Artykuł metodologiczny

In vitro Test na zakrzepicę dla urządzeń wspomagających pracę komór

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67731

⸱

21 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Meinig School of Biomedical Engineering, Cornell University, 2Department of Bioengineering, University of Pittsburgh, 3Department of Cardiovascular Surgery, Hospital of the University of Pennsylvania

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentujemy protokół laboratoryjny do wywoływania zakrzepicy w urządzeniach wspomagających komorowe (VAD) w ramach recyrkulacyjnej platformy testowej. Metoda ta służy do identyfikacji zakrzepowych punktów zapalnych na ścieżce przepływu krwi i może pomóc w poprawie trombooporności przed badaniami przedklinicznymi na modelach zwierzęcych.

Streszczenie

Ryzyko zakrzepicy pozostaje istotnym problemem w rozwoju i klinicznym zastosowaniu urządzeń wspomagających komorę (VADs). Tradycyjne oceny trombogenności VAD, głównie za pomocą badań na zwierzętach, są kosztowne i czasochłonne, budzą obawy etyczne i ostatecznie mogą nie odzwierciedlać dokładnie wyników uzyskanych u ludzi. Aby zaradzić tym ograniczeniom, opracowaliśmy agresywny protokół testów in vitro, którego celem jest wywołanie zakrzepicy i zidentyfikowanie potencjalnych obszarów wysokiego ryzyka na ścieżce przepływu krwi. Protokół ten, motywowany pracą Maruyamy i wsp., wykorzystuje zmodyfikowaną strategię przeciwzakrzepową i wykorzystuje łatwo dostępne komponenty, dzięki czemu jest dostępny dla większości laboratoriów przeprowadzających badania krwi in vitro na obecność VAD. Wykazaliśmy użyteczność tej metody poprzez iteracyjne testowanie i udoskonalanie miniaturowego, magnetycznie lewitującego pediatrycznego VAD (PediaFlow PF5). Metoda okazała się skuteczna w identyfikacji zakrzepowych punktów zapalnych spowodowanych wadami konstrukcyjnymi i produkcyjnymi we wczesnych prototypach VAD, umożliwiając ukierunkowane ulepszenia przed przejściem do badań na zwierzętach. Pomimo swoich ograniczeń, w tym braku przepływu pulsacyjnego i wpływu charakterystyki krwi dawcy, protokół ten służy jako praktyczne narzędzie do opracowywania VAD na wczesnym etapie i ograniczania ryzyka.

Wprowadzenie

Urządzenia wspomagające pracę komór (VADs) stały się standardem opieki nad pacjentami z zaawansowaną niewydolnością serca, jednak ryzyko zakrzepicy i udaru mózgu pozostaje poważnym wyzwaniem1,2. Zakrzepica w obrębie VED jest zwykle oceniana podczas przedklinicznych badań na zwierzętach, które, choć cenne, wiążą się ze znacznymi kosztami i wyzwaniami logistycznymi. Badania te są zasobochłonne, czasochłonne i podatne na pojedynczą wadę, która zagraża całemu testowi i wymaga dodatkowych prób. To nie tylko zwiększa obciążenie finansowe, ale także budzi obawy etyczne ze względu na konieczność wielokrotnych testów na zwierzętach.

Chociaż istnieje wiele modeli numerycznych do przewidywania odkładania się płytek krwi i zakrzepicy3,4,5,6, tylko kilka z nich nadaje się do symulacji tworzenia się skrzepliny w urządzeniach w skali makro, takich jak VADs7,8,9. Co więcej, istniejące modele nieuchronnie zakładają wyidealizowane powierzchnie i uproszczone "wodoszczelne" geometrie, które nie odzwierciedlają dokładnie złożoności i niedoskonałości rzeczywistych zespołów pomp. Gdy rozważane są interakcje płytk-powierzchnia, te modele w skali makro zazwyczaj wykorzystują jednolicie określone właściwości materiału (zwykle modelowane jako współczynnik w warunkach brzegowych strumienia powierzchniowego)10,11,12. W związku z tym modele numeryczne nie mogą całkowicie zastąpić eksperymentalnych badań z krwią.

Zarówno wybór materiału, jak i wykończenie powierzchni odgrywają kluczową rolę w adhezji płytek krwi na powierzchniach VAD13,14,15,16,17. Niedoskonałości, takie jak szorstkie plamy lub nierówności, mogą sprzyjać adhezji płytek krwi i tworzeniu się skrzeplin. Dodatkowo, szczeliny między komponentami na ścieżce przepływu mogą służyć jako nidus dla zakrzepicy, zapewniając chronione środowisko, w którym mogą tworzyć się i rosnąć skrzepy18,19. Stosowanie smarów, smarów lub uszczelniaczy podczas montażu może również stanowić ryzyko, ponieważ substancje te mogą przenikać do ścieżki przepływu i wchodzić w interakcje z krwią, co dodatkowo zwiększa ryzyko powikłań.

Istnieje zatem potrzeba dobrze zdefiniowanego protokołu badań in vitro, który może wiarygodnie ocenić trombooporność VAD zanim zostaną one poddane testom na zwierzętach lub zastosowaniu klinicznemu. Chociaż istnieje powszechnie przyjęty standard ASTM do oceny hemolizy20, nie istnieje taki standard dla badania trombogenności VED w klinicznie istotnych warunkach operacyjnych21. Pomimo nowatorskich badań sprzed trzech dekad wykazujących wykonalność testów in vitro na zakrzepicę w pompach krwi22,23,24,25, testy na zwierzętach przetrwały do tej pory jako de facto praktyka oceny zakrzepicy26. Przeszkodą w szerszym zastosowaniu metod in vitro jest prawdopodobnie złożony charakter krzepnięcia, z mnogością czynników zakłócających, które mogą wpływać na wyniki testów, co utrudnia odróżnienie wewnętrznej trombogenności pompy od artefaktów wynikających z ograniczeń metodologicznych i błędów proceduralnych.

To zmotywowało nas do udostępnienia szczegółowego protokołu jako przewodnika dla eksperymentatorów, aby uniknąć pułapek, promując w ten sposób stosowanie testów in vitro i zmniejszając zależność od badań na zwierzętach. Opisany w niniejszym dokumencie protokół, wywodzący się z Maruyama et al.27, został dopracowany i zweryfikowany podczas projektowania pediatrycznego VAD28,29. Ta metoda testowa okazała się pomocna w systematycznym identyfikowaniu i eliminowaniu potencjalnych zagrożeń zakrzepotwórczych w prototypach VAD przed testami na zwierzętach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pełna krew owcza użyta w tym badaniu została uzyskana od komercyjnego dostawcy i dlatego nie wymagała przeglądu przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella.

1. Budowa pętli przepływu testowego

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów, aby uzyskać szczegółową listę komponentów pętli i wszystkich innych materiałów używanych w tym protokole.

  1. Zmodyfikuj worek dożylny (IV).
    1. Użyj plastikowej zgrzewarki, aby zmodyfikować worek dożylny, aby dostosować jego objętość i kształt, jak pokazano na Rysunek 1.
      UWAGA: Kształt worka ułatwia odpowietrzanie i umożliwia zaciśnięcie worka za pomocą hemostatu w poprzek linii płynu30,31. Lokalizacja linii uszczelniającej jest wybierana na podstawie objętości zalewania VAD i rurki, aby osiągnąć całkowitą objętość zalewania 150 ml.
    2. Wprowadź otwór wentylacyjny, wykonując 4-milimetrowe nacięcie w górnej części torby. Włóż zadziorany żeński zamek luer do nacięcia i uszczelnij miejsce klejem z kauczuku silikonowego RTV. Przymocuj jednokierunkowy kran do zamka luer.
  2. Zmontuj pętlę testową za pomocą zmodyfikowanego worka dożylnego, rurki z polichlorku winylu (PVC), łączników kolczastych z poliwęglanu oraz 3-drogowych i 1-drogowych kurków odcinających, jak pokazano na Rysunek 1.
  3. Podłączyć manometr ciśnieniowy.
    1. Podłącz 6-calowe przedłużacze do portów ciśnieniowych po stronie wlotowej i wylotowej. Przymocuj jednokierunkowy kran odcinający do drugiego końca przedłużacza.
      UWAGA: Zawór odcinający umożliwia odłączenie rurki manometru w celu zalania przewodu przedłużającego płynem przed uruchomieniem pompy, jak opisano w kroku 4.3.
    2. Podłącz jeden koniec każdej rurki o średnicy wewnętrznej 1/8" (ID) do króćca manometru i włóż męską złączkę luer na drugi koniec.
    3. Podłączyć męskie złączki luer do jednokierunkowych kurków. Otwórz kurki, aby umożliwić odczyty ciśnienia.
  4. Zastosuj zaciskową ultradźwiękową sondę przepływu, aby zmierzyć natężenie przepływu.
  5. Umieść Hoffman clamp dystalnie do portu ciśnienia wylotowego, aby regulować opór przepływu.

2. Przygotowanie roztworu chlorku wapnia (CaCl2)

  1. Rozpuścić sproszkowany CaCl2 w 1x soli fizjologicznej buforowanej TRIS (pH 7,4) w celu przygotowania 1 M roztworu. Należy unikać zawierających fosforany (np. PBS lub DPBS), ponieważ wapń i fosforan reagują, tworząc nierozpuszczalny osad.
  2. W przypadku przygotowywania CaCl2 w dużych ilościach, proszek CaCl2 należy dodawać stopniowo w kilku etapach, ponieważ jego rozpuszczanie jest procesem egzotermicznym.
  3. Miareczkować pH roztworu do 6-8 za pomocą kwasu solnego (HCl) lub wodorotlenku sodu (NaOH), jeśli to konieczne.

3. Przygotowanie krwi

UWAGA: Krew owcza użyta w tym badaniu została uzyskana od komercyjnego dostawcy wymienionego w Tabeli Materiałów. Krew pobrano za pomocą igły 14 G, a zwierzę było unieruchomione w standardowej rolniczej pozycji stojącej. Proces pobierania trwał 10-12 minut od wkłucia igły do zakończenia. Krew była antykoagulowana z 14 częściami CPD do 86 częściami krwi (preparat CPD: 26,3 g / l cytrynianu Na, 25,2 g dekstrozy, 3 g / l kwasu cytrynowego i 2,2 g / l fosforanu Na w wodzie dejonizowanej [DI]). Worek z krwią został wysłany w nocy w izolowanym pojemniku z wkładami z lodu i został wykorzystany do eksperymentu w ciągu 24 godzin od pobrania.

  1. Przygotować krew dawcy do użycia.
    1. Umieść worek na krew na przechylnej platformie na 15-30 minut, aby delikatnie wymieszać krew i pozwolić jej osiągnąć temperaturę pokojową (RT).
    2. Umieść mieszadło magnetyczne w zlewce lub pojemniku z poliwęglanu przeznaczonym do transferu krwi.
    3. Przenieść krew do zlewki przez filtr do transfuzji w celu usunięcia makroagregatów. Z krwią należy obchodzić się delikatnie, aby zapobiec uszkodzeniu składników komórkowych. Wlej krew wzdłuż ścianek pojemnika, aby uniknąć swobodnego spadania i zminimalizować uraz komórkowy.
      UWAGA: Wyrzuć krew, jeśli obecne są duże skrzepliny lub jeśli filtr się zatka.
    4. Umieść zlewkę lub pojemnik na mieszadle magnetycznym i dostosuj prędkość, aż powierzchnia krwi zacznie delikatnie wirować, nie tworząc dużego wiru. Mieszaj w sposób ciągły przez co najmniej 5 minut.
    5. Zmierz hematokryt i liczbę płytek krwi, aby upewnić się, że wartości mieszczą się w normalnym zakresie dla danego gatunku.
  2. Wykonać miareczkowanie w celu określenia docelowego stężenia CaCl2.
    UWAGA: Krew cytrynowana jest ponownie wapnia, aby umożliwić badanie krzepnięcia i zakrzepicy, z dodatkiem heparyny, aby zapobiec niekontrolowanemu krzepnięciu. Docelowy czas krzepnięcia po aktywacji (ACT) dla rozpoczęcia badania wynosi 300 s. Należy pamiętać, że referencyjne wartości ACT podane w tej sekcji zostały uzyskane przy użyciu krwi owiec dawców i mogą się różnić w zależności od gatunku i poziomu antykoagulacji zastosowanej podczas pobierania. Dodatkowo, pomiary ACT mogą się różnić w zależności od instrumentu32,33,34. Może być konieczne przeprowadzenie pewnych prób i błędów w celu ustalenia optymalnego zakresu ACT dla określonej konfiguracji laboratorium.
    1. Przenieść 2 ml przygotowanego 1 M roztworu CaCl2 i 0,5 ml heparyny sodowej (1000 U/ml) z opakowania producenta do probówek do mikrowirówek, aby uniknąć zanieczyszczenia roztworów podstawowych.
    2. Przenieś 10 ml krwi do 14-mililitrowych probówek polipropylenowych. Przygotuj cztery takie tuby.
    3. Aby osiągnąć stężenie heparyny 0,5 U/ml we krwi, dodaj 5 μl heparyny sodowej do 10 ml próbki krwi.
    4. Aby osiągnąć stężenie wapnia 5 mM we krwi, dodaj 50 μl 1 M roztworu CaCl2 do 10 ml próbki krwi. Podczas dozowania obracaj końcówką pipety, aby rozprowadzić CaCl2 na większym obszarze.
    5. Natychmiast odwróć rurkę 10 razy, zwiń ją poziomo (na płaskiej powierzchni lub między dłońmi), a następnie odwróć jeszcze 10 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    6. Zmierz ACT za pomocą przyłóżkowego systemu krzepnięcia krwi pełnej zgodnie z instrukcjami producenta. Początkowy ACT zwykle waha się między 400-500 s.
    7. Utrzymując stałe stężenie heparyny, należy zwiększyć stężenie CaCl2 (do około 7-8 mM), aby osiągnąć ACT na poziomie 300 s.
    8. Sprawdź końcowe stężenie i wynikowy ACT w oddzielnej probówce z krwią.

4. Procedury przed testem

UWAGA: Wszystkie kroki opisane w tej sekcji dotyczą sekcji 5 i 6. Wykonaj te czynności przed uruchomieniem pompy z albuminą surowicy bydlęcej (BSA) lub krwią w pętli. Przenieś krew między naczyniami za pomocą karmienia grawitacyjnego, aby zminimalizować naprężenia mechaniczne. Należy unikać używania tłoka strzykawki do wtłaczania krwi, ponieważ może to spowodować nadmierne ciśnienie. Dodatkowo unikaj dławienia krwi przez wąskie otwory, aby zapobiec uszkodzeniu składników komórkowych.

  1. Napełnianie i opróżnianie pętli testowej
    1. Podłącz 30-calowy przedłużacz do portu iniekcyjnego i podłącz cylinder strzykawki o pojemności 60 ml jako lejek. Otwórz zawór odcinający zbiornika, aby działał jako odpowietrznik.
    2. Wlej płyn do lejka, podnosząc go w razie potrzeby, aby przyspieszyć napełnianie. Napełnij pętlę do 1-2 cm poniżej otworu wentylacyjnego w górnej części torby. Zamknąć zawór odpowietrzający i zawór odcinający portu wtryskowego.
    3. Aby opróżnić powietrze, otwórz zawór odpowietrzający i zawór odcinający portu wtryskowego i opuść lejek poniżej poziomu stołu. Podnieś pompę powyżej portu odpływowego, aby usunąć pozostały płyn.
  2. Odpowietrzanie pętli testowej
    UWAGA: Wykonaj tę procedurę podczas napełniania pętli BSA lub krwią przed uruchomieniem pompy.
    1. Upewnij się, że w żadnym miejscu pętli nie jest uwięzione powietrze. Usuń pęcherzyki powietrza z powierzchni, delikatnie stukając i ściskając rurkę i zbiornik.
    2. Jeśli oceniasz pompę krwi o przepływie osiowym, obróć ją do pozycji pionowej, aby uwolnić powietrze przez wyporność. Jeśli używasz pompy odśrodkowej, odwróć ją do góry nogami i obróć, aby upewnić się, że powietrze nie zostanie uwięzione w wtórnych ścieżkach przepływu.
    3. Dokładnie sprawdź poziome odcinki przewodów i połączenia między rurkami a złączami, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    4. Ściśnij worek dożylny, aby zbliżyć poziom płynu do górnej wąskiej części i zaciśnij worek z hemostatem w poprzek linii płynu, aby wyeliminować granicę faz płyn-powietrze. Zamknąć zawór odpowietrzający.
  3. Zalewanie przewodów ciśnieniowych i króćca pobierania próbek
    1. Zamknij kran na końcu przewodów ciśnieniowych, wyjmij rurkę manometru i podłącz strzykawkę o pojemności 3 ml. Otwórz kran i wlej 1-2 ml płynu do przedłużacza (około 4 cm).
    2. Zamknąć zawór odcinający, odłączyć strzykawkę i ponownie podłączyć rurkę manometru. Otwórz zawór odcinający, aby umożliwić odczyty ciśnienia.
    3. Zalać port pobierania próbek za pomocą strzykawki.
  4. Czyszczenie portów wtrysku i pobierania próbek
    1. Pokrój lub rozerwij niestrzępiącą się chusteczkę na trzy równe fragmenty. Przekręć róg jednego fragmentu, aby utworzyć końcówkę i włóż go do portu, aby wchłonąć resztki krwi.
    2. Przekręć drugi fragment, zwilż go solą fizjologiczną i włóż mokrą końcówkę do portu. Przekręć go wokół portu, aby usunąć całą pozostałą krew.
    3. Użyj trzeciego fragmentu, aby wchłonąć resztki soli fizjologicznej w porcie.
      UWAGA: Tę procedurę czyszczenia należy wykonać natychmiast po pobraniu próbki krwi lub za każdym razem, gdy w portach znajdują się resztki krwi.

5. Pasywacja powierzchni mających kontakt z krwią

  1. Napełnij pętlę 1% roztworem BSA i uruchom VAD, aby krążyć w nim przez co najmniej 30 minut.
  2. Sprawdź pętlę pod kątem wycieków i w razie potrzeby zmontuj ponownie.
  3. Całkowicie opróżnij roztwór BSA, aby uniknąć hemodilutacji.

6. Badania na zakrzepicę

  1. Przygotuj pętlę testową.
    1. Napełnij pętlę 150 ml krwi.
    2. Odwietrzyć pętlę i zalać przewody ciśnieniowe oraz port pobierania próbek zgodnie z opisem w krokach 4.2-4.4.
    3. Uruchom pompę z niską prędkością i pracuj przez około 5 sekund, aby usunąć wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza w pompie, a następnie zatrzymaj pompę.
    4. Jeśli w torbie pojawią się bąbelki, powtórz krok 4.2, aby ponownie wykonać odpowietrzanie.
    5. Uruchom ponownie pompę z niską prędkością, aby krew krążyła w pętli.
  2. Dodaj heparynę do krwi w pętli.
    1. Przenieś 1 ml heparyny sodowej (1000 U/ml) i 1,5 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA; 0,5 M) z opakowania producenta do oddzielnych probówek, aby ułatwić obsługę podczas testu.
    2. Użyj poprzecznego portu 3-drogowego kranu do podawania substancji do pętli za pomocą strzykawki. Obróć męską blokadę luer na kurku tak, aby port wtryskowy był skierowany do góry, aby zatrzymać pęcherzyki powietrza u góry.
    3. Osiągnij stężenie heparyny 0,5 U/ml w pętli, dodając 75 j. heparyny sodowej do 150 ml krwi. Odessać 75 j. heparyny (75 μl w przypadku stosowania o stężeniu 1000 μl) do mikropipety i dozować ją do strzykawki o pojemności 3 ml, jednocześnie dozując pipetę i pociągając tłok strzykawki. Upewnij się, że cały płyn został przeniesiony bez rozlewania.
    4. Podłączyć strzykawkę do portu iniekcyjnego za pomocą zamka typu luer, z portem skierowanym do góry i końcówką strzykawki skierowaną pionowo w dół. Narysować tłok strzykawki, aby napełnić ją krwią i zmieszać heparynę z krwią, jednocześnie zasysając powietrze do strzykawki. Pozwolić, aby pęcherzyk powietrza uniósł się do górnej części strzykawki. Wstrzyknąć mieszaninę do pętli, upewniając się, że nie dostaje się powietrze.
    5. Wprowadź i wyjdź krwi ze strzykawki 4-5 razy, aby upewnić się, że krew w heparyniźnie nie pozostanie zamknięta w przestrzeni w porcie. Upewnij się, że żadne powietrze nie dostaje się do pętli.
  3. Miareczkować ACT krwi w pętli.
    1. Osiągnąć początkowe stężenie wapnia wynoszące 5 mM w pętli, dodając 750 μl 1 M roztworu CaCl2 do 150 ml krwi przy użyciu tej samej procedury, co heparyna.
      1. Krew wystawiona na działanie wysokich stężeń wapnia może zacząć krzepnąć w strzykawce. Szybko wstrzyknąć płyn po usunięciu resztek powietrza. Opcjonalnie należy rozcieńczyć CaCl2 w strzykawce 1 ml soli fizjologicznej buforowanej TRIS, aby zmniejszyć ryzyko przedwczesnej krzepnięcia.
    2. Pozwól, aby wstrzyknięty CaCl2 krążył w pętli przez co najmniej 2 minuty przed pobraniem próbki krwi w celu zmierzenia początkowego ACT.
    3. Podłączyć strzykawkę o pojemności 1 ml do portu pobierania próbek. Pobrać i wyrzucić 0,5 ml krwi odpadowej, aby usunąć stojącą krew z portu.
    4. Podłączyć nową strzykawkę o pojemności 1 ml, pobrać 0,5 ml krwi do analizy i zmierzyć ACT. Oczyść port pobierania próbek, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 4.4.
    5. Zapoznaj się z wartościami miareczkowania w kroku 3.2, aby określić docelowe stężenie CaCl2. Stopniowo zwiększaj stężenie wapnia, aby osiągnąć ACT 300 s. Unikać dodawania pełnej ilości CaCl2 na raz, aby zapobiec szybkiemu krzepnięciu.
      UWAGA: W testach zastosowanych w tym badaniu początkowe stężenie wapnia wynoszące 5 mM dało ACT 450 ± 50 s, a końcowe stężenie 7-8 mM dało ACT 300 ± 20 s. Chociaż ta reakcja może się różnić, staraj się sprowadzić ACT do lub poniżej 300 s na początku testu.
  4. Rozpocznij test.
    1. Po osiągnięciu ACT 300 s w pętli rozpocznij 1-godzinny test. Dostosuj pompę do żądanego natężenia przepływu i ciśnienia, modyfikując prędkość wirnika i regulując opór za pomocą zacisku Hoffmana.
    2. Mierz ACT co 15 minut, wykonując kroki 6.3.3-6.3.4.
    3. Jeśli ACT spadnie poniżej 200 s, wstrzyknąć dodatkowe 25 j. heparyny sodowej do pętli.
  5. Zakończ test.
    1. Pod koniec 1 godziny wstrzyknąć EDTA do pętli, aby zahamować dalszą koagulację, dążąc do końcowego stężenia 5 mM we krwi. (Wstrzyknąć 1,5 ml, jeśli używasz 0,5 M roztworu EDTA.)
    2. Pozwól EDTA krążyć i mieszaj przez 2 minuty, a następnie zatrzymaj pompę.
  6. Odłączyć i przepłukać pompę.
    1. Zacisnąć rurkę podłączoną do wlotu i wylotu pompy za pomocą hemostatów, umieszczając zaciski w odległości 3-4 cm od króćców wlotowych i wylotowych.
    2. Ostrożnie odłącz wężyk, aby zwolnić pompę.
    3. Spuść krew z pompy i pętli przepływu do pojemnika.
    4. Zmyj resztki krwi z pompy poprzez grawitacyjne podawanie lub pipetowanie soli fizjologicznej przez wlot i wylot pompy.
      UWAGA: Kroki 6.7 i 6.8 są wykonywane równocześnie.
  7. Sprawdź ścieżkę przepływu pompy.
    1. Uchwyć obrazy wlotu i wylotu pompy za pomocą kamery endoskopowej/boroskopowej.
    2. Zdemontuj pompę (jeśli dotyczy). Umyj elementy w kąpieli solankowej i sprawdź, czy nie ma skrzeplin za pomocą lunety sekcyjnej lub obiektywu makro.
    3. Sfotografuj powierzchnie mające kontakt z krwią w celu dokumentacji.
      UWAGA: Konsekwentna kontrola i dokładna dokumentacja mają kluczowe znaczenie dla testów porównawczych.
  8. Przefiltruj zużytą krew.
    1. Wytnij kawałek nylonowej siatki o grubości 100 μm wystarczająco duży, aby zakryć otwór pojemnika na odpady.
    2. Umieść siatkę nad pojemnikiem z lekkim naciągnięciem, aby krew mogła przez nią skutecznie przepływać. Zabezpiecz krawędzie siatki, aby zapobiec jej ślizganiu się podczas filtracji.
    3. Przepuść zużytą krew przez nylonową siatkę. Krew należy utylizować zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi postępowania z odpadami biologicznymi.
    4. Zbadaj siatkę pod kątem wychwyconych skrzeplin i udokumentuj wyniki.
  9. Przygotuj się do analizy histologicznej.
    1. Jeśli planowana jest analiza histologiczna, należy utrwalić wszelkie skrzepliny znajdujące się w roztworze formaliny, postępując zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa.
      UWAGA: Podczas pracy z formaldehydem należy zawsze używać dygestorium.

7. Procedura czyszczenia

  1. Zdemontuj pętlę przepływu. Wyrzuć worek na krew z PVC i rurki.
  2. Namocz na noc wszystkie inne elementy mające kontakt z krwią (złącza, zawory odcinające, zamki typu luer itp.) w 1% enzymatycznym roztworze detergentu w proszku. Spłucz ciepłą wodą z kranu, a następnie wodą DI i wysusz na powietrzu.
    1. Jeśli pozostaną skrzepy, należy poddać sonikacji składników w roztworze detergentu. Dokładnie spłucz i wysusz na powietrzu.
  3. Wyczyść pompę.
    1. Jeśli pompę można zdemontować, namocz i poddaj sonikacji elementy mające kontakt z krwią za pomocą 1% uniwersalnego roztworu środka czyszczącego/odtłuszczającego, a następnie 1% aktywnego enzymatycznie roztworu detergentu w proszku.
    2. Jeśli pompy nie można zdemontować, podłącz ją do nowej pętli przepływu wypełnionej roztworami czyszczącymi i pracuj z dużą prędkością przez co najmniej 30 minut. W razie potrzeby powtórz.
  4. Dokładnie wypłucz pompę ciepłą wodą z kranu, a następnie wodą DI i wysusz na powietrzu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślna realizacja niniejszego protokołu umożliwia identyfikację zlokalizowanych obszarów osadzania się płytek krwi, co pozwala na wykrycie problematycznych miejsc w ścieżce przepływu pompy. Konsekwentne stosowanie tego protokołu pozwala na wprowadzanie stopniowych ulepszeń poprzez eliminację tych zidentyfikowanych „punktów zapalnych”.

Na przykład podczas opracowywania VAD PediaFlow PF5 napotkaliśmy trudności z ręcznym polerowaniem strony ciśnieniowej łopatek stojana ze względu na miniaturowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pierwsze badanie nowej pompy na ludziach jest zawsze niepewnym przedsięwzięciem, ponieważ badania przedkliniczne nie mogą wiarygodnie przewidzieć trombogenności VED u ludzi26. Warto zauważyć, że niektóre VAD, które wykazały brak zakrzepicy w badaniach na zwierzętach, wykazały później znaczną trombogenność w zastosowaniu klinicznym36. Agresywny schemat badań in vitro opracowany specjalnie w celu wywołania zakrzepicy stanowi cenną okazję do zidentyfikowania potencjal...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

S.E.O. obecnie pełni funkcję konsultanta w Magenta Medical, a wcześniej był konsultantem w Boston Scientific. Żaden inny autor nie ma żadnych istotnych ujawnień finansowych ani konfliktów interesów, które mógłby zgłosić.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez R01HL089456 grantowe National Institutes of Health oraz U.S. Army Medical Research Acquisition Activity Project Number W81XWH2010387.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki 14 mlFalcon352059Probówki polipropylenowe z okrągłym dnem i zatrzaskiem
1-kierunkowy kranQosina99759Blokada Luer żeńska, męska Luer z blokadą obrotową
3-drogowy zawór odcinającyQosina997712 żeńskie zamki Luer Lock, obrotowe męskie Luer Lock
ACT+ kuwety do HemochronWerfen000JACT+45/Box
Uniwersalny środek czyszczący/odtłuszczającySimple Green2710200613005Simple Green Cleaner and Degreaser. Użyj 1% roztworu.
Łączniki kolczasteQosina73311Materiał: poliwęglan; ¼ ” x & frac14; ” łącznik prosty
Łączniki kolczaste z zamkiem luer lockQosina73316Materiał: poliwęglan; ¼ ” x & frac14; ” złącze proste z zamkiem typu luer
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Thermo Scientific ChemicalsAAJ6465522Lub równoważny
Chlorek wapnia, CaCl2Thermo Scientific ChemicalsAA89866-30Bezwodny, ≥ 96,0% ACS
Luneta preparcyjna (zalecana)Olympushttps://www.olympus-lifescience.com/en/technology/museum/micro/1984/Olympus SZH10 (powiększenie ciągłe 7x - 70x) lub podobny
DPBS (bez wapnia i magnezu)Gibco14200075sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco, bez wapnia, bez magnezu, 10X (przed użyciem należy rozcieńczyć do 1X)
EDTA Quality Biological351-027-721EA0,5 M, pH 7,0– 8.0 (Kwas etylenodiaminotetraoctowy)
Endoskop / boroskop / kamera otoskopowa (opcjonalnie)Bebirdhttps://bebird.com/products/earsight-pro-ear-wax-removers3– Średnica sondy 4 mm
Enzymatyczny detergent w proszkuAlconox1304-1Alconox Tergazyme. Użyj 1% roztworu.
Linia przedłużająca, 30"Qosina 3621830" długość,  żeński zamek luer do męskiego zamka luer
Linia przedłużająca, 6"Qosina 36212Długość 6 ",  żeński zamek luer do męskiego zamka luer
luer, kolczastyQosina11548Pasuje do rurki o średnicy wewnętrznej 1/8 cala; Materiał: poliwęglan;
PrzepływomierzTransonichttps://www.transonic.com/t402-t403-consolesModuł Transonic TS410
HemostatFisherbrand13-820-004Hemostat blokujący o długości końcówki co najmniej 5 cm
Heparyna SódMcKesson Usługi pakowania949513stężeniu 1000 U/ml
Zacisk HoffmanaHumboldtH8720Zacisk drobnogwintowany
Worek IV (zgodny zbiornik krwi)Qosina51494Materiał: PVC, 2 porty rurowe 0,258 "ID. Worek o pojemności 100 ml jest modyfikowany za pomocą zgrzewarki
Chusteczki niestrzępiące sięKimberly-Clark Professional34120Wycieraczki Kimtech Science
Mieszadło magnetyczneINTLLABMS-500Lub podobne
Męski zamek luer, kolczastyQosina11549Pasuje do rurki ID 1/8 cala; materiał: poliwęglan;
Manometr (cyfrowy)Sper Scientific840081SPER-840081 lub podobny
Nylonowa siatka filtrującaMcMaster-Carr9318T21100-μ m (0,0039") rozmiar otworu
Krew owczaLampire7209004Dawca krwi pełnej, antykoagulowanej ACD 14:86, wysyłanej z dnia na dzień
Zgrzewarka do worków foliowychUlineH-190Uline H-190 lub podobna (bez noża)
Klej z kauczuku silikonowegoSmooth-On B00IRC1YI0Sil-Poxy lub podobny
Strzykawka z blokadą luer, 1 mlFisher Scientific14-955-646Strzykawka ręczna Fisherbrand bez igły do celów badawczych
Strzykawka z blokadą luer, 3 mlFisher Scientific14-955-457Strzykawka ręczna Fisherbrand bez igły do celów badawczych
Strzykawka z blokadą luer, 60 mlFisher Scientific14-955-461Ręczna strzykawka Fisherbrand bez igły do celów badawczych
Filtr do transfuzjiHaemonetics Corporation SQ40S/SQ40NSHaemonetics Corporation SQ40S filtr do transfuzji krwi na palce
TRIS Buforowana sól fizjologicznaThermo Scientific ChemicalsAAJ62938K2TBS 10x (przed użyciem należy rozcieńczyć do 1X), rurka pH 7,4
Rurka TygonADF00017Tygon ND-100-65 (klasa medyczna)
Ultradźwiękowy czujnik przepływuTransonichttps://www.transonic.com/hqxl-flowsensorsWybierz odpowiedni model czujnika przepływu dla używanego rozmiaru przewodu. Czujnik zaciskowy ME6PXL pasuje do 3/8" Rurki OD. Czujnik jest kalibrowany przez firmę Transonic dla płynu testowego (np. krew w  24C) i klasy rurki (np. Tygon ND-100-65)
Ultradźwiękowy sonograf (opcjonalnie)Branson UltrasonicsCPX952238RBranson CPX2800H lub podobny
system VADPediaFlowPF5System VAD, który ma być testowany; obejmuje pompę i sterownik
System krzepnięcia krwi pełnejWerfenhttps://www.werfen.com/na/en/point-of-care-testing-devices/ACT-machine-hemochron-signature-eliteHemochron Signature Elite lub Signature Jr
żeński

Bibliografia

  1. Kirklin, J. K., et al. Eighth annual INTERMACS report Special focus on framing the impact of adverse events. J Heart Lung Transplant. 36 (10), 1080-1086 (2017).
  2. Kormos, R. L., et al. The Society of Thoracic Surgeons Intermacs Database Annual Report: Evolving indications, outcomes, and scientific partnerships. Ann Thorac Surg. 107 (2), 341-353 (2019).
  3. Leiderman, K., Fogelson, A. An overview of mathematical modeling of thrombus formation under flow. Thromb Res. 133 (SUPPL. 1), S12-S14 (2014).
  4. Anand, M., Rajagopal, K. A short review of advances in the modelling of blood rheology and clot formation. Fluids. 2 (3), 35(2017).
  5. Belyaev, A. V., Dunster, J. L., Gibbins, J. M., Panteleev, M. A., Volpert, V. Modeling thrombosis in silico: Frontiers, challenges, unresolved problems and milestones. Phys Life Rev. 26- 27, 57-95 (2018).
  6. Manning, K. B., Nicoud, F., Shea, S. M. Mathematical and computational modeling of device-induced thrombosis. Curr Opin Biomed Eng. 20, 100349(2021).
  7. Wu, W. T., Yang, F., Wu, J., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. High fidelity computational simulation of thrombus formation in Thoratec HeartMate II continuous flow ventricular assist device. Sci Rep. 6 (Decemeber), 1-11 (2016).
  8. Méndez Rojano, R., Lai, A., Zhussupbekov, M., Burgreen, G. W., Cook, K., Antaki, J. F. A fibrin enhanced thrombosis model for medical devices operating at low shear regimes or large surface areas. PLoS Comput Biol. 18 (10), e1010277(2022).
  9. Taylor, J. O., Meyer, R. S., Deutsch, S., Manning, K. B. Development of a computational model for macroscopic predictions of device-induced thrombosis. Biomech Model Mechanobiol. 15 (6), 1713-1731 (2016).
  10. Strong, A. B., Stubley, G. D., Chang, G., Absolom, D. R. Theoretical and experimental analysis of cellular adhesion to polymer surfaces. J Biomed Mater Res. 21 (8), 1039-1055 (1987).
  11. Sorensen, E. N., Burgreen, G. W., Wagner, W. R., Antaki, J. F. Computational simulation of platelet deposition and activation: I. Model development and properties. Ann Biomed Eng. 27 (4), 436-448 (1999).
  12. Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Wagner, W. R., Aubry, N., Massoudi, M., Antaki, J. F. Multi-constituent simulation of thrombus deposition. Sci Rep. 7 (1), 42720(2017).
  13. Yamane, T. How Do We Select Materials. Mechanism of Artificial Heart. , Springer. Tokyo. (2016).
  14. Sin, D., Kei, H., Miao, X. Surface coatings for ventricular assist devices. Expert Rev Med Devices. 6 (1), 51-60 (2009).
  15. Zhang, M., Tansley, G. D., Dargusch, M. S., Fraser, J. F., Pauls, J. P. Surface coatings for rotary ventricular assist devices: A systematic review. ASAIO J. 68 (5), 623-632 (2022).
  16. Linneweber, J., Dohmen, P. M., Kerzscher, U., Affeld, K., Nosé, Y., Konertz, W. The effect of surface roughness on activation of the coagulation system and platelet adhesion in rotary blood pumps. Artif Organs. 31 (5), 345-351 (2007).
  17. Jayaraman, A., Kang, J., Antaki, J. F., Kirby, B. J. The roles of sub-micron and microscale roughness on shear-driven thrombosis on titanium alloy surfaces. Artif Organs. 47 (3), 490-501 (2023).
  18. Jamiolkowski, M. A., Pedersen, D. D., Wu, W., Antaki, J. F., Wagner, W. R. Visualization and analysis of biomaterial-centered thrombus formation within a defined crevice under flow. Biomaterials. 96, 72-83 (2016).
  19. Zhussupbekov, M., Wu, W. -T., Jamiolkowski, M. A., Massoudi, M., Antaki, J. F. Influence of shear rate and surface chemistry on thrombus formation in micro-crevice. J Biomech. 121, 110397(2021).
  20. ASTM F1841-19: Standard practice for assessment of hemolysis in continuous flow blood pumps. , ASTM International. At https://www.astm.org/f1841-19.html (2019).
  21. Sarode, D. N., Roy, S. In vitro models for thrombogenicity testing of blood-recirculating medical devices. Expert Rev Med Devices. 16 (7), 603-616 (2019).
  22. Swier, P., Bos, W. J., Mohammad, S. F., Olsen, D. B., Kolff, W. J. An in vitro test model to study the performance and thrombogenecity of cardiovascular devices. ASAIO Trans. 35 (3), 683-686 (1989).
  23. Schima, H., et al. In vitro investigation of thrombogenesis in rotary blood pumps. Artif Organs. 17 (7), 605-608 (1993).
  24. Tayama, E., et al. In vitro thrombogenic evaluation of centrifugal pumps. Artif organs. 21 (5), 418-420 (1997).
  25. Paul, R., et al. In vitro thrombogenicity testing of artificial organs. Int J Artif Organs. 21 (9), 548-552 (1998).
  26. Jamiolkowski, M. A., Snyder, T. A., Perkins, I. L., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Preclinical device thrombogenicity assessments: Key messages from the 2018 FDA, industry, and academia forum. ASAIO J. 67 (2), 214-219 (2021).
  27. Maruyama, O., Tomari, Y., Suciyama, D., Nishida, M., Tsutsui, T., Yamane, T. Simple in vitro testing method for antithrombogenic evaluation of centrifugal blood pumps. ASAIO J. 55 (4), 314-322 (2009).
  28. Olia, S. E., et al. Preclinical performance of a pediatric mechanical circulatory support device: The PediaFlow ventricular assist device. J Thorac Cardiovasc Surg. 156 (4), 1643-1651.e7 (2018).
  29. Borovetz, H. S., Olia, S. E., Antaki, J. F. Toward the Development of the PediaFlowTM Pediatric Ventricular Assist Device: Past, Present, Future. Appl Eng Sci. 11, 100113(2022).
  30. Herbertson, L. H., et al. Multilaboratory study of flow-induced hemolysis using the FDA benchmark nozzle model. Artif Organs. 39 (3), 237-248 (2015).
  31. Olia, S. E., Herbertson, L. H., Malinauskas, R. A., Kameneva, M. V. A reusable, compliant, small volume blood reservoir for in vitro hemolysis testing. Artif Organs. 41 (2), 175-178 (2017).
  32. Doherty, T. M., Shavelle, R. M., French, W. J. Reproducibility and variability of activated clotting time measurements in the cardiac catheterization laboratory. Catheter Cardiovasc Interv. 65 (3), 330-337 (2005).
  33. Chia, S., Van Cott, E. M., Raffel, C. O., Jang, I. -K. Comparison of activated clotting times obtained using Hemochron and Medtronic analysers in patients receiving anti-thrombin therapy during cardiac catheterisation. Thromb Haemost. 101 (03), 535-540 (2009).
  34. Li, H., Serrick, C., Rao, V., Yip, P. M. A comparative analysis of four activated clotting time measurement devices in cardiac surgery with cardiopulmonary bypass. Perfusion. 36 (6), 610-619 (2021).
  35. Hastings, S. M., Ku, D. N., Wagoner, S., Maher, K. O., Deshpande, S. Sources of circuit thrombosis in pediatric extracorporeal membrane oxygenation. ASAIO J. 63 (1), 86-92 (2017).
  36. Starling, R. C., et al. Unexpected abrupt increase in left ventricular assist device thrombosis. N Engl J Med. 370 (1), 33-40 (2014).
  37. Hastings, S. M., Deshpande, S. R., Wagoner, S., Maher, K., Ku, D. N. Thrombosis in centrifugal pumps: Location and composition in clinical and in vitro circuits. Int J Artif Organs. 39 (4), 200-204 (2016).
  38. Patel, M., Jamiolkowski, M. A., Vejendla, A., Bentley, V., Malinauskas, R. A., Lu, Q. Effect of temperature on thrombogenicity testing of biomaterials in an in vitro dynamic flow loop system. ASAIO J. 69 (6), 576-582 (2023).
  39. ASTM F2888-19: Standard practice for platelet leukocyte count-An in-vitro measure for hemocompatibility assessment of cardiovascular materials. , ASTM International. Available from: https://www.astm.org/f2888-19.html (2019).
  40. Patel, M., Serna, C., Parrish, A., Gupta, A., Jamiolkowski, M., Lu, Q. Alternative anticoagulant strategy to improve the test sensitivity of ASTM F2888-19 standard for platelet and leukocyte count assay. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 112 (12), e35514(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Badania zakrzepowo cidroga przep ywu krwiprotok laboratoryjnyaktywowany czas krzepni ciamiareczkowanie chlorkiem wapniadepozycja p ytek krwiprototypowanie pompyalternatywy dla bada na zwierz tach

Powiązane artykuły