyciem: Dodać 100 μl Triton-X do 20 ml PBS. Pozostawić do inkubacji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kilka minut, aż Triton-X rozpuści się w roztworze. Dokładnie wymieszaj.
  3. Zassać pożywkę w dołkach płytki. Umyj komórki raz 2 ml PBS. Odessać wszystkie PBS ze studzienek.
  4. Dodaj 2 ml 4% roztworu formaldehydu do każdej studzienki. Pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Całkowicie odessać 4% formaldehydu ze studzienek.
  5. Umyj komórki 3 razy 2 ml PBS. Całkowicie usuń PBS ze studzienek po każdym myciu.
  6. Dodaj 2 ml roztworu przepuszczalnego do każdej studzienki. Pozostawić na 10 minut w temperaturze pokojowej. Całkowicie odessać roztwór przepuszczalny.
  7. Umyj komórki 3 razy 2 ml PBS. Całkowicie odessać PBS po pierwszych dwóch płukaniach, pozostawiając PBS w studzienkach po trzecim płukaniu.
    UWAGA: Komórki można przechowywać w ostatnim praniu PBS w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni po tym etapie, upewniając się, że płytka jest uszczelniona folią parafinową, aby uniknąć parowania cieczy. Jeśli procedurę można kontynuować, ten krok można pominąć.

5. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Usuń wszystkie PBS ze studzienek. Blokuj komórki, dodając 2 ml ADB do każdej studzienki i inkubuj w temperaturze pokojowej, kołysząc przez 30 minut.
  2. Pod koniec 30-minutowego czasu blokowania wymieszać rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego z ADB (rozcieńczenie 1:1,000 zarówno dla przeciwciał Laminy B1, jak i dsDNA, Tabela 1). Na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba 75 μl, dlatego 600 μl ADB, 0,6 μl pierwszorzędowego przeciwciała Laminy B i 0,6 μl przeciwciała dsDNA należy zmieszać na sześć szkiełek nakrywkowych. Dokładnie wymieszaj.
  3. Usuń ADB ze studzienek. Na płaskiej powierzchni przyklej taśmą kawałek folii parafinowej, który ma wystarczająco dużą powierzchnię, aby położyć wszystkie przetwarzane szkiełka nakrywkowe.
  4. Do każdego szkiełka nakrywkowego dodać 75 μl rozcieńczenia przeciwciał pierwotnych na błonę parafinową, upewniając się, że w ADB nie są pipetowane żadne pęcherzyki. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na kropli ADB za pomocą kleszczy.
  5. Przykryć szkiełka nakrywkowe z inkubacji pokrywką płytki dołkowej i pozostawić do inkubacji na 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej za pomocą kleszczy i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem w płytce 6-dołkowej, stroną z komórką skierowaną do góry.
  7. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 2 ml PBS-T, kołysząc za każdym razem przez 3-5 minut. Usuń cały PBS-T ze studzienek po każdym myciu.
  8. Podczas ostatniego płukania należy przygotować rozcieńczenie przeciwciał drugorzędowych (1:1 000 dla obu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych, tabela 1). Na każde szkiełko nakrywkowe potrzeba 75 μl, dlatego należy zmieszać 600 μl ADB i 0,6 μl obu drugorzędowych przeciwciał oznaczonych Alexa Fluor na sześć szkiełek nakrywkowych. Dokładnie wymieszaj. Przykryj wtórne rozcieńczenie przeciwciał przed światłem tak bardzo, jak to możliwe.
powiedział:
Przeciwciałoźródłofirmaodniesienie
dsDNA Marker Przeciwciało (HYB331-01)Mysz monoklonalnaSanta CruzSC-58749
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 488kozaRybak termiczny A32723
Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor Plus 405kozaInvitrogenA31553
Przeciwciało poliklonalne Laminy B1królikTechnologia białkowa12987-1-AP
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H+L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 594kozaInvitrogenNr kat. A11037

Tabela 1: Przeciwciała. Lista wszystkich przeciwciał użytych w tym protokole.

  1. Usuń cały PBS-T z ostatniego prania. Szkiełka nakrywkowe inkubować w drugorzędowym rozcieńczeniu przeciwciał na folii parafinowej, jak w kroku 5, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chronić przed światłem na tym etapie i we wszystkich pozostałych etapach. Małe pudełko może służyć do osłaniania światła. Upewnij się, że pracujesz szybko, gdy zajdzie taka potrzeba, aby dodać lub usunąć roztwory ze studzienek.
  2. Usuń szkiełka nakrywkowe z folii parafinowej za pomocą kleszków i umieść szkiełka nakrywkowe z powrotem na płytce 6-dołkowej, komórką do góry.
  3. Umyj szkiełka nakrywkowe 3 razy 2 ml PBS-T. Usuń cały PBS-T ze studzienek po każdym myciu.
  4. Odwodnić szkiełka serią etanolu (70%, 90%, 100%). Zacznij od dodania 2 ml 70% etanolu do każdej studzienki. Pozostaw na 1-2 minuty i usuń cały etanol z studzienek. Powtórz z pozostałą zawartością procentową etanolu.
  5. Usuń szkiełka nakrywkowe ze studzienek za pomocą kleszczy i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu, chronione przed światłem, na niestrzępiącej się ściereczniku.
  6. Zamontuj szkiełko nakrywkowe stroną z komórką do dołu na szklanych szkiełkach mikroskopowych, używając 20 μl podłoża mocującego na szkiełko nakrywkowe. Pozostawić do wyschnięcia na noc, chronić przed światłem.

6. Akwizycja obrazu

  1. Przed obrazowaniem pokryj krawędzie szkiełek nakrywkowych cienką warstwą przezroczystego lakieru do paznokci (wystarczy dowolna marka lub rodzaj). Pozostawić do wyschnięcia na powietrzu, chronić przed światłem.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące używania mikroskopu do obrazowania będą się różnić w zależności od używanego mikroskopu. Rozdzielczość kamery w użytym tutaj mikroskopie wynosi 1280 x 960 pikseli. Wystarczy podobna lub lepsza rozdzielczość.
  2. Przed umieszczeniem szkiełka na stoliku mikroskopu należy dostosować ustawienia zapisywania plików. Włącz mikroskop i włóż dysk USB. Dostosuj ustawienia zapisywania w ustawieniach mikroskopu i upewnij się, że wszystkie kanały (GFP i RFP) zostaną zapisane osobno i że obrazy trafiają do właściwej lokalizacji na dysku USB.
    UWAGA: Utwórz folder na dysku USB i nadaj każdemu szkiełku nakrywkowemu własną nazwę do wykorzystania w przyszłości.
  3. Przed obrazowaniem spryskaj niestrzępiącą się chusteczką z 70% etanolem i delikatnie wyczyść tylną część szkiełek. Delikatnie wyczyść przód prowadnic, upewniając się, że wywierany jest bardzo minimalny nacisk.
  4. Umieść czysty szkiełko podstawowe na mikroskopie, szkiełkami nakrywkowymi skierowanymi w dół. Przykryj pudełkiem z osłoną świetlną.
  5. Używając soczewki obiektywowej 40x, użyj odpowiedniego kanału (RFP dla zastosowanego tutaj przeciwciała laminy B1), aby zlokalizować jądra na ekranie mikroskopu. Na początek dostosuj natężenie światła do około 50%.
  6. Aby sprawdzić, czy nie ma przesyconych obszarów, wybierz opcję Color Off (Wyłącz kolor) i upewnij się, że żadne obszary na szkiełku nakrywkowym nie mają czerwonego sygnału w trybie czarno-białym. Jeśli jest dużo czerwonego sygnału, zmniejsz natężenie światła, aż pojawi się minimalny czerwony sygnał.
    UWAGA: Czerwony sygnał oznacza przesycenie. Jeśli jądra wydają się ledwo widoczne, zwiększaj intensywność o 10% przyrosty, aż do uzyskania odpowiedniej intensywności bez przesycenia.
  7. Sprawdź wszystkie inne szkiełka nakrywkowe z taką samą intensywnością, aby upewnić się, że nie są przesycone. Sprawdź wszystkie szkiełka nakrywkowe z drugim kanałem, korzystając z tego samego procesu, co powyżej (GFP dla zastosowanego tutaj przeciwciała dsDNA).
  8. Nagrywaj natężenie światła dla każdego kanału. Upewnij się, że wszystkie natężenia światła dla każdego kanału są utrzymywane na stałym poziomie przez cały proces obrazowania.
  9. Zobrazuj każde szkiełko nakrywkowe z osobna. Zacznij od pierwszego kanału, skup jądra i uchwyć obraz.
  10. Ostrożnie przełącz kanały i ponownie ustaw ostrość komórek. Po ustawieniu ostrości uchwyć obraz.
  11. Po przechwyceniu obrazów w odpowiednich kanałach (GFP i RFP) wybierz opcję Nakładka, aby obserwować scalony obraz i upewnić się, że slajd nie porusza się podczas robienia obrazu. Jeśli kanały nie nakładają się na siebie, powtórz wymagany kanał, aż obrazy się wyrównają.
  12. Zapisz obraz, klikając ikonę dysku flash. Przenieś się w inne miejsce na szkiełku nakrywkowym, aby kontynuować obrazowanie.
    UWAGA: Upewnij się, że za każdym razem obrazowany jest inny obszar szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć wielokrotnego rejestrowania tego samego obszaru. Zaleca się rozpoczęcie obrazowania od lewego górnego rogu szkiełka nakrywkowego i przesuwanie w układzie "S", aby zapewnić pełne pokrycie bez duplikacji.

7. Analiza danych

  1. Dane uzyskane tą metodą mają charakter wizualny. Zbadaj obrazy pod kątem oznak wycieku DNA lub pęcherzyków jądrowych. Przykłady pęcherzyków i wycieków przedstawiono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Niniejsza praca przedstawia metodę immunofluorescencji (IF) do wizualizacji blaszki jądrowej wraz z dwuniciowym DNA (dsDNA). Po przeprowadzeniu metody IF, uzyskane obrazy mogą zostać poddane analizie pod kątem występowania pęcherzykowania jądra komórkowego oraz wycieku DNA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony protokół zawiera kilka krytycznych etapów, z których najważniejszym jest leczenie utrwalonych komórek przeciwciałami pierwszorzędowymi i wtórnymi. Zapewnienie użycia dobrej jakości przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko badanemu celowi z odpowiednim odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym z fluoroforami w zakresie użytego mikroskopu przyniesie optymalne wyniki19. Jakość przeciwciała może mieć duży wpływ na wyniki tej techniki, ponieważ wadliwe przeciwciała mogą wchodzić w interakcj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant R03AG064525 dla ASW przez National Institute on Aging. Chcielibyśmy podziękować dr Jasonowi A. Stewartowi za pomoc w mentoringu technicznym oraz laboratorium Hui Chen za udostępnienie używanego mikroskopu. Chcielibyśmy również podziękować Fabio Martinonowi za linie komórkowe HeLa użyte w tych eksperymentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka nakrywkowe kwadratowe 22 mmPropper Manufacturing CompanyM8710Można użyć dowolnego rozmiaru lub kształtu, o ile można je przymocować do standardowego szkiełka mikroskopowego.
36,5% FormaldehydSigma AldrichF8775Odczynnik utrwalający. 
75 cm 2 kolbyCorning430725UDo hodowli komórkowych.
Surowica bydlęca Albinum (BSA)Fisher Scientific9048-46-8Bufor do rozcieńczania przeciwciał. 
DMEM z 1 g/L glukozy, L-glutaminą i pirogronianem soduCorning10-014-CVDo hodowli komórkowych.
Etanol (200 Proof)Decon Laboratories2701Do odwadniania próbek przed montażem, rozcieńczony w celu uzyskania wielu stężeń. 
EVOS FL Cyfrowy mikroskop odwróconej fluorescencjiFisher Scientific12-563-460Obrazowanie. 
Żelatyna rybnaSigma AldrichG7041Bufor do rozcieńczania przeciwciał. 
Fluoromount-GSouthern Biotech0100-01Podłoże montażowe zapobiegające fotowybielaniu. 
Parafilm (4 cale)Fisher Scientific13-374-12Można zastąpić dowolny rozmiar, o ile używane szkiełka nakrywkowe mogą pasować.
Penicylina-StreptomycynaGibco15-140-122Do hodowli komórkowych.
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)N/AN/AWytwarzana i sterylizowana w laboratorium do hodowli tkankowych i roztworów.
Premium Płodowa Surowica Bydlęca (FBS)Atlanta BiologicalsS11150Do hodowli komórkowych. 
Szkiełka mikroskopowe Superfrost PremiumFisher Scientific12-544-7Można używać dowolnych standardowych szkiełek mikroskopowych.
Hodowla tkankowa 6-dołkowe płytki z płaskim dnemFalcon353046Do hodowli komórkowych.
TritonX-100Thermofisher ScientificA16046. APDo prania.
Trypsyna-EDTA (0,5%)Gibco15-400-054Do hodowli komórkowych. 
Tween 20Fisher Scientific9005-64-5Odczynnik do przenikania komórek. 

Bibliografia

  1. Navarro, C. L., et al. New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update. Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).
  2. Dittmer, T. A., Misteli, T. The lamin protein family. Genome Biol. 12 (222), 1-16 (2011).
  3. Gruenbaum, Y., Margalit, A., Goldman, R. D., Shumaker, D. K., Wilson, K. L. The nuclear lamina comes of age. Nat Rev Mol Cell Biol. 6, 21-31 (2005).
  4. Navarro, C. L., et al. Lamin A and ZMPSTE24 (FACE-1) defects cause nuclear disorganization and identify restrictive dermopathy as a lethal neonatal laminopathy. Hum Mol Genet. 13 (20), 2493-2503 (2004).
  5. Barrowman, J., Wiley, P. A., Hudon-Miller, S. E., Hrycyna, C. A., Michaelis, S. Human ZMPSTE24 disease mutations: Residual proteolytic activity correlates with disease severity. Hum Mol Genet. 21 (18), 4084-4093 (2012).
  6. Richards, S., Muter, J., Ritchie, P., Lattanzi, G., Hutchison, C. The accumulation of un-repairable DNA damage in laminopathy progeria fibroblasts is caused by ROS generation and is prevented by treatment with N-acetyl cysteine. Hum Mol Genet. 20 (20), 3997-4004 (2011).
  7. Davies, B. S., Fong, L. G., Yang, S. H., Coffinier, C., Young, S. G. The post-translational processing of prelamin A and disease. Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 153-174 (2009).
  8. Barrowman, J., Hamblet, C., George, C. M., Michaelis, S. Analysis of prelamin A biogenesis reveals the nucleus to be a CaaX processing compartment. Mol Biol Cell. 19, 5398-5408 (2008).
  9. Young, S., Meta, M., Yang, S. H., Fong, L. G. Prelamin A farnesylation and progeroid syndromes. J Biol Chem. 281 (52), 39741-39745 (2006).
  10. Houthaeve, G., Robijns, J., Braeckmans, K., De Vos, W. H. Bypassing border control: Nuclear envelope rupture in disease. Physiol. 33 (1), 39-49 (2017).
  11. Schreiber, K. H., Kennedy, B. K. When lamins go bad: Nuclear structure and disease. Cell. 152 (6), 1365-1375 (2013).
  12. Fong, L. G., et al. Heterozygosity for Lmna deficiency eliminates the progeria-like phenotypes in Zmpste24-deficient mice. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (52), 18111-18116 (2004).
  13. Pendas, A. M., et al. Defective prelamin A processing and muscular and adipocyte alterations in Zmpste24 metalloproteinase-deficient mice. Nat Genet. 31, 94-99 (2002).
  14. Goldman, R. D., et al. Accumulation of mutant lamin A causes progressive changes in nuclear architecture in Hutchinson-Gilford progeria syndrome. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 8963-8968 (2004).
  15. Eriksson, M., et al. Recurrent de novo point mutations in lamin A cause Hutchinson–Gilford progeria syndrome. Nature. 423, 293-298 (2003).
  16. Young, S. G., Fong, L. G., Michaelis, S. Thematic review series: Lipid post-translational modifications. Prelamin A, Zmpste24, misshapen cell nuclei, and progeria—new evidence suggesting that protein farnesylation could be important for disease pathogenesis. J Lipid Res. 46 (12), 2531-2558 (2005).
  17. Worman, H. J., Michaelis, S. Prelamin A and ZMPSTE24 in premature and physiological aging. Nucleus. 14 (1), 1-17 (2023).
  18. Pande, S., Ghosh, D. K. Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases. FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).
  19. Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence techniques. J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).
  20. Kumar, V. Immunofluorescence and enzyme immunomicroscopy methods. J Immunoassay Immunochem. 21 (2-3), 235-253 (2000).
  21. Tjaden, A., Giessmann, R. T., Knapp, S., Schroder, M., Muller, S. High-content live-cell multiplex screen for chemogenomic compound annotation based on nuclear morphology. STAR Protoc. 3 (101791), 1-15 (2022).
  22. Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability. Sci Rep. 14, 6013(2024).
  23. Yu, L., Liu, P. Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).
  24. Odinammadu, K. O., et al. The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B. Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Barwienie immunofluorescencyjnelamina j drowalaminopatienaprawa DNAknockout ZMPSTE24kom rki HeLaotoczka j drowadwuniciowe DNA
Wykrywanie pęcherzyków jądrowych i wycieku DNA w komórkach ssaków za pomocą immunofluorescencji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.