Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

DOI:

10.3791/67748

⸱

21 marca 2025

1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre ATPazy typu P, takie jak Ca2+-ATPaza (SERCA) sarko/retikulum endoplazmatyczne, są z natury labilnymi białkami błonowymi, które wymagają specyficznych warunków fizykochemicznych podczas oczyszczania, aby uzyskać je o wysokiej czystości i jakości strukturalnej oraz w formie aktywnej katalitycznie. Trehaloza dwucucharydowa jest kompatybilną substancją rozpuszczoną, która jest syntetyzowana i gromadzona w wysokich stężeniach w cytoplazmie drożdży w celu stabilizacji błon i białek. Zastosowanie trehalozy jako dodatku w protokole oczyszczania błony plazmatycznej H+-ATPazy skutkuje uzyskaniem wysokiej jakości preparatu, którego strukturę heksameryczną wykazują biochemiczne metody analityczne. Trehaloza może być zatem stosowana jako dodatek stabilizujący do oczyszczania białek błonowych (P-ATPazy). Protokół ten opisuje modyfikację klasycznego protokołu oczyszczania SERCA poprzez poddanie SERCA wirowaniu na gradiencie stężeń trehalozy. Włączenie tego węglowodanu doprowadziło do oczyszczenia SERCA w formie aktywnej katalitycznie o wysokiej czystości i co ważne w formie stabilnej. Częściowa charakterystyka biochemiczna oczyszczonego SERCA (SDS-PAGE, kinetyka enzymów, znakowanie FITC, spektroskopia dichroizmu kołowego) wykazała, że enzym nadaje się do badań funkcjonalnych i strukturalnych. Sugeruje się zastosowanie trehalozy w protokole oczyszczania ATPaz typu P i innych labilnych białek błonowych (i cytozolowych).

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Białka/enzymy błonowe są niezbędnymi składnikami biologicznymi komórek, ponieważ odgrywają kluczową rolę w różnych procesach1,2,3. Niektóre z funkcji mogą obejmować transport jonów i cząsteczek do i z kompartmentów wewnętrznych komórki / wewnętrznych (zarówno aktywnych/pasywnych), rozpoznawanie komórka-komórka, wiązanie międzykomórkowe, zakotwiczenie/przyłączanie i wykrywanie środowiska zewnętrznego poprzez integrację z maszynerią transdukcji sygnału w normalnych i trudnych warunkach fizycznych i chemicznych (wysoka zawartość soli, niska woda, wysoka temperatura, oporność na leki, itp.)3 Dlatego określenie trójwymiarowej (3D) struktury białek błonowych i/lub enzymów stało się bardzo ważne zarówno dla badań podstawowych, jak i stosowanych4,7,6. Co ważne, białka/enzymy błonowe są szeroko wykorzystywane jako cele do odkrywania leków (zarówno naturalnych, jak i zaprojektowanych)7,8,9. Oznacza to, że białka błonowe mają nieodłączne znaczenie dla zdrowia9,10,11.

Hydrofobowy charakter białek/enzymów błonowych jest najtrudniejszą technicznie właściwością fizykochemiczną dla laboratorium eksperymentalnego12,13,14, tym bardziej podczas pracy z oligomerycznymi i/lub bardzo labilnymi integralnymi białkami błonowymi15,16. Izolacja odpowiednich ilości białka/enzymu błonowego o najwyższej możliwej jakości do funkcjonalnych testów eksperymentalnych i badań strukturalnych jest wysoce pożądana17. Białka błonowe, które są z natury hydrofobowe, są bardzo trudne do oczyszczenia, a wybór detergentu jest zwykle jedną z najważniejszych kwestii, które należy wziąć pod uwagę17,18,19,20. W związku z tym metody laboratoryjne stosowane do izolowania białek błonowych zazwyczaj powodują pewien stopień uszkodzenia układu strukturalnego 3D białka21. Niektóre z tych metod obejmują użycie (a) sonikacji (fale ultradźwiękowe o wysokiej częstotliwości/energii), (b) detergentów rozpuszczających białka (ostrych, średnich lub delikatnych)22, (c) stosunkowo wysokich ciśnień w chromatografii kolumnowej i ultrawirowaniu z dużą prędkością23, (d) cząsteczek wytrącających, (e) enzymów trawiennych i innych21. Wszystkie te procesy mogą przyczyniać się do lub być główną przyczyną destabilizacji białek podczas oczyszczania21. Pod tym względem niektóre protokoły wydają się działać stosunkowo dobrze dla danego białka błonowego. Jednak optymalizacja jest zawsze mile widziana w przypadku korzystania z nowych nowoczesnych testów lub metod, które wymagają wyższej jakości przygotowania białka błonowego w celu uzyskania zadowalających wyników24. Kroki optymalizacyjne mogą obejmować, między innymi, ulepszenie konstrukcji konstrukcji, znalezienie optymalnych warunków dla ekspresji białek błonowych, ustanowienie lepszych warunków obsługi (tj. pH, temperatury itp.), znalezienie najlepszego kompatybilnego detergentu, dostosowanie etapów oczyszczania, takich jak czas sonikacji, prędkość wirowania, przeformułowanie roztworów buforowych poprzez dodanie środków stabilizujących itp.25,26,27. Dlatego każda zmiana w metodologii oczyszczania, która prowadzi do wzrostu jakości (czystości) i aktywności oczyszczonego białka/enzymu błonowego, jest ważna.

W rodzinie ATPazy typu P, błona plazmatyczna drożdży H+-ATPaza wydaje się być jednym z najbardziej labilnych członków28,29. H+-ATPaza traci swoją aktywność hydrolizującą ATP po odwodnieniu (liofilizacji), szoku cieplnym itp.28,29. Zastosowanie trehalozy jako stabilizatora białka przetestowano w izolacji błony komórkowej H+-ATPazy z drożdży K. lactis30,31; otrzymany preparat H+-ATPazy charakteryzował się wysoką czystością i wykazywał aktywność katalityczną. Co ważne, pozwoliło to na wyjaśnienie oligomerycznego stanu enzymu metodami biochemicznymi, ujawniając, że jest to heksamer, a następnie potwierdzone przez mikroskopię krioelektronową31,32,33,34,35. W związku z tym wydaje się prawdopodobne, że delikatne trójwymiarowe (3D) ułożenie białek błonowych może zostać utracone w stosunkowo trudnych warunkach podczas oczyszczania36. Kinetykę inaktywacji dwufazowej obserwuje się dla H+-ATPazy podczas inaktywacji za pośrednictwem ciepła29. W komórkach drożdży, podobnie jak w wielu innych organizmach, disacharydowa trehaloza gromadzi się w wysokich stężeniach w warunkach stresu środowiskowego37,38,39. Trehaloza utrzymuje integralność błony i funkcję transportową poprzez stabilizację białek (zarówno osadzonych w błonie, jak i cytozolowych) oraz błon komórkowych40,41. Mechanizm stabilizujący trehalozę został szeroko zbadany przez kilka grup oraz przez nasze laboratorium42,43,44,45. Eksperymenty z H+-ATPazą i innymi enzymami wykazały, że trehaloza jest najskuteczniejszym stabilizatorem białek wśród mono- i disacharydów28,29. Doprowadziło to do włączenia go do protokołu oczyszczania H+-ATPazy30. Ostatnio trehaloza została również wykorzystana do oczyszczania siateczki sarkoplazmatycznej Ca2+-ATPazy (SERCA) z szybkokurczliwych mięśni królika z dobrymi wynikami w czystości i aktywności białka46. Dlatego trehaloza wydaje się być dobrym i odpowiednim dodatkiem do oczyszczania ATPaz typu P i prawdopodobnie innych białek błonowych i cytozolowych.

Dla P-ATPaz istnienie strukturalnych domen cytoplazmatycznych jest eksperymentalną zaletą, szczególnie w badaniach interakcji substrat/ligand47; Wiązanie ATP zostało zbadane w wysoce czystych rekombinowanych domenach N47,48,49, eliminując w ten sposób techniczne rozważania dotyczące oczyszczania całych enzymów błonowych47,48,50, między innymi51. Niestety, niektóre badania funkcjonalne (katalityczna/konwersja energii) i strukturalne (układ podjednostek i interakcja z innymi białkami) nadal wymagają całej klasy P-ATPase52,53. W związku z tym oczyszczenie SERCA zostało osiągnięte przez kilka grup badawczych54,55,56,57,58. Jednak ulepszenia nadal mogą być wdrażane46, na przykład zwiększając nienaruszoność oczyszczonej ATPase59, unikając denaturacji/zakłóceń kompleksów białkowych25, zwiększyć rozpuszczalność bez denaturacji białka błonowego (tj. unikając tworzenia agregatów makromolekularnych)60, prowadzić do lepszej kompatybilności z testami i innymi metodami analitycznymi61 Ponadto, w miarę pojawiania się nowych strategii eksperymentalnych, dodatków, inhibitorów enzymów itp. w literaturze naukowej61,62,63,64,65,66, czasami muszą być testowane z całą P-ATPazą. W pracy opisano protokół oczyszczania SERCA i zastosowania trehalozy jako dodatku stabilizującego strukturę białka i aktywność ATPazy; Oznacza to, że oprócz poprawy jakości enzymu (strukturalnej), trehaloza pomaga zapobiegać utracie struktury i aktywności enzymu podczas izolacji i przechowywania enzymu, co pomaga oszczędzać materiał biologiczny, a tym samym zmniejszać liczbę oczyszczań enzymów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) wytycznymi dotyczącymi postępowania ze zwierzętami w laboratoriach doświadczalnych51,67,68. Tkankę mięśniową uzyskano z dzikiego typu Oryctolagus cuniculus z lokalnej jednostki zajmującej się zwierzętami (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Lekarz weterynarii z doświadczeniem w zarządzaniu zwierzętami laboratoryjnymi przeprowadził wstępną sekcję mięśni i obróbkę. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu używanego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Izolacja retikulum sarkoplazmatycznego z szybkokurczliwego mięśnia królika (Czas, 7 - 9 godzin)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, zapoznaj się z Champeil et al.69.

  1. Uzyskanie szybkokurczliwej tkanki mięśniowej (~70 g z obu tylnych nóg na zwierzę) z dzikiego typu Oryctolagus cuniculus.
    UWAGA: Wymagana jest wcześniejsza identyfikacja wizualna mięśni, które mają być wypreparowane70,71.
  2. Maceruj mięsień szybkokurczliwy w blenderze, zawieszając go w trzech objętościach po 100 mM KCl, z 1 minutą włączonego i 1 minutą w lodowatym spoczynku, powtórz trzy razy72.
  3. Usunąć resztki tkanek przez odwirowanie (1500 × g) w temperaturze 4 °C przez 5 minut; w razie potrzeby przeprowadza się drugie odwirowanie (4200 × g).
  4. Zebrać supernatant i homogenizować go za pomocą młynka do tkanek (10 uderzeń przy niskiej prędkości, tj. 500-1,500 obr./min)72,73. Odwirować homogenat (10 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 minut
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas homogenizacji, ponieważ użycie stosunkowo dużej prędkości może spowodować uszkodzenie systemu i operatora.
  5. Odwirować supernatant (zawierający retikulum sarkoplazmatyczne) (33 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 120 minut.
  6. Zawiesić granulki w 40 ml 0,5 M sacharozy i odwirować (12 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Rozcieńczyć supernatant (0,6 M KCl i 0,15 M sacharozy) i odwirować zawiesinę (34 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 165 minut.
  7. Zawiesić osad zawierający arkusze pęcherzyków retikulum sarkoplazmatycznego (SRV) w 0,3 M sacharozy, 0,1 M KCl i 5 mM Tris-HCl o pH 7,0. Określ stężenie białka, używając testu Lowry'ego74 i albuminy surowicy ludzkiej jako wzorca białka.
  8. Podwielokrotnić SRV (30-32 mg/ml) w objętości 1 ml. Próbki SRV należy przechowywać w temperaturze -72 °C do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Wydajność białka wynosi 100-110 mg SRV na zwierzę.

2. Oczyszczanie SERCA (czas, 18 - 20 godzin)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, zapoznaj się z Rivera-Morán et al.46.

  1. Rozcieńczyć zawiesinę SRV do 2 mg białka/ml za pomocą lodowato zimnych 75 mM Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA i 0,1% (w/v) deoksycholanu (DOC). Zawiesinę SRV inkubować na lodzie przez 10 minut i delikatnie mieszać. Odwirować zawiesinę SRV (100 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 min.
    UWAGA: DOC należy dodawać kropla po kropli.
  2. Zawiesić granulki w <3 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45% glicerolu (v/v) i 2 mM EDTA. Homogenizować zawiesinę i dostosować do końcowej objętości 10 ml. Określ stężenie białka, a następnie dostosuj je do 6,5 mg/ml. Dodać azolektynę w dawce 5 mg/ml i 0,85 (w/w) Zwittergent 3-14,
    UWAGA: Azolectin i Zwittergent 3-14 należy dodawać kropla po kropli.
  3. Zawiesinę homogenizować i odwirować (100 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 minut. Zebrać supernatant i rozcieńczyć w stosunku 1:2 2 2 mM EGTA (pH 7,2).
  4. Delikatnie wlać zawiesinę na nieciągły gradient stężenia trehalozy (45, 40, 35 i 30% w/v) w 10 mM Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,1% deoksycholanu i 1 mg/ml azolektyny. Wirować (100 000 × g) w temperaturze 4 °C przez 14 godzin. Zebrać przezroczysty, lekko żółtawy granulat utworzony na dnie probówek.
    UWAGA: Zarówno wytworzenie gradientu trehalozy, jak i dodanie zawiesiny próbki musi być przeprowadzone przy użyciu odpowiednich technik. Zaleca się wirowanie przez noc.
  5. Delikatnie zawiesić osad w małej objętości (<1,5 ml) 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45% glicerolu i 2 mM EDTA. Określ stężenie białka. Dostosować stężenie białka przez rozcieńczenie do 2 mg/ml. Pobrać porcje (~50 μl) zawiesiny i przechowywać oczyszczony HEART w temperaturze -72 °C do momentu jego użycia.
  6. Wykonaj SDS-PAGE dla oczyszczonego SERCA72 oraz próbek białek pobranych na różnych etapach oczyszczania. Zabarwić żel za pomocą Coomassie Blue72.
    UWAGA: Zastosowanie 0,6 M trehalozy zamiast glicerolu w buforze zawiesiny zwiększa stabilność enzymu podczas cykli przechowywania i zamrażania-rozmrażania28,29.

3. Test aktywności ATPazy (czas, 1 - 2 godziny)

  1. Test sprzężony z enzymami: dehydrogenaza ATPazy-kinazy pirogronianowo-mleczanowej
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną (1 ml): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolopirogronian, 250 μM NADH. Uwzględnij zmienne stężenia ATP (od 0,001 do 0,25 mM).
    2. Dokładnie homogenizować test reakcji przez wirowanie. Inkubować test reakcji w temperaturze 37 ◦C przez 10 minut. Dodać 0,9 U dehydrogenazy L-mleczanowej (LDH) i 1,5 U kinazy pirogronianowej (PK).
    3. Reakcję ATPazy należy rozpocząć przez dodanie 10 μg SERCA.
    4. Określ tworzenie NADH. Śledź zmianę intensywności absorbancji co sekundę przez 600 s przy długości fali (λ) 340 nm w czasie za pomocą spektrofotometru z termostatowanym uchwytem na kuwetę.
      UWAGA: Przedział czasowy pomiaru absorbancji może się różnić, ale spróbuj zapisać jak najwięcej punktów danych, aby narysować początkową linię prostą reakcji ATPazy.
  2. Określ szybkość hydrolizy ATP
    UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, zapoznaj się z Rivera-Morán et al.46.
    1. Obliczyć wartość nachylenia (Δabs/min) części liniowej w każdej utworzonej krzywej. Użyj molowego współczynnika ekstynkcji (ε) NADH (λ = 6,220 M−1·cm−1), aby określić aktywność ATPazy (μmole ATP hydrolizowane/min.mg prot.)
  3. Określić parametry kinetyki K, m i V, max
    1. Wykreśl dane dotyczące prędkości w funkcji stężenia ATP za pomocą oprogramowania do analizy danych i tworzenia wykresów.
    2. Dopasuj dane za pomocą regresji nieliniowej do równania Michaelisa-Mentena (równanie 1)46:
      figure-protocol-1
      gdzie v jest prędkością, Vmax jest prędkością maksymalną, [S] jest stężeniem ATP, a Km jest stałą Michaelisa-Mentena.
    3. Określ Km i Vmax przez iterację.
      UWAGA: Włączenie DOC może zwiększyć odpowiedź szybkości ATPazy; Zaleca się testowanie różnych stężeń DOC w celu znalezienia optymalnego.

4. Test znakowania SERCA za pomocą izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) (czas, 30 - 45 min, tylko do etykietowania FITC)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, zapoznaj się z54,75,76.

  1. Zawiesić SERCA (20 μg) w 50 μl (objętość końcowa) buforu znakującego (100 mM KCl, 5 mM MgCl2 i 30 mM Tris-HCl, pH 8,9) zawierającym 1 mM FITC. Wymieszaj przez wirowanie.
  2. Próbki należy inkubować w różnym czasie (15 min, 10 min, 7 min, 5 min i 2 min) w ciemności i w temperaturze pokojowej.
  3. Zatrzymać reakcję znakowania, dodając 1 objętość lodowatego buforu zatrzymującego (480 mM sacharozy i 48 mM MOPS, pH 7,0), zawierającego ATP (5 mM). Inkubować na lodzie przez 5 minut w ciemności.
  4. Poddaj SERCA oznaczone FITC SDS-PAGE72. Przezroczyste żele należy wystawić na działanie promieniowania UV (λ = 302 nm). Zdjęcie udokumentuje wynik.
  5. Odbarwić żel kolorem Coomassie blue. Zdjęcie udokumentuj wynik.
    UWAGA: Wykonanie znakowania FITC w ciemnym pomieszczeniu może poprawić jakość sygnału fluorescencji.

5. Widma dichroizmu kołowego (CD) (Czas, 30 min)

UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat procedury, zapoznaj się z11,77.

  1. Zawiesić SERCA (3 μM) w 400 μL 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,0) w temperaturze 25 °C.
  2. Załaduj próbkę do celi o długości ścieżki 0,1 cm. Ustaw widma dalekiego UV λ w zakresie 190-260 nm. Ustaw rozdzielczość wewnętrzną i szerokość pasma na 1 nm.
  3. Nagraj sygnał CD z prędkością 50 nm/min w temperaturze 25 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDS-PAGE of HEART na różnych etapach oczyszczania (Rysunek 1). Niebiesko zabarwiony żel Coomassie wykazuje wzbogacenie pasma białka SERCA (pozorna masa cząsteczkowa >100 kDa) w miarę postępu protokołu oczyszczania. Pasmo białkowe odpowiadające SERCA wykazuje czystość >90% po odwirowaniu na gradiencie stężeń trehalozy. Wykres szybkości hydrolizy ATP w funkcji stężenia ATP (Rysunek 2A). Kinetyczną ATPazę Michaelisa-Mentena (wzór hiperboliczny) obserwuje się dla oczyszc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Większość cząsteczek i jonów nie może swobodnie przenikać przez błony komórkowe, np. proton (H+) wymaga transportera błonowego w błonie plazmatycznej różnych organizmów i organelli, takich jak mitochondria83,84. Błony komórkowe są selektywne, a cząsteczki i jony, które przechodzą przez błony komórkowe, są różnorodne, więc w komórce można znaleźć kilka rodzajów białek błonowych, takich jak (a) transportery ABC, (b) kanały jonowe, (c) ATPazy związane z b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autor dziękuje za pomoc Edmundo Mata-Moralesa w edycji filmu, VM, Valentína de la Cruz-Torresa w oczyszczaniu SRV, Miguela A. Rivera-Morana w oczyszczaniu i analizie SERCA oraz Juana C. Gonzaleza-Castro, Franco E. Juareza, Alejandry Nevarez, Nicolasa Rocha-Vizueta i Jocelina I. Ramíreza-Alonso w produkcji wideo. Nie otrzymano żadnych funduszy, grantów ani innego wsparcia na przeprowadzenie tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ATPSigma-Aldrich CorpA2383
Azolectin z soiSigma-Aldrich Corp44924
Stacjonarny transoświetlacz UV Cole-ParmerEW-97623-08Podwójna intensywność Wysokie ustawienie jest idealne do dokumentacji analitycznej. Niskie ustawienie zmniejsza fotonickowanie lub fotowybielanie próbek żelu podczas wykonywania prac przygotowawczych.
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich Corp223506
Coolpix B500 camera Nikon CorpS210
Coomassie brylantowy niebieski G-250Bio-Rad1610406
Dodecyl maltosideSigma-Aldrich CorpD4641
Glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-N,N,N′,N′ -tetraoctowySigma-Aldrich CorpE4378
Sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodwodziana Sigma-Aldrich CorpE6511
Izotiocyjanian fluoresceinySigma-Aldrich CorpF3651
KClJT Baker7447-40-7
MgCl2 • 6H2OSigma-Aldrich CorpM9272
MOPSSigma-Aldrich CorpM1254
NADHChem-Impex International Inc230
N-tetradecylo-N,N-dimetylo-3-amon-1-propanosulfonianSigma-Aldrich CorpD0431
Fosfoenolopirogronian (PEP)Chem-Impex International Inc9711
Dehydrogenaza mleczanowa z mięśni królikaRoche10003557103
Kinazapirogronianowa z mięśni królikaSigma-Aldrich CorpP1506
Deoksycholan soduSigma-Aldrich CorpD6750
dodecylosiarczanu soduBio-Rad1610302
 Jasco Corp.Jasco J1500 
SacharozaSigma-Aldrich Corp84100
TrehalozaSigma-Aldrich CorpT0167Dihydrat
chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanuUltrawirówka Sigma-Aldrich Corp857645
BeckmanOptima XPN
&NBSP;Agilent Technologies8453Spektrofotometr UV-Vis Agilent 8453 wykorzystuje matrycę fotodiod do jednoczesnego pomiaru pełnego widma światła ultrafioletowego do widzialnego
WiseStir HS-30EDaihan Scientific Co.Dh. WOS01010Idealny do wszystkich zastosowań dyspergujących i homogenizujących, przeznaczony do rozdrabniaczy tkanek.
Spektropolarymetr Spektrofotometr UV/VS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schuberth, C., Wedlich-Söldner, R. Building a patchwork - The yeast plasma membrane as model to study lateral domain formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (4), 767-774 (2015).
  2. Douglas, L. M., Konopka, J. B. Fungal membrane organization: The eisosome concept. Annu Rev Microbiol. 68 (1), 377-393 (2014).
  3. Borrell, J. H., Domènech, Ò, Keough, K. M. W. Membrane protein - Lipid interactions: Physics and Chemistry in the Bilayer. , Springer International Publishing. (2016).
  4. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. The next generation in membrane protein structure determination. , Springer International Publishing. (2016).
  5. White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459 (7245), 344-346 (2009).
  6. Lacapère, J. -J. Membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. , Humana Press. 459(1002).
  7. Palmgren, M. G. Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for nutrient uptake. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52 (1), 817-845 (2001).
  8. Yatime, L., et al. P-type ATPases as drug targets: Tools for medicine and science. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1787 (4), 207-220 (2009).
  9. Drews, J. Tetrahydrobiopterin biosynthesis as an off-target of sulfa drugs. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  10. Xu, Z., Meshcheryakov, V. A., Poce, G., Chng, S. -S. MmpL3 is the flippase for mycolic acids in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (30), 7993-7998 (2017).
  11. Siligardi, G., Hussain, R., Patching, S. G., Phillips-Jones, M. K. Ligand- and drug-binding studies of membrane proteins revealed through circular dichroism spectroscopy. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1 PARTA), 34-42 (2014).
  12. Rawlings, A. E. Membrane proteins: Always an insoluble problem. Biochem Soc Trans. 44 (3), 790-795 (2016).
  13. Popot, J. -L. Membrane proteins in aqueous solutions. , Springer International Publishing. 708(2018).
  14. Palmgren, M. G., Sommarin, M., Ulvskov, P., Larsson, C. Effect of detergents on the H+-ATPase activity of inside-out and right-side-out plant plasma membrane vesicles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1021 (2), 133-140 (1990).
  15. McBride, Z., Chen, D., Reick, C., Xie, J., Szymanski, D. B. Global analysis of membrane-associated protein oligomerization using protein correlation profiling. Mol Cell Proteomics. 16 (11), 1972-1989 (2017).
  16. Yoneda, J. S., et al. Multimeric species in equilibrium in detergent-solubilized Na, K-ATPase. Int J Biol Macromol. 89, 238-245 (2016).
  17. Ohlendieck, K. Extraction of membrane proteins. Protein Purif Protocols. 59, 283-294 (2004).
  18. Champeil, P., et al. A robust method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem. 511, 31-35 (2016).
  19. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biol Proced Online. 18, 4(2016).
  20. le Maire, M., et al. Gel chromatography and analytical ultracentrifugation to determine the extent of detergent binding and aggregation, and Stokes radius of membrane proteins using sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase as an example. Nat Protoc. 3 (11), 1782-1795 (2008).
  21. Du, M., et al. Progress, applications, challenges and prospects of protein purification technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1-26 (2022).
  22. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
  23. Harding, S. E. Analytical ultracentrifugation as a matrix-free probe for the study of kinase related cellular and bacterial membrane proteins and glycans. Molecules. 26, 6080(2021).
  24. Chen, Y. -C., et al. Thermal stability, storage and release of proteins with tailored fit in silica. Sci Rep. 7 (1), 46568(2017).
  25. Montigny, C. C., Arnou, B., Marchal, E., Champeil, P. Use of glycerol-containing media to study the intrinsic fluorescence properties of detergent-solubilized native or expressed SERCA1a. Biochemistry. 47 (46), 12159-12174 (2008).
  26. Simongini, M., Puglisi, A., Genovese, F., Hochkoeppler, A. Trehalose counteracts the dissociation of tetrameric rabbit lactate dehydrogenase induced by acidic pH conditions. Arch Biochem Biophys. 740, 109584(2023).
  27. Shivanna, B. D., Rowe, E. S. Preservation of the native structure and function of Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum: Solubilization and reconstitution by new short-chain phospholipid detergent 1,2-diheptanoyl-sn-phosphatidylcholine. Biochem J. 325 (2), 533-542 (1997).
  28. Sampedro, J. G., Guerra, G., Pardo, J. P., Uribe, S. Trehalose-mediated protection of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis during freeze-drying and rehydration. Cryobiology. 37 (2), 131-138 (1998).
  29. Sampedro, J. G., Cortés, P., Muñoz-Clares, R. A., Fernández, A., Uribe, S. Thermal inactivation of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Protection by Trehalose. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1544 (1-2), 64-73 (2001).
  30. Sampedro, J. G., et al. Fluorescence quenching by nucleotides of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Biochemistry. 46 (18), 5616-5622 (2007).
  31. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  32. Zhao, P., Zhao, C., Chen, D., Yun, C., Li, H., Bai, L. Structure and activation mechanism of the hexameric plasma membrane H+-ATPase. Nat Commun. 12 (1), 6439(2021).
  33. Auer, M., Scarborough, G. A., Kühlbrandt, W. Surface crystallization of the plasma membrane H+-ATPase on a carbon support film for electron crystallography. J Mol Biol. 287 (5), 961-968 (1999).
  34. Hennessey, J. P., Scarborough, G. A. Secondary structure of the Neurospora CRASSA plasma membrane H+-ATPase as estimated by circular dichroism. J Biol Chem. 263 (7), 3123-3130 (1988).
  35. Scarborough, G. A. Crystallization, structure and dynamics of the proton-translocating P-type ATPase. J Exp Biol. 203 (Pt 1), 147-154 (2000).
  36. Sumida, K. H., et al. Improving protein expression, stability, and function with proteinMPNN. J Am Chem Soc. 146 (3), 2054-2061 (2024).
  37. Eleutherio, E., Panek, A., De Mesquita, J. F., Trevisol, E., Magalhães, R. Revisiting yeast trehalose metabolism. Curr Genet. 61 (3), 263-274 (2015).
  38. Attfield, P. V. Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to agents that induce heat shock response. FEBS Lett. 225 (1-2), 259-263 (1987).
  39. Marunde, M. R., et al. Improved tolerance to salt and water stress in Drosophila melanogaster cells conferred by late embryogenesis abundant protein. J Insect Physiol. 59 (4), 377-386 (2013).
  40. Crowe, J. H. Anhydrobiosis: An unsolved problem with applications in human welfare. Subcell Biochem. 71, 263-280 (2015).
  41. Crowe, J. H., Crowe, L. M., Chapman, D. Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms: The role of trehalose. Science. 223 (4637), 701-703 (1984).
  42. Sampedro, J. G., Rivera-Moran, M. A., Uribe-Carvajal, S. Kramers' theory and the dependence of enzyme dynamics on trehalose-mediated viscosity. Catalysts. 10 (6), 1-19 (2020).
  43. Sampedro, J. G., Uribe, S. Trehalose-enzyme interactions result in structure stabilization and activity inhibition. The role of viscosity. Mol Cell Biochem. 256 - 257 (1-2), 319-327 (2004).
  44. Crowe, J. H. Trehalose as a "chemical chaperone": Fact and fantasy. Adv Exp Med Biol. 594, 143-158 (2007).
  45. Crowe, J. H., Carpenter, J. F., Crowe, L. M., Anchordoguy, T. J. Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology. 27 (3), 219-231 (1990).
  46. Rivera-Morán, M. A., Sampedro, J. G. Isolation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit fast-twitch muscle. Methods Protoc. 6 (5), 102(2023).
  47. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  48. Ramírez-Alonso, J. I., Sampedro, J. G. Effect of cations on ATP binding to the N-domain of Na+, K+-ATPase. J Fluoresc. , (2024).
  49. De la Cruz-Torres, V., Cataño, V., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS Interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. J Fluoresc. 30 (3), 483-496 (2020).
  50. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. J Fluoresc. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  51. Kiani, A. K., et al. Ethical considerations regarding animal experimentation. J Prev Med Hyg. 63 (2 Suppl 3), E255-E266 (2022).
  52. Ruiz-Granados, Y., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  53. Wang, S., et al. Structural basis for sarcolipin's regulation of muscle thermogenesis by the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Sci Adv. 7 (48), eabi7154(2021).
  54. Champeil, P., et al. ATP regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Metal-free ATP and 8-bromo-ATP bind with high affinity to the catalytic site of phosphorylated ATPase and accelerate dephosphorylation. J Biol Chem. 263 (25), 12288-12294 (1988).
  55. Møller, J. V., Olesen, C. Preparation of Ca(2+)-ATPase1a enzyme from rabbit sarcoplasmic reticulum. Methods Mol Biol. 1377, 11-17 (2016).
  56. Wuytack, F., De Schutter, G., Casteels, R. Partial purification of (Ca2+ + Mg2+)-dependent ATPase from pig smooth muscle and reconstitution of an ATP-dependent Ca2+-transport system. Biochem J. 198 (2), 265-271 (1981).
  57. Mandal, A., et al. Solubilization, purification and reconstitution of Ca2+-ATPase from bovine pulmonary artery smooth muscle microsomes by different detergents: Preservation of native structure and function of the enzyme by DHPC. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1760 (1), 20-31 (2006).
  58. Inesi, G., Ma, H., Hua, S., Toyoshima, C. Characterization of Ca2+ ATPase residues involved in substrate and cation binding. Ann NY Acad Sci. 986 (1), 63-71 (2003).
  59. Van Winkle, W. B., Pitts, B. J., Entman, M. L. Rapid purification of canine cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J Biol Chem. 253 (24), 8671-8673 (1978).
  60. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  61. Teramoto, N., Sachinvala, N. D., Shibata, M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible, and bioactive materials. Molecules. 13 (8), 1773-1816 (2008).
  62. Dao, T. T., et al. Demethoxycurcumin is a potent inhibitor of P-type ATPases from diverse kingdoms of life. PLOS ONE. 11 (9), e0163260(2016).
  63. Bleeker, N. P., Cornea, R. L., Thomas, D. D., Xing, C. A novel SERCA inhibitor demonstrates synergy with classic SERCA inhibitors and targets multidrug-resistant AML. Mol Pharmaceutics. 10 (11), 4358-4366 (2013).
  64. Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem Soc Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
  65. Tadini-Buoninsegni, F., Smeazzetto, S., Gualdani, R., Moncelli, M. R. Drug interactions with the Ca2+-ATPase from Sarco(Endo)Plasmic Reticulum (SERCA). Front Mol Biosci. 5, 36(2018).
  66. Clausen, J. D., et al. Elucidation of antimicrobial activity and mechanism of action by N-substituted carbazole derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 27 (19), 4564-4570 (2017).
  67. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 Edition, Members of the Panel on Euthanasia AVMA Staff Consultants. , AVMA. Schaumburg, IL. (2020).
  68. de Aluja, A. S. Laboratory animals and official Mexican norms (NOM-062-ZOO-1999). Gac Med Mex. 138 (3), 295-298 (2002).
  69. Champeil, P., Buschlen-Boucly, S., Bastide, F., Gary-Bobo, C. Sarcoplasmic reticulum ATPase. Spin labeling detection of ligand-induced changes in the relative reactivities of certain sulfhydryl groups. J Biol Chem. 253 (4), 1179-1186 (1978).
  70. Skalec, A., Janeczek, M., Czerski, A. Anatomy and histology of the rabbit common calcanean tendon. J Vet Med Series C: Anat Histol Embryol. 48 (5), 466-475 (2019).
  71. Janes, L. E., Mioton, L. M., Fracol, M. E., Ko, J. H. An in vivo comparison: Novel mesh suture versus traditional suture-based repair in a rabbit tendon model. J Hand Surg Glob Online. 4 (1), 32-39 (2022).
  72. Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. Protein Methods. , Wiley. (1996).
  73. Gagné, F. Tissue preparation and subcellular fractionation techniques. Biochem Ecotoxicol. , 21-31 (2014).
  74. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  75. Autry, J. M., Rubin, J. E., Svensson, B., Li, J. L., Thomas, D. D. Nucleotide activation of the Ca-ATPase. J Biol Chem. 287 (46), 39070-39082 (2012).
  76. Winters, D. L., Autry, J. M., Svensson, B., Thomas, D. D. Interdomain fluorescence resonance energy transfer in SERCA probed by cyan-fluorescent protein fused to the actuator domain. Biochemistry. 47 (14), 4246-4256 (2008).
  77. Miles, A. J., Wallace, B. A. Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins. Chem Soc Rev. 14 (45), 1130-1135 (2016).
  78. Scofano, H. M., Vieyra, A., de Meis, L. Substrate regulation of the sarcoplasmic reticulum ATPase. Transient kinetic studies. J Biol Chem. 254 (20), 10227-10231 (1979).
  79. Yamamoto, T., Tonomura, Y. Reaction mechanism of the Ca++-dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle: I. Kinetic studies. J Biochem. 62 (5), 558-575 (1967).
  80. Murphy, A. J. Affinity labeling of the active site of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 946 (1), 57-65 (1988).
  81. Csermely, P., Katopis, C., Wallace, B. A., Martonosi, A. The E1→E2 transition of Ca2+-transporting ATPase in sarcoplasmic reticulum occurs without major changes in secondary structure. A circular-dichroism study. Biochem J. 241 (3), 663-669 (1987).
  82. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  83. Scarborough, G. A. The plasma membrane proton-translocating ATPase. Cell Mol Life Sci. 57 (6), 871-883 (2000).
  84. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  85. Kanai, R., Vilsen, B., Cornelius, F., Toyoshima, C. Crystal structures of Na+, K+-ATPase reveal the mechanism that converts the K+-bound form to Na+-bound form and opens and closes the cytoplasmic gate. FEBS Lett. 597 (15), 1957-1976 (2023).
  86. Palmgren, M. P-type ATPases: Many more enigmas left to solve. J Biol Chem. 299 (11), 105352(2023).
  87. Frauenfelder, H. Ask not what physics can do for biology-Ask what biology can do for physics. Phys Biol. 11 (5), 053004(2014).
  88. Frauenfelder, H. The physics of proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, Springer. New York. New York, NY. (2010).
  89. Narhi, L. O. Biophysics for Therapeutic Protein Development. , Springer Science+Business Media. (2013).
  90. East, J. M. Purification of a membrane protein (Ca2+/Mg2+-ATPase) and its reconstitution into lipid vesicles. Methods Mol Biol. 27, 87-94 (1994).
  91. Lee, E. -H., et al. Enhancement of enzyme activity and stability by poly(γ-glutamic acid). Polymer J. 42 (10), 818-822 (2010).
  92. Norrild, R. K., et al. Increasing protein stability by inferring substitution effects from high-throughput experiments. Cell Rep Methods. 2 (11), 100333(2022).
  93. Song, Z., Zhang, Q., Wu, W., Pu, Z., Yu, H. Rational design of enzyme activity and enantioselectivity. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1-14 (2023).
  94. Jidenko, M., Lenoir, G., Fuentes, J. M., le Maire, M., Jaxel, C. Expression in yeast and purification of a membrane protein, SERCA1a, using a biotinylated acceptor domain. Protein Expr Purif. 48 (1), 32-42 (2006).
  95. Hua, S., Ma, H., Lewis, D., Inesi, G., Toyoshima, C. Functional role of "N" (nucleotide) and "P" (phosphorylation) domain interactions in the sarcoplasmic reticulum (SERCA) ATPase. Biochemistry. 41 (7), 2264-2272 (2002).
  96. Pang, Y. -H., Chen, J. -W. Anisodamine causes the changes of structure and function in the transmembrane domain of the Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum. Biosci Biotechnol Biochem. 68 (1), 126-131 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie SERCAsiateczka sarkoplazmatycznastabilizacja trehalozATPazy typu Poczyszczanie bia ek b onowychanaliza SDS PAGEdichroizm ko owypomiar aktywno ci ATPazyznakowanie FITC

Powiązane artykuły