Artykuł metodologiczny

Ulepszona metodologia badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste w mysim modelu uszkodzenia szpiku kostnego

DOI:

10.3791/67727

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopedic Surgery, UConn School of Medicine, 2Department of Neuroscience, UConn School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy jest użytecznym narzędziem do badania osteogenezy poporodowej poprzez kostnienie śródbłoniaste. Ten uproszczony protokół chirurgiczny opisuje procedurę ablacji szpiku kostnego w celu dalszej oceny tworzenia się nowej kości i odpowiedzi komórkowych po urazie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długie urazy kostne goją się poprzez wewnątrzchrzęstne lub śródbłonowe ścieżki tworzenia kości. W przeciwieństwie do szlaku endochrzęstnego, który wymaga szablonu chrząstki, proces kostnienia śródbłoniastego obejmuje bezpośrednią konwersję szkieletowych komórek macierzystych i progenitorowych (SSPC) w osteoblasty tworzące kości. Istnieją ograniczone metody chirurgiczne do modelowania tego procesu u myszy eksperymentalnych. W tym miejscu ulepszyliśmy model uszkodzenia szpiku kostnego u myszy, aby ułatwić badanie naprawy kości poprzez kostnienie śródbłoniaste i ocenić postnatalne regulatory osteogenezy. Metoda ta jest wysoce powtarzalna i przyjazna dla użytkownika, a także pozwala na czasową ocenę tworzenia się nowej kości w krótkim czasie (3-7 dni po urazie) za pomocą mikrotomografii komputerowej (μCT) i histologii zamrożonego skrawka. Co więcej, udział SSPC i dojrzałych osteoblastów można łatwo ocenić przy użyciu kombinacji fluorescencyjnych myszy reporterowych i tego śródbłoniastego modelu uszkodzenia szpiku kostnego. W kontekstach klinicznych wewnątrzbłoniaste tworzenie kości jest istotne dla leczenia krytycznych ubytków wielkości, ustabilizowanych złamań, ubytków kory mózgowej, urazów spowodowanych resekcjami guza i wymiany stawów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długie urazy kości goją się drogą wewnątrzchrzęstną lub wewnątrzbłoniastą kości. W przeciwieństwie do szlaku endochrzęstnego, który wymaga etapu prekursorowego chrząstki, naprawa kości poprzez kostnienie śródbłoniaste obejmuje bezpośrednią konwersję komórek macierzystych i progenitorowych szkieletu (SSPCS) w osteoblasty tworzące kości1. Klinicznie proces ten jest istotny dla gojenia kości w różnych kontekstach, w tym krytycznych defektów wielkości, ustabilizowanych złamań, wad kory mózgowej, osteogenezy dystrakcyjnej, urazów spowodowanych resekcjami guza, i osteointegracja implantów endoprotezozastępczych stawów2,3. Co ciekawe, w badaniach pacjentów ze złamaniami kości długich, 66%-82% miało złamania z przemieszczeniem, które wymagały urządzeń mocujących do stabilizacji kości4,5. Te sztywno ustabilizowane kości goją się głównie poprzez kostnienie śródbłoniaste, gdy złamane końce kości stykają się ze sobą bezpośrednio6,7. Jednak mechanistyczna regulacja śródbłoniastej regeneracji kości pozostaje stosunkowo słabo zbadana w porównaniu z tworzeniem kości za pośrednictwem szlaków endochrzęstnych. Zatwierdzone przez Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) terapie wspomagające gojenie się kości są utrudnione ze względu na ograniczoną skuteczność kliniczną i wysokie koszty oraz wiążą się ze znaczącymi skutkami ubocznymi8.

Mechaniczna ablacja szpiku kostnego dostarcza cennego modelu do badania wewnątrzbłoniastego tworzenia się kości. Ten prosty model urazu pozwala na badanie regeneracji kości w szpiku kostnym bez naruszania kości korowej. Po ablacji BM proces gojenia obejmuje odrębne, ale nakładające się na siebie fazy. Faza początkowa następuje w ciągu pierwszych 1 do 5 dni i obejmuje tworzenie się skrzepów i stan zapalny, w którym komórki zapalne i cytokiny inicjują gojenie. Od 3 do 14 dnia druga faza charakteryzuje się regeneracją, w tym neowaskularyzacją, migracją i proliferacją mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), różnicowaniem osteoblastycznym i tworzeniem tkanych kości. Końcowa faza przebudowy rozpoczyna się około 10 dni po zabiegu, a tkanka kostna przechodzi dojrzewanie i restrukturyzację, aż szpik kostny zostanie w pełni przywrócony do dnia 569. Ten szybki czas gojenia sprawia, że model ablacji BM jest idealny do badania wczesnych reakcji naprawy kości, szczególnie w krytycznych okresach stanu zapalnego, rekrutacji komórek progenitorowych i różnicowania osteoblastów. Za pomocą technik takich jak histologia, cytometria przepływowa i ilościowa analiza μCT można ocenić odpowiedzi komórkowe i tworzenie kości we wczesnych stadiach naprawy. Wykorzystując wyżej wymienione techniki, model ablacji BM może dostarczyć informacji na temat mechanizmów śródbłonowej regeneracji kości i pomóc w identyfikacji kluczowych celów terapeutycznych w celu poprawy gojenia się kości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące procedury zostały przeprowadzone za zgodą University of Connecticut Health Center Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie operacje zostały przeprowadzone w sterylnych warunkach, zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health (NIH). Ból i ryzyko infekcji były kontrolowane za pomocą odpowiednich środków przeciwbólowych i antyseptycznych, aby zapewnić pomyślny wynik.

1. Przygotowanie pola operacyjnego i narzędzi

  1. Przygotuj salę zabiegową, dezynfekując powierzchnie robocze środkiem dezynfekującym klasy klinicznej.
    UWAGA: Chirurg powinien nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), w tym sterylne rękawiczki jednorazowe, czepek do włosów, fartuch i maskę.
  2. Przygotuj poduszkę grzewczą pokrytą sterylną podkładką chirurgiczną. Zbierz i ułóż wszystkie sterylne narzędzia i odczynniki (Tabela materiałów) w wygodny dostęp.

2. Znieczulenie przedoperacyjne

  1. Zważ wszystkie myszy przed operacją. Obliczyć objętości leku przeciwbólowego, który należy zastosować, w oparciu o dostępną postać buprenorfiny.
  2. Zamontuj jednostkę do znieczulenia zwierząt w sterylnej przestrzeni roboczej, która obejmuje komorę indukcyjną i zespół stożka nosowego. Ustaw wydajność tlenu na 2 litry min-1 i izofluran na 1,5-3% (v/v) w zależności od wieku i wagi myszy.
  3. Po podaniu mysz uspokojonej wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej i umieść je na sterylnej podkładce chirurgicznej w pozycji leżącej. Nałóż lubrykant okulistyczny na oba oczy. Umieść stożek nosowy nad głową. Sprawdź, czy mysz jest odpowiednio znieczulona, delikatnie szczypiąc palec u nogi. Przed kontynuowaniem upewnij się, że nie ma reakcji odruchowej kończyn tylnych.
  4. Przed zabiegiem chirurgicznym należy na krótko usunąć mysz ze stożka nosowego, aby wstrzyknąć całkowitą dawkę buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu drogą podskórną; całkowita dawka wynosi 3,25 mg/kg.

3. Opis zabiegu chirurgicznego

UWAGA: Ten zabieg chirurgiczny wykorzystuje samce i samice myszy C57BL/6 w wieku od 10 tygodni do 24 tygodni. Procedura może być wykonywana na myszach w wieku od 6 tygodni do 33 tygodni oraz na różnych szczepach wsobnych, jak pokazują inni10,11. Młodsze myszy mogą wymagać krótszych igieł, podczas gdy starsze lub większe myszy mogą wymagać dłuższej igły.

  1. Napełnij strzykawkę o pojemności 3 ml wyposażoną w igłę 26 G sterylnym roztworem soli fizjologicznej. Odłóż to na bok.
  2. Usuń sierść z tylnej kończyny, na której zostanie wykonany zabieg, za pomocą elektrycznych lub zasilanych bateryjnie maszynek do strzyżenia (ostrze #40) i usuń luźne futro z pola operacyjnego. Za pomocą sterylnych aplikatorów z bawełnianą końcówką potraktuj pole operacyjne peelingiem na bazie jodu (10% jodu powidonu), a następnie 70% alkoholem izopropylowym. Wyszoruj miejsce operowane, zaczynając od środka kolana i wykonując okrężny ruch na zewnątrz. Pozostaw miejsce do wyschnięcia. Powtórz kroki peelingu 3 razy.
  3. Połóż mysz na plecach i zegnij kolano nogi operacyjnej. Przytrzymaj nogę myszy w ręce niedominującej tak, aby kolano było zgięte nad środkowym palcem, drugi palec spoczywał na kości udowej, a kciuk spoczywał na kości piszczelowej.
  4. Wykonaj małe, płytkie poziome nacięcie tuż pod rzepką za pomocą skalpela.
    UWAGA: Ten krok poprawia wizualizację miejsca wstawienia. Z doświadczeniem ten krok można pominąć.
  5. Zlokalizuj przestrzeń stawową, umieszczając igłę poziomo w poprzek zgiętego kolana i wyczuwając przestrzeń między kością udową a piszczelową. Korzystając z tego anatomicznego miejsca do prowadzenia, weź igłę 25 G i ręcznie przewierć (przekręcając igłę i jednocześnie wywierając umiarkowany nacisk na igłę) do dystalnej części kości udowej od kolana w kierunku bliższej strony. Wbić igłę przez rzepkę lub wokół niej.
  6. Prześwietl mysz, aby upewnić się, że igła została prawidłowo umieszczona w jamie szpikowej, jak najbliżej środka (Rysunek 1).
  7. Wyjąć igłę 25 G i natychmiast włożyć igłę 26 G do tego samego otworu w jamie szpiku. Rozwiercaj boki jamy szpikowej okrężnymi ruchami co najmniej 5 razy, aż będzie gładka. Utrzymuj stałą liczbę ruchów rozwiercania między każdą myszą.
    UWAGA: Kroki 3.5 i 3.7 mogą spowodować zranienie chirurgia igłą, jeśli nie będą traktowane ostrożnie.
  8. Wyjąć igłę 26 G i wymienić igłę 26 G podłączoną do strzykawki z solą fizjologiczną. Przepłucz wnękę, aż przepływ zwrotny będzie czysty. Zwykle wymaga to 1,5-2 ml soli fizjologicznej. Wyjąć strzykawkę i igłę i bezpiecznie wyrzucić je do ostrego pojemnika.
    UWAGA: Podczas pchania płynu nie powinno być oporu. Jeśli tak, należy ponownie wprowadzić igłę, aby upewnić się, że znajduje się ona w jamie ustnej. Może być konieczne wyciągnięcie igły do połowy.
  9. Zamknij ranę skóry za pomocą miejscowego szwu adhezyjnego.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Bezpośrednio po zabiegu chirurgicznym należy podać pozostałą połowę dawki buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu, dozując z kroku 2.4.
    UWAGA: Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu zapewnia ulgę w bólu do 72 godzin.
  2. Monitoruj zwierzęta na poduszce grzewczej pod kątem oznak normalnego, niezakłóconego oddychania, dopóki nie obudzą się po operacji. Po przejściu na ambulatorium przywróć myszy do klatki.
  3. Kontynuuj monitorowanie myszy raz dziennie przez 3 dni po operacji, aby upewnić się, że goją się prawidłowo i mają pełną mobilność, obserwując oznaki bólu.

5. Przetwarzanie kości do skanowania i analizy μCT

  1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z metodą humanitarnej eutanazji regulowaną i zatwierdzoną przez IACUC lub inną obowiązującą politykę instytucjonalną. W tym przypadku zastosowano pierwotną metodę eutanazji polegającą na wdychaniu CO2 , a następnie wtórną metodę zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Zbierz kości udowe, odrywając skórę wokół kończyn tylnych i usuwając całą kończynę w stawie biodrowym.
  3. Umieść każdą kończynę między dwiema gąbkami w kasecie do zatapiania. Przenieś kości w kasetach do 10% roztworu formaliny i utrwal je w temperaturze 4 °C przez 5-7 dni, biorąc pod uwagę wiek i wielkość myszy.
    UWAGA: Zarówno nadmierna, jak i niedostateczna fiksacja powodują słabą rozdzielczość szpiku.
  4. Po utrwaleniu umyj kasety w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przez 5 minut 3 razy.
  5. Wyjmij kończyny z kaset i w razie potrzeby odetnij mięśnie za pomocą skalpela.
    UWAGA: W zależności od dalszych zastosowań, nieostrożne obchodzenie się z nią może naruszyć warstwę okostną kości.
  6. Oddziel kość udową w kolanie, ostrożnie przecinając więzadła za pomocą małych nożyczek chirurgicznych lub skalpela.
    UWAGA: Piszczele mogą być używane do innych zastosowań lub wyrzucone.
  7. Przenieś kości udowe do stożkowych probówek o pojemności 1,7 ml lub 15 ml do 70% roztworu etanolu. Kości mogą pozostać w 70% etanolu w temperaturze 4 °C, dopóki nie będą gotowe do skanowania μCT.
  8. Skanuj i oceniaj kości udowe pod kątem parametrów beleczkowania, uzyskując dane jakościowe i ilościowe.

6. Przetwarzanie kości do zamrożonego podziału i histologii

UWAGA: Kości mogą być przetwarzane do zamrożonego przekroju i histologii po przejściu skanowania μCT. Skanowanie nie ma wpływu na znakowanie fluorescencyjne ani późniejsze barwienie przeciwciałami.

  1. Przenieś kości z 70% etanolu do PBS i umyj 3 razy po 5 minut na pranie.
  2. Inkubować w serii roztworów sacharozy od 10%, 20% do 30% w PBS w temperaturze 4 °C przez noc przy każdym stężeniu. Przechowywać kości w 30% sacharozie do 5 dni w temperaturze 4 °C lub w tym roztworze w temperaturze -20 °C przez 6-12 miesięcy, aż będą gotowe do osadzenia.
    UWAGA: Zastosowanie gradientu sacharozy powoduje lepszą penetrację tkanek. Po kroku 6.1 kości można umieścić bezpośrednio w 30% roztworze sacharozy na noc.
  3. Osadzanie kości w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) za pomocą form do zatapiania w krioemburgu. Przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do krojenia.
  4. Cięcie osadzonych kości metodą taśmy kriofilmowej z temperaturą kriostatu ustawioną w zakresie od -24 °C do -26 °C.
  5. Przyklej skrawki kriofilmu do szkiełka adhezyjnego za pomocą kleju optycznego i utwardź go do momentu stwardnienia za pomocą środka sieciującego w ultrafiolecie (UV).

7. Przetwarzanie dla cytometrii przepływowej

UWAGA: Ten protokół jest kompatybilny z różnymi przeciwciałami. Aby scharakteryzować szkieletowe komórki macierzyste i progenitorowe, zaleca się zebranie 3-4 kości razem, ponieważ są to rzadkie populacje komórek w szpiku kostnym.

  1. Przygotuj pożywkę do barwienia (FSM) do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Aby przygotować 1000 ml roztworu FSM, połącz: 100 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS), 10 ml kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), 20 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 870 ml dd H2O. Przepuścić roztwór FSM przez filtr 0,2 μm.
  2. Przed pobraniem tkanki należy wypełnić szalki Petriego 4-5 ml sterylnego PBS bez wapnia i magnezu.
  3. Przygotuj pożywkę wytrawiającą
    1. Na każde 4-6 kości udowych przygotuj mieszaninę trawiącą w 10 ml PBS zawierającą 0,005 g kolagenazy P i 0,02 g hialuronidazy. Wymieszać przez delikatne wirowanie i przepuścić mieszaninę przez filtr 0,22 μm.
  4. Zbierz kości w 3. dniu po operacji, zgodnie z opisem w kroku 5.2. Usuń wszystkie mięśnie i tkankę łączną za pomocą ostrza skalpela.
  5. Napełnij szalkę Petriego 5 ml pożywki wytrawiającej. Umieść 4-6 kości w pożywce wytrawiającej. Drobno posiekaj każdą kość, wykonując pierwsze cięcie wzdłuż i bocznie.
  6. Przenieść tkankę do probówki okrągłodennej o pojemności 14 ml i uszczelnić parafilmem. Przykryj rurki folią aluminiową.
  7. Wstrząsać w temperaturze 37 °C przez 20 minut, trzymając probówkę poziomo na shakerze.
  8. Wyjmij rurkę z shakera. Komórki zostaną zbite na dole. Delikatnie zebrać strawiony materiał, nie naruszając komórek na dnie, i przepuścić trawienie przez filtr 70 μm. Zebrać filtrat do nowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 10 ml zimnego FSM i przechowywać go na lodzie.
  9. Do komórek dodaj pozostałe 5 ml mieszanki trawiącej. Ponownie uszczelnij parafolią i przykryj folią aluminiową. Potrząśnij rurką zgodnie z powyższym opisem. Powtórz kroki 7.7-7.8.
  10. Po 20 minutach inkubacji w temperaturze 37 °C, przenieść wytrawianie do tej samej probówki zawierającej trawienie z etapu 7.8, przechodząc przez filtr 70 μm z kolejnymi 10 ml FSM.
  11. Odwirować zawiesinę o sile 274 x g w temperaturze 4 °C. Odessać supernatant i zebrać osad komórkowy. Usuń granulkę, delikatnie stukając w rurkę.
    UWAGA: Siła odśrodkowa (g) opiera się na promieniu wirnika wynoszącym 170 mm. Sprawdź promień wirnika i odpowiednio dostosuj prędkość.
  12. Aby przeprowadzić lizę czerwonych krwinek, dodaj 1 ml buforu lizującego chlorek amonu i potasu (ACK). Trzymaj wszystkie odczynniki i komórki na lodzie.
  13. Inkubować komórki w ACK przez około 5 minut w temperaturze pokojowej. Nie przekraczaj 5 minut, aby uniknąć nadmiernej lizy komórek.
  14. Dodać 9 ml FSM. Wirować przy 274 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  15. Odessać supernatant. Rozbij osad komórkowy, delikatnie grabiąc rurkę na stojaku na tuby.
  16. Dodaj 10 ml FSM (objętość na 4 kości, można dostosować w zależności od liczby połączonych kości) i ponownie zawiesić.
  17. Pobrać podwielokrotność każdej próbki i dodać jodek propidyny (PI) zgodnie z instrukcjami producenta. Policz żywe i całkowite komórki za pomocą licznika komórek.
  18. Kontynuuj barwienie przeciwciał próbek przy użyciu żądanych markerów do analizy cytometrii przepływowej12,13,14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sukces procedury mechanicznej ablacji szpiku kostnego (BM) został potwierdzony przez obrazowanie rentgenowskie, podczas gdy igła 26G została wprowadzona do jamy szpikowej (Rysunek 2A). Gdy obrazowanie rentgenowskie wykazało, że igła została wprowadzona pod niewłaściwym kątem lub przebiła się przez kość, igła została ponownie włożona pod odpowiednim kątem i ponownie zobrazowana, aby potwierdzić dokładne umieszczenie. Gdy nie można było osiągnąć udanej pozycji, zwierzę było wykluczane z analizy. Podczas...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem było opracowanie wiarygodnej i powtarzalnej metody badania procesów molekularnych i komórkowych regulujących naprawę kości, koncentrując się na bezpośredniej konwersji szkieletowych komórek macierzystych i progenitorowych (SSPC) w osteoblasty odkładające się w kościach w przestrzeni/jamie szpiku kostnego. Opisana tutaj metoda mechanicznej ablacji szpiku kostnego jest zoptymalizowanym i zwalidowanym protokołem ablacji szpiku kostnego przez uraz mechaniczny, który pozwala na badanie wewnątrzbłoniastego tworzenia się ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych ujawnień do przekazania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie zostało zapewnione przez NIH/NIDCR R01-DE030716-01 i NIH/NIAMS R01-DE030716-01S1 do AS, NIH/NIAMS R01AR080131 do RG oraz UConn REP Convergence Grant dla RG i AS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% roztwór formaliny Sigma-AldrichHT501128
25 G 0,625 cala Igła podskórna Air-tite EZ FloAit Tite/ Fisher Scientific14-817-239; ref #NEZ25058
26 G 1/2" Jednorazowe igły podskórneExel International/ Fisher Scientific14-840-83; Nr ref. #26402Wszelkie igły 26 G można zastąpić, muszą być odłączane od strzykawki 
3 ml sterylna strzykawkaFisherbrand/ Fisher Scientific 14-955-457
AB Sterylna podkładkaMcKesson/ Fisher ScientificNC0593755Alternatywnie można użyć autoklawowalnych wkładek chłonnych 
Kwas octowy, glidowatymilipor SigmaAX0073Należy rozcieńczyć do 1%
buforu lizującego chlorku amonu i potasu (ACK)Gibco/ Thermo Fisher Scientific A1049201Służy do lizy czerwonych krwinek w ramach przygotowań do cytometrii przepływowej 
Komora indukcyjna do znieczulenia 2 lVetEquip941444
Roztwór Betadiny (Prowidon-Jod) Penn Veterinary Supply Inc/ Fisher ScientificNC0158124
Buprenorfina HCL do wstrzykiwań 0,3 mg/ml Generyczny/ Covetrus59122Musi uzyskać stanową i federalną licencję DEA na zakup substancji kontrolowanej
Calcein-AMSigma Aldrich206700-1MG
Collagenase P Roche11249002001Służy do trawienia kości
Waciki bawełniane i aplikatoryFisherbrand/ Fisher Scientific 22-363-172
Kriofilm typu II C(10), 3,5 cmsekcja laboratoryjna, JaponiaCFS 105
DAPI Abcamab228549
Cyfrowa waga gramowaToprime / AmazonB06X6LW4V9Może używać dowolnej wagi marki do ważenia myszy Kleszcze
preparacyjne Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-953E; 08-953F
Nożyczki preparacyjne Fisherbrand/ Fisher Scientific 08-940
Endure Niskoprofilowe ostrza kriostatu/mikrotomuTanner ScientificTNR315LP
Ethiqa XR Buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu 1,3 mg / mlEthiqa XR / Cevetrus72117Musi uzyskać stanową i federalną licencję DEA na zakup substancji kontrolowanej
Fast Green, 0,2%Electron Miscroscopy Sciences EMS50-319-57
Ciepło płodu bydlęcego dezaktywowanyGibco/ Thermo Fisher Scientific A5256801Służy do produkcji środków barwiących FACS (FSM)
Rozwiązanie montażowe Fluoromount-G Południowa Biotechnologia 0100-01
GLUSEAL Klej do stosowania miejscowego do skóry Chirurgiczne zapalenie Azs (AD) chirurgiczne GLU-550
Koza anty-królik Alexa 647Thermo FisherA21244Rozcieńczenie 1:300
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco / Thermo Fisher Scientific14065056Używany do produkcji środków barwiących FACS (FSM)
Podkładka grzewcza (duża)Boncare / AmazonB0CLHSWXSXMożna użyć dowolnej marki poduszki grzewczej, zdejmij osłonę z tkaniny 
HematoxylinMilliporeSigma/ Fisher ScientificM1051740500
HialuronidazaMilliporeSigmaHX0514Służy do trawienia kości
Izofluran System znieczulenia zwierzątVetEquip901810
KUBTEC Parametr Gabinet 2D System rentgenowskiOncoMed SolutionsN/AMożna zastosować dowolny system obrazowania w szafie rentgenowskiej
Mikrowirówka DętkiCorning/ Thomas Scientific 8600A52
Szkło nakrywkowe mikroskopu, 18 mm x 18 mm, # 1 GrubośćGlobe Scientific1414-10
Kwas N-2-hydroksyetylopiperazyno-N-2-etanosulfonowy HEPES (1M) Gibco/ Thermo Fisher Scientific156300-80Służy do produkcji środków barwiących FACS (FSM)
Klej optyczny Norland NO61Edmund Optical37-322Służy do przyklejania odcinków kriofilmu do szkiełka 
Przeciwciało monoklonalne królika Osterix Abcamab209484Rozcieńczenie 1:500
Peroxigard Gotowy do użycia jednoetapowy środek dezynfekującyVirox Technologies29101Można zastąpić dowolnym innym środkiem dezynfekującym klasy klinicznej/laboratoryjnej
Jodek propidium (PI) Invitrogen/ Thermo Fisher Naukowy P1304MPJądrowa plama fluorescencyjna używana do wykrywania martwych komórek w celu zwiększenia liczby zjadliwości
Akumulatorowy trymer elektrycznyWahl / AmazonB001FWXKUEMożna użyć dowolnych maszynek do strzyżenia, mniejszy trymer ułatwi golenie mniejszych zwierząt
Stożek do nosa gryzoniVetEquip921609
Safranin O, 85% czysty, certyfikowanyprzez Fisher ScientificAC419211000
Seal'N Freeze Cryotray Square MoldsElectron Miscroscopy Sciences EMS62642-01Używane do zatapiania, można stosować inne formy do zatapiania. Ten konkretny model posiada głębszą formę, a także pokrywę do uszczelnienia bloku 
Azotan srebraSigma AldrichS6506Azotan srebra do barwienia von Kossa
Sterylna sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Gibco/ Thermo Fisher Scientific10010023Alternatywnie można użyć świeżo przygotowanego PBS, który został przefiltrowany i autoklawowany
Sterylne standardowe skalpeleIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sterylne standardowe skalpeleIntegra Miltex/ Fisher Scientific12-460-455
Sacharoza w proszku 1 KGThermo Fisher Scientific036508-A1
Prowadnice Miscroscope Superfrost PlusFisherbrand/ Fisher Scientific 1255015Szkiełka samoprzylepne
Sure-Tek Przetwarzanie / Zatapianie KasetyFisherbrand Histosette/ Fisher Scientific22-048-141
Tissue Plus Optymalna temperatura cięcia Związek O.C.T FisherScientific23-730-571
Gąbki do tkanekEpredia/ Fisher Scientific84-53Gąbki tkankowe chronią tkanki przed nadmiernym rozmnażaniem 
Toluidyna BlueFisher AC348600050
Roztwór do barwienia Scientific

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. J Orthop Res. 37 (1), 35-50 (2019).
  2. Ko, F. C., Sumner, D. R. How faithfully does intramembranous bone regeneration recapitulate embryonic skeletal development. Dev Dyn. 250 (3), 377-392 (2021).
  3. Patt, H. M., Maloney, M. A. Bone marrow regeneration after local injury: a review. Exp Hematol. 3 (2), 135-148 (1975).
  4. Chitnis, A., et al. Long bone fractures: treatment patterns and factors contributing to use of intramedullary nailing. Expert Rev Med Devices. 17 (7), 731-737 (2020).
  5. Singaram, S., Naidoo, M. The physical impact of long bone fractures on adults in KwaZulu-Natal. S Afr J Physiother. 76 (1), 1393(2020).
  6. Kim, T., et al. Orthopedic implants and devices for bone fractures and defects: past, present and perspective. Eng Regen. 1, 6-18 (2020).
  7. Marsell, R., Einhorn, T. A. The biology of fracture healing. Injury. 42 (6), 551-555 (2011).
  8. Katagiri, T., et al. morphogenetic protein-induced heterotopic bone formation: what have we learned from the history of a half century. Jpn Dent Sci Rev. 51 (2), 42-50 (2015).
  9. Wise, J. K., et al. Temporal gene expression profiling during rat femoral marrow ablation-induced intramembranous bone regeneration. PLoS One. 5 (10), e12987(2010).
  10. Chen, X. D., et al. Biglycan-deficient mice have delayed osteogenesis after marrow ablation. Calcified Tissue Int. 72 (5), 577-582 (2003).
  11. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration differs among common inbred mouse strains following marrow ablation. J Orthop Res. 33 (9), 1374-1381 (2015).
  12. Jeffery, E. C., Mann, T. L. A., Pool, J. A., Zhao, Z., Morrison, S. J. Bone marrow and periosteal skeletal stem/progenitor cells contribute distinct to bone maintenance and repair. Cell Stem Cell. 29 (11), 1547-1561.e6 (2022).
  13. Loopmans, S., Stockmans, I., Carmeliet, G., Stegen, S. Isolation and in vitro characterization of murine young-adult long bone skeletal progenitors. Front Endocrinol. 13, 930358(2022).
  14. Chan, C. K. F., et al. Identification and specification of the mouse skeletal stem cell. Cell. 160 (1-2), 285-298 (2015).
  15. Moran, M. M., et al. Intramembranous bone regeneration in diversity outbred mice is heritable. Bone. 164, 116524(2022).
  16. Lybrand, K., Bragdon, B., Gerstenfeld, L. Mouse models of bone healing: fracture, marrow ablation, and distraction osteogenesis. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (1), 35-49 (2015).
  17. Cooper, G. M., et al. Testing the critical size in calvarial bone defects: revisiting the concept of a critical-size defect. Plast Reconstr Surg. 125 (6), 1685-1692 (2010).
  18. Yu, Y., Bahney, C., Hu, D., Marcucio, R. S., Miclau, T. Creating rigidly stabilized fractures for assessing intramembranous ossification, distraction osteogenesis, or healing of critical sized defects. J Vis Exp. (62), e3552(2012).
  19. Wu, X., et al. Enhancing calvarial defects repair with PDGF-BB mimetic peptide hydrogels. J Control Release. 370, 277-286 (2024).
  20. Stanton, E., et al. A murine calvarial defect model for the investigation of the osteogenic potential of newborn umbilical cord mesenchymal stem cells in bone regeneration. Plast Reconstr Surg. 153 (3), 637-646 (2023).
  21. Manassero, M., et al. Establishment of a segmental femoral critical-size defect model in mice stabilized by plate osteosynthesis. J Vis Exp. (116), e52940(2016).
  22. Petersen, A., et al. A biomaterial with a channel-like pore architecture induces endochondral healing of bone defects. Nat Commun. 9 (1), 4430(2018).
  23. Xiao, X., et al. Spatial transcriptomic interrogation of the murine bone marrow signaling landscape. Bone Res. 11 (1), 59(2023).
  24. Yu, V. W. C., Scadden, D. T. Heterogeneity of the bone marrow niche. Curr Opin Hematol. 23 (4), 331-338 (2016).
  25. Matsushita, Y., Ono, W., Ono, N. Growth plate skeletal stem cells and their transition from cartilage to bone. Bone. 136, 115359(2020).
  26. Mizuhashi, K., et al. Resting zone of the growth plate houses a unique class of skeletal stem cells. Nature. 563 (7730), 254-258 (2018).
  27. Muruganandan, S., et al. A FoxA2+ long-term stem cell population is necessary for growth plate cartilage regeneration after injury. Nat Commun. 13 (1), 2515(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Intramembranous OssificationBone Marrow InjuryPostnatal OsteogenesisSkeletal Stem CellsBone RegenerationMurine Bone ModelOsteoblast DifferentiationMicro Computed TomographyFrozen Section HistologyBone Repair Mechanisms

Powiązane artykuły