Obrazowanie sygnałów^Ca2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Układ naczyniowy płuc odgrywa ważną rolę w wymianie gazów, dodawaniu tlenu i usuwaniu dwutlenku węgla z krwi^1,2. Tętnice płucne (PA) otrzymują krew ubogą w tlen z prawego serca. Wymiana gazowa zachodzi na poziomie naczyń włosowatych (naczyń włosowatych pęcherzyków płucnych), a krew bogata w tlen jest dostarczana do lewego serca przez żyły płucne (PV). W przeciwieństwie do innych żył, które przenoszą krew ubogą w tlen, PV pełnią ważną funkcję dostarczania krwi bogatej w tlen do lewego serca, a w konsekwencji do ważnych narządów w ciele. Jednak mechanizmy sygnalizacyjne, które regulują funkcję PV w warunkach normalnych i chorobowych, są słabo poznane.

Badania nad układem naczyń płucnych koncentrowały się głównie na PA i naczyniach włosowatych płuc. Ostatnie badania pokazują, że sygnały Ca²⁺ w warstwach komórek śródbłonka i mięśni gładkich mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji PAs^3,4,5. Ponadto nieprawidłowe mechanizmy sygnalizacji Ca^{2 +} są odpowiedzialne za upośledzenie funkcji PA i naczyń włosowatych płuc w stanach chorobowych^6,7,8,9,10. Jednak badania nad żyłami wewnątrzpłucnymi (małymi PV) pozostają nieliczne. Aktywność ektopowa w dużych PV przylegających do lewego serca (PVs sercowych) została zaproponowana jako źródło migotania przedsionków u ludzi^11,12, oraz spontaniczna pulsacja¹³ i sygnały Ca^2+12,14,15 zostały również pokazane w dużych PV. Małe PV dostarczają krew bogatą w tlen do dużych PV. Jednak mechanizmy sygnalizacji Ca²⁺ w małych PV nie były badane pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym.

W tym manuskrypcie wprowadzamy nową metodę izolacji, kaniulacji i zwiększania ciśnienia małych PV oraz obrazowania sygnałów Ca²⁺ w miocytach PV za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Ogólnym celem tej metody jest rejestracja spontanicznych i indukowanych sygnałów Ca²⁺ w małych miocytach PV pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym. Ciśnienie śródświetlne odgrywa kluczową rolę w regulacji sygnałów Ca²⁺ w miocytach¹⁶. Zazwyczaj PV są poddawane fizjologicznemu ciśnieniu śródświetlnemu w zakresie od 4 do 10 mm Hg^17,18. Zmiany ciśnienia śródświetlnego w całym cyklu pracy serca mogą wpływać na sygnały Ca²⁺ w miocytach PV. Dlatego ważne jest, aby zastosować technikę, która pozwoli nam badać te sygnały w warunkach fizjologicznych i badać, jak wpływają na nie różne ciśnienia śródświetlne. Ponadto większość wcześniejszych badań nad PV koncentrowała się na większych PV serca. Obecna technika koncentruje się na małych ogniwach fotowoltaicznych znajdujących się głęboko w płucach, co może być bardziej istotne dla zrozumienia regulacji czynności płuc zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii (protokoły 4100 i 4120). Myszy C57BL6/J w wieku 10-12 tygodni są poddawane eutanazji za pomocą pentobarbitalu (90 mg/kg; dootrzewnowo), a następnie zwichnięciu szyjki macicy w celu pobrania tkanki płucnej^3,4,19,20.

1. Izolacja małych paneli fotowoltaicznych

1. Wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania 100% etanolem, a następnie umyj wodą dejonizowaną.
2. Użyj nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc.
3. Umieścić tkankę na płytce pokrytej preparatem Sylgard zawierającej zimny (4-10 °C) roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPS (HEPES-PSS, w mM, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂ heksahydrat, 2 CaCl₂ dwuwodny i 7 dekstroza, pH dostosowane do 7,4 przy użyciu 1 M NaOH)^3,4,19. Użyj szpilek do rozwarstwienia, aby przygwoździć serce i płuca tak, aby duże PV i PA były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty, jak pokazano na Rysunek 1.
4. Używając dużych żył płucnych (PV) jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły wewnątrzpłucne (małe PV o średnicy około 50-100 μm, oznaczone przerywanym prostokątem w Rysunek 1) za pomocą cienkich nożyczek. Upewnij się, że unikasz bezpośredniego kontaktu z małymi PV. Delikatnie odizoluj małe PV od otaczającej tkanki.
5. Odizoluj segmenty małych paneli fotowoltaicznych o długości około 1-2 mm. Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS.

2. Ładowanie małych paneli fotowoltaicznych za pomocą wskaźnika Ca²⁺

UWAGA: Z małymi PV należy obchodzić się ostrożnie, upewniając się, że kleszcze dotykają tylko końcówek PVs. Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej^3,7,20,21.

1. Przygotuj stężenie zapasowe 2,5 mM Fluo-4 AM z DMSO^3,4. Korzystając z powyższego roztworu podstawowego, przygotować 10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego z HEPES-PSS.
2. Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w probówce o pojemności 1,5 ml z roztworem ładującym (10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego w HEPES-PSS)^3,4. Przykryć probówkę folią aluminiową i umieścić w łaźni wodnej do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
3. Po inkubacji ostrożnie zastąpić roztwór nasycający roztworem o temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS i trzymać na lodzie przez 30 minut jako etap mycia.

3. Kaniulacja małych PV

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej^3,20,21.

1. Przygotuj komorę miografii ciśnieniowej z dwiema szklanymi kaniulami, po jednej z każdej strony. Napełnij kaniule PSS (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂ 160 sześciowodzian, 2,5 mM CaCl₂ dwuwodny^3,4,21,22, 7 mM dekstrozy i 24 mM NaHCO₃, utrzymywane w pH 7,4 przez bulgotanie roztworu z 21% O₂ i 5% CO₂) za pomocą strzykawki 10 ml.
2. Usuń niewielką cząstkę PV z roztworu myjącego i umieść ją w komorze miografii ciśnieniowej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małego PV na jedną z kaniul. Następnie, za pomocą mikrofilamentu wykonanego z nylonowej nici, zawiąż węzeł wokół kaniulowanego końca małej PV i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć.
3. Delikatnie przepchnij PSS przez kaniulę, aby usunąć krew z PV. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien, jak pokazano na Rysunek 1.

4. Zwiększanie ciśnienia iobrazowanie Ca²⁺ małych PV

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej^3,21.

1. Za pomocą regulatora ciśnienia serwomechanizmu podłączonego do rurki zawierającej PSS, zwiększ ciśnienie w małym ogniwie fotowoltaicznym z jednego końca na poziomie 5 mm Hg. Użyj pompy perystaltycznej podłączonej zarówno do wlotu, jak i wylotu, aby przelać PSS. Utrzymać temperaturę superfusatu na poziomie 37 °C.
2. Po okresie równoważenia uzyskaj obrazy Ca²⁺ przez 1000 klatek (liczba klatek na sekundę: 30 klatek na sekundę) za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie (NA 0,8) i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem. Wzbudzić Fluo-4 za pomocą lasera na ciele stałym o długości fali 488 nm i wychwycić emitowaną fluorescencję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 525/36 nm.
3. Zastosuj antagonistę receptora ryanodine (RyR) ryanodine (5 μM)^21,23 do superfuzatu. Poczekaj 5 minut. Zrób ponownie zdjęcia Ca²⁺ zgodnie z powyższym opisem, przechwytując kolejne 1000 klatek z szybkością 30 klatek/s.

5. Analiza obrazu Ca²⁺

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej^21,22,24. Zmiany w aktywności sygnałów Ca^{2 +} w miocytach PV mogą dostarczyć ważnych informacji na temat hamowania lub wzmacniania sprzężenia wzbudzenie-skurcz w PV.

1. Użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania (opracowanego przez dr Adriana Boneva, https://github.com/vesselman/SparkAn) do analizy obrazów Ca²⁺.
2. Płynne obrazy dzięki filtrowi boxcar 5 x 5 i filtrowi mediany 5 x 5. Użyj ramki wyznaczającej płaski obszar PV z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.
3. Kliknij Widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Użyj następujących ustawień: próg zdarzenia przy amplitudzie 1,3 F/F₀, tolerancja 20%, pole skanowania 7 x 7 pikseli i średnia bieżąca 7 obrazów. Generuj średnie obrazy automatycznie co 10 obrazów, zaczynając od pierwszego obrazu.
4. Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie (ikona oka). Znajdź tabelę zdarzeń zapisaną jako Zaznacz plik w menu Plik. Aby obliczyć zdarzenia na μm², podziel liczbę wykrytych sygnałów Ca²⁺ przez obszar wybranej ramki.

Rysunek 2A pokazuje pole widzenia z małego PV przy ciśnieniu śródświetlnym 5 mm Hg. Symbole + wskazują automatycznie wykryte sygnały Ca2+ w wybranej klatce (Wideo 1), oznaczone zielonym konturem. Z każdej fotowoltaiki zarejestrowano jedno pole widzenia, a z każdej myszy wykorzystano jedno pole widzenia. Jedna mała PV została uznana za n=1. Liczbę sygnałów Ca2+ na μm2 na minutę porównano przed i 5 minut po dodaniu inhibitora RyR ryanodyny (5 μM)23 w sparowanych eksperymentach. Sparowany test t został wykorzystany do porównań statystycznych w celu wykrycia istotnych różnic. Liczba spontanicznie występujących sygnałów Ca2+ wynosiła 0,73 ± 0,2 zdarzenia na minutę na μm2 (Rysunek 2B,C) w warunkach opisanych powyżej. Leczenie ryanodyną prawie całkowicie zahamowało sygnały Ca2+ w małych ogniwach fotowoltaicznych (Rysunek 2C, wideo 2), na co wskazuje drastyczne zmniejszenie liczby zdarzeń na minutę na μm2. Dane te pokazują, że spontaniczna aktywność sygnałów Ca2+ w warstwie miocytów z małych PV pod ciśnieniem reprezentuje otwory RyRs. Wyniki te dostarczają dowodów na to, że aktywność sygnałów Ca2+ można badać w małych PV pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym. Metoda ta ułatwi przyszłe badania nad wpływem ciśnienia śródświetlnego i mediatorów neurohumoralnych na sygnalizację Ca2+ w małych miocytach PV, potencjalnie oferując cenne informacje na temat regulacji funkcji PV. Podczas gdy obecne badanie koncentruje się na liczbie sygnałów RyR Ca2+, możliwa jest również analiza właściwości kinetycznych tych sygnałów, w tym czasu trwania, amplitudy, rozrzutu przestrzennego i czasu narastania. Zrozumienie, w jaki sposób bodźce fizjologiczne i patologiczne wpływają na właściwości kinetyczne sygnałów RyR Ca2+, może dostarczyć ważnych informacji dotyczących regulacji funkcji PV zarówno w stanach zdrowych, jak i chorych.

Rysunek 1: Przygotowanie i obrazowanie Ca2+ PVs. Sekwencyjne obrazy przedstawiające identyfikację i izolację małych PV, inkubację fluo4-AM, kaniulację i zwiększanie ciśnienia (5 mm Hg), szybkie obrazowanie konfokalne z wirującym dyskiem i analizę obrazu. Przerywany prostokąt na ilustracji po lewej stronie reprezentuje PV użytą do badania. Skróty: PA = tętnica płucna; RA = prawe przedsionek; PV = żyła płucna; LA = lewe przedsionek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Analiza obrazowania Ca2+. (A) Obrazy pola widzenia z ciśnieniowego (5 mm Hg), wypełnionego fluo-4, małego PV przy braku (po lewej) lub obecności ryanodyny (5 μM; Inhibitor RyR, po prawej). Zielony prostokąt oznacza obszar, który został wybrany do automatycznej detekcji sygnałów Ca2+. Znaki + reprezentują automatycznie wykryte zdarzenia w ramce. Czerwone znaki oznaczają sygnały o powierzchni mniejszej niż 3000μm2, natomiast niebieskie oznaczają sygnały, które zajmowały obszar większy niż 3000μm2. Każdy znak + oznacza jedno zdarzenie lub sygnał Ca2+. (B) F/F0 ślady wykrytych zdarzeń z wybranego obszaru wskazanego w A, pokazujące aktywność sygnałów Ca2+ w warstwie miocytów od małych PV pod ciśnieniem w warunkach podstawowych (po lewej) i w obecności ryanodyny (po prawej). (C) Kwantyfikacja zdarzeń na minutę na μm2 sygnałów Ca2+ w małych PV przed i po dodaniu ryanodyny (1 PV na mysz; n = 6 myszy; **p < 0,01 vs Basal; sparowany test t). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Sygnały Ca2+ w małym PV pod ciśnieniem 5 mm Hg przed leczeniem ryanodyną. Pole widzenia reprezentuje wybraną klatkę, pokazaną na zielono w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Sygnały Ca2+ w małym PV pod ciśnieniem 5 mm Hg po leczeniu ryanodyną (5 μM). Pole widzenia reprezentuje wybraną klatkę, pokazaną na zielono w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.