Artykuł metodologiczny

Testy fluorescencyjne do badania interakcji Mycobacterium tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1

DOI:

10.3791/67745

⸱

28 lutego 2025

 ,  ,  , 
1Centro de Investigaciones Básicas y Aplicadas (CIBA), Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (UNNOBA), 2Centro de Investigaciones y Transferencias del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (CIT NOBA), UNNOBA- Universidad Nacional de San Antonio de Areco (UNSAdA)- Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3CONICET- Universidad de Buenos Aires, Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN), 4Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Departamento de Química Biológica, Universidad de Buenos Aires

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zawiera protokół oceny interakcji Mycobacterium tuberculosis z czujnikiem mikrobiologicznym SLAMF1. Testy przeprowadzono na ludzkich makrofagach pochodzących z monocytów przy użyciu cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej. Opisane narzędzia są istotne dla badania interakcji między patogenami a immunoreceptorami.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena bezpośredniej interakcji między patogenami a receptorami immunologicznymi zwykle obejmuje wyrafinowane techniki lub zakłada użycie szczepów transgenicznych i komórek modyfikowanych genetycznie. W tym miejscu opisano alternatywną metodę wykrywania interakcji biochemicznej między czujnikiem mikrobiologicznym makrofagów SLAMF1 a Mycobacterium tuberculosis . Opracowano dwa podejścia techniczne wykorzystujące cytometrię przepływową i mikroskopię fluorescencyjną. Wygenerowano całkowite ekstrakty białkowe z ludzkich makrofagów, a następnie inkubowano z całymi komórkami antygenów M. tuberculosis (WCMtb) lub M. tuberculosis (Mtb Ags) przez noc w temperaturze 4 °C, a na koniec usieciowano za pomocą traktowania formaldehydem/glicyną/glikolem etylenowym bis (bursztynian sukcynimidylu). Interakcję SLAMF1 z WCMtb za pomocą cytometrii przepływowej wykryto za pomocą przeciwciała anty-SLAMF1 specyficznego dla PE. Istnienie interakcji za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej przeprowadzono poprzez dołączenie Mtb Ag barwionych rodaminą-PE do szkiełek pokrytych poli-D-lizyną, które inkubowano z całkowitym ekstraktem białkowym z makrofagów pochodzących z monocytów. Po leczeniu sieciowaniem SLAMF1 wizualizowano za pomocą przeciwciał pierwszorzędowych (anty-SLAMF1) i drugorzędowych (Alexa Fluor 488). Testy dostarczyły silnego narzędzia biochemicznego do pomiaru interakcji między patogenem a immunoreceptorem, pokonując trudności związane z eksperymentami z transgenicznymi liniami komórkowymi i modulacją ekspresji genów białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mycobacterium tuberculosis, patogen wywołujący gruźlicę zidentyfikowany 142 lata temu, pozostaje globalnym wyzwaniem, zarażając obecnie co najmniej jedną czwartą światowejpopulacji1. Przenoszony drogą kropelkową od zakażonych osób, M. tuberculosis dociera do makrofagów pęcherzykowych w płucach, gdzie może przetrwać przez długi czas w stanie utajonym 2,3. Nie tylko aktywowana jest lokalna odpowiedź makrofagiczna, ale w ostatnich latach opisano, że monocyty obwodowe mogą być rekrutowane do dróg oddechowych i różnicować się w makrofagi pęcherzykowe, generując jeszcze silniejszą odpowiedź przeciwko M. tuberculosis niż ich odpowiednik pochodzenia płodowego 2,4.

Makrofagi są podstawowymi graczami odporności wrodzonej. Po spożyciu M. tuberculosis makrofagi wykazują liczne funkcje bakteriobójcze, takie jak wydzielanie cytokin prozapalnych, fuzja fagolizosomu i aktywacja innych komórek odpornościowych w celu zabicia M. tuberculosis 2,3. Jednak złożona struktura architektoniczna tego patogenu dostarcza efektorów (np. białek i lipidów) zdolnych do regulacji metabolizmu i funkcji makrofagów, a w konsekwencji procesu zapalnego3. Ta manipulacja reakcjami makrofagów, poprzez wydzielanie czynników wirulencji lub wykorzystanie czynników gospodarza, prowadzi do różnych strategii ucieczki wywieranych przez M. tuberculosis. Niektóre kluczowe mechanizmy unikania obejmują indukcję cytokin przeciwzapalnych, hamowanie dojrzewania i zakwaszania fagolizosomów, zmiany stresu oksydacyjnego, zakłócenie autofagii oraz niedobory podczas przetwarzania i prezentacji antygenu 3,5.

Ściśle regulowana interakcja między makrofagami a M. tuberculosis ma kluczowe znaczenie dla rozwoju prawidłowej odpowiedzi immunologicznej. Dlatego badanie tych synaps jest kluczem do identyfikacji mechanizmów immunoprotekcyjnych lub immunopatogennych indukowanych przez wzajemne oddziaływanie gospodarz-patogen, a także do identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Wiele receptorów pośredniczy w rozpoznawaniu i/lub internalizacji M. tuberculosis, w tym TLR 6,7,8, NLR 7,8, receptory dopełniacza 6,8, receptory lektyny typu C 6,8 i receptory zmiatacze 6,8. Coraz więcej danych wskazuje, że zarówno powierzchniowe, jak i wewnątrzkomórkowe PRR odgrywają ważną rolę podczas infekcji, rozpoznając opsonizowane i nieopsonizowane M. tuberculosis.

Zihad i Sifat i wsp. dokonali niedawno przeglądu udziału PRR w odpowiedziach wywołanych przez M. tuberculosis przez komórki wrodzone9. W szczególności większość członków rodziny TLR jest zaangażowana w interakcję z ligandami M. tuberculosis 6,7. Powierzchnia TLR2 rozpoznaje antygeny prątków, takie jak acylowane lipoproteiny, lipoproteina 19-kDa, lipoproteina LprA, lipoproteina LprG, antygen 30-kDa, antygen 38-kDa, MymA, kwas prolinowo-prolinowy-glutaminowy (PPE)-57, LAM, LM, PIM, białko szoku cieplnego 60, białko sygnatury Rv1509 i wydzielane białko ESAT-67. Błona TLR4 oddziałuje z białkami szoku cieplnego, antygenem 38-kDa, RpfE, Rv0652, Rv0335c, Rv2659c, Rv1738, Rv2627c, Rv2628, GrpE i HBHA. Z drugiej strony, ligandy dla endosomalnych TLR (TLR 3, 7, 8 i 9) obejmują dsRNA, tRNA, ssRNA, fagosomalne RNA i dsDNA M. tuberculosis. Ponadto TLR2 odgrywa aktywną rolę w inicjowaniu odpowiedzi immunologicznej, gdy działa w połączeniu z TLR1 i TLR6, TLR4 i TLR9 6,7. NOD2 i NLRP3 są najlepiej scharakteryzowanymi cytoplazmatycznymi NLR w gruźlicy. Chociaż ich specyficzne ligandy są nadal badane, receptory te są aktywowane odpowiednio przez dipeptyd muramylowy lub ESAT-6 7,8. Receptory lektyny typu C są klasycznie zaangażowane w endocytozę M. tuberculosis. Podczas gdy dektyna-2 działa jako bezpośredni PRR dla ManLAM ściany komórkowej M. tuberculosis, ligand Dectin-1 nie został jeszcze odkryty8. Zarówno Mincle, jak i MCL rozpoznają glikolipidowy trehalozo-6,6′-dimykolan (TDM), zwany również czynnikiem pępowinowym7. DCAR oddziałuje z glikolipidami prątków, mannozydami fosfatydylo-mio-inozytolu (PIM)7. CR3 rozpoznaje prątki LAM i PIM, DC-SIGN liguje ManLAM, MR rozpoznaje szereg składników M. tuberculosis, w tym ManLAM, PIM, LM, glikoproteinę 38-kDa, antygen 19-kDa i inne mannozylowane białka, podczas gdy ligand DCIR jest nadal niezidentyfikowany.

Rozpuszczalne CLR obejmują SP-A, który rozpoznaje ManLam, LM, glikoproteinę 60 kDa i glikoproteinę Apa; SP-D współdziała z LAM, LM i PILAM; oraz MBL, który specjalizuje się w rozpoznawaniu ManLAM 6,7. Receptory zmiataczy są również fagocytarnymi PRR. SR-A i MARCO mają TDM jako swój ligand, SR-B1 rozpoznaje ESAT-6, a CD36 wiąże ManLAM i LM 7,8. Dodatkowo Dectin-1, Mincle i MARCO mogą również łączyć się z TLR2 lub TLR4 w celu wyzwalania sygnałów po wykryciu M. tuberculosis PAMPs 6,7. CD14 jest receptorem powierzchniowym, który ma zdolność internalizacji nieopsonizowanych bakterii, a także rozpoznaje białko szoku cieplnego Chaperonin 60.1. W szczególności CD14 działa jako koreceptor wraz z MARCO i TLR26. AIM2 jest receptorem cytozolowym, który może wyczuwać ssDNA na M. tuberculosis ucieka z fagosomu8. Wreszcie, AhR jest czynnikiem transkrypcyjnym aktywowanym ligandem, który wiąże pigmentowany czynnik wirulencji naftochinon ftiokol z M. tuberculosis6.

Wiele z opisanych powyżej interakcji zostało postulowanych, a nie ściśle zademonstrowanych. Nawet ligandy dla niektórych receptorów pozostają nieznane, co wzmacnia potrzebę lepszego zrozumienia dziedziny immunorozpoznawania M. tuberculosis. W tym kontekście, cząsteczka kostymulacyjna SLAMF1 (Signaling Lymphocytic Activation Molecule) została niedawno opisana jako receptor M. tuberculosis przez Barbero i wsp.10. Działając nie tylko jako cząsteczka sygnałowa, ale także jako czujnik M. tuberculosis, SLAMF1 odgrywa szczególnie intrygującą rolę w gruźlicy. SLAMF1 może indukować aktywację komórek odpornościowych poprzez modulowanie funkcji ochronnych, takich jak wytwarzanie IFN-γ przez limfocyty T poprzez fosforylację Erk / CREB 11,12,13, autofagię w neutrofilach 14 i klirens bakteryjny w makrofagach15.

Interakcje receptor-ligand były badane przez lata przy użyciu technik takich jak ELISA, powierzchniowy rezonans plazmonów (SPR), izotermiczna kalorymetria miareczkowa (ITC), polaryzacja fluorescencyjna (FP), krystalografia rentgenowska, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR), termoforeza w mikroskali (MST), rezonansowy transfer energii (np. BRET lub FRET), mikroskopia konfokalna, mikroskopia elektronowa, mikroskopia krioelektronowa (Cryo-EM) i mikroskopia sił atomowych (AFM)16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Niektóre z tych podejść implikują użycie genów reporterowych, znakowanych rekombinowanych białek lub cząsteczek chimerycznych, modeli nokautu, knockdownu lub nadekspresji. Alternatywnie, narzędzia obliczeniowe mogą przewidywać interakcje receptor-ligand i miejsca wiązania i są często używane w połączeniu z podejściami biologicznymi w celu uzyskania kompleksowego zrozumienia interakcji 29,30,31. W tym miejscu opisano dwie alternatywy wykrywania interakcji biochemicznych, a także sekcję dotyczącą fluorescencyjnego znakowania bakterii. Przedstawiono protokół, który umożliwia badanie interakcji receptor-patogen in vitro, w szczególności oceniając zaangażowanie SLAMF1-M. w gruźlicę za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej, dwóch zwykle dostępnych i rutynowo stosowanych technik.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie zabiegi z udziałem makrofagów pochodzących od ludzkich monocytów zostały przeprowadzone zgodnie z Deklaracją Helsińską (2013) oraz w porozumieniu z Komitetem Etyki UNNOBA (COENOBA). Pisemną świadomą zgodę uzyskano przed pobraniem próbki. Rozkład w grupie mężczyzn/kobiet wynosił 13/6, a mediana wieku wynosiła 32 lata, z rozstępem międzykwartylowym (IQR) 18-75 lat. Obecność wcześniejszych patologii, chorób współistniejących lub pozytywna diagnoza gruźlicy zostały określone jako kryteria wykluczenia. Szczegółowe informacje na temat odczynników i wyposażenia są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Hodowla i stymulacja makrofagów pochodzących z monocytów

  1. Pobieranie krwi
    1. Pobrać 60 ml krwi od zdrowych dawców przez nakłucie żyły w strzykawce z heparyną.
      UWAGA: Ekstrakcja krwi musi być wykonana przez biochemika lub technika flebotomii.
    2. Wyrzuć igłę do pojemnika na ostre odpady i wszelki materiał, który miał kontakt z krwią dawcy, do pojemnika na odpady patologiczne.
  2. Izolacja monocytów i generacja makrofagów
    1. Ostrożnie przenieś krew do probówek o pojemności 50 ml i rozcieńcz ją do połowy roztworem soli fizjologicznej.
    2. Przeprowadzić wirowanie na pożywce o gradiencie gęstości, aby uzyskać jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC).
    3. Zbierz PBMC z białawej aureoli.
    4. Wykonać dwa płukania roztworem soli fizjologicznej o stężeniu 400 x g przez 10 minut i końcowe płukanie roztworem soli fizjologicznej o sile 200 x g przez 15 minut w temperaturze 20 °C w celu usunięcia płytek krwi.
    5. Określ liczbę PBMC w komorze zliczania komórek i przeprowadź dodatnią selekcję magnetyczną CD14 za pomocą kulek CD14.
      UWAGA: Podczas wyboru magnetycznego należy dokładnie postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Dodatkowo można sprawdzić czystość wyizolowanych monocytów za pomocą cytometrii przepływowej.
    6. Ponownie zawiesić izolowane komórki w RPMI 1640 i określić liczbę monocytów w komorze zliczania komórek.
    7. Wysiewaj 500 μl 1 × 106 / ml CD14 dodatnich wybranych monocytów na dołek na 24-dołkowej płytce do hodowli komórkowej przy braku surowicy, aby promować przyleganie.
    8. Po 2 godzinach usuń nieprzylegające komórki, myjąc je wstępnie podgrzanym RPMI 1640.
    9. Aby rozróżnić makrofagi, należy hodować przylegające monocyty przez dodatkowe 16-18 godzin (przez noc) w 1 ml kompletnej pożywki (pożywka RPMI 1640 uzupełniona L-glutaminą, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny).
    10. Następnego dnia zmień pożywkę hodowlaną. Usuń pożywkę, przemyj 1 ml 1x PBS i dodaj 1 ml kompletnej pożywki.
    11. Stymulować makrofagi sonikacją M. tuberculosis (M. tuberculosis antigens (Ags)) przez 24 godziny. Stosować 10 μl M. tuberculosis Ags (10 μl = 1 × 106 bakterii) na 1 × 106 makrofagów pochodzących z monocytów.
      UWAGA: 10 μL M. tuberculosis Ags (Mtb Ags) = 1 × 106 bakterii, oznaczone ilościowo za pomocą średnicy zewnętrznej 600nm w spektrofotometrze, biorąc pod uwagę średnicę zewnętrzną 1 jako 1 x 108 bakterii/ml. Stosować komory bezpieczeństwa biologicznego BSL2 i inkubator w temperaturze 37 °C w atmosferze o stężeniu 5% CO2 na wszystkich etapach hodowli.
  3. Potwierdzenie wyrażenia SLAMF1
    1. Zbierz makrofagi z jednej studzienki. Umieść płytkę hodowlaną na zimnej powierzchni. Odłącz ogniwa, wykonując ruchy w górę iw dół, dodając 1 ml zimnego FACS (1x PBS + 2% FBS) dwa razy z rzędu. Do pobrania użyj probówki z okrągłym dnem do cytometrii.
    2. Odwirować komórki o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant przez jego wysypanie.
    3. Barwić komórki sprzężonym z fluoroforem przeciwciałem anty-ludzkim SLAMF1 przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Wirować po dodaniu 1,25 μL przeciwciała.
    4. Umyj komórki, aby wyeliminować nadmiar przeciwciał za pomocą FACS, ponownie zawieś osad w FACS i pobierz próbkę za pomocą cytometru przepływowego.
      UWAGA: 1,25 μl przeciwciała anty-SLAMF1 odpowiada 0,0625 μg, które służy do znakowania makrofagów 0,5 x 106 . Jednak zdecydowanie zaleca się miareczkowanie przeciwciała, a także wykonanie odpowiedniej kontroli izotypu lub fluorescencji minus jeden (FMO).

2. Przygotowanie ekstraktu z białka komórkowego

  1. Przygotowanie buforu do lizy
    1. Przygotować bufor do testu immunoprecypitacji radiowej (RIPA) z NaCl 150 mM, Tris 10 mM, EDTA 5 mM, SDS 1%, Triton X-100 1% i deoksycholanem sodu 1%.
    2. Uzupełnij bufor RIPA o 1 mM fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) i inhibitory proteazy, takie jak pepstatyna A i leupeptyna.
  2. Pobieranie komórek i izolacja białek
    1. Wyrzuć cały RPMI z dołków płytkowych za pomocą pipety P1000 i zbierz makrofagi przez pipetowanie w górę iw dół za pomocą zimnego 1x PBS.
    2. Przenieś komórki do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. Zebrać jedną studzienkę na mikroprobówkę.
    3. Wirować przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
    4. Dodać 1 ml zimnego PBS i powtórzyć kroki 2.2.2 i 2.2.3, zbierając komórki do tej samej probówki do mikrowirówki.
    5. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μl 1x PBS i połączyć cztery probówki. Powtórz krok 2.2.3. Każda probówka będzie zawierała 2 x 106 makrofagów.
    6. Dodać 100 μl uzupełnionego buforu RIPA i inkubować zawiesinę na lodzie przez 1 godzinę, wirując co 10 minut.
    7. Wirować przy 14 000 x g przez 15 min. Zebrać supernatant i przechowywać go do czasu użycia w temperaturze -20 °C.

3. Interakcja M. tuberculosis -SLAMF1 za pomocą cytometrii przepływowej

  1. Sieciowanie białek i bakterii
    1. Inkubować 1 × 106 całych inaktywowanych komórek M. tuberculosis (WCMtb, M. tuberculosis inaktywowanych przez promieniowanie gamma) z ekstraktem białkowym z 1 x 106 makrofagów (50 μl) przez noc w temperaturze 4 °C w obracającym się uchwycie na mikroprobówki.
      UWAGA: 10 μL WCMtb = 1 × 106 bakterii, oznaczone ilościowo za pomocą średnicy zewnętrznej 600nm w spektrofotometrze, biorąc pod uwagę średnicę zewnętrzną 1 jako 1 x 108 bakterii/ml.
    2. Następnego dnia dodać 500 μl 1% formaldehydu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut pod mieszaniem (wytrząsarką) w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Dodać 25 μl 0,125 M glicyny rozcieńczonej w wodzie. Inkubować przez 5 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.
    4. Umyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS w 14 000 x g przez 5 min. Wyrzucić supernatant między etapami mycia.
    5. Zawiesić osad i inkubować zawiesinę w 500 μl 2 mM środka sieciującego z glikolu etylenowego bis (bursztynian sukcynimidylu) (EGS) rozcieńczonego w mieszaninie 1:1 lodowatego kwasu octowego:woda przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przygotowanie odczynników w momencie użycia. Aby przygotować EGS, lodowaty kwas octowy i wodę należy zmieszać w równych proporcjach i podgrzać do temperatury 70 °C. Jeśli roztwór nie jest gorący, EGS nie jest całkowicie zawieszony.
  2. Barwienie SLAMF1
    1. Powtórzyć krok 3.1.4, używając 500 μl 1x PBS w pierwszym praniu i 1 ml w drugim.
    2. Kompleks białkowo-bakteryjny barwić przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności przeciwciałem anty-ludzkim SLAMF1 (jak w kroku 1.3.3), dodając przeciwciało do mikroprobówki i wirując. Użyj ilości przeciwciała odpowiedniej dla 1 x 106 komórek (2,5 μl lub 0,125 μg).
    3. Umyj komórki, aby wyeliminować nadmiar przeciwciał za pomocą FACS, ponownie zawieś osad w FACS i pobierz próbkę do cytometru przepływowego (jak w kroku 1.3.4).
      UWAGA: Wykonaj odpowiednią kontrolę izotypu lub FMO.

4. Znakowanie antygenów M. tuberculosis

  1. Zawiesić rodaminę B w etanolu w stężeniu podstawowym 5 mg/ml (1000x). Przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Dodać 1 μl rodaminy B na 100 μl M. tuberculosis Ags w probówce do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml.
  3. Inkubować przez 45 minut w temperaturze pokojowej w ciągłym mieszaniu (wir).
  4. Przemyć co najmniej 3 razy w temperaturze 14 000 x g przez 5 minut w temperaturze 24 °C, używając 1 ml 1x PBS, aż supernatant stanie się przezroczysty. Granulka (Mtb-R Ags) będzie wyglądać na jasnoróżową.
  5. Ponownie zawiesić Mtb-R Ags w 100 μl 1x PBS, aby przywrócić początkową objętość.
    UWAGA: Zalecana jest praca w sterylnych warunkach. Upewnij się, że barwienie zostało wykonane bezpośrednio przed wykonaniem eksperymentów.

5. Interakcja M. tuberculosis -SLAMF1 za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Sieciowanie bakteryjno-białkowe
    1. Wprowadzić okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm do 24-dołkowych płytek hodowlanych (1 szkiełko nakrywkowe na dołek) za pomocą pęsety chirurgicznej z okrągłym noskiem.
      UWAGA: Dokładnie wyczyść szkiełka nakrywkowe 70% etanolem. W razie potrzeby można je sterylizować w autoklawie lub sterylizować w świetle UV przez 30 minut.
    2. Inkubować szkiełko nakrywkowe z 400 μl 10 μg/ml poli-D-lizyny przez noc w temperaturze 4 °C. Przykryć płytkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem.
    3. Następnego dnia wyjmij płytkę z lodówki i umyj szkiełko nakrywkowe dwukrotnie 1 ml wody.
    4. Pozostaw szkiełko nakrywkowe do wyschnięcia.
    5. Rozcieńczyć 20 μL (2 x 106) Mtb-R Ags w 180 μL 1x PBS. Ostatnie 200 μl wystarcza do całkowitego pokrycia szkiełka nakrywkowego.
    6. Inkubować szkiełko nakrywkowe z Mtb-R Ags przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze komórkowym.
    7. Wylej pozostały płyn i przemyj dwukrotnie 1 ml 1x PBS.
      UWAGA: Na tym etapie prawidłowe przyleganie Mtb-R do szkiełka nakrywkowego można sprawdzić za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego przy użyciu filtrów odpowiadających kanałowi czerwonemu.
    8. Dodać 400 μl buforu blokującego (10% FBS w 1x PBS) przez 30 minut w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaczu).
    9. Przemyć dwukrotnie 400 μl buforu blokującego.
    10. Inkubować ze 100 μl ekstraktu białkowego rozcieńczonego w 300 μl 1x PBS przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaniu).
    11. Dodać 400 μl 1% formaldehydu rozcieńczonego w 1x PBS. Inkubować przez 15 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.
    12. Dodać 500 μl glicyny 0,125 M rozcieńczonej w wodzie. Inkubować przez 5 minut pod mieszaniem (wytrząsaczem) w temperaturze pokojowej.
    13. Umyć dwukrotnie 1 ml 1x PBS.
    14. Dodać 400 μl 2 mM EGS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w mieszaniu (wytrząsaczu).
    15. Powtórz krok 5.1.13
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się przygotowanie odczynników w momencie użycia.
  2. Barwienie SLAMF1
    1. Owiń pokrywkę płytki hodowlanej folią parafinową.
    2. Dodać kroplę 60 μl uprzednio miareczkowanego przeciwciała pierwszorzędowego anty-SLAMF1 (rozcieńczenie 1:75) na pokrywkę pokrytą folią parafinową.
    3. Ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe z płytki za pomocą zakrzywionej pęsety chirurgicznej i igieł z cienką końcówką.
      UWAGA: Aby ułatwić usuwanie szkiełek nakrywkowych, igłę można wygiąć pod kątem około 45°.
    4. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na kropli zawierającej przeciwciało. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Podnieś szkiełko nakrywkowe i umyj je dwukrotnie buforem blokującym.
    6. Odwrócić szkiełko nakrywkowe na nową kroplę zawierającą przeciwciało drugorzędowe (rozcieńczenie 1:200). Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    7. Powtórz krok 5.2.5.
    8. Usuń nadmiar płynu i zamontuj szkiełko nakrywkowe na kropli płynu montażowego umieszczonej na szkiełku podstawowym.
    9. Obserwuj pod mikroskopem fluorescencyjnym przy użyciu odpowiednich filtrów.
      UWAGA: Zalecana jest praca w sterylnych warunkach. Rozcieńczyć przeciwciała w buforze blokującym. Z szkiełkiem nakrywkowym należy obchodzić się ostrożnie, aby uniknąć zadrapań, które mogą utrudniać obserwację pod mikroskopem. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płynu montażowego odpowiedniego do fluorescencji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiono protokół, który umożliwia ocenę interakcji M. tuberculosis z receptorem immunologicznym SLAMF1 w ludzkich makrofagach (ryc. 1). W tym celu pozyskano krew obwodową od zdrowych dawców. Następnie PBMC oddzielono przez wirowanie na pożywce o gradiencie gęstości, a monocyty wyizolowano przez pozytywną selekcję magnetyczną (czystość ≥95%, ryc. 2A, B). Wyizolowane monocyty przyklejono do plastikowych płytek hod...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to stanowi przydatny przewodnik do badania interakcji biochemicznej między M. tuberculosis a czujnikami mikrobiologicznymi ulegającymi ekspresji w ludzkich makrofagach, kluczowym typie komórek biorących udział w odpowiedzi gospodarza podczas gruźlicy. Dostarczone protokoły będą istotne dla rozszyfrowania cząsteczek, które odgrywają rolę w wnikaniu M. tuberculosis do fagocytów.

Scharakteryzowanie interakcji biomolekularnych, takich jak ta między patogenami a immunorece...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez Universidad Nacional del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (granty o numerach SIB 0618/2019, SIB 2582/2012 dla V.P.), Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica (ANPCyT, granty o numerach PICT-2012-2459 i PICT A 2017-1896 dla V.P. i PICT-2021-I-INVI-00584 dla A.B.); Fundacja Florencio Fiorini; oraz Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET, grant nr PIO 15720150100010CO do V.P.). Dziękujemy Natalii Menite i Gastónowi Villafañe za wsparcie techniczne. Dziękujemy dr Pauli Barrionuevo i dr Lucianie Balboa za dyskusję naukową podczas publikacji, która dała początek rozwojowi testów przedstawionych w tej pracy. Na koniec dziękujemy dr Estermannowi za jego porady dotyczące protokołów sieciowania, Lic. Moroni za jego rady dotyczące pracy z polilizyną i licem. Moriconi za pomoc przy schematycznych figurach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488InvitrogenNr kat. A21121Do mikroskopii fluorescencyjnej
przeciwciało anty-SLAMF1 FITC eBionauka11-1509-42Do cytometrii przepływowej
przeciwciało anty-SLAMF1 PE Legenda biologiczna306308Do cytometrii przepływowej
przeciwciało pierwotne anty-SLAMF1 Legenda biologiczna306302Do mikroskopii fluorescencyjnej
Aqua-Poly/MocowanieNauki polilogiczne18606-20Nośniki montażowe
Mikrokulki CD14Miltenyi Biotec130-097-052Do izolacji monocytów
Szkiełka nakrywkowe 12mmHDA-Do oznaczania interakcji za pomocą mikroskopii
EGS (Grupa)ThermoFisher Naukowy 21565Do leczenia sieciowania
FACSCanto IIBD Nauki biologiczne338960Cytometr przepływowy z oprogramowaniem BD FACSDiva
Surowica bydlęca płodu Natocor-Inaktywowane i napromieniane, do hodowli makrofagów
Ficoll-Paque PLUSCytiva (Cytiwa)17144003Do separacji PBMC
Fidżi/ImageJOprogramowanie Open Source-Do analizy mikrograficznej
FlowJo 7.6.2 Gwiazda drzewa-Do analizy metodą cytometrii przepływowej
FormaldehydMerckK47740803613Do leczenia sieciowania
Szkiełka szklaneSzkło Klass-Do oznaczania interakcji za pomocą mikroskopii
GlicynaSigmaKlasa g8898 powiedział:Do leczenia sieciowania
Imager.A2 (Obrazik)Carl Zeiss430005-9901-000Mikroskop fluorescencyjny z modułem oświetleniowym Colibri 7
iMark (Znacznik iMarkBIO-RAD1681130Czytnik absorbancji mikropłytek 
L-glutaminaSigma Aldrich49419Do hodowli makrofagów
M. tuberculosis, szczep H37Rv, całe komórki napromieniowane promieniami gamma Zasoby BEI, NIAID, NIHNR-14819 (wersja angielska)Do oznaczania interakcji
M. tuberculosis, szczep H37Rv, lizat pełnokomórkowyZasoby BEI, NIAID, NIHNR-14822 (wersja angielska)Do stymulacji makrofagów i oznaczania interakcji
Neofuge 13RSiła leczeniaNeofuge 13RWirówka z chłodzeniem o dużej prędkości do ekstrakcji białek
Penicylina/StreptomycynaGibco (firma Gibco)15140122Do hodowli makrofagów
PMSF (Kanał PMSF)ThermoFisher Naukowy36978Do izolacji białek
Poli-D-lizynaSigma AldrichA-003-MDo obróbki szkiełek nakrywkowych
Koktajl inhibitorów proteazySigma Aldrich Zobacz materiał P8340 powiedział:Do izolacji białek
Rodamina B Sigma Aldrich 21955Barwienie M. tuberculosis
Silnik RPMI 1640Gibco (firma Gibco)11875093Do hodowli makrofagów
Wirówka Sorvall ST 16/16RThermoFisher Naukowy75004240Do izolacji PBMC i monocytów

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Global Tuberculosis Report 2023. , World Health Organization. Available at: https://www.who.int/tb/publications/global_report/en/ (2023).
  2. Ahmad, F., et al. Macrophage: A cell with many faces and functions in tuberculosis. Front Immunol. 13, 882130(2022).
  3. Bo, H., et al. Mycobacterium tuberculosis-macrophage interaction: Molecular updates. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1187205(2023).
  4. Papp, A. C., et al. AmpliSeq transcriptome analysis of human alveolar and monocyte-derived macrophages over time in response to Mycobacterium tuberculosis infection. PLoS One. 13 (5), e0198069(2018).
  5. Zhai, W., Wu, F., Zhang, Y., Fu, Y., Liu, Z. The immune escape mechanisms of Mycobacterium tuberculosis. Int J Mol Sci. 20 (2), 340(2019).
  6. Van Crevel, R., Ottenhoff, T. H. M., Van der Meer, J. W. M. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis. Clin Microbiol Rev. 15 (2), 294-309 (2002).
  7. Mortaz, E., et al. Interaction of pattern recognition receptors with Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol. 35 (1), 1-10 (2015).
  8. Stamm, C. E., Collins, A. C., Shiloh, M. U. Sensing of Mycobacterium tuberculosis and consequences to both host and bacillus. Immunol Rev. 264 (1), 204-219 (2015).
  9. Zihad, S. M. N. K., et al. Role of pattern recognition receptors in sensing Mycobacterium tuberculosis. Heliyon. 9 (10), e20636(2023).
  10. Barbero, A. M., et al. SLAMF1 signaling induces Mycobacterium tuberculosis uptake leading to endolysosomal maturation in human macrophages. J Leukoc Biol. 109 (8), 257-273 (2021).
  11. Pasquinelli, V., et al. Expression of signaling lymphocytic activation molecule-associated protein interrupts IFN-γ production in human tuberculosis. J Immunol. 172 (2), 1177-1185 (2004).
  12. Pasquinelli, V., et al. Phosphorylation of mitogen-activated protein kinases contributes to interferon-γ production in response to Mycobacterium tuberculosis. J Infect Dis. 207 (2), 340-350 (2012).
  13. Pasquinelli, V., et al. IFN-γ production during active tuberculosis is regulated by mechanisms that involve IL-17, SLAM, and CREB. J Infect Dis. 199 (5), 661-665 (2009).
  14. Pellegrini, J. M., et al. Neutrophil autophagy during human active tuberculosis is modulated by SLAMF1. Autophagy. 17 (2), 423-426 (2021).
  15. Song, T., Dong, C., Xiong, S. Signaling lymphocyte-activation molecule SLAMF1 augments mycobacteria BCG-induced inflammatory response and facilitates bacterial clearance. Int J Med Microbiol. 305 (6), 572-580 (2015).
  16. Eble, J. A. Titration ELISA as a method to determine the dissociation constant of receptor-ligand interaction. J Vis Exp. (132), e57032(2018).
  17. Patching, S. G. Surface plasmon resonance spectroscopy for characterization of membrane protein-ligand interactions and its potential for drug discovery. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 43-55 (2014).
  18. Draczkowski, P., Matosiuk, D., Jozwiak, K. Isothermal titration calorimetry in membrane protein research. J Pharm Biomed Anal. 87, 296-304 (2014).
  19. Smith, D. S., Eremin, S. A. Fluorescence polarization immunoassays and related methods for simple, high-throughput screening of small molecules. Anal Bioanal Chem. 391 (5), 1499-1507 (2008).
  20. García-Nafría, J., Tate, C. G. Cryo-electron microscopy: Moving beyond X-ray crystal structures for drug receptors and drug development. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 60, 51-71 (2020).
  21. Asami, J., Shimizu, T. Structural and functional understanding of the toll-like receptors. Protein Sci. 30 (4), 761-772 (2021).
  22. Phạm, T. T. T., Rainey, J. K. On-cell nuclear magnetic resonance spectroscopy to probe cell surface interactions. Biochem Cell Biol. 99 (6), 683-692 (2021).
  23. El Deeb, S., et al. Microscale thermophoresis as a powerful growing analytical technique for the investigation of biomolecular interaction and the determination of binding parameters. Methods Appl Fluoresc. 10 (4), 045001(2022).
  24. El Khamlichi, C., et al. Bioluminescence resonance energy transfer as a method to study protein-protein interactions: Application to G protein-coupled receptor biology. Molecules. 24 (3), 505(2019).
  25. Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods Enzymol. 545, 103-125 (2014).
  26. Park, A. M. W., Schirmer, P. S. H. Atomic force microscopy: A multifaceted tool to study membrane proteins and their interactions with ligands. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1), 74-89 (2014).
  27. Zalejski, J., Sun, J., Sharma, A. Unravelling the mystery inside cells by using single-molecule fluorescence imaging. J Imaging. 9 (9), 183(2023).
  28. Zheng, S., Zou, M., Shao, Y., Wu, H., Wang, X. Two-dimensional measurements of receptor-ligand interactions. Front Mol Biosci. 10, 1075587(2023).
  29. Zlotnikov, I. D., Kudryashova, E. V. Computer simulation of the receptor-ligand interactions of mannose receptor CD206 in comparison with the lectin concanavalin A model. Biochemistry (Moscow). 87 (1), 54-69 (2022).
  30. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: A case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 2018, 7604567(2018).
  31. Farina, B., et al. A novel approach for studying receptor-ligand interactions on living cells' surface by using NUS/T1ρ-NMR methodologies combined with computational techniques: The RGDechi15D-αvβ5 integrin complex. Comput Struct Biotechnol J. 19, 3303-3318 (2021).
  32. Driessen, N. N., et al. Role of phosphatidylinositol mannosides in the interaction between mycobacteria and DC-SIGN. Infect Immun. 77 (10), 4538-4547 (2009).
  33. Bansal, K., et al. Src homology 3-interacting domain of Rv1917c of Mycobacterium tuberculosis induces selective maturation of human dendritic cells by regulating PI3K-MAPK-NF-κB signaling and drives Th2 immune responses. J Biol Chem. 285 (47), 36511-36522 (2010).
  34. Xu, Y., et al. PPE57 induces activation of macrophages and drives Th1-type immune responses through TLR2. J Mol Med. 93 (6), 645-662 (2015).
  35. Olesen, R., et al. DC-SIGN (CD209), pentraxin 3 and vitamin D receptor gene variants associate with pulmonary tuberculosis risk in West Africans. Genes Immun. 8, 456-467 (2007).
  36. Berger, S. B., et al. SLAM is a microbial sensor that regulates bacterial phagosome functions in macrophages. Nat Immunol. 11 (10), 920-927 (2010).
  37. Degos, C., et al. Omp25-dependent engagement of SLAMF1 by Brucella abortus in dendritic cells limits acute inflammation and favours bacterial persistence in vivo. Cell Microbiol. 22 (4), e13156(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

SLAMF1 InteractionFlow CytometryFluorescence MicroscopyMacrophage Protein ExtractsPathogen Immune ReceptorCross Linking TreatmentMonocyte Derived MacrophagesPathogen Receptor Interaction

Powiązane artykuły