Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67748

⸱

21 marca 2025

1Instituto de Física, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje ulepszoną metodę oczyszczania SERCA, która obejmuje trehalozę disacharydową w końcowym etapie wirowania. Węglowodan ten stabilizuje białka w trudnych warunkach. Oczyszczone SERCA było aktywne katalitycznie i wykazywało wysoką czystość, dzięki czemu nadawało się do badań strukturalnych i funkcjonalnych.

Streszczenie

Niektóre ATPazy typu P, takie jak Ca2+-ATPaza (SERCA) sarko/retikulum endoplazmatyczne, są z natury labilnymi białkami błonowymi, które wymagają specyficznych warunków fizykochemicznych podczas oczyszczania, aby uzyskać je o wysokiej czystości i jakości strukturalnej oraz w formie aktywnej katalitycznie. Trehaloza dwucucharydowa jest kompatybilną substancją rozpuszczoną, która jest syntetyzowana i gromadzona w wysokich stężeniach w cytoplazmie drożdży w celu stabilizacji błon i białek. Zastosowanie trehalozy jako dodatku w protokole oczyszczania błony plazmatycznej H+-ATPazy skutkuje uzyskaniem wysokiej jakości preparatu, którego strukturę heksameryczną wykazują biochemiczne metody analityczne. Trehaloza może być zatem stosowana jako dodatek stabilizujący do oczyszczania białek błonowych (P-ATPazy). Protokół ten opisuje modyfikację klasycznego protokołu oczyszczania SERCA poprzez poddanie SERCA wirowaniu na gradiencie stężeń trehalozy. Włączenie tego węglowodanu doprowadziło do oczyszczenia SERCA w formie aktywnej katalitycznie o wysokiej czystości i co ważne w formie stabilnej. Częściowa charakterystyka biochemiczna oczyszczonego SERCA (SDS-PAGE, kinetyka enzymów, znakowanie FITC, spektroskopia dichroizmu kołowego) wykazała, że enzym nadaje się do badań funkcjonalnych i strukturalnych. Sugeruje się zastosowanie trehalozy w protokole oczyszczania ATPaz typu P i innych labilnych białek błonowych (i cytozolowych).

Wprowadzenie

Białka/enzymy błonowe są niezbędnymi składnikami biologicznymi komórek, ponieważ odgrywają kluczową rolę w różnych procesach1,2,3. Niektóre z funkcji mogą obejmować transport jonów i cząsteczek do i z kompartmentów wewnętrznych komórki / wewnętrznych (zarówno aktywnych/pasywnych), rozpoznawanie komórka-komórka, wiązanie międzykomórkowe, zakotwiczenie/przyłączanie i wykrywanie środowiska zewnętrznego poprzez integrację z maszynerią transdukcji sygnału w normalnych i trudnych warunkach fizycznych i chemicznych (wysoka zawartość soli, niska woda, wysoka temperatura, oporność na leki, itp.)3 Dlatego określenie trójwymiarowej (3D) struktury białek błonowych i/lub enzymów stało się bardzo ważne zarówno dla badań podstawowych, jak i stosowanych4,7,6. Co ważne, białka/enzymy błonowe są szeroko wykorzystywane jako cele do odkrywania leków (zarówno naturalnych, jak i zaprojektowanych)7,8,9. Oznacza to, że białka błonowe mają nieodłączne znaczenie dla zdrowia9,10,11.

Hydrofobowy charakter białek/enzymów błonowych jest najtrudniejszą technicznie właściwością fizykochemiczną dla laboratorium eksperymentalnego12,13,14, tym bardziej podczas pracy z oligomerycznymi i/lub bardzo labilnymi integralnymi białkami błonowymi15,16. Izolacja odpowiednich ilości białka/enzymu błonowego o najwyższej możliwej jakości do funkcjonalnych testów eksperymentalnych i badań strukturalnych jest wysoce pożądana17. Białka błonowe, które są z natury hydrofobowe, są bardzo trudne do oczyszczenia, a wybór detergentu jest zwykle jedną z najważniejszych kwestii, które należy wziąć pod uwagę17,18,19,20. W związku z tym metody laboratoryjne stosowane do izolowania białek błonowych zazwyczaj powodują pewien stopień uszkodzenia układu strukturalnego 3D białka21. Niektóre z tych metod obejmują użycie (a) sonikacji (fale ultradźwiękowe o wysokiej częstotliwości/energii), (b) detergentów rozpuszczających białka (ostrych, średnich lub delikatnych)22, (c) stosunkowo wysokich ciśnień w chromatografii kolumnowej i ultrawirowaniu z dużą prędkością23, (d) cząsteczek wytrącających, (e) enzymów trawiennych i innych21. Wszystkie te procesy mogą przyczyniać się do lub być główną przyczyną destabilizacji białek podczas oczyszczania21. Pod tym względem niektóre protokoły wydają się działać stosunkowo dobrze dla danego białka błonowego. Jednak optymalizacja jest zawsze mile widziana w przypadku korzystania z nowych nowoczesnych testów lub metod, które wymagają wyższej jakości przygotowania białka błonowego w celu uzyskania zadowalających wyników24. Kroki optymalizacyjne mogą obejmować, między innymi, ulepszenie konstrukcji konstrukcji, znalezienie optymalnych warunków dla ekspresji białek błonowych, ustanowienie lepszych warunków obsługi (tj. pH, temperatury itp.), znalezienie najlepszego kompatybilnego detergentu, dostosowanie etapów oczyszczania, takich jak czas sonikacji, prędkość wirowania, przeformułowanie roztworów buforowych poprzez dodanie środków stabilizujących itp.25,26,27. Dlatego każda zmiana w metodologii oczyszczania, która prowadzi do wzrostu jakości (czystości) i aktywności oczyszczonego białka/enzymu błonowego, jest ważna.

W rodzinie ATPazy typu P, błona plazmatyczna drożdży H+-ATPaza wydaje się być jednym z najbardziej labilnych członków28,29. H+-ATPaza traci swoją aktywność hydrolizującą ATP po odwodnieniu (liofilizacji), szoku cieplnym itp.28,29. Zastosowanie trehalozy jako stabilizatora białka przetestowano w izolacji błony komórkowej H+-ATPazy z drożdży K. lactis30,31; otrzymany preparat H+-ATPazy charakteryzował się wysoką czystością i wykazywał aktywność katalityczną. Co ważne, pozwoliło to na wyjaśnienie oligomerycznego stanu enzymu metodami biochemicznymi, ujawniając, że jest to heksamer, a następnie potwierdzone przez mikroskopię krioelektronową31,32,33,34,35. W związku z tym wydaje się prawdopodobne, że delikatne trójwymiarowe (3D) ułożenie białek błonowych może zostać utracone w stosunkowo trudnych warunkach podczas oczyszczania36. Kinetykę inaktywacji dwufazowej obserwuje się dla H+-ATPazy podczas inaktywacji za pośrednictwem ciepła29. W komórkach drożdży, podobnie jak w wielu innych organizmach, disacharydowa trehaloza gromadzi się w wysokich stężeniach w warunkach stresu środowiskowego37,38,39. Trehaloza utrzymuje integralność błony i funkcję transportową poprzez stabilizację białek (zarówno osadzonych w błonie, jak i cytozolowych) oraz błon komórkowych40,41. Mechanizm stabilizujący trehalozę został szeroko zbadany przez kilka grup oraz przez nasze laboratorium42,43,44,45. Eksperymenty z H+-ATPazą i innymi enzymami wykazały, że trehaloza jest najskuteczniejszym stabilizatorem białek wśród mono- i disacharydów28,29. Doprowadziło to do włączenia go do protokołu oczyszczania H+-ATPazy30. Ostatnio trehaloza została również wykorzystana do oczyszczania siateczki sarkoplazmatycznej Ca2+-ATPazy (SERCA) z szybkokurczliwych mięśni królika z dobrymi wynikami w czystości i aktywności białka46. Dlatego trehaloza wydaje się być dobrym i odpowiednim dodatkiem do oczyszczania ATPaz typu P i prawdopodobnie innych białek błonowych i cytozolowych.

Dla P-ATPaz istnienie strukturalnych domen cytoplazmatycznych jest eksperymentalną zaletą, szczególnie w badaniach interakcji substrat/ligand47; Wiązanie ATP zostało zbadane w wysoce czystych rekombinowanych domenach N47,48,49, eliminując w ten sposób techniczne rozważania dotyczące oczyszczania całych enzymów błonowych47,48,50, między innymi51. Niestety, niektóre badania funkcjonalne (katalityczna/konwersja energii) i strukturalne (układ podjednostek i interakcja z innymi białkami) nadal wymagają całej klasy P-ATPase52,53. W związku z tym oczyszczenie SERCA zostało osiągnięte przez kilka grup badawczych54,55,56,57,58. Jednak ulepszenia nadal mogą być wdrażane46, na przykład zwiększając nienaruszoność oczyszczonej ATPase59, unikając denaturacji/zakłóceń kompleksów białkowych25, zwiększyć rozpuszczalność bez denaturacji białka błonowego (tj. unikając tworzenia agregatów makromolekularnych)60, prowadzić do lepszej kompatybilności z testami i innymi metodami analitycznymi61 Ponadto, w miarę pojawiania się nowych strategii eksperymentalnych, dodatków, inhibitorów enzymów itp. w literaturze naukowej61,62,63,64,65,66, czasami muszą być testowane z całą P-ATPazą. W pracy opisano protokół oczyszczania SERCA i zastosowania trehalozy jako dodatku stabilizującego strukturę białka i aktywność ATPazy; Oznacza to, że oprócz poprawy jakości enzymu (strukturalnej), trehaloza pomaga zapobiegać utracie struktury i aktywności enzymu podczas izolacji i przechowywania enzymu, co pomaga oszczędzać materiał biologiczny, a tym samym zmniejszać liczbę oczyszczań enzymów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z międzynarodowymi i lokalnymi (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) wytycznymi dotyczącymi obchodzenia się ze zwierzętami w laboratoriach eksperymentalnych51,67,68. Tkanka mięśniową pobrano od osobników dzikiego typu Oryctolagus cuniculus z lokalnej jednostki ds. obsługi zwierząt (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Wstępną sekcję i obróbkę mięśni przeprowadził lekarz weterynarii specjalizujący się w zarządzaniu zwierzętami laboratoryjnymi. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytych w tej badaniu znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Izolacja siateczki sarkoplazmatycznej z szybko kurczących się mięśni królika (Czas trwania: 7 - 9 h)

UWAGA: Szczegóły procedury opisano w pracy Champeil i wsp.69.

  1. Pobrać tkankę mięśni szybkokurczliwych (~70 g z obu tylnych kończyn na zwierzę) od dzikiego typu Oryctolagus cuniculus.
    UWAGA: Wymagana jest wcześniejsza identyfikacja wizualna mięśni przeznaczonych do sekcji70,71.
  2. Rozmielić mięśnie szybkokurczliwe w blenderze, zawieszając je w trzech objętościach 100 mM KCl; cykl obejmuje 1 min pracy i 1 min odpoczynku w lodzie, powtórzyć trzy razy72.
  3. Usunąć resztki tkankowe poprzez wirowanie (1500 × g) w temperaturze 4 °C przez 5 min; w razie potrzeby należy przeprowadzić drugie wirowanie (4200 × g).
  4. Zebrać nadsącz i zhomogenizować go za pomocą homogenizatora tkankowego (10 pociągnięć przy niskiej prędkości, tj. 500-1,500 rpm)72,73. Odwirować homogenat (10,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 min.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność podczas homogenizacji, ponieważ użycie stosunkowo wysokiej prędkości może doprowadzić do uszkodzenia urządzenia oraz operatora.
  5. Odwirować nadsącz (zawierający siateczkę sarkoplazmatyczną) (33,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 120 min.
  6. Zawiesić osad w 40 mL 0,5 M sacharozy i wirować (12,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 15 min. Rozcieńczyć nadsącz (0,6 M KCl i 0,15 M sacharozy) i wirować zawiesinę (34,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 165 min.
  7. Zawiesić osad zawierający płaty pęcherzyków siateczki sarkoplazmatycznej (SRVs) w 0,3 M sacharozy, 0,1 M KCl i 5 mM Tris-HCl, pH 7,0. Określić stężenie białka metodą Lowry'ego74, stosując albuminę surowicy ludzkiej jako standard białkowy.
  8. Rozdzielić SRVs (30-32 mg/mL) na alykwoaty o objętości 1 mL. Próbki SRVs przechowywać w temperaturze -72 °C do dalszego przetwarzania.
    UWAGA: Wydajność białka wynosi 100-110 mg SRVs na zwierzę.

2. Oczyszczanie SERCA (Czas trwania: 18 - 20 h)

UWAGA: Szczegóły dotyczące procedury znajdują się w pracy Rivera-Morán et al.46.

  1. Rozcieńczyć zawiesinę SRVs do stężenia 2 mg białka/mL, używając schłodzonego w lodzie buforu zawierającego 75 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA oraz 0.1% (w/v) deoksycholan sodu (DOC). Inkubować zawiesinę SRVs na lodzie przez 10 min przy łagodnym mieszaniu. Odwir upcoming zawiesinę SRVs (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 min.
    UWAGA: DOC należy dodawać kroplami.
  2. Resuspender osad w <3 mL buforu zawierającego 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, 45% glicerolu (v/v) oraz 2 mM EDTA. Zhomogenizować zawiesinę i dopełnić do objętości końcowej 10 mL. Oznaczyć stężenie białka, a następnie dostosować je do 6.5 mg/mL. Dodać azolectynę do stężenia 5 mg/mL oraz Zwittergent 3-14 w proporcji 0.85 (w/w).
    UWAGA: Azolectynę i Zwittergent 3-14 należy dodawać kroplami.
  3. Zhomogenizować zawiesinę i odwirować (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 60 min. Zebrać nadsącz i rozcieńczyć w stosunku 1:2 za pomocą 2 mM EGTA (pH 7.2).
  4. Delikatnie nalać zawiesinę na nieciągły gradient stężeń trehalozy (45, 40, 35 i 30% w/v) w 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, 0.1% deoksycholanu i 1 mg/mL azolectyny. Odwirować (100,000 × g) w temperaturze 4 °C przez 14 h. Zebrać przezroczysty, lekko żółtawy osad utworzony na dnie probówek.
    UWAGA: Zarówno tworzenie gradientu trehalozy, jak i nakładanie zawiesiny próbki muszą być wykonane przy użyciu odpowiednich technik. Zaleca się wirowanie przez noc.
  5. Delikatnie resuspender osad w małej objętości (<1.5 mL) buforu zawierającego 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, 45% glicerolu oraz 2 mM EDTA. Oznaczyć stężenie białka. Dostosować stężenie białka poprzez rozcieńczenie do 2 mg/mL. Pobrać alikwoty (~50 µL) zawiesiny i przechowywać oczyszczoną SERCA w temperaturze −72 °C do momentu użycia.
  6. Przeprowadzić analizę SDS-PAGE oczyszczonej SERCA72 oraz próbek białek pobranych na różnych etapach oczyszczania. Zabarwić żel błękitem Coomassie72.
    UWAGA: Zastosowanie 0.6 M trehalozy zamiast glicerolu w buforze do resuspensji zwiększa stabilność enzymu podczas przechowywania oraz cykli zamrażania i rozmrażania28,29.

3. Analiza aktywności ATPase (Czas trwania, 1 - 2 h)

  1. Test sprzężony enzymatycznie: ATPase-kinaza pirogronianowa-dehydrogenaza mleczanowa
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolopirogronianu, 250 µM NADH. Uwzględnić zmienne stężenia ATP (od 0,001 do 0,25 mM).
    2. Starannie ujednorodnić mieszaninę reakcyjną za pomocą wstrząsania w vorteksie. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 ◦C przez 10 min. Dodać 0,9 U dehydrogenazy mleczanowej (LDH) oraz 1,5 U kinazy pirogronianowej (PK).
    3. Rozpocząć reakcję ATPase poprzez dodanie 10 µg SERCA.
    4. Oznaczyć tworzenie NADH. Monitorować zmianę intensywności absorbancji co sekundę przez 600 s przy długości fali (λ) 340 nm w czasie, używając spektrofotometru z termostatowaną podstawką na kuwetę.
      UWAGA: Interwał czasowy pomiaru absorbancji może być różny, jednak należy starać się zarejestrować jak najwięcej punktów danych, aby wyznaczyć początkową linię prostą reakcji ATPase.
  2. Wyznaczyć szybkość hydrolizy ATP
    UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacji Rivera-Morán i wsp.46.
    1. Obliczyć wartość nachylenia (Δabs/min) części liniowej każdej z otrzymanych krzywych. Użyć molowego współczynnika ekstynkcji (ε) NADH (λ = 6,220 M−1·cm−1), aby określić aktywność ATPase (µmoli ATP zhydrolizowanych/min.mg białka).
  3. Wyznaczyć parametry kinetyczne Km i Vmax
    1. Przedstawić zależność szybkości od stężenia ATP na wykresie przy użyciu oprogramowania do analizy danych i tworzenia grafiki.
    2. Dopasować dane metodą regresji nieliniowej do równania Michaelisa-Menten (Równanie 1)46:
      Równanie Michaelisa-Menten: v=Vmax·S/(Km+S), formuła kinetyki enzymatycznej, analiza biochemiczna.
      gdzie v to szybkość, Vmax to szybkość maksymalna, [S] to stężenie ATP, a Km to stała Michaelisa-Menten.
    3. Wyznaczyć Km i Vmax metodą iteracyjną.
      UWAGA: Dodatek DOC może zwiększyć szybkość reakcji ATPase; zaleca się przetestowanie różnych stężeń DOC w celu znalezienia wartości optymalnej.

4. Analiza znakowania SERCA izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) (Czas trwania: 30 - 45 min, wyłącznie dla znakowania FITC)

UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacjach54,75,76.

  1. Zawiesić SERCA (20 µg) w 50 µL (objętość końcowa) buforu do znakowania (100 mM KCl, 5 mM MgCl2 oraz 30 mM Tris-HCl, pH 8.9) zawierającego 1 mM FITC. Wymieszać za pomocą wortexa.
  2. Inkubować próbki przez różne odstępy czasu (15 min, 10 min, 7 min, 5 min i 2 min) w ciemności i w temperaturze pokojowej.
  3. Zatrzymać reakcję znakowania poprzez dodanie 1 objętości lodowatego buforu zatrzymującego (480 mM sacharozy i 48 mM MOPS, pH 7.0), zawierającego ATP (5 mM). Inkubować na lodzie przez 5 min w ciemności.
  4. Poddać oznakowane FITC białko SERCA elektroforezie SDS-PAGE72. Naświetlić przezroczyste żele światłem UV (λ = 302 nm). Wykonać dokumentację fotograficzną wyniku.
  5. Zabarwić żel błękitem Coomassie. Wykonać dokumentację fotograficzną wyniku.
    UWAGA: Przeprowadzenie znakowania FITC w ciemni może poprawić jakość sygnału fluorescencyjnego.

5. Widma dichroizmu kołowego (CD) (Czas trwania: 30 min)

UWAGA: Szczegóły procedury znajdują się w publikacjach11,77.

  1. Zawiesić SERCA (3 µM) w 400 µL 10 mM buforu fosforanowego (pH 7.0) w temperaturze 25 °C.
  2. Nanieść próbkę do kuwety o drodze optycznej 0.1 cm. Ustawić zakres długości fal λ dla widm dalekiego UV pomiędzy 190-260 nm. Ustawić rozdzielczość wewnętrzną oraz szerokość pasma na 1 nm.
  3. Zarejestrować sygnał CD z prędkością 50 nm/min w temperaturze 25 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

SDS-PAGE białka SERCA na różnych etapach oczyszczania (Rysunek 1). Żel barwiony błękitem Coomassie wykazuje wzbogacenie prążka białka SERCA (pozorna masa cząsteczkowa >100 kDa) w miarę postępu protokołu oczyszczania. Prążek białkowy odpowiadający SERCA wykazuje czystość >90% po wirowaniu w gradiencie stężeń trehalozy. Wykres szybkości hydrolizy ATP w funkcji stężenia ATP (Rysunek 2A). Dla oczyszczonego SERCA zaobserwowano kinetykę ATPase według mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Większość cząsteczek i jonów nie może swobodnie przenikać przez błony komórkowe, np. proton (H+) wymaga transportera błonowego w błonie plazmatycznej różnych organizmów i organelli, takich jak mitochondria83,84. Błony komórkowe są selektywne, a cząsteczki i jony, które przechodzą przez błony komórkowe, są różnorodne, więc w komórce można znaleźć kilka rodzajów białek błonowych, takich jak (a) transportery ABC, (b) kanały jonowe, (c) ATPazy związane z b...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor oświadcza, że nie ma konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autor dziękuje za pomoc Edmundo Mata-Moralesa w edycji filmu, VM, Valentína de la Cruz-Torresa w oczyszczaniu SRV, Miguela A. Rivera-Morana w oczyszczaniu i analizie SERCA oraz Juana C. Gonzaleza-Castro, Franco E. Juareza, Alejandry Nevarez, Nicolasa Rocha-Vizueta i Jocelina I. Ramíreza-Alonso w produkcji wideo. Nie otrzymano żadnych funduszy, grantów ani innego wsparcia na przeprowadzenie tego badania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ATPSigma-Aldrich CorpA2383
Azolectin z soiSigma-Aldrich Corp44924
Stacjonarny transoświetlacz UV Cole-ParmerEW-97623-08Podwójna intensywność Wysokie ustawienie jest idealne do dokumentacji analitycznej. Niskie ustawienie zmniejsza fotonickowanie lub fotowybielanie próbek żelu podczas wykonywania prac przygotowawczych.
CaCl2 • 2H2OSigma-Aldrich Corp223506
Coolpix B500 camera Nikon CorpS210
Coomassie brylantowy niebieski G-250Bio-Rad1610406
Dodecyl maltosideSigma-Aldrich CorpD4641
Glikol etylenowy-bis(eter 2-aminoetylowy)-N,N,N′,N′ -tetraoctowySigma-Aldrich CorpE4378
Sól tetrasodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego dwuwodwodziana Sigma-Aldrich CorpE6511
Izotiocyjanian fluoresceinySigma-Aldrich CorpF3651
KClJT Baker7447-40-7
MgCl2 • 6H2OSigma-Aldrich CorpM9272
MOPSSigma-Aldrich CorpM1254
NADHChem-Impex International Inc230
N-tetradecylo-N,N-dimetylo-3-amon-1-propanosulfonianSigma-Aldrich CorpD0431
Fosfoenolopirogronian (PEP)Chem-Impex International Inc9711
Dehydrogenaza mleczanowa z mięśni królikaRoche10003557103
Kinazapirogronianowa z mięśni królikaSigma-Aldrich CorpP1506
Deoksycholan soduSigma-Aldrich CorpD6750
dodecylosiarczanu soduBio-Rad1610302
 Jasco Corp.Jasco J1500 
SacharozaSigma-Aldrich Corp84100
TrehalozaSigma-Aldrich CorpT0167Dihydrat
chlorowodorku tris(hydroksymetylo)aminometanuUltrawirówka Sigma-Aldrich Corp857645
BeckmanOptima XPN
&NBSP;Agilent Technologies8453Spektrofotometr UV-Vis Agilent 8453 wykorzystuje matrycę fotodiod do jednoczesnego pomiaru pełnego widma światła ultrafioletowego do widzialnego
WiseStir HS-30EDaihan Scientific Co.Dh. WOS01010Idealny do wszystkich zastosowań dyspergujących i homogenizujących, przeznaczony do rozdrabniaczy tkanek.
Spektropolarymetr Spektrofotometr UV/VS

Bibliografia

  1. Schuberth, C., Wedlich-Söldner, R. Building a patchwork - The yeast plasma membrane as model to study lateral domain formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1853 (4), 767-774 (2015).
  2. Douglas, L. M., Konopka, J. B. Fungal membrane organization: The eisosome concept. Annu Rev Microbiol. 68 (1), 377-393 (2014).
  3. Borrell, J. H., Domènech, Ò, Keough, K. M. W. Membrane protein - Lipid interactions: Physics and Chemistry in the Bilayer. , Springer International Publishing. (2016).
  4. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. The next generation in membrane protein structure determination. , Springer International Publishing. (2016).
  5. White, S. H. Biophysical dissection of membrane proteins. Nature. 459 (7245), 344-346 (2009).
  6. Lacapère, J. -J. Membrane protein structure determination. Methods Mol Biol. , Humana Press. 459(1002).
  7. Palmgren, M. G. Plant plasma membrane H+-ATPases: Powerhouses for nutrient uptake. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 52 (1), 817-845 (2001).
  8. Yatime, L., et al. P-type ATPases as drug targets: Tools for medicine and science. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1787 (4), 207-220 (2009).
  9. Drews, J. Tetrahydrobiopterin biosynthesis as an off-target of sulfa drugs. Science. 287 (5460), 1960-1964 (2000).
  10. Xu, Z., Meshcheryakov, V. A., Poce, G., Chng, S. -S. MmpL3 is the flippase for mycolic acids in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (30), 7993-7998 (2017).
  11. Siligardi, G., Hussain, R., Patching, S. G., Phillips-Jones, M. K. Ligand- and drug-binding studies of membrane proteins revealed through circular dichroism spectroscopy. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1838 (1 PARTA), 34-42 (2014).
  12. Rawlings, A. E. Membrane proteins: Always an insoluble problem. Biochem Soc Trans. 44 (3), 790-795 (2016).
  13. Popot, J. -L. Membrane proteins in aqueous solutions. , Springer International Publishing. 708(2018).
  14. Palmgren, M. G., Sommarin, M., Ulvskov, P., Larsson, C. Effect of detergents on the H+-ATPase activity of inside-out and right-side-out plant plasma membrane vesicles. Biochim Biophys Acta Biomembr. 1021 (2), 133-140 (1990).
  15. McBride, Z., Chen, D., Reick, C., Xie, J., Szymanski, D. B. Global analysis of membrane-associated protein oligomerization using protein correlation profiling. Mol Cell Proteomics. 16 (11), 1972-1989 (2017).
  16. Yoneda, J. S., et al. Multimeric species in equilibrium in detergent-solubilized Na, K-ATPase. Int J Biol Macromol. 89, 238-245 (2016).
  17. Ohlendieck, K. Extraction of membrane proteins. Protein Purif Protocols. 59, 283-294 (2004).
  18. Champeil, P., et al. A robust method to screen detergents for membrane protein stabilization, revisited. Anal Biochem. 511, 31-35 (2016).
  19. Gimpl, K., Klement, J., Keller, S. Characterising protein/detergent complexes by triple-detection size-exclusion chromatography. Biol Proced Online. 18, 4(2016).
  20. le Maire, M., et al. Gel chromatography and analytical ultracentrifugation to determine the extent of detergent binding and aggregation, and Stokes radius of membrane proteins using sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase as an example. Nat Protoc. 3 (11), 1782-1795 (2008).
  21. Du, M., et al. Progress, applications, challenges and prospects of protein purification technology. Front Bioeng Biotechnol. 10, 1-26 (2022).
  22. Slotboom, D. J., Duurkens, R. H., Olieman, K., Erkens, G. B. Static light scattering to characterize membrane proteins in detergent solution. Methods. 46 (2), 73-82 (2008).
  23. Harding, S. E. Analytical ultracentrifugation as a matrix-free probe for the study of kinase related cellular and bacterial membrane proteins and glycans. Molecules. 26, 6080(2021).
  24. Chen, Y. -C., et al. Thermal stability, storage and release of proteins with tailored fit in silica. Sci Rep. 7 (1), 46568(2017).
  25. Montigny, C. C., Arnou, B., Marchal, E., Champeil, P. Use of glycerol-containing media to study the intrinsic fluorescence properties of detergent-solubilized native or expressed SERCA1a. Biochemistry. 47 (46), 12159-12174 (2008).
  26. Simongini, M., Puglisi, A., Genovese, F., Hochkoeppler, A. Trehalose counteracts the dissociation of tetrameric rabbit lactate dehydrogenase induced by acidic pH conditions. Arch Biochem Biophys. 740, 109584(2023).
  27. Shivanna, B. D., Rowe, E. S. Preservation of the native structure and function of Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum: Solubilization and reconstitution by new short-chain phospholipid detergent 1,2-diheptanoyl-sn-phosphatidylcholine. Biochem J. 325 (2), 533-542 (1997).
  28. Sampedro, J. G., Guerra, G., Pardo, J. P., Uribe, S. Trehalose-mediated protection of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis during freeze-drying and rehydration. Cryobiology. 37 (2), 131-138 (1998).
  29. Sampedro, J. G., Cortés, P., Muñoz-Clares, R. A., Fernández, A., Uribe, S. Thermal inactivation of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Protection by Trehalose. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1544 (1-2), 64-73 (2001).
  30. Sampedro, J. G., et al. Fluorescence quenching by nucleotides of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Biochemistry. 46 (18), 5616-5622 (2007).
  31. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  32. Zhao, P., Zhao, C., Chen, D., Yun, C., Li, H., Bai, L. Structure and activation mechanism of the hexameric plasma membrane H+-ATPase. Nat Commun. 12 (1), 6439(2021).
  33. Auer, M., Scarborough, G. A., Kühlbrandt, W. Surface crystallization of the plasma membrane H+-ATPase on a carbon support film for electron crystallography. J Mol Biol. 287 (5), 961-968 (1999).
  34. Hennessey, J. P., Scarborough, G. A. Secondary structure of the Neurospora CRASSA plasma membrane H+-ATPase as estimated by circular dichroism. J Biol Chem. 263 (7), 3123-3130 (1988).
  35. Scarborough, G. A. Crystallization, structure and dynamics of the proton-translocating P-type ATPase. J Exp Biol. 203 (Pt 1), 147-154 (2000).
  36. Sumida, K. H., et al. Improving protein expression, stability, and function with proteinMPNN. J Am Chem Soc. 146 (3), 2054-2061 (2024).
  37. Eleutherio, E., Panek, A., De Mesquita, J. F., Trevisol, E., Magalhães, R. Revisiting yeast trehalose metabolism. Curr Genet. 61 (3), 263-274 (2015).
  38. Attfield, P. V. Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to agents that induce heat shock response. FEBS Lett. 225 (1-2), 259-263 (1987).
  39. Marunde, M. R., et al. Improved tolerance to salt and water stress in Drosophila melanogaster cells conferred by late embryogenesis abundant protein. J Insect Physiol. 59 (4), 377-386 (2013).
  40. Crowe, J. H. Anhydrobiosis: An unsolved problem with applications in human welfare. Subcell Biochem. 71, 263-280 (2015).
  41. Crowe, J. H., Crowe, L. M., Chapman, D. Preservation of membranes in anhydrobiotic organisms: The role of trehalose. Science. 223 (4637), 701-703 (1984).
  42. Sampedro, J. G., Rivera-Moran, M. A., Uribe-Carvajal, S. Kramers' theory and the dependence of enzyme dynamics on trehalose-mediated viscosity. Catalysts. 10 (6), 1-19 (2020).
  43. Sampedro, J. G., Uribe, S. Trehalose-enzyme interactions result in structure stabilization and activity inhibition. The role of viscosity. Mol Cell Biochem. 256 - 257 (1-2), 319-327 (2004).
  44. Crowe, J. H. Trehalose as a "chemical chaperone": Fact and fantasy. Adv Exp Med Biol. 594, 143-158 (2007).
  45. Crowe, J. H., Carpenter, J. F., Crowe, L. M., Anchordoguy, T. J. Are freezing and dehydration similar stress vectors? A comparison of modes of interaction of stabilizing solutes with biomolecules. Cryobiology. 27 (3), 219-231 (1990).
  46. Rivera-Morán, M. A., Sampedro, J. G. Isolation of the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase from rabbit fast-twitch muscle. Methods Protoc. 6 (5), 102(2023).
  47. Páez-Pérez, E. D., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. Nucleotide binding in an engineered recombinant Ca2+-ATPase N-domain. Biochemistry. 55 (49), 6751-6765 (2016).
  48. Ramírez-Alonso, J. I., Sampedro, J. G. Effect of cations on ATP binding to the N-domain of Na+, K+-ATPase. J Fluoresc. , (2024).
  49. De la Cruz-Torres, V., Cataño, V., Olivo-Rodríguez, M., Sampedro, J. G. ANS Interacts with the Ca2+-ATPase nucleotide binding site. J Fluoresc. 30 (3), 483-496 (2020).
  50. Sampedro, J. G., Nájera, H., Uribe-Carvajal, S., Ruiz-Granados, Y. G. Mapping the ATP binding site in the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. J Fluoresc. 24 (6), 1849-1859 (2014).
  51. Kiani, A. K., et al. Ethical considerations regarding animal experimentation. J Prev Med Hyg. 63 (2 Suppl 3), E255-E266 (2022).
  52. Ruiz-Granados, Y., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  53. Wang, S., et al. Structural basis for sarcolipin's regulation of muscle thermogenesis by the sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Sci Adv. 7 (48), eabi7154(2021).
  54. Champeil, P., et al. ATP regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. Metal-free ATP and 8-bromo-ATP bind with high affinity to the catalytic site of phosphorylated ATPase and accelerate dephosphorylation. J Biol Chem. 263 (25), 12288-12294 (1988).
  55. Møller, J. V., Olesen, C. Preparation of Ca(2+)-ATPase1a enzyme from rabbit sarcoplasmic reticulum. Methods Mol Biol. 1377, 11-17 (2016).
  56. Wuytack, F., De Schutter, G., Casteels, R. Partial purification of (Ca2+ + Mg2+)-dependent ATPase from pig smooth muscle and reconstitution of an ATP-dependent Ca2+-transport system. Biochem J. 198 (2), 265-271 (1981).
  57. Mandal, A., et al. Solubilization, purification and reconstitution of Ca2+-ATPase from bovine pulmonary artery smooth muscle microsomes by different detergents: Preservation of native structure and function of the enzyme by DHPC. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1760 (1), 20-31 (2006).
  58. Inesi, G., Ma, H., Hua, S., Toyoshima, C. Characterization of Ca2+ ATPase residues involved in substrate and cation binding. Ann NY Acad Sci. 986 (1), 63-71 (2003).
  59. Van Winkle, W. B., Pitts, B. J., Entman, M. L. Rapid purification of canine cardiac sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J Biol Chem. 253 (24), 8671-8673 (1978).
  60. Ruiz-Granados, Y. G., De La Cruz-Torres, V., Sampedro, J. G. The oligomeric state of the plasma membrane H+-ATPase from Kluyveromyces lactis. Molecules. 24 (5), 958(2019).
  61. Teramoto, N., Sachinvala, N. D., Shibata, M. Trehalose and trehalose-based polymers for environmentally benign, biocompatible, and bioactive materials. Molecules. 13 (8), 1773-1816 (2008).
  62. Dao, T. T., et al. Demethoxycurcumin is a potent inhibitor of P-type ATPases from diverse kingdoms of life. PLOS ONE. 11 (9), e0163260(2016).
  63. Bleeker, N. P., Cornea, R. L., Thomas, D. D., Xing, C. A novel SERCA inhibitor demonstrates synergy with classic SERCA inhibitors and targets multidrug-resistant AML. Mol Pharmaceutics. 10 (11), 4358-4366 (2013).
  64. Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem Soc Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
  65. Tadini-Buoninsegni, F., Smeazzetto, S., Gualdani, R., Moncelli, M. R. Drug interactions with the Ca2+-ATPase from Sarco(Endo)Plasmic Reticulum (SERCA). Front Mol Biosci. 5, 36(2018).
  66. Clausen, J. D., et al. Elucidation of antimicrobial activity and mechanism of action by N-substituted carbazole derivatives. Bioorg Med Chem Lett. 27 (19), 4564-4570 (2017).
  67. Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 Edition, Members of the Panel on Euthanasia AVMA Staff Consultants. , AVMA. Schaumburg, IL. (2020).
  68. de Aluja, A. S. Laboratory animals and official Mexican norms (NOM-062-ZOO-1999). Gac Med Mex. 138 (3), 295-298 (2002).
  69. Champeil, P., Buschlen-Boucly, S., Bastide, F., Gary-Bobo, C. Sarcoplasmic reticulum ATPase. Spin labeling detection of ligand-induced changes in the relative reactivities of certain sulfhydryl groups. J Biol Chem. 253 (4), 1179-1186 (1978).
  70. Skalec, A., Janeczek, M., Czerski, A. Anatomy and histology of the rabbit common calcanean tendon. J Vet Med Series C: Anat Histol Embryol. 48 (5), 466-475 (2019).
  71. Janes, L. E., Mioton, L. M., Fracol, M. E., Ko, J. H. An in vivo comparison: Novel mesh suture versus traditional suture-based repair in a rabbit tendon model. J Hand Surg Glob Online. 4 (1), 32-39 (2022).
  72. Bollag, D. M., Rozycki, M. D., Edelstein, S. J. Protein Methods. , Wiley. (1996).
  73. Gagné, F. Tissue preparation and subcellular fractionation techniques. Biochem Ecotoxicol. , 21-31 (2014).
  74. Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
  75. Autry, J. M., Rubin, J. E., Svensson, B., Li, J. L., Thomas, D. D. Nucleotide activation of the Ca-ATPase. J Biol Chem. 287 (46), 39070-39082 (2012).
  76. Winters, D. L., Autry, J. M., Svensson, B., Thomas, D. D. Interdomain fluorescence resonance energy transfer in SERCA probed by cyan-fluorescent protein fused to the actuator domain. Biochemistry. 47 (14), 4246-4256 (2008).
  77. Miles, A. J., Wallace, B. A. Circular dichroism spectroscopy of membrane proteins. Chem Soc Rev. 14 (45), 1130-1135 (2016).
  78. Scofano, H. M., Vieyra, A., de Meis, L. Substrate regulation of the sarcoplasmic reticulum ATPase. Transient kinetic studies. J Biol Chem. 254 (20), 10227-10231 (1979).
  79. Yamamoto, T., Tonomura, Y. Reaction mechanism of the Ca++-dependent ATPase of sarcoplasmic reticulum from skeletal muscle: I. Kinetic studies. J Biochem. 62 (5), 558-575 (1967).
  80. Murphy, A. J. Affinity labeling of the active site of the Ca2+-ATPase of sarcoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta - Biomembr. 946 (1), 57-65 (1988).
  81. Csermely, P., Katopis, C., Wallace, B. A., Martonosi, A. The E1→E2 transition of Ca2+-transporting ATPase in sarcoplasmic reticulum occurs without major changes in secondary structure. A circular-dichroism study. Biochem J. 241 (3), 663-669 (1987).
  82. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  83. Scarborough, G. A. The plasma membrane proton-translocating ATPase. Cell Mol Life Sci. 57 (6), 871-883 (2000).
  84. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. Proc Natl Acad Sci. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  85. Kanai, R., Vilsen, B., Cornelius, F., Toyoshima, C. Crystal structures of Na+, K+-ATPase reveal the mechanism that converts the K+-bound form to Na+-bound form and opens and closes the cytoplasmic gate. FEBS Lett. 597 (15), 1957-1976 (2023).
  86. Palmgren, M. P-type ATPases: Many more enigmas left to solve. J Biol Chem. 299 (11), 105352(2023).
  87. Frauenfelder, H. Ask not what physics can do for biology-Ask what biology can do for physics. Phys Biol. 11 (5), 053004(2014).
  88. Frauenfelder, H. The physics of proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, Springer. New York. New York, NY. (2010).
  89. Narhi, L. O. Biophysics for Therapeutic Protein Development. , Springer Science+Business Media. (2013).
  90. East, J. M. Purification of a membrane protein (Ca2+/Mg2+-ATPase) and its reconstitution into lipid vesicles. Methods Mol Biol. 27, 87-94 (1994).
  91. Lee, E. -H., et al. Enhancement of enzyme activity and stability by poly(γ-glutamic acid). Polymer J. 42 (10), 818-822 (2010).
  92. Norrild, R. K., et al. Increasing protein stability by inferring substitution effects from high-throughput experiments. Cell Rep Methods. 2 (11), 100333(2022).
  93. Song, Z., Zhang, Q., Wu, W., Pu, Z., Yu, H. Rational design of enzyme activity and enantioselectivity. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1-14 (2023).
  94. Jidenko, M., Lenoir, G., Fuentes, J. M., le Maire, M., Jaxel, C. Expression in yeast and purification of a membrane protein, SERCA1a, using a biotinylated acceptor domain. Protein Expr Purif. 48 (1), 32-42 (2006).
  95. Hua, S., Ma, H., Lewis, D., Inesi, G., Toyoshima, C. Functional role of "N" (nucleotide) and "P" (phosphorylation) domain interactions in the sarcoplasmic reticulum (SERCA) ATPase. Biochemistry. 41 (7), 2264-2272 (2002).
  96. Pang, Y. -H., Chen, J. -W. Anisodamine causes the changes of structure and function in the transmembrane domain of the Ca2+-ATPase from sarcoplasmic reticulum. Biosci Biotechnol Biochem. 68 (1), 126-131 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oczyszczanie SERCAsiateczka sarkoplazmatycznastabilizacja trehaloząATPazy typu Poczyszczanie białek błonowychanaliza SDS-PAGEdichroizm kołowypomiar aktywności ATPazyznakowanie FITC
Oczyszczanie siateczki sarko-endoplazmatycznej Ca2+-ATPazy z mięśni królika
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.