Obrazowanie sygnałówCa2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

Yen-Lin Chen; Kyosuke Kazama; Vihaan Vattipally; Swapnil K. Sonkusare

doi:10.3791/67722

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie sygnałów^Ca2+ w małych żyłach płucnych przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym

903 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67722

⸱

21 marca 2025

Yen-Lin Chen¹ , Kyosuke Kazama¹ , Vihaan Vattipally¹ , Swapnil K. Sonkusare¹^,²

¹Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, ²Department of Molecular Physiology and Biological Physics, University of Virginia

W tym artykule

Podsumowanie

W tym protokole prezentujemy nowatorską technikę rejestrowania i analizowania sygnałów Ca²⁺ w żyłach wewnątrzpłucnych (małe żyły płucne lub PV) przy fizjologicznym ciśnieniu śródświetlnym. Technika ta obejmuje izolację małych PV, inkubację ich za pomocą wskaźnika Ca²⁺, kaniulowanie i zwiększanie ciśnienia, obrazowanie konfokalne sygnałów Ca²⁺ oraz analizę danych.

Streszczenie

Żyły płucne (PV) przenoszą bogatą w tlen krew z płuc z powrotem do lewego serca, pełniąc w ten sposób ważną funkcję w dostarczaniu bogatej w tlen krwi do ważnych organów. Jednak większość badań nad unaczynieniem płuc koncentrowała się na tętnicach płucnych i naczyniach włosowatych w warunkach normalnych i chorobowych. Sygnały Ca²⁺ są krytycznymi regulatorami funkcji naczyń krwionośnych. Pomimo krytycznych fizjologicznych ról PV, sygnały Ca²⁺ w małych wewnątrzpłucnych PV nie zostały zarejestrowane w warunkach fizjologicznych. W tym miejscu opisujemy technikę rejestrowania aktywności sygnału Ca²⁺ w mysich PV izolowanych, kaniulowanych i pod ciśnieniem 5 mmHg. Włączając wskaźnik Ca^{2 +}, możemy badać sygnały Ca^{2 +} w warstwie miocytów małych PV za pomocą szybkiego, wirującego obrazowania konfokalnego dysku w warunkach fizjologicznych. Nasze reprezentatywne dane wskazują, że sygnały Ca²⁺ w małych miocytach PV są pośredniczone przez otwory kanałów jonowych receptora ryanodine. Metoda ta będzie cieszyła się dużym zainteresowaniem badaczy zajmujących się fizjologią i zaburzeniami naczyń płucnych.

Wprowadzenie

Układ naczyniowy płuc odgrywa ważną rolę w wymianie gazów, dodawaniu tlenu i usuwaniu dwutlenku węgla z krwi¹^,². Tętnice płucne (PA) otrzymują krew ubogą w tlen z prawego serca. Wymiana gazowa zachodzi na poziomie naczyń włosowatych (naczyń włosowatych pęcherzyków płucnych), a krew bogata w tlen jest dostarczana do lewego serca przez żyły płucne (PV). W przeciwieństwie do innych żył, które przenoszą krew ubogą w tlen, PV pełnią ważną funkcję dostarczania krwi bogatej w tlen do lewego serca, a w konsekwencji do ważnych narządów w ciele. Jednak mechanizmy sygnalizacyjne, które regulują funkcję PV w warunkach normalnych i chorobowych, są słabo poznane.

Badania nad układem naczyń płucnych koncentrowały się głównie na PA i naczyniach włosowatych płuc. Ostatnie badania pokazują, że sygnały Ca²⁺ w warstwach komórek śródbłonka i mięśni gładkich mają kluczowe znaczenie w regulacji funkcji PAs³^,⁴^,⁵. Ponadto nieprawidłowe mechanizmy sygnalizacji Ca^{2 +} są odpowiedzialne za upośledzenie funkcji PA i naczyń włosowatych płuc w stanach chorobowych⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰. Jednak badania nad żyłami wewnątrzpłucnymi (małymi PV) pozostają nieliczne. Aktywność ektopowa w dużych PV przylegających do lewego serca (PVs sercowych) została zaproponowana jako źródło migotania przedsionków u ludzi¹¹^,¹², oraz spontaniczna pulsacja¹³ i sygnały Ca²⁺¹²^,¹⁴^,¹⁵ zostały również pokazane w dużych PV. Małe PV dostarczają krew bogatą w tlen do dużych PV. Jednak mechanizmy sygnalizacji Ca²⁺ w małych PV nie były badane pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym.

W tym manuskrypcie wprowadzamy nową metodę izolacji, kaniulacji i zwiększania ciśnienia małych PV oraz obrazowania sygnałów Ca²⁺ w miocytach PV za pomocą szybkiej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem. Ogólnym celem tej metody jest rejestracja spontanicznych i indukowanych sygnałów Ca²⁺ w małych miocytach PV pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym. Ciśnienie śródświetlne odgrywa kluczową rolę w regulacji sygnałów Ca²⁺ w miocytach¹⁶. Zazwyczaj PV są poddawane fizjologicznemu ciśnieniu śródświetlnemu w zakresie od 4 do 10 mm Hg¹⁷^,¹⁸. Zmiany ciśnienia śródświetlnego w całym cyklu pracy serca mogą wpływać na sygnały Ca²⁺ w miocytach PV. Dlatego ważne jest, aby zastosować technikę, która pozwoli nam badać te sygnały w warunkach fizjologicznych i badać, jak wpływają na nie różne ciśnienia śródświetlne. Ponadto większość wcześniejszych badań nad PV koncentrowała się na większych PV serca. Obecna technika koncentruje się na małych ogniwach fotowoltaicznych znajdujących się głęboko w płucach, co może być bardziej istotne dla zrozumienia regulacji czynności płuc zarówno w zdrowiu, jak i chorobie.

Protokół

Wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Wirginii (protokoły 4100 i 4120). Myszy C57BL6/J w wieku 10-12 tygodni są poddawane eutanazji za pomocą pentobarbitalu (90 mg/kg; dootrzewnowo), a następnie zwichnięciu szyjki macicy w celu pobrania tkanki płucnej³^,⁴^,¹⁹^,²⁰.

1. Izolacja małych paneli fotowoltaicznych

Wyczyść narzędzia i naczynia do preparowania 100% etanolem, a następnie umyj wodą dejonizowaną.
Użyj nożyczek, aby otworzyć klatkę piersiową. Użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć serce i płuca z jamy klatki piersiowej przy minimalnym dotykaniu płuc.
Umieścić tkankę na płytce pokrytej preparatem Sylgard zawierającej zimny (4-10 °C) roztwór soli fizjologicznej buforowany przez HEPS (HEPES-PSS, w mM, 10 HEPES, 134 NaCl, 6 KCl, 1 MgCl₂heksahydrat, 2 CaCl₂ dwuwodny i 7 dekstroza, pH dostosowane do 7,4 przy użyciu 1 M NaOH)³^,⁴^,¹⁹. Użyj szpilek do rozwarstwienia, aby przygwoździć serce i płuca tak, aby duże PV i PA były wyraźnie widoczne, a lewy płat płuca był lekko rozciągnięty, jak pokazano na Rysunek 1.
Używając dużych żył płucnych (PV) jako punktów odniesienia, ostrożnie usuń tkankę otaczającą małe żyły wewnątrzpłucne (małe PV o średnicy około 50-100 μm, oznaczone przerywanym prostokątem w Rysunek 1) za pomocą cienkich nożyczek. Upewnij się, że unikasz bezpośredniego kontaktu z małymi PV. Delikatnie odizoluj małe PV od otaczającej tkanki.
Odizoluj segmenty małych paneli fotowoltaicznych o długości około 1-2 mm. Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS.

2. Ładowanie małych paneli fotowoltaicznych za pomocą wskaźnika Ca²⁺

UWAGA: Z małymi PV należy obchodzić się ostrożnie, upewniając się, że kleszcze dotykają tylko końcówek PVs. Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej³^,⁷^,²⁰^,²¹.

Przygotuj stężenie zapasowe 2,5 mM Fluo-4 AM z DMSO³^,⁴. Korzystając z powyższego roztworu podstawowego, przygotować 10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego z HEPES-PSS.
Umieść małe ogniwa fotowoltaiczne w probówce o pojemności 1,5 ml z roztworem ładującym (10 μM fluo-4 AM i 0,04% kwasu pluronowego w HEPES-PSS)³^,⁴. Przykryć probówkę folią aluminiową i umieścić w łaźni wodnej do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
Po inkubacji ostrożnie zastąpić roztwór nasycający roztworem o temperaturze 4-10 °C HEPES-PSS i trzymać na lodzie przez 30 minut jako etap mycia.

3. Kaniulacja małych PV

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej³^,²⁰^,²¹.

Przygotuj komorę miografii ciśnieniowej z dwiema szklanymi kaniulami, po jednej z każdej strony. Napełnij kaniule PSS (119 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgCl₂ 160 sześciowodzian, 2,5 mM CaCl₂ dwuwodny³^,⁴^,²¹^,²², 7 mM dekstrozy i 24 mM NaHCO₃, utrzymywane w pH 7,4 przez bulgotanie roztworu z 21% O₂ i 5% CO₂) za pomocą strzykawki 10 ml.
Usuń niewielką cząstkę PV z roztworu myjącego i umieść ją w komorze miografii ciśnieniowej. Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką ostrożnie nałóż jeden koniec małego PV na jedną z kaniul. Następnie, za pomocą mikrofilamentu wykonanego z nylonowej nici, zawiąż węzeł wokół kaniulowanego końca małej PV i końcówki kaniuli, aby ją zabezpieczyć.
Delikatnie przepchnij PSS przez kaniulę, aby usunąć krew z PV. Użyj nylonowej nici, aby związać drugi koniec szklaną kaniulą za pomocą mikrowłókien, jak pokazano na Rysunek 1.

4. Zwiększanie ciśnienia iobrazowanie Ca²⁺ małych PV

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej³^,²¹.

Za pomocą regulatora ciśnienia serwomechanizmu podłączonego do rurki zawierającej PSS, zwiększ ciśnienie w małym ogniwie fotowoltaicznym z jednego końca na poziomie 5 mm Hg. Użyj pompy perystaltycznej podłączonej zarówno do wlotu, jak i wylotu, aby przelać PSS. Utrzymać temperaturę superfusatu na poziomie 37 °C.
Po okresie równoważenia uzyskaj obrazy Ca²⁺ przez 1000 klatek (liczba klatek na sekundę: 30 klatek na sekundę) za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzającego w wodzie (NA 0,8) i systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem. Wzbudzić Fluo-4 za pomocą lasera na ciele stałym o długości fali 488 nm i wychwycić emitowaną fluorescencję za pomocą filtra pasmowo-przepustowego 525/36 nm.
Zastosuj antagonistę receptora ryanodine (RyR) ryanodine (5 μM)²¹^,²³ do superfuzatu. Poczekaj 5 minut. Zrób ponownie zdjęcia Ca²⁺ zgodnie z powyższym opisem, przechwytując kolejne 1000 klatek z szybkością 30 klatek/s.

5. Analiza obrazu Ca²⁺

UWAGA: Ta metoda jest modyfikacją techniki opisanej wcześniej²¹^,²²^,²⁴. Zmiany w aktywności sygnałów Ca^{2 +} w miocytach PV mogą dostarczyć ważnych informacji na temat hamowania lub wzmacniania sprzężenia wzbudzenie-skurcz w PV.

Użyj specjalnie zaprojektowanego oprogramowania (opracowanego przez dr Adriana Boneva, https://github.com/vesselman/SparkAn) do analizy obrazów Ca²⁺.
Płynne obrazy dzięki filtrowi boxcar 5 x 5 i filtrowi mediany 5 x 5. Użyj ramki wyznaczającej płaski obszar PV z wieloma komórkami do automatycznego wykrywania zdarzeń.
Kliknij Widok i automatyczne wykrywanie zdarzeń. Użyj następujących ustawień: próg zdarzenia przy amplitudzie 1,3 F/F₀, tolerancja 20%, pole skanowania 7 x 7 pikseli i średnia bieżąca 7 obrazów. Generuj średnie obrazy automatycznie co 10 obrazów, zaczynając od pierwszego obrazu.
Kliknij Rozpocznij wyszukiwanie (ikona oka). Znajdź tabelę zdarzeń zapisaną jako Zaznacz plik w menu Plik. Aby obliczyć zdarzenia na μm², podziel liczbę wykrytych sygnałów Ca²⁺ przez obszar wybranej ramki.

Wyniki

Rysunek 2A pokazuje pole widzenia z małego PV przy ciśnieniu śródświetlnym 5 mm Hg. Symbole + wskazują automatycznie wykryte sygnały Ca²⁺ w wybranej klatce (Wideo 1), oznaczone zielonym konturem. Z każdej fotowoltaiki zarejestrowano jedno pole widzenia, a z każdej myszy wykorzystano jedno pole widzenia. Jedna mała PV została uznana za n=1. Liczbę sygnałów Ca²⁺ na μm²na minutę porównano przed i 5 minut po dodaniu inhibitora RyR ryanodyny (5 μM)²³ w sparowanych eksperymentach. Sparowany test t został wykorzystany do porównań statystycznych w celu wykrycia istotnych różnic. Liczba spontanicznie występujących sygnałów Ca²⁺ wynosiła 0,73 ± 0,2 zdarzenia na minutę na μm²(Rysunek 2B,C) w warunkach opisanych powyżej. Leczenie ryanodyną prawie całkowicie zahamowało sygnały Ca²⁺ w małych ogniwach fotowoltaicznych (Rysunek 2C, wideo 2), na co wskazuje drastyczne zmniejszenie liczby zdarzeń na minutę na μm². Dane te pokazują, że spontaniczna aktywność sygnałów Ca²⁺ w warstwie miocytów z małych PV pod ciśnieniem reprezentuje otwory RyRs. Wyniki te dostarczają dowodów na to, że aktywność sygnałów Ca²⁺ można badać w małych PV pod fizjologicznym ciśnieniem śródświetlnym. Metoda ta ułatwi przyszłe badania nad wpływem ciśnienia śródświetlnego i mediatorów neurohumoralnych na sygnalizację Ca²⁺ w małych miocytach PV, potencjalnie oferując cenne informacje na temat regulacji funkcji PV. Podczas gdy obecne badanie koncentruje się na liczbie sygnałów RyR Ca²⁺, możliwa jest również analiza właściwości kinetycznych tych sygnałów, w tym czasu trwania, amplitudy, rozrzutu przestrzennego i czasu narastania. Zrozumienie, w jaki sposób bodźce fizjologiczne i patologiczne wpływają na właściwości kinetyczne sygnałów RyR Ca²⁺, może dostarczyć ważnych informacji dotyczących regulacji funkcji PV zarówno w stanach zdrowych, jak i chorych.

figure-results-1
Rysunek 1: Przygotowanie i obrazowanie Ca²⁺ PVs. Sekwencyjne obrazy przedstawiające identyfikację i izolację małych PV, inkubację fluo4-AM, kaniulację i zwiększanie ciśnienia (5 mm Hg), szybkie obrazowanie konfokalne z wirującym dyskiem i analizę obrazu. Przerywany prostokąt na ilustracji po lewej stronie reprezentuje PV użytą do badania. Skróty: PA = tętnica płucna; RA = prawe przedsionek; PV = żyła płucna; LA = lewe przedsionek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Analiza obrazowania Ca²⁺. (A) Obrazy pola widzenia z ciśnieniowego (5 mm Hg), wypełnionego fluo-4, małego PV przy braku (po lewej) lub obecności ryanodyny (5 μM; Inhibitor RyR, po prawej). Zielony prostokąt oznacza obszar, który został wybrany do automatycznej detekcji sygnałów Ca²⁺. Znaki + reprezentują automatycznie wykryte zdarzenia w ramce. Czerwone znaki oznaczają sygnały o powierzchni mniejszej niż 3000^μm2, natomiast niebieskie oznaczają sygnały, które zajmowały obszar większy niż 3000^μm2. Każdy znak + oznacza jedno zdarzenie lub sygnał Ca²⁺. (B) F/F0 ślady wykrytych zdarzeń z wybranego obszaru wskazanego w A, pokazujące aktywność sygnałów Ca²⁺ w warstwie miocytów od małych PV pod ciśnieniem w warunkach podstawowych (po lewej) i w obecności ryanodyny (po prawej). (C) Kwantyfikacja zdarzeń na minutę na μm² sygnałów Ca²⁺ w małych PV przed i po dodaniu ryanodyny (1 PV na mysz; n = 6 myszy; **p < 0,01 vs Basal; sparowany test t). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Sygnały Ca²⁺ w małym PV pod ciśnieniem 5 mm Hg przed leczeniem ryanodyną. Pole widzenia reprezentuje wybraną klatkę, pokazaną na zielono w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Sygnały Ca²⁺ w małym PV pod ciśnieniem 5 mm Hg po leczeniu ryanodyną (5 μM). Pole widzenia reprezentuje wybraną klatkę, pokazaną na zielono w Rysunek 2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

Sygnały^Ca2+ w komórkach mięśni gładkich odgrywają kluczową rolę w regulacji funkcji naczyń krwionośnych²⁵. PV są ważnym, ale stosunkowo słabo zbadanym łożyskiem naczyniowym odpowiedzialnym za dostarczanie bogatej w tlen krwi do lewego serca²⁶. Jednak mechanizmy sygnalizacji Ca²⁺ w małych PV i ich wpływ na funkcje fizjologiczne są nieznane. Celem tego manuskryptu jest opisanie nowej metody izolacji, kaniulacji i zwiększania ciśnienia małych PV w celu rejestrowania sygnałów Ca²⁺ w warstwie miocytów i analizy tych sygnałów Ca²⁺ . Możliwość wizualizacji sygnałów Ca²⁺ w małych ogniwach fotowoltaicznych może pomóc w lepszym zrozumieniu, jak te sygnały działają w normalnych i chorych warunkach. Podczas gdy badanie sygnałów Ca^{2 +} w PV w nienaruszonym płucu dostarczyłoby fizjologicznie bardziej istotnych danych, małe PV nie są wyraźnie widoczne w nienaruszonym płucu, co może stanowić wyzwanie techniczne związane z ładowaniem barwników Ca²⁺ i obrazowaniem konfokalnym. Izolowanie i zwiększanie ciśnienia w małych ogniwach fotowoltaicznych stanowi alternatywny sposób obserwacji sygnałów Ca²⁺ pod fizjologicznym ciśnieniem wewnątrzświetlnym, temperaturą i roztworami jonowymi.

Obrazowanie Ca^{2 +} PV opisane w tym manuskrypcie opiera się na naszej dobrze ugruntowanej procedurze obrazowania Ca^{2 +} w tętnicach układowych^21,22,27. Dane wskazują, że większość sygnałów Ca²⁺ w małych miocytach PV jest spowodowana otwarciem kanałów jonowych RyR. W związku z tym protokół opisany w tym manuskrypcie umożliwi przyszłe badania nad regulacją RyR i jej wpływem na funkcję PV w normalnych warunkach i chorobach. Aktywność RyR2 jest niezbędna do skurczów miocytów serca²⁸, podczas gdy w komórkach mięśni gładkich tętnic wiąże się z relaksacją²⁹. Dokładny wpływ aktywności RyR na kurczenie się małych ogniw fotowoltaicznych pozostaje nieznany. Miografia ciśnieniowa jest powszechnie stosowaną techniką monitorowania zmian w skurczu małych naczyń krwionośnych. Dlatego jest prawdopodobne, że przygotowanie fotowoltaiki pod ciśnieniem może być również stosowane do monitorowania małych skurczów PV.

Ryanodyna wykazuje zależny od stężenia wpływ na aktywność RyR, zwiększając ją przy stężeniach submikromolowych i zmniejszając przy stężeniach mikromolowych²³. Ryanodyna może również mieć pośredni wpływ hamujący na inne sygnały Ca²⁺ w małych PV, co nie zostało przetestowane. Przy zastosowanym stężeniu nie zaobserwowaliśmy kompensacyjnego wzrostu sygnałów Ca²⁺ w PV. Regulacja sygnałów Ca²⁺ w izolowanych i ciśnieniowych ogniwach fotowoltaicznych może różnić się od regulacji w ogniwach fotowoltaicznych w nienaruszonym płucu, co jest możliwością, która nie została jeszcze zbadana. Jednak rejestrowanie sygnałów Ca^{2 +} w małych PV w nienaruszonym płucu od znieczulonej myszy stanowi poważne wyzwanie, wynikające z lokalizacji płuca w jamie klatki piersiowej i trudności w selektywnym ładowaniu wskaźnika Ca^{2 +} w PV u znieczulonej myszy.

Wiadomo, że naprężenie ścinające przepływ krwi zmienia funkcję naczyń krwionośnych. Chociaż obecna metoda pozwala na odizolowanie wpływu ciśnienia śródświetlnego na sygnały Ca²⁺ w małych ogniwach fotowoltaicznych, brak naprężeń przepływowych lub ścinających jest potencjalnym ograniczeniem. Jednak naprężenie przepływowe lub ścinające można łatwo włączyć i przeprowadzić w połączeniu z obrazowaniem Ca²⁺ przy użyciu konfiguracji opisanych wcześniej²¹. Możliwe, że naprężenie przepływowo-ścinające modyfikuje aktywność sygnałów Ca²⁺ w małych ogniwach fotowoltaicznych, co byłoby interesującym tematem do przyszłych badań.

Użyliśmy fluo-4-AM jako wskaźnika Ca²⁺ do rejestracji sygnałów Ca²⁺ w małych PV. W zależności od potrzeb eksperymentalnych powinno być możliwe użycie innych wskaźników Ca²⁺ , które mogą być wzbudzone przy 488 nm (Calbryte 520 AM)⁷ lub 560 nm (Calbryte 590 AM)³⁰. Zastosowanie systemu obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem pozwala na obrazowanie sygnałów Ca²⁺ , szczególnie w miocytach PV. Chociaż nie badano tego w obecnym badaniu, skupienie się na warstwie komórek śródbłonka pozwoli na rejestrację śródbłonkowych sygnałów Ca²⁺ w małych PV. PA i PV różnią się funkcjonalnie i są narażone na różne mikrośrodowiska. Dlatego porównanie sygnałów Ca² + miocytów i śródbłonka między małymi PA i małymi PV może dostarczyć kluczowych informacji na temat ich różnic funkcjonalnych.

Jest prawdopodobne, że sygnały Ca²⁺ w małych PV regulują przepływ krwi bogatej w tlen przez PV. Ciśnienie wewnątrz lewego przedsionka zmienia się z 4 mmHg do 12 mmHg podczas każdego cyklu pracy serca^17,18. Ponieważ PV dostarczają krew do lewego przedsionka, jest prawdopodobne, że ciśnienie wewnątrz PV zmienia się również podczas cyklu pracy serca. Wcześniejsze badania wykazały, że RyR może być aktywowany przez ciśnienie śródświetlne w małych tętnicach¹⁶. Dlatego pomiar wpływu ciśnienia śródświetlnego na sygnały PV Ca²⁺ może dostarczyć nowych informacji na temat dostarczania bogatej w tlen krwi z PV do lewego serca. Stymulacja nerwów i mediatory humoralne w krwiobiegu mogą również aktywować sygnały Ca^{2 +} mięśni gładkich. Obecna metoda ułatwi przyszłe badania nad wpływem mediatorów neurohumoralnych na sygnały PV^{Ca 2+} i funkcję PV.

W protokole jest kilka krytycznych kroków, o które należy zadbać. Dokładna sekcja żył płucnych (PV) jest niezwykle ważna. Bardzo ważne jest, aby unikać dotykania obszaru obrazowania PV narzędziami do preparowania, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na ich zdrowie. Należy dotykać tylko końców paneli fotowoltaicznych. Skrócenie czasu preparacji może zwiększyć wskaźnik sukcesu. Niewystarczające obciążenie barwnikiem może skutkować niższym stosunkiem sygnału do szumu i zwiększyć prawdopodobieństwo wystąpienia fałszywych alarmów podczas automatycznego wykrywania zdarzeń. Przestrzeganie opisanego tutaj protokołu powinno zapewnić odpowiednie obciążenie barwnikiem w miocytach PV.

Podsumowując, przedstawiliśmy metodę rejestracji sygnałów Ca²⁺ w małych PV, która pozwala na badanie mechanizmów sygnalizacyjnych Ca²⁺ w tym ważnym, ale często pomijanym łożysku naczyniowym. Co ważne, zdolność do rejestrowania sygnałów Ca²⁺ w małych PV w normalnych warunkach może dostarczyć cennego zrozumienia patologicznych mechanizmów chorób płuc, w tym nadciśnienia płucnego, uszkodzenia płuc i obrzęku płuc wywołanego niewydolnością serca.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z nagród NHLBI (HL167208, HL157407 i HL146914) dla SKS i NIDDK (DK138271) dla YLC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Specjalnie zaprojektowane oprogramowanie SparkAn	University of Vermont		https://github.com/vesselman/SparkAn
Fluo-4, AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FN1 Mikroskop pionowy	firmy Nikon
	Warner Instruments
	Andor
Oprogramowanie do przejęcia iQ 3.x	Andor
Kamery iXon EMCCD Andor
Nić nylonowa do wiązania naczyń krwionośnych	Żywe systemy Oprzyrządowanie	THR-G
Komora miografii ciśnieniowej	Zakład Oprzyrządowania i Modelowania, University of Vermont, Burlington, VT, USA
Revolution WD (z Borealis) Szybki system obrazowania konfokalnego z wirującym dyskiem	Andor
Ryanodine	Bio-Techne	1329
Regulator ciśnienia serwomechanizmu	Oprzyrządowanie
Kołki rozwarstwiające SS, średnica 0,2 mm	Oprzyrządowanie systemów żywych	PIN-0,2 mm
Pompa rurowa REGLO	ISMATEC	ISM4212

Grzejnik/regulator temperatury System obrazowania systemów żywych

Bibliografia

Suresh, K., Shimoda, L. A. Lung circulation. Compr Physiol. 6 (2), 897-943 (2016).
Sundjaja, J. H., Bordoni, B. Thorax, heart pulmonic valve. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Daneva, Z., et al. Caveolar peroxynitrite formation impairs endothelial TRPV4 channels and elevates pulmonary arterial pressure in pulmonary hypertension. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (17), e2023130118(2021).
Daneva, Z., et al. Endothelial pannexin 1-TRPV4 channel signaling lowers pulmonary arterial pressure in mice. Elife. 10, e67777(2021).
Kuhr, F. K., Smith, K. A., Song, M. Y., Levitan, I., Yuan, J. X. New mechanisms of pulmonary arterial hypertension: role of Ca2+ signaling. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (8), H1546-H1562 (2012).
Sonkusare, S. K., Laubach, V. E. Endothelial TRPV4 channels in lung edema and injury. Curr Top Membr. 89, 43-62 (2022).
Kuppusamy, M., et al. Purinergic P2Y2 receptor-induced activation of endothelial TRPV4 channels mediates lung ischemia-reperfusion injury. Sci Signal. 16 (808), eadg1553(2023).
Alvarez, D. F., et al. Transient receptor potential vanilloid 4-mediated disruption of the alveolar septal barrier: a novel mechanism of acute lung injury. Circ Res. 99 (9), 988-995 (2006).
Balakrishna, S., et al. TRPV4 inhibition counteracts edema and inflammation and improves pulmonary function and oxygen saturation in chemically induced acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (2), L158-L172 (2014).
Suresh, K., et al. Reactive oxygen species induced Ca2+ influx via TRPV4 and microvascular endothelial dysfunction in the SU5416/hypoxia model of pulmonary arterial hypertension. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (5), L893-L907 (2018).
Haissaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. N Engl J Med. 339 (10), 659-666 (1998).
Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression. Circ Res. 114 (9), 1483-1499 (2014).
Brunton, T. L., Fayrer, J. XXII Note on independent pulsation of the pulmonary veins and vena cava. Proc R Soc Lond. 25, 174-176 (1877).
Namekata, I., et al. Involvement of the Na(+)/Ca(2+) exchanger in the automaticity of guinea-pig pulmonary vein myocardium as revealed by SEA0400. J Pharmacol Sci. 110 (1), 111-116 (2009).
Cros, C., et al. Regional differences in Ca2+ signaling and transverse-tubules across left atrium from adult sheep. Int J Mol Sci. 24 (3), 2347(2023).
Dabertrand, F., Nelson, M. T., Brayden, J. E. Ryanodine receptors, calcium signaling, and regulation of vascular tone in the cerebral parenchymal microcirculation. Microcirculation. 20 (4), 307-316 (2013).
Nair, R., Lamaa, N. Pulmonary capillary wedge pressure. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Fukuta, H., Little, W. C. The cardiac cycle and the physiologic basis of left ventricular contraction, ejection, relaxation, and filling. Heart Fail Clin. 4 (1), 1-11 (2008).
Daneva, Z., et al. Endothelial IK and SK channel activation decreases pulmonary arterial pressure and vascular remodeling in pulmonary hypertension. Pulm Circ. 13 (1), e12186(2023).
Marziano, C., et al. Nitric oxide-dependent feedback loop regulates transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel cooperativity and endothelial function in small pulmonary arteries. J Am Heart Assoc. 6 (12), e007157(2017).
Chen, Y. L., et al. Novel smooth muscle Ca2+-signaling nanodomains in blood pressure regulation. Circulation. 146 (7), 548-564 (2022).
Sonkusare, S. K., et al. Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function. Science. 336, 597-601 (2012).
Arias-Cavieres, A., et al. Ryanodine receptor-mediated calcium release has a key role in hippocampal LTD induction. Front Cell Neurosci. 12, 403(2018).
Chen, Y. L., et al. Calcium signal profiles in vascular endothelium from Cdh5-GCaMP8 and Cx40-GCaMP2 mice. J Vasc Res. 58 (3), 159-171 (2021).
Ottolini, M., Sonkusare, S. K. The calcium signaling mechanisms in arterial smooth muscle and endothelial cells. Compr Physiol. 11 (2), 1831-1869 (2021).
Boyette, L. C., Burns, B. Physiology, pulmonary circulation. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).
Ottolini, M., et al. Local peroxynitrite impairs endothelial transient receptor potential vanilloid 4 channels and elevates blood pressure in obesity. Circulation. 141 (16), 1318-1333 (2020).
Shan, J., et al. Phosphorylation of the ryanodine receptor mediates the cardiac fight or flight response in mice. J Clin Invest. 120 (12), 4388-4398 (2010).
Knot, H. J., Standen, N. B., Nelson, M. T. Ryanodine receptors regulate arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat via Ca2+-dependent K+ channels. J Physiol. 1 (Pt 1), 211-221 (1998).
Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), 11377-11382 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Sygna y wapniowe ci nienie w wietle naczynia konfokalna mikroskopia dysku wiruj cego myografia ci nieniowa receptor ryanodynowy Fluo 4 AM y y p ucne myszy fizjologia naczyniowa obrazowanie wapnia