Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67732

⸱

21 marca 2025

 ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California, San Diego, 2School of Biological Sciences, Department of Ecology, Behavior, and Evolution, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9.

Streszczenie

Pojawienie się technologii CRISPR-Cas9 (ang. clustered, regularly interpersed, short palindromic repeats)-Cas9 zrewolucjonizowało dziedzinę inżynierii genetycznej i otworzyło drzwi do precyzyjnej edycji genomu u wielu gatunków, w tym organizmów niemodelowych. U komara Aedes aegypti za pomocą tej technologii osiągnięto mutacje powodujące utratę funkcji i insercje DNA. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół edycji genomu poprzez mikroiniekcję embrionalną u komara A. aegypti przy użyciu technologii CRISPR-Cas9, koncentrując się zarówno na generowaniu linii nokautu genu, jak i knockin. W tym protokole igły kwarcowe są wypełnione mieszaniną przewodnika RNA, rekombinowanego Cas9 i plazmidu zawierającego kasetę DNA kodującą gen dla markera fluorescencyjnego, jeśli pożądana jest pukanie genu. Zarodki w stadium preblastodermy są ustawiane w rzędzie na pasku dwustronnej taśmy klejącej umieszczonym na szkiełku nakrywkowym, które następnie jest mocowane na szkiełku podstawowym. Za pomocą mikrowstrzykiwacza igły są delikatnie wprowadzane do tylnego końca zarodków i dozowana jest niewielka objętość mieszaniny CRISPR. Po wykluciu się zarodków larwy są sprawdzane pod kątem fluorescencyjnym, a poczwarki są sortowane według płci i rozdzielane w różnych klatkach. Po pojawieniu się dorosłych osobników są one wzajemnie krzyżowane z osobnikami typu dzikiego, karmione krwią i umieszczane w celu złożenia jaj. Po wykluciu się tych jaj zebrane fluorescencyjne larwy reprezentują osoby ze stabilną insercją kasety DNA do ich genomu. Larwy te są następnie hodowane do stadium dorosłego, krzyżowane z osobnikami typu dzikiego, a następnie oceniane za pomocą technik molekularnych w celu potwierdzenia, że dokładna sekwencja kasety DNA jest obecna w pożądanym miejscu genomu komara. Linie homozygotyczne można również uzyskać, postępując zgodnie z dostarczonym procesem schematu krzyżowania i molekularnych badań przesiewowych mutacji.

Wprowadzenie

Precyzyjna edycja genomu stała się prawdopodobnie łatwiejsza, ale możliwa, dzięki wprowadzeniu technologii CRISPR-Cas molekularnych nożyczek1. Technologie te wykorzystują mechanizm, który prokariotyczny układ odpornościowy wykorzystuje do walki z infekcjami fagowymi2. Wśród tych systemów, zgrupowane, regularnie przeplatane, krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR) wraz z nukleazą Cas9 zwykle opierają się na 20 parach zasad RNA, przewodnikowych RNA (gRNA), z sekwencjami homologicznymi do docelowego DNA, po których następuje sekwencja NGG protospacer sąsiedniego motywu (PAM)3. GRNA załadowane do Cas9 kierują te nukleazy precyzyjnie do określonych miejsc docelowych w genomie, wywołując pęknięcia dwuniciowego DNA3.

Pęknięcia podwójnej nici DNA indukują mechanizmy naprawcze, które łatają podwójną helisę4. Podczas gdy oczekuje się, że każda naprawa DNA będzie precyzyjna, istnieją mniej dokładne mechanizmy naprawy DNA, które mogą pozostawić blizny po sekwencji, a co za tym idzie, mutacje powodujące utratę funkcji4. Wśród podatnych na błędy mechanizmów naprawy DNA, niehomologiczne łączenie końców (NHEJ) może powodować mutacje przesunięcia ramki, w tym małe delecje, insercje i zmiany nukleotydowe (SNP), które mogą powodować mutację powodującą utratę funkcji. Z drugiej strony, mechanizm Homology Directed Repair (HDR) opiera się na chromosomie homologicznym jako matrycy do kopiowania dokładnej sekwencji nieuszkodzonego allelu i dokonywania doskonałej naprawy docelowej sekwencji DNA4.

Na podstawie tej wiedzy, technologia CRISPR-Cas9 została opracowana do precyzyjnej edycji genomów, prawdopodobnie w dowolnej sekwencji zawierającej miejsce PAM3. U komarów technologia CRISPR-Cas9 została wykorzystana do wyeliminowania różnych genów poprzez embrionalną mikroiniekcję mieszaniny Cas9 i gRNA, wykorzystując mechanizm naprawy NHEJ5,6. Podobną mutagenezę linii zarodkowej uzyskuje się przez wstrzyknięcie mieszaniny gRNA + Cas9 do hemolimfy dorosłych samic komarów7. Technologia ta została ukuta jako kontrola ReMOT i opiera się na zmodyfikowanej wersji Cas9 oznaczonej peptydem, który jest pobierany przez jajniki przez endocytozę podczas procesu rozwoju jaja (witellogeneza)7. Wbicie określonych kaset genowych do genomu jest możliwe tylko poprzez embrionalną mikroiniekcję mieszaniny gRNA i Cas9 (lub plazmidu wyrażającego te cząsteczki) wraz z plazmidem kodującym pożądaną kasetę DNA8. Wykorzystując mechanizm HDR, plazmid zawierający interesującą nas kasetę DNA otoczoną sekwencjami homologicznymi (500-1,000bp)9,10 przed i za miejscem docelowym jest używany jako matryca do ponownego napisania pęknięcia dwuniciowego, kopiując również kasetę DNA do sekwencji docelowej9.

Technologia CRISPR-Cas9 została użyta do wyeliminowania wielu genów związanych głównie z systemami sensorycznymi komara Aedes aegypti11, ale także genów związanych z płodnością samców i żywotnością samic (PgSIT) do kontroli populacji12. Wyeliminowanie docelowych genów zostało również osiągnięte poprzez wbicie genów kodujących markery fluorescencyjne do sekwencji kodujących określone geny13,14. Strategia ta ma tę zaletę, że nie tylko indukuje mutacje z przesunięciem ramki ramki, ale także pozwala na użycie światła fluorescencyjnego do sortowania osobników nowej linii nokautu13,14. Genom A. aegypti został również zmodyfikowany za pomocą sekwencji binarnych systemów ekspresji, takich jak Q-system (QF-QUAS)11. Wpukanie genu kodującego transaktywator QF do promotora określonego genu zapewnia zdefiniowaną czasoprzestrzenną ekspresję transaktywatora15,16. Gdy linia komara wykazująca ekspresję QF zostanie skrzyżowana z inną linią komara zawierającą miejsca wiązania (QUAS) dla QF, ta ostatnia wiąże się z nią i wyzwala ekspresję genów poniżej sekwencji QUAS15,16. Ogólnie rzecz biorąc, system ten umożliwia specyficzną dla tkanek i czasu ekspresję takich genów efektorowych, które mogą być markerami fluorescencyjnymi używanymi do lokalizacji komórek lub wykrywania aktywności neuronalnej, a nawet nukleazami Cas9 do zakłócania genów w określonych tkankach (tj. nokaut somatyczny)11.

Biorąc pod uwagę wszystkie dostępne informacje na temat transformacji genetycznej A. aegypti, przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół z instrukcjami krok po kroku do przeprowadzenia edycji genomu za pomocą systemu CRISPR-Cas9 poprzez mikroiniekcję embrionalną. Omówiono strategie generowania zarówno nokautu, poprzez mutacje i delecje z przesunięciem ramki, w których pośredniczy NHEJ, jak i linii knockin, przez insercje kaset genowych za pośrednictwem HDR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Szczegóły związane z sprzętem i odczynnikami używanymi w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Wszystkie zwierzęta były traktowane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, zgodnie z zaleceniami National Institutes of Health. Procedury zostały zatwierdzone przez UCSD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC, Animal Use Protocol #S17187) oraz UCSD Biological Use Authorization (BUA #R2401).

1. Projekt gRNA i plazmidu dawcy

  1. Aby stworzyć mutanty nokautujące, zaprojektuj dwa gRNA oddalone od siebie o ~20-100 pz (Rysunek 1A).
    1. Zaprojektuj 20 bp gRNA dla CRISPR-Cas9, z wyłączeniem sekwencji PAM (NGG) za pomocą narzędzia online (Rysunek 1A), takiego jak CHOPCHOP ( https://chopchop.cbu.uib.no/)17lub Benchling (benchling.com) lub CRISPOR (http://crispor.gi.ucsc.edu/)18. Wybierz najbardziej specyficzne i niedocelowe gRNA do eksperymentów, zgodnie z sugestiami narzędzia online.
    2. Upewnij się, że skuteczne miejsce cięcia enzymu restrykcyjnego jest zawarte w sekwencji między miejscami cięcia gRNA (Rysunek 1A). Dołącz miejsce enzymu restrykcyjnego między miejscami cięcia gRNA, aby umożliwić szybkie wizualne potwierdzenie udanych edycji.
      UWAGA: Kiedy następuje delecja, miejsce restrykcyjne jest usuwane, więc enzym nie przetnie sekwencji, wytwarzając pojedynczą, nieodciętą prążek na żelu, aby potwierdzić delecję.
  2. W przypadku insercji kaset genowych za pośrednictwem HDR, zaprojektuj wiele gRNA przy użyciu wymienionych narzędzi do tworzenia mutantów nokautujących i wybierz najskuteczniejszy po późniejszej ocenie.
  3. Zaprojektuj plazmidy dawcy do naprawy kierowanej homologią (HDR) zawierające ramiona homologii miejsca docelowego, sekwencję DNA ładunku, marker fluorescencyjny, pochodzenie replikacji i gen oporności na antybiotyki (Figura 1B).
    1. Wybierz ramiona homologii z górnych i dolnych regionów miejsca docelowego, z których każde obejmuje 500-1,000 bp10 (Rysunek 1B).
    2. Wybierz sekwencję ładunku, która może zawierać marker fluorescencyjny, gen będący przedmiotem zainteresowania lub element regulatorowy (np. QF2).
    3. Wybierz marker fluorescencyjny. Powszechne markery fluorescencyjne stosowane w przypadku A. aegypti są zawarte w kasecie DNA zawierającej promotor, gen kodujący marker fluorescencyjny i sekwencję 3' UTR. Zobacz dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.

2. Przygotowanie mieszanki iniekcyjnej

  1. Rozcieńczyć białko Cas9 buforem rozcieńczającym Cas9 do 1 μg/μL.
    UWAGA: Nie rozmrażaj i nie zamrażaj Cas9 więcej niż 2x. Wskazane jest wykonanie porcji białka Cas9.
  2. Kup gRNA lub wyprodukuj je we własnym zakresie.
    UWAGA: W przypadku produkcji własnej należy stosować standardowe praktyki odkażania RNA i materiały wolne od RNAzy.
    1. Zaprojektuj 4-6 gRNA i wybierz najlepsze dwa gRNA do wstrzyknięcia (patrz test rozszczepienia in vitro poniżej).
    2. Zaprojektuj starter do przodu, który zawiera sekwencję promotora T7 przed sekwencją gRNA. Użyj uniwersalnego odwróconego startera gRNA do reakcji PCR bez matrycy, jak opisano poniżej. Nakładająca się na siebie zasada sekwencji paruje się z odpowiednią sekwencją w uniwersalnym starterze odwrotnym (pogrubionym i podkreślonym), tworząc matrycę dla polimerazy DNA w celu amplifikacji ich sekwencji.
      UWAGA: W przypadku tych reakcji PCR, starter do przodu powinien zawierać promotor T7 (pogrubiony), po którym następują dwie guaniny (ważne dla inicjacji transkrypcji przez polimerazę RNA T7), sekwencja 20-nukleotydowa gRNA (N20; bez sekwencji PAM) i sekwencja nakładająca się starterów (podkreślona).
      Podstawowy napastnik: 5'- GAAATTAATACGACTCACTATAGGN20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGC- 3'
      Rewers podkładu: 5''-AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTT CAAGTTGATAACGGACTAGC
      CTTATT TTAACTT GCTATTTCTAGCTCTAAAAC - 3'
    3. Zsyntetyzuj matrycę DNA metodą PCR bez matrycy. Przygotuj wiele reakcji (każda zawierająca 12,5 μl 2x mieszanki głównej, 1,25 μl 10 μM roztworu startera wstępnego, 1,25 μl roztworu 10 μM startera odwrotnego i 10 μl wody ultraczystej), tak aby dostępna była wystarczająca ilość produktu PCR (300 ng) do reakcji transkrypcji in vitro. Stosować następujące warunki PCR: początkowa denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C; 35 cykli amplifikacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, 10 s w temperaturze 62 °C i 10 s w temperaturze 72 °C; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min; i przechowywanie w temperaturze 4 °C.
    4. Potwierdź amplifikację pojedynczego fragmentu DNA (122 pary zasad) na żelu agarozowym (2%).
    5. Oczyść szablon PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    6. Wykonaj reakcję transkrypcji in vitro za pomocą zestawu do transkrypcji T7. Wymieszać 2 μl 10x buforu reakcyjnego, po 2 μl nukleotydów (ATP, CTP, UTP i GTP), 2 μl polimerazy T7 RNA, 3 μl matrycy DNA (100 ng / μL) i 5 μl ultraczystej wody. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny (nie więcej niż 16 godzin) do nocy (12 godzin).
      UWAGA: W tej reakcji polimeraza RNA T7 wiąże się z promotorem T7 zawartym w sekwencji do przodu startera, co prowadzi do transkrypcji gRNA.
    7. Reakcję transkrypcji należy traktować DNazą, dodając 1 μl DNazy (dobrze wymieszać) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.
    8. Oczyść zsyntetyzowane sgRNA za pomocą zestawu do czyszczenia transkrypcji, postępując zgodnie z zaleceniami producenta.
    9. Wykonaj test rozszczepienia in vitro, aby ocenić skuteczność cięcia wybranych gRNA (Rysunek 1C).
      1. Zaprojektuj startery do amplifikacji fragmentu DNA (500-1,000 pz) flankującego miejsce cięcia gRNA.
      2. Ustaw reakcje PCR w następujący sposób: 12,5 μl 2x mieszanki głównej, 1,25 μl 10 μM roztworu startera przedniego, 1,25 μl 10 μM roztworu startera wstecznego, 9 μl wody ultraczystej i 1 μl 5 ng/μL matrycy DNA.
      3. Stosować następujące warunki PCR: warunki: początkowa denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C; 35 cykli amplifikacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, 15–30 s w temperaturze X °C (idealna temperatura wyżarzania dla starterów) i 35 s w temperaturze 72 °C; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 minuty; i końcowe długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 °C.
      4. Zapoznaj się z wytycznymi producenta, aby uzyskać najlepsze amplifier temperatury i przedział czasowy. Zebrać co najmniej pięć reakcji lub zwiększyć objętości odczynników tak, aby uzyskać wystarczającą ilość produktu PCR (1,5-2 μg) po oczyszczeniu PCR (jednopasmowym) lub oczyszczeniu pasmowym PCR w żelu agarozowym.
      5. Przygotować reakcje rozszczepienia Cas9 z rekombinowanym Cas9, inkubując następującą mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę: 1 μl 10x buforu reakcyjnego Cas9, 0,35 μl rekombinowanego Cas9 (1 μg/μL), 1 μL gRNA (100 ng/μL), 6,65 μl ultraczystej wody i 1 μL 300 ng/μL matrycowego DNA.
      6. Ustaw reakcję kontroli ujemnej bez gRNA.
      7. Sprawdź wydajność rozszczepienia, przeprowadzając reakcje na żelu agarozowym (1,5-2,0%; Rysunek 1C).

3. Montaż plazmidu dawcy

  1. PCR-amplifikacja ramion homologii z genomowego DNA A. aegypti.
    1. Aby uzyskać informacje na temat projektowania podkładu, zapoznaj się z wytycznymi producenta zestawu do klonowania. Użyj narzędzia online (np. Benchling), które zapewnia wsparcie dla projektowania i składania plazmidów przy użyciu różnych strategii klonowania (np. Gibson, Golden Gate i klonowanie oparte na enzymach restrykcyjnych).
    2. Amplifikuj sekwencję ładunku z genomowego DNA A. aegypti lub zamów komercyjnie zsyntetyzowany fragment genu.
    3. Amplifikacja markerów fluorescencyjnych z plazmidów we własnym zakresie.
  2. Zliguj fragmenty DNA z kroków 3.1.1 do 3.1.3 do szkieletu istniejącego plazmidu za pomocą montażu Gibsona. Inkubować mieszaninę 10 μl 2x mieszanki głównej, X μL wszystkich fragmentów DNA, 10-X μl ultraczystej wody w temperaturze 50 °C przez 1 h.
    UWAGA: Zapoznaj się z wytycznymi producenta dotyczącymi obliczania idealnego stosunku wkładek do szkieletu plazmidowego.
    1. Oblicz stężenia każdego fragmentu klonowania w piko molach: pmols = (waga w ng) × 1,000/(pary zasad × 650 daltonów).
    2. Użyj 50-100 ng szkieletu plazmidowego i 2-3-krotnego nadmiaru molowego każdej wkładki.
    3. W przypadku składania 2-3 fragmentów dodaj 0,02-0,5 pmols każdego fragmentu do reakcji Gibsona. W przypadku składania 4-6 fragmentów należy dodać 0,2-1,0 pmols każdego z nich.
  3. Użyj 3-5 μl reakcji składania Gibsona, aby przekształcić kompetentne komórki E. coli JM109.
    UWAGA: JM109 został wybrany do montażu Gibsona ze względu na jego genotyp recA, który zmniejsza niepożądane zdarzenia rekombinacji i zapobiega przenoszeniu nukleazy podczas pobierania komórek, zapewniając integralność zmontowanych fragmentów DNA
    W przypadku plazmidów większych niż 10 kb zalecamy transformację komórek kompetentnych DH5α przy użyciu rozszerzonego protokołu, zgodnie z zaleceniami producenta.
  4. Rozwiń przekształcone bakterie i oczyść plazmid za pomocą zestawu do miniprzygotowania.
  5. W celu potwierdzenia prawidłowego złożenia plazmidu należy przeprowadzić diagnostyczne trawienie enzymu restrykcyjnego z oczyszczonym plazmidowym DNA i uwidocznić za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym (Rysunek 1D, E).
    UWAGA: Sugerujemy skorzystanie z narzędzia online do wyboru kilku enzymów restrykcyjnych, które mogą przeciąć plazmid w jednym miejscu. Oprogramowanie takie jak Benchling ma wbudowane narzędzie, które przeprowadza wirtualne trawienie sekwencji plazmidowych z wybranymi enzymami restrykcyjnymi, wyświetlając oczekiwany wzór pasma DNA na wirtualnym żelu do elektroforezy (Rysunek 1D).
    1. Przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym plazmidu. Inkubować mieszaninę składającą się z 1 μl 10-krotnego buforu restrykcyjnego, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 1, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 2, 1 μl plazmidowego DNA (300 ng/ml) i 7 μl ultraczystej wody w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
    2. Przeprowadź reakcje trawienia restrykcji na żelu agarozowym (1,5%).
      UWAGA: Wzorzec prążków DNA (Rysunek 1E) powinien przypominać wzorzec wirtualnego pasma trawienia (Rysunek 1D). Plazmidy mogą być również wysyłane do sekwencjonowania całego plazmidu, jeśli dostępna jest usługa.
  6. Wyhodować klon plazmidu w 150 ml pożywki LB.
  7. Wykonaj maxiprep plazmidu, postępując zgodnie z wytycznymi producenta.
  8. Zawieś plazmid w ultraczystej wodzie.

4. Mieszanie konstrukcji iniekcyjnej

UWAGA: Sugerowane końcowe zakresy stężeń dla każdego konstruktu są podane w Tabeli 1. Zacznij od stosunku 2:1:2 (ng Cas9: ng sgRNA: plazmid dawcy ng) i dostosuj w razie potrzeby, aby zoptymalizować wydajność HDR. Monitorowanie wyników pomoże zidentyfikować najskuteczniejszą kombinację.

  1. Do tworzenia mutantów nokautujących,
    1. Rozcieńczyć podwielokrotność białka Cas9 do pożądanego stężenia za pomocą buforu rozcieńczającego Cas9 i rozcieńczyć podwielokrotność gRNA ultraczystą wodą.
    2. Wymieszaj białko Cas9 z każdym gRNA, aby utworzyć kompleks rybonukleoproteiny (RNP). Połącz wstępnie zmieszane roztwory.
  2. W przypadku insercji kaset genowych za pośrednictwem HDR,
    1. Rozcieńczyć i wymieszać białko Cas9 i gRNA zgodnie z sugestią dotyczącą tworzenia mutantów nokautujących.
    2. Rozcieńczyć plazmid dawcy ultraczystą wodą.
    3. Połącz wszystkie konstrukty.

5. Wyciąganie i ładowanie igieł do mikroiniekcji

  1. Użyj filamentu kwarcowego, aby wyciągnąć igły iniekcyjne (Rysunek 2). Upewnij się, że filament ma 10 cm długości, średnicę zewnętrzną 1 mm i średnicę wewnętrzną 0.7 mm.
  2. Wyciągnij igły za pomocą laserowego ściągacza do mikropipet z jednym z następujących dwóch programów:
    Program 1: Ciepło 805, Żarnik 4, Prędkość 50, Opóźnienie 145, Ciągnięcie 145
    Program 2: Ciepło 650, Żarnik 4, Prędkość 40, Opóźnienie 150, Ciąg 156
    UWAGA: Program 1 skutkuje cieńszą, ale dłuższą końcówką igły, dzięki czemu nadaje się do iniekcji o niższym stężeniu, gdzie cieńsza końcówka jest korzystna dla precyzji. Program 2 daje krótszą, ale grubszą końcówkę igły, idealną do iniekcji o wyższym stężeniu, ponieważ konstrukcja jest grubsza i wymaga mocniejszej igły.

6. Pobieranie zarodków

  1. Przygotuj elektryczny lub ręczny aspirator do zbierania komarów i użyj plastikowych fiolek do pobierania i pobierania zarodków.
  2. Zwilż bibuły filtracyjne z białym kołem i umieść je na wewnętrznej ścianie lub na wilgotnej bawełnie w kolektorze.
  3. Umieść w kolektorze 5-10 samic komarów, które były karmione krwią 5-10 dni temu. Umieść kolektor w ciemności na 45 minut.
  4. Wyjmij bibuły filtracyjne do pobrania zarodków.

7. Ustawienie zarodka

  1. Do wstrzykiwania zarodków należy użyć szczepu A. aegypti typu dzikiego (Liverpool).
  2. Wybierz zarodki w stadium preblastodermicznym, szczególnie te, które są koloru jasnoszarego, z papieru do pobierania (Ryc. 3).
  3. Przenieś kilka zarodków za pomocą zwilżonej szczoteczki na dwustronną taśmę klejącą umieszczoną na szkiełku nakrywkowym. Ustaw zarodki równolegle, gdy ich otoczenie jest jeszcze mokre, upewniając się, że są obok siebie, tak aby wszystkie tylne końce były skierowane do przodu.
  4. Po prawidłowym ustawieniu pozwól środowisku lekko wyschnąć, aby zabezpieczyć zarodki na miejscu.
  5. Dodaj olej Halocarbon 700 na zarodki podczas wyrównywania, aby zapobiec wysuszeniu.
    UWAGA: Upewnij się, że zarodki nie są otoczone wodą podczas dodawania oleju, ponieważ spowodowałoby to unoszenie się zarodków w oleju.

8. Mikroiniekcja zarodka

UWAGA: Wtryskiwanie odbywa się w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 18 °C. Temperatura 18°C jest zalecana ze względów praktycznych, ponieważ opóźnia rozwój zarodka.

  1. Ustaw mikrowtryskiwacz o następujących parametrach: ciśnienie kompensacji (Pc) 300 hPa, ciśnienie wtrysku (Pi) 500 hPa. Dostosuj te warunki w razie potrzeby.
  2. Załadować 3 μl zmieszanego konstruktu do igły za pomocą mikroładowarki.
  3. Umieść szkło nakrywkowe z wyrównanymi zarodkami na szkiełku mikroskopowym (Rysunek 3). Umieścić szkło nakrywkowe i wsunąć pod mikroskop w celu wstrzyknięcia. Upewnij się, że tylny koniec zarodka jest skierowany w stronę igły.
  4. Umieść jedną igłę w uchwycie igły razem z mikromanipulatorem i ustaw igłę pod kątem 10° w kierunku tylnego końca wyrównanych zarodków, utrzymując ją nieruchomo (Rysunek 4A). Delikatnie otworzyć igłę pod mikroskopem i delikatnie dotknąć jej krawędzią szkiełka nakrywkowego.
    UWAGA: Inną opcją jest utworzenie małego otworu w igle poprzez stukanie w nią zarodkiem. Zalecany jest jednak nieco szerszy otwór igły, ponieważ lepkość białka Cas9 może zatkać igłę.
  5. Przesunąć szkiełko szkiełkowe w kierunku igły do wstrzykiwań (Rysunek 5).

9. Pielęgnacja po wstrzyknięciu zarodków

  1. Użyj niestrzępiących się, jednorazowych chusteczek, aby usunąć olej otaczający zarodki.
  2. Dodaj wodę dejonizowaną, aby wypłukać zarodki i przenieś zarodki na mokrą bibułę filtracyjną. Umieść mokrą bibułę filtracyjną na mokrej chusteczce w kubkach karatowych o pojemności 9 uncji ( Rysunek 4B i Rysunek 6A, B).
  3. Umieść mokrą bawełnę na dnie kubka, aby utrzymać wilgoć (Rysunek 6B).
  4. Konserwować wstrzyknięte zarodki na mokrej bibule filtracyjnej.

10. Wylęganie się zarodków i badania przesiewowe larw G0

  1. Co najmniej 4 dni po wstrzyknięciu przenieś bibułę filtracyjną z zarodkami do około 3 l dejonizowanej wody w 6-litrowych naczyniach Sterilite do wylęgu.
    UWAGA: Jaja zazwyczaj wykluwają się wydajniej w ciągu 2 tygodni po wstrzyknięciu. Upewnij się, że w tym okresie jaja pozostają wilgotne. Bibuła filtracyjna nie powinna być zbyt mokra, ponieważ nadmierna wilgoć może prowadzić do wczesnego wykluwania się zarodków. Chociaż dłuższa konserwacja może poprawić wskaźniki wylęgu, nie przekraczaj miesiąca, aby uzyskać optymalne wyniki. Używanie odtlenionej wody może również pomóc w wylęgu.
  2. Po wykluciu się larw G0 dodaj na patelnię jako pokarm dla ryb zmieszany z wodą jako pokarm.
  3. Przesiewaj larwy G0 pod kątem markera fluorescencyjnego w stadium larwalnym od 3 do 4 (Ryc. 7).
  4. Larwy należy utrzymywać oddzielnie w zależności od ich statusu fluorescencyjnego, przy czym larwy fluorescencyjnie dodatnie i fluorescencyjnie ujemne należy przechowywać w oddzielnych naczyniach.

11. Sortowanie poczwarek według płci i krzyżowanie z dzikim typem

  1. Oddziel komary, którym wstrzyknięto tabletki, według płci, gdy się przepoczwarzają, używając do identyfikacji wielkości i struktur specyficznych dla płci w płacie narządów płciowych:
    1. Samce: Mniejszy rozmiar, bardziej wydatny i spiczasty płat narządów płciowych i szersze łopatki (struktury na końcu ogona poczwarek; Rysunek 8A 1,A2).
    2. Samice: Większy rozmiar, mniejszy i mniej wyraźny płat narządów płciowych i węższe wiosła (Rysunek 8B 1,B2).
  2. Basen komarów fluorescencyjnie dodatnich lub fluorescencyjnych ujemnych każdej płci.
  3. Krzyżuj komary w kałużach z komarami płci przeciwnej ze szczepu Liverpool. Użyj proporcji 3:1 do 5:1 komara typu dzikiego do komara G0.
  4. Krzyżuj komary przez 4 dni.
  5. Zapewnij samicom posiłek z krwi po skrzyżowaniu.

12. Badanie przesiewowe G1

  1. Trzy dni po karmieniu krwią zaopatrz się w kubki na jajka, umieszczając ręcznik papierowy w ściance kubków Karat o pojemności 9 uncji i dodając około 3 uncji wody dejonizowanej.
  2. Po 3-4 dniach zbierz i wykluj zarodki G1. Przebadaj larwy G1 pod kątem markera fluorescencyjnego w 3. do 4. stadium rozwoju (Ryc. 7).
  3. Zbierz fluorescencyjne larwy, sugerując wstawienie HDR. Kiedy fluorescencyjne osobniki G1 osiągną stadium poczwarki, oddziel je według płci i umieść każdą płeć w osobnych klatkach.
  4. Krzyżuj fluorescencyjne komary G1 z osobnikami płci przeciwnej szczepu Liverpool.

13. Potwierdzenie miejsca wstawienia G1

  1. Po podaniu mączki z krwi przygotuj samice G1 do składania jaj przez pojedynczą samicę, umieszczając mały kawałek ręcznika papierowego w pojedynczych fiolkach Drosophila i dodając 3 ml wody dejonizowanej.
  2. Dla mutantów nokautujących:
    1. Po złożeniu jaj woda odparowuje, a ręcznik papierowy wysycha, wykluwają się jaja z samic, które wyraźnie wykazują mutacje nokautujące i uzyskuje się pokolenie G2.
    2. Zbierz ciało matek G1, które pomyślnie wykluły potomstwo G2 i wyodrębnij DNA.
    3. Użyj DNA jako matrycy do PCR, aby amplifikować sekwencję pokrywającą miejsce docelowe. Upewnij się, że startery amplifikują fragment DNA o wartości ~200 pz. Przygotować reakcje (każda zawierająca 12,5 μl 2x mieszanki głównej, 1,25 μl 10 μM roztworu startera wstępnego, 1,25 μl 10 μM roztworu startera wstecznego, 9 μl wody ultraczystej i 1 μl matrycy DNA [5 ng/μL]). Stosować następujące warunki PCR: początkowa denaturacja przez 30 s w temperaturze 98 °C; 35 cykli amplifikacji przez 10 s w temperaturze 98 °C, 15–30 s w temperaturze X °C (idealna temperatura wyżarzania starterów) i 10 s w temperaturze 72 °C; końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 2 min; i końcowe długotrwałe przechowywanie w temperaturze 4 °C.
    4. Oczyść fragmenty PCR i przeprowadź trawienie enzymem restrykcyjnym fragmentów PCR poprzez inkubację mieszaniny 1 μl 10x buforu do trawienia restrykcyjnego, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 1, 0,5 μl enzymu restrykcyjnego 2, 1 μl fragmentu PCR (200 ng/ml) i 7 μl ultraczystej wody w temperaturze 37 °C przez 30 min.
      UWAGA: Niektóre enzymy restrykcyjne mogą być stosowane w mieszaninie PCR bez uprzedniego oczyszczania.
    5. Wizualizuj trawienie fragmentów PCR za pomocą elektroforezy żelowej, aby potwierdzić, czy doszło do rozszczepienia.
    6. Zsekwencjonuj niestrawiony fragment PCR, aby zidentyfikować mutacje nokautujące.
    7. W przypadku wkłuć za pośrednictwem HDR, po złożeniu jaj:
      1. Zbierz ciało matki G1 i wyekstrahuj DNA.
      2. Użyj DNA jako matrycy do PCR, aby amplifikować sekwencję pokrywającą miejsce docelowe.
      3. Wykonaj sekwencjonowanie amplifikowanego fragmentu DNA, aby potwierdzić integralność wstawionej kasety DNA.
      4. Wykluć jajo i uzyskać pokolenie G2.

14. Rozbudowa nowych linii CRISPR

  1. Dla linii mutantów do nokautu:
    1. Ustaw samice G2 do składania jaj, z 20 samicami na G1. Każdy G1 reprezentuje jedną linię.
    2. Po złożeniu jaj należy potwierdzić mutacje nokautujące w taki sam sposób, jak w przypadku G1.
    3. Postępuj z pięcioma liniami G1, które wykazują wyraźnie zidentyfikowane mutacje zarówno w G1, jak i G2. Wykluwają się jaja zebrane z G2 z każdej linii, dając początek pokoleniu G3.
    4. Z pięciu skrzyżowanych linii wybierz dwie linie z wyraźnie zidentyfikowanymi mutacjami i wysokim dopasowaniem lub pożądanym fenotypem.
    5. Krzyżuj samice G3 z każdej wybranej linii z samcami ze szczepu Liverpool.
    6. Ustaw 50 pojedynczych samic do składania jaj z każdej linii. Potwierdź mutacje nokautujące, tak jak to zrobiono wcześniej dla G1.
      UWAGA: Zwiększ liczbę samic w konfiguracji, aby zachować różnorodność.
    7. Powtórz procedury dla dwóch dodatkowych generacji z dwiema liniami (Rysunek 4J).
  2. W przypadku nowych linii wstawiania zapośredniczonych przez HDR:
    1. Sprawdź obecność osobników fluorescencyjnych w pokoleniu G2.
    2. Krzyżuj komary G2, od każdego osobnika G1, ze szczepem Liverpool. Każdy pojedynczy G1 reprezentuje jedną linię.
    3. Kontynuuj z trzema kolejnymi generacjami krzyżowania się. Ciągle sprawdzaj znacznik fluorescencyjny i obserwuj fitness19 każdej linii (Rysunek 4x).
    4. Wybierz jedną linię z prawidłowymi insercjami i wysokim dopasowaniem oraz pożądanym fenotypem.

15. Twórz linie homozygotyczne

  1. Dla linii mutantów do nokautu:
    1. Generacja G6:
      1. Wykluć jaja wyprodukowane przez G5 i uzyskać pokolenie G6.
      2. Krzyżują się dorośli G6 w swoich odpowiednich liniach (Rysunek 4K i Rysunek 9A).
      3. Ustaw 50 pojedynczych samic G6 do składania jaj w każdej linii i wykluwaj jaja zgodnie z wcześniejszym opisem (Rysunek 9B).
      4. Zbierz samice G6, które pomyślnie wykluły potomstwo G7, wyekstrahuj DNA i przeprowadź PCR i trawienie enzymami restrykcyjnymi, tak jak to zrobiono dla G1 (Rysunek 9C).
        UWAGA: Na tym etapie można użyć prostego i niedrogiego bufora zgniatającego (SB) do ekstrakcji DNA.
        1. Za pomocą ręcznego młynka zmaceruj pojedynczego komara w 100 μl 1x SB (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA i 25 mM NaCl). Dodać proteinazę K (200 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95 °C przez 2 minuty. Wirować z prędkością 10 000 × g przez 5 minut i zebrać supernatant20.
      5. Potwierdź mutację, wizualizując wyniki na żelu.
      6. Odrzuć jaja wyprodukowane przez samice bez mutacji (Ryc. 9D).
      7. Utrzymuj larwy samic z potwierdzonymi mutacjami, aby ustalić kilka linii G7 i odrzucaj lęgi bez mutacji (Rysunek 9D).
    2. Generacja G7:
      1. Krzyżują się samice i mężczyźni w każdej linii G7 (Ryc. 9E).
      2. Ustaw 10 pojedynczych samic G7 do składania jaj w każdej linii i wykluwaj jaja zgodnie z wcześniejszym opisem (Rysunek 9F).
      3. Zbierz samice G7, które pomyślnie wykluły potomstwo G7, wyekstrahuj DNA i przeprowadź PCR oraz trawienie enzymami restrykcyjnymi (Rysunek 9G).
      4. Wykryj mutacje nokautujące na obu allelach lub pojedynczym allelu, wizualizując wyniki na żelu.
      5. Utrzymuj larwy samic G7, u których potwierdzono nokauty w obu allelach, tworząc pokolenie G8 (Rysunek 9H). Odrzuć lęgi bez mutacji (Rysunek 9H).
        UWAGA: Ten krok zapewnia, że samice są homozygotyczne. W G8 badanie homozygotyczności potomstwa potwierdza, czy ojcowie są również homozygotyczni.
    3. Generacja G8:
      1. Krzyżuj dorosłe osobniki G8 na każdą linię żeńską G7 (Ryc. 9I).
      2. Losowo wybierz pięć samców G8, wyekstrahuj DNA i przeprowadź PCR oraz trawienie enzymem restrykcyjnym (Rysunek 9J).
      3. Zapewnij mączkę z krwi i wykluj jaja od samic G8, które zostały skrzyżowane z samcami G8, u których potwierdzono nokauty w obu allelach.
      4. Kontynuuj z liniami G7, w których wszystkie wykryte samce mają nokauty w obu allelach, co wskazuje, że te linie są homozygotyczne.
  2. W przypadku linii wstawiania zapośredniczonych przez HDR:
    1. Wykluć jaja wyprodukowane przez G5 i uzyskać pokolenie G6. Przesiać larwy w stadium G6 pod kątem markerów fluorescencyjnych.
    2. Odrzuć larwy bez markerów fluorescencyjnych (Rysunek 4xi).
    3. Krzyżują się komary, które wykazują markery fluorescencyjne.
    4. Kontynuuj tę procedurę dla każdego kolejnego pokolenia, aż nie zaobserwuje się larw niefluorescencyjnych. W tym momencie linia komarów będzie homozygotyczna.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Projektowanie i walidacja ukierunkowanego celowania genów za pomocą gRNA dla rekombinacji homologicznej HDR
Aby zapewnić precyzyjne celowanie w pożądany gen, zalecamy wybór kilku gRNA oraz umieszczenie ramion homologii 5' i 3' blisko miejsca cięcia w celu przeprowadzenia rekombinacji homologicznej za pośrednictwem HDR (Rycina 1A). Na przykład zaprojektowaliśmy dwa gRNA celujące w obie strony kodonu startowego badanego genu i wykorzystaliś...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Technologia CRISPR-Cas zmieniła krajobraz edycji genomu, promując specyficzne dla celu zmiany w chromosomie1. Mimo że elementy transpozycyjne były niezbędne do powstania pierwszych transgenicznych komarów, ich miejsca insercji są nieco losowe, a ekspresja konstruktu ładunku (promotor + gen) może nie odpowiadać profilowi ekspresji rzeczywistego genu ze względu na efekt położenia genomu (tj. miejsce insercji), który zwykle prowadzi do ekspresji ektopowej21. Przed pojawieniem ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

O.S.A. jest założycielem Agragene, Inc. i Synvect, Inc. z udziałem w kapitale własnym. Warunki tej umowy zostały zweryfikowane i zatwierdzone przez Uniwersytet Kalifornijski w San Diego zgodnie z jego zasadami dotyczącymi konfliktu interesów. Pozostali autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Judy Ishikawie i Avie Stevenson za pomoc w hodowli komarów. Praca ta została wsparta dofinansowaniem z nagród NIH (R01AI151004, RO1AI148300, RO1AI175152) przyznanych O.S.A. i K22AI166268 N.H.R. Figurki zostały stworzone przy użyciu BioRender.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x Cas9 bufor reakcyjnyPNA Bio CB01
Benchling Software BenchlingN/Awww.benchling.com
Cas9 bufor rozcieńczającyPNA Bio CB03
Cas9 białkoPNA Bio CP01-50
DH5α E. coli Kompetentne komórkiNew England BiolabsC2987
Dwustronna taśma klejącaScotch Permanent3136
Fiolki DrosophilaGenesee Scientific 32-109
Bibuły filtracyjne GE Healthcare Nauki przyrodnicze 1450-042
Pokarm dla ryb Płatkizłotej rybki Tetra B00025Z6YI 
FlugsGenesee Scientific AS273
Leica Microsystems   Fragment genu M165 FC
Zintegrowane technologie DNA Niedotyczy
gRNASynthegoN/A
Olej halowęglowy 700 Sigma-AldrichH8898
Mikroskop iniekcyjnyLeica Microsystems DM2000
JM109  E. coli Kompetentne komórki Zymo ResearchT3005
MikrowtryskiwaczEppendorfFemtoJet 4x 
Końcówki do mikroładowarek do napełniania femtotipów Mikromanipulator EppendorfE5242956003
 EppendorfTransferMan 4r 
Ściągacze do mikropipet Instrument Suttera P-2000
 Marka rybacka 12-542-B
Szkiełko mikroskopowe Eisco12-550-A3
Krew myszy (żywe myszy używane do karmienia)Uniwersytet KalifornijskiIACUC, Protokół wykorzystania zwierząt #S17187Używany do karmienia krwią komarów; Szczegóły są zgodne z protokołami etyki zwierząt
NEB Q5 Polimeraza DNA High-Fidelity New England BiolabsM0491S
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen28004
Zestaw do miniprzygotowania plazmidu Zymo ResearchD4036
Filament kwarcowy Sutter InstrumentsQF100-70-10
Zestaw do czyszczenia transkrypcjiFisher ScientificAM1908
Ultraczysta woda Technologie życiowe10977-023
Mikroskop fluorescencyjny Szkło osłonowe mikroskopu

Bibliografia

  1. Anzalone, A. V., Koblan, L. W., Liu, D. R. Genome editing with CRISPR-Cas nucleases, base editors, transposases and prime editors. Nat Biotechnol. 38 (7), 824-844 (2020).
  2. Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
  3. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  4. Shen, H., Li, Z. DNA double-strand break repairs and their application in plant DNA integration. Genes (Basel). 13 (2), 322(2022).
  5. Vinauger, C., et al. Modulation of host learning in Aedes aegypti mosquitoes. Curr Biol. 28 (3), 333-344.e8 (2018).
  6. Li, M., Bui, M., Yang, T., Bowman, C. S., White, B. J., Akbari, O. S. Germline Cas9 expression yields highly efficient genome engineering in a major worldwide disease vector. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (49), E10540-E10549 (2017).
  7. Chaverra-Rodriguez, D., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein into arthropod ovaries for heritable germline gene editing. Nat Commun. 9 (1), 3008(2018).
  8. Rouyar, A., et al. Transgenic line for characterizing GABA-receptor expression to study the neural basis of olfaction in the yellow-fever mosquito. Front Physiol. 15, 1381164(2024).
  9. Ang, J. X. D., et al. Considerations for homology-based DNA repair in mosquitoes: Impact of sequence heterology and donor template source. PLoS Genet. 18 (2), e1010060(2022).
  10. Zhang, J. -P., et al. Efficient precise knockin with a double cut HDR donor after CRISPR/Cas9-mediated double-stranded DNA cleavage. Genome Biol. 18 (1), 35(2017).
  11. Coutinho-Abreu, I. V., Akbari, O. S. Technological advances in mosquito olfaction neurogenetics. Trends Genet. 39 (2), 154-166 (2023).
  12. Li, M., et al. Targeting sex determination to suppress mosquito populations. eLife. 12, RP90199(2024).
  13. Zhan, Y., Alonso San Alberto, D., Rusch, C., Riffell, J. A., Montell, C. Elimination of vision-guided target attraction in Aedes aegypti using CRISPR. Current Biol. 31 (18), 4180-4187.e6 (2021).
  14. Greppi, C., et al. Mosquito heat seeking is driven by an ancestral cooling receptor. Science. 367 (6478), 681-684 (2020).
  15. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  16. Riabinina, O., et al. Improved and expanded Q-system reagents for genetic manipulations. Nat Methods. 12 (3), 5 p following 222 219-222 (2015).
  17. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  18. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).
  19. Williams, A. E., et al. Quantifying fitness costs in transgenic Aedes aegypti mosquitoes. J Vis Exp. , e65136(2023).
  20. Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. -L. Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system. Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).
  21. Coutinho-Abreu, I. V., Zhu, K. Y., Ramalho-Ortigao, M. Transgenesis and paratransgenesis to control insect-borne diseases: current status and future challenges. Parasitol Int. 59 (1), 1-8 (2010).
  22. Christian, M., et al. Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases. Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).
  23. Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).
  24. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  25. McMeniman, C. J., Corfas, R. A., Matthews, B. J., Ritchie, S. A., Vosshall, L. B. Multimodal integration of carbon dioxide and other sensory cues drives mosquito attraction to humans. Cell. 156 (5), 1060-1071 (2014).
  26. Lobo, N. F., Clayton, J. R., Fraser, M. J., Kafatos, F. C., Collins, F. H. High efficiency germ-line transformation of mosquitoes. Nat Protoc. 1 (3), 1312-1317 (2006).
  27. Kistler, K. E., Vosshall, L. B., Matthews, B. J. Genome engineering with CRISPR-Cas9 in the mosquito Aedes aegypti. Cell Rep. 11 (1), 51-60 (2015).
  28. Handler, A. M., Harrell, R. A. 2nd Transformation of the Caribbean fruit fly, Anastrephasuspensa, with a piggyBac vector marked with polyubiquitin-regulated GFP. Insect Biochem Mol Biol. 31 (2), 199-205 (2001).
  29. Harrell, R. A. 2nd Mosquito embryo microinjection under halocarbon oil or in aqueous solution. 2024 (7), Cold Spring Harb Protoc. (2024).
  30. Sun, R., Raban, R., Akbari, O. S. Generating mutant strains with transgenic Cas9. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 671-678 (2023).
  31. Giraldo, D., et al. An expanded neurogenetic toolkit to decode olfaction in the African malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep Methods. 4 (2), 100714(2024).
  32. Liu, G., Lin, Q., Jin, S., Gao, C. The CRISPR-Cas toolbox and gene editing technologies. Mol Cell. 82 (2), 333-347 (2022).
  33. Chu, V. T., et al. Increasing the efficiency of homology-directed repair for CRISPR-Cas9-induced precise gene editing in mammalian cells. Nat Biotechnol. 33 (5), 543-548 (2015).
  34. Laursen, W. J., et al. Humidity sensors that alert mosquitoes to nearby hosts and egg-laying sites. Neuron. 111 (6), 874-887.e8 (2023).
  35. Weng, S. -C., Antoshechkin, I., Marois, E., Akbari, O. S. Efficient sex separation by exploiting differential alternative splicing of a dominant marker in Aedes aegypti. PLoS Genet. 19 (11), e1011065(2023).
  36. Li, M., et al. Development of a confinable gene drive system in the human disease vector. eLife. 9, e51701(2020).
  37. Dalla Benetta, E., et al. Engineered Antiviral Sensor Targets Infected Mosquitoes. The CRISPR journal. 6 (6), 543-556 (2023).
  38. Li, H. -H., et al. C-Type lectins link immunological and reproductive processes in Aedes aegypti. iScience. 23 (9), 101486(2020).
  39. van Oers, M. M., Vlak, J. M., Voorma, H. O., Thomas, A. A. M. Role of the 3' untranslated region of baculovirus p10 mRNA in high-level expression of foreign genes. J Gen Virol. 80 (Pt 8), 2253-2262 (1999).
  40. Salem, T. Z., et al. The influence of SV40 polyA on gene expression of baculovirus expression vector systems. PloS One. 10 (12), e0145019(2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mikroiniekcja zarodkowanokaut genuknock in genumarker fluorescencyjnynaprawa kierowana homologisupresja populacji komar wprzewodni RNA
Edycja genomu u komara Aedes aegypti z żółtą febrą przy użyciu CRISPR-Cas9
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.