Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja i oczyszczanie tkanek Przygotowanie próbek mysiego rdzenia kręgowego

DOI:

10.3791/67749

⸱

11 kwietnia 2025

 ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine, 2Key Laboratory of Anesthesiology, (Shanghai Jiaotong University), Ministry of Education, 3Department of Anesthesiology, Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University, School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia protokół ekstrakcji i przygotowania oczyszczonych próbek całego mózgu i rdzenia kręgowego z zachowanymi sygnałami fluorescencyjnymi, zwiększając wydajność eksperymentu i integralność danych w celu przyspieszenia badań neurobiologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania neurobiologiczne skoncentrowane na centralnym układzie nerwowym wymagają dogłębnego zrozumienia różnych czynników, w tym rozmieszczenia komórek, połączeń neuronalnych i dynamiki molekularnej. Tradycyjne metodologie badania całego mózgu i rdzenia kręgowego często obejmują izolację, cięcie i skanowanie wycinków tkanki, a następnie pracochłonny proces trójwymiarowej rekonstrukcji obrazu. To konwencjonalne podejście może być zarówno czasochłonne, jak i kłopotliwe. Postępy w technikach oczyszczania tkanek i obrazowania całych narządów zrewolucjonizowały analizę całego mózgu i rdzenia kręgowego. Aby zmaksymalizować potencjał tych innowacyjnych metod, konieczne jest pobranie i usunięcie próbek mózgu przy jednoczesnym zachowaniu ich połączenia z rdzeniem kręgowym. Protokół ten zawiera szczegółowy i systematyczny przewodnik dotyczący przygotowywania próbek mózgu połączonego z rdzeniem kręgowym, przedstawiający procedury ekstrakcji i oczyszczania. Usprawniając te procesy, podejście to znacznie zwiększa wydajność eksperymentów i integralność danych, wspierając w ten sposób postęp w badaniach neurobiologicznych i umożliwiając bardziej kompleksowe badania złożoności ośrodkowego układu nerwowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dokładne mapowanie i analiza rozmieszczenia nerwów dostarczają cennych informacji na temat strukturalnej i funkcjonalnej organizacji ośrodkowego układu nerwowego, torując drogę dla innowacyjnych strategii terapeutycznych i zwiększając nasze ogólne zrozumienie mechanizmów neuronalnych. Obecnie brakuje kompleksowych samouczków wideo, które pomogłyby naukowcom w przygotowaniu i ekstrakcji próbek mózgu połączonych z rdzeniem kręgowym oraz osiągnięciu pomyślnego oczyszczenia tkanek.

Dostępnych jest kilka metod oczyszczania tkanek: hydrofobowe, hydrofilowe, oparte na hydrożelu i metody oczyszczania rozszerzania tkanek1,2,3. Technika oczyszczania tkanek jest szeroko stosowana w badaniu narządów, takich jak śledziona4, lungs5, mięsień brzuchaty łydki6, brain7, rdzeń kręgowy8 i nerki9. Nasz protokół dostarczy szczegółowych instrukcji, jak przygotować próbki całego mózgu połączone z rdzeniem kręgowym, które zostały oznaczone markerem fluorescencyjnym przy użyciu myszy szczepu STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Będzie zawierał wskazówki krok po kroku dotyczące ekstrakcji próbki i opisze protokół oczyszczania przy użyciu zestawów hydrofilowych do oczyszczania tkanek. Protokół ten pomaga naukowcom opanować cały proces, od pobrania próbki rdzenia mózgowo-rdzeniowego po przygotowanie, a następnie skanowanie. To nie tylko zwiększy wydajność eksperymentów, ale także zapewni integralność i jakość próbek, dostarczając dokładniejszych i bardziej wiarygodnych danych wspierających badania neurobiologiczne.

W porównaniu z konwencjonalnymi metodami cięcia, obrazowania i rekonstrukcji trójwymiarowej10,11, przedstawione tutaj podejście oferuje kilka kluczowych zalet, takich jak (1) zwiększona integralność strukturalna: poprzez zachowanie struktury całego narządu, metoda ta zmniejsza ryzyko utraty krytycznych informacji, które mogą wystąpić podczas sekcji12; (2) Kompleksowe pozyskiwanie danych: zastosowanie zestawu do oczyszczania tkanek pozwala na szczegółowe mapowanie komórek, które są trudne do osiągnięcia przy użyciu tradycyjnych technik; (3) Wydajność i dokładność: Protokół usprawnia cały proces od ekstrakcji próbki do obrazowania, skracając czas wymagany przez procedury immunohistochemiczne lub barwienia oraz minimalizując błędy związane z cięciem i montażem13.

Protokół pokonuje ograniczenia tradycyjnych metod podziału, które często skutkują niekompletnymi i fragmentarycznymi danymi. Zachowując nienaruszone połączenie mózg-rdzeń kręgowy i wykorzystując nowoczesne metody oczyszczania tkanek, protokół ten zapewnia bardziej holistyczne spojrzenie na ośrodkowy układ nerwowy, co ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia złożonych mechanizmów i funkcji neuronalnych. Podstawowym celem tej metody jest umożliwienie kompleksowego obrazowania ośrodkowego układu nerwowego poprzez przygotowanie próbek całego mózgu połączonych z rdzeniem kręgowym, które zostały znakowane fluorescencyjnymi markerami neuronalnymi. Protokół ten ma na celu ułatwienie szczegółowej wizualizacji struktur nerwowych i rozmieszczenia komórek przy użyciu zaawansowanych metod anatomicznych i technik oczyszczania tkanek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) oraz National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Niniejsze badanie zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Szpitala Renji, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. W tym przypadku do niniejszego badania wykorzystano 7-8 tygodniowe samce myszy szczepu STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J (pochodzenie C57BL/6J x CBA). Zwierzęta zostały pozyskane w celach handlowych (patrz tabela materiałów) i trzymane w standardowych klatkach (22 °C ± 2 °C, 12 godzin/12 godzin cykl światła/ciemności, pożywienie i woda ad libitum).

1. Perfuzja

  1. Głęboko znieczulić dorosłe myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia pentobarbitalu sodu (0,5% rozpuszczonego w sterylnej wodzie destylowanej, 50 mg/kg, i.p, patrz tabela materiałów) podawanego we wstrzyknięciu dootrzewnowym za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Sprawdź głębokość znieczulenia za pomocą reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
  2. Przymocuj kończyny myszy do białej akrylowej tablicy za pomocą stalowych zacisków. Przetnij skórę między dwiema kośćmi udowymi myszy i kontynuuj cięcie w górę, aż dojdziesz do przepony. Otwórz obie strony klatki piersiowej przez przeponę, aby odsłonić serce za pomocą nożyczek i prostych kleszczy.
  3. Wprowadzić igłę infuzyjną 0,7 mm do lewej komory. Wykonaj nacięcie 1-2 mm w prawym uszku przedsionka.
  4. Wykonać perfuzję z 1x PBS zawierającą 10 U/ml heparyny sodowej z szybkością 10 ml / min za pomocą pompy perystaltycznej (patrz tabela materiałów) w celu całkowitego oczyszczenia krwi. Całkowite zblednięcie wątroby wskazuje na pomyślne usunięcie odpadów.
  5. Ukrwić 50 ml wstępnie schłodzonego 4% PFA za pomocą pompy perystaltycznej z szybkością 10 ml/min. Monitorować objawy, takie jak zwijanie ogona myszy i drganie mięśni.
    UWAGA: Nieudana perfuzja może wpłynąć na kolejne procesy oczyszczania. Objawy te (zwijanie ogona myszy i drganie mięśni) wskazują na normalną perfuzję i nie wskazują na przytomność lub niewystarczające znieczulenie.

2. Pobieranie próbek

  1. Ostrożnie wypreparuj cały mózg i rdzeń kręgowy za pomocą nożyczek i kleszczy, aby uniknąć uszkodzenia próbki.
  2. Oddziel skórę na grzbiecie i głowie myszy za pomocą nożyczek okulistycznych. Przeciąć kręgosłup w miejscu, w którym linia łącząca górne tylne krawędzie obu kończyn przecina się z kręgosłupem.
  3. Usuń tkankę mięśniową i tłuszczową z szyi i grzbietu myszy, aby odsłonić kręgosłup i czaszkę. Wytnij wzdłuż szczeliny linii środkowej między lewą i prawą stroną kręgosłupa i rdzenia kręgowego od dolnego końca kanału kręgowego za pomocą nożyczek do żyły.
  4. Usuń górną część i obustronne strony odciętego kręgosłupa, aby odsłonić rdzeń kręgowy. Powtarzaj kroki, aż dotrzesz do połączenia mózgowego.
  5. Umieść końcówkę jednego ostrza nożyczek wenus między otworem wielkim a mózgiem. Przesuń i przetnij wzdłuż szwu środkowego strzałkowego, aby otworzyć czaszkę. Użyj kleszczy, aby usunąć czaszkę i odsłonić mózg.
  6. Usuń tkankę rdzenia kręgowego mózgu myszy z końca czaszki za pomocą kleszczy i nożyczek do wenus.
    UWAGA: Przecięcia lub uszkodzenia powierzchni mogą ulec nasileniu podczas późniejszego oczyszczania, potencjalnie powodując nieprzewidywalne uszkodzenie próbki. Z próbkami należy obchodzić się ostrożnie.
  7. Użyj kleszczy preparacyjnych, aby usunąć błonę rdzenia kręgowego pod mikroskopem stereoskopowym.
  8. Przymocuj próbkę rdzenia mózgowo-rdzeniowego do płytki mocującej (patrz Tabela materiałów) za pomocą szwów. Dodać co najmniej 20-krotność objętości próbki wynoszącej 4% PFA i umieścić ją na wytrząsarce w temperaturze 4 °C w celu powolnego mieszania. Fix na noc na 16-24 h.
    UWAGA: Nadmierna fiksacja prowadzi do nadmiernego sieciowania białek, zmniejszając skuteczność oczyszczania14. Niewystarczające lub opóźnione utrwalenie może powodować degradację antygenu i zniszczenie morfologii tkanki.
  9. Wyrzucić PFA i przemyć próbkę 3x 1x PBS. Upewnij się, że objętość PBS jest co najmniej 10-krotnie większa od objętości próbki, całkowicie zanurzając próbkę. Każde mycie trwa 2 godziny z mieszaniem na wytrząsarce z prędkością nie mniejszą niż 60 obr./min w celu dokładnego usunięcia resztek PFA.

3. Oczyszczanie tkanek

UWAGA: Tutaj używany jest zestaw do oczyszczania tkanek (zobacz Tabelę Materiałów).

  1. Przygotować roztwór do usuwania lipidów, mieszając roztwór A i roztwór B w stosunku masowym 9:1,
    UWAGA: Zaleca się, aby objętość roztworu do usuwania lipidów była większa niż 20 razy większa od objętości próbki.
  2. Umieść utrwaloną tkankę w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml i dodaj 50 ml roztworu do usuwania lipidów. Umieścić probówkę wirówkową w wytrząsarce w temperaturze 37 °C, delikatnie wstrząsając z prędkością 60 obr./min w celu usunięcia lipidów. Zmieniaj roztwór do usuwania lipidów codziennie przez 3-5 dni. Aby określić zakończenie, umieść probówkę wirówkową na kasecie świetlnym z linią skali. Jeśli linia podziałki jest wyraźnie widoczna i niezniekształcona w próbce, proces jest zakończony.
  3. Umieścić próbkę w 20 ml roztworu C na wytrząsarce w temperaturze 25 °C, wstrząsając z prędkością mniejszą niż 60 obr./min w celu dopasowania współczynnika załamania światła. Zmień roztwór C po 24 godzinach. Umieścić naczynie hodowlane z próbką całkowicie zanurzoną w roztworze C na kasecie świetlnym z linią podziałki. Jeśli podziałka jest wyraźnie widoczna i niezniekształcona w próbce, proces dopasowywania jest zakończony.
    UWAGA: W przypadku tkanek dorosłych myszy dopasowanie współczynnika załamania światła zwykle kończy się w ciągu 2 dni.

4. Osadzanie tkanek

  1. Przygotować roztwór żelu ze 147 g roztworu C w szklanej butelce o pojemności 200 ml, dodać 3,0 g agarozy, dobrze wymieszać przez wirowanie, a następnie podgrzać w kuchence mikrofalowej do wrzenia i natychmiast wyłączyć kuchenkę mikrofalową. Przenieść probówkę wirówkową do inkubatora o temperaturze 37 °C, aż agaroza się rozpuści.
    UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeżego roztworu żelu w razie potrzeby.
  2. Oczyszczoną próbkę należy zatopić w formie warstwą roztworu żelu o temperaturze 37 °C o głębokości 2 mm i schłodzić w lodówce o temperaturze 4 °C przez 30 minut, aż do jej częściowego zestalenia. Umieść próbkę o dopasowanym współczynniku załamania światła w formie i dodaj roztwór żelu, aby był równy lub nieco poniżej górnej części próbki.
  3. Umieść formę z powrotem w lodówce o temperaturze 4 °C na 2 godziny. Dodaj roztwór żelu, aż zrówna się z powierzchnią formy. Przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Przyspieszyć krzepnięcie w lodówce o temperaturze 4 °C przez 2 godziny. Osadzoną próbkę należy przechowywać przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C. Kontynuuj obrazowanie tak szybko, jak to możliwe.

5. Skanowanie

  1. Usuń szkiełko nakrywkowe pęsetą i wyjmij osadzoną próbkę. Umieść próbkę w probówce o pojemności 50 ml i dodaj 30 ml roztworu do obrazowania, aby całkowicie zanurzyć próbkę.
  2. Nałożyć klej 502, aby mocno przymocować próbkę do uchwytu próbki. Zamocuj uchwyt na urządzeniu do przetwarzania obrazu.
  3. Uruchom oprogramowanie do skanowania zgodnie z opisem. Wybierz poziom powiększenia 4x w sekcji powiększenia. Kliknij przycisk Kalibracja, aby aktywować tryb kalibracji.
  4. Kliknij przycisk Podgląd, aby przejść do trybu podglądu. Kliknij przycisk ruchu w kierunku Z, aby powoli przesuwać próbkę w górę od dna komory próbki, aż wygenerowany arkusz świetlny przejdzie przez próbkę.
  5. Wybierz odpowiedni kanał laserowy i opcję trybu oświetlenia. Wybierz kierunek ścieżki skanowania dla próbki. Kliknij przycisk Auto Scan (Automatyczne skanowanie), aby rozpocząć przechwytywanie próbki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół skutecznie izoluje cały mózg połączony z rdzeniem kręgowym u samców myszy szczepu STOCK Tg (Thy1-EGFP) MJrs/J. Sprawia również, że próbki są przezroczyste, zapewniając, że sygnały fluorescencyjne są w pełni zachowane i przechwycone, zapewniając wyraźne i szczegółowe obrazy, które zachowują integralność oryginalnej fluorescencji.

Rysunek 1 przedstawia nienaruszony rdzeń mózgowo-rdzeniowy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proponowany protokół eksperymentalny polega na wykorzystaniu myszy, których mózgi są połączone z rdzeniem kręgowym znakowanym fluorescencyjnymi wirusami śledzenia neuronów. Protokół ten zawiera wyczerpujące i szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania próbek całego mózgu, które pozostają połączone z rdzeniem kręgowym. Protokół skrupulatnie opisuje każdy krok, zapewniając, że badacze mogą odtworzyć proces z precyzją.

Kilka kluczowych etapów tego protokołu przyczynia się do poprawy jakości o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (grant nr 82101249 i nr 82471204 dla XY Sun). Chińska Fundacja Badań Podoktoranckich (grant nr 2022M722125 dla XY Sun).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 1 mlShandong Weigao Group Medical Polymer
502 klejinsulinowa Deli Group
BDBecton,Dickinson i  Firma328421
Ząbkowane kleszcze preparacyjne z zębamiJinzhongJD1050
Okrągły stalowy zaciskWeili
Drobne nożyczkiJinzhongy00030
Kleszcze hemostatyczne zgięte z zębemJinzhongJ31020
Kleszcze hemostatyczne proste z zębemJinzhongJ31010
Igła infuzyjna 0,7 mmKindly Group
Linia wagi do kasetonów świetlnychNuohai Life ScienceNH210901
Kleszcze proste do mikrodysekcjiJinzhongWA3020
NobeliumSoftwareNuohaiLife Science Oprogramowanie
paraformaldehyduBiosharpBL539A
Pompy perystaltyczneNuohai Life ScienceNH1000
Głowica pomp perystaltycznychNuohai Life ScienceNH-15
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiServicebioG4202
Heparyna sodowaShanghai PharmaH31022051
STOCK Tg (Thy1-EGFP) Myszy szczepu MJrs/JLaboratorium Jacksona 007788
Kleszcze preparacyjne z prostymi zębamiJinzhongJD1060
Zestaw do oczyszczania tkanek (hirofilny)Nuohai Life ScienceNH-CR-210701
Zabieg do hodowli tkankowych 100mm x 20mmNEST704001
Nożyczki do tkanekJinzhongJ21040
Pentobarbital soduSigma-AldrichP3761
Nożyczki VenusJinzhongYBC010
Strzykawka do skanowania

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ueda, H. R., et al. Tissue clearing and its applications in neuroscience. Nat Rev Neurosci. 21 (2), 61-79 (2020).
  2. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annu Rev Cell Dev Biol. 32, 713-741 (2016).
  3. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: Toward organism-level systems biology in mammals. Cell Chem Biol. 23 (1), 137-157 (2016).
  4. Wu, M., et al. Innervation of nociceptor neurons in the spleen promotes germinal center responses and humoral immunity. Cell. 187 (12), 2935-2951.e19 (2024).
  5. Liu, T., et al. Local sympathetic innervations modulate the lung innate immune responses. Sci Adv. 6 (20), eaay1497(2020).
  6. Qi, Y., et al. FDISCO: Advanced solvent-based clearing method for imaging whole organs. Sci Adv. 5 (1), eaau8355(2019).
  7. Bagnoli, S., Terzibasi Tozzini, E., Cellerino, A. Whole-Brain clearing and immunofluorescence in Nothobranchius furzeri. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (9), 698-704 (2023).
  8. Lu, T., Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. 3D imaging of supraspinal inputs to the thoracic and lumbar spinal cord mapped by retrograde tracing and light-sheet microscopy. J Neurochem. 162 (4), 352-370 (2022).
  9. Saritas, T., Puelles, V. G., Su, X. T., Ellison, D. H., Kramann, R. Optical clearing and imaging of immunolabeled kidney tissue. J Vis Exp. (149), e60002(2019).
  10. Song, J. H., et al. Precise mapping of single neurons by calibrated 3D reconstruction of brain slices reveals topographic projection in mouse visual cortex. Cell Rep. 31 (8), 107682(2020).
  11. Fournel, R., Veruki, M. L., Hartveit, E. Digital reconstruction and quantitative morphometric analysis of bipolar cells in live rat retinal slices. J Comp Neurol. 530 (10), 1700-1728 (2022).
  12. Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
  13. Peng, Y. C., et al. Rapid histological assessment of prostate specimens in the three-dimensional space by hydrophilic tissue clearing and confocal microscopy. J Histochem Cytochem. 70 (8), 597-608 (2022).
  14. Singhal, P., et al. Evaluation of histomorphometric changes in tissue architecture in relation to alteration in fixation protocol - An in vitro study. J Clin Diagn Res. 10 (8), ZC28-ZC32 (2016).
  15. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  16. Lee, S. H., Son, H. J. Second wave, late-stage neuroinflammation in cleared brains of aged 5xFAD Alzheimer's mice detected by macrolaser light sheet microscopy imaging. Int J Mol Sci. 24 (23), 242317058(2023).
  17. Zhao, J., Lai, H. M., Qi, Y., He, D., Sun, H. Current status of tissue clearing and the path forward in neuroscience. ACS Chem Neurosci. 12 (1), 5-29 (2021).
  18. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385 (6713), eadm6869(2024).
  19. Ou, Z., et al. Achieving optical transparency in live animals with absorbing molecules. Science. 385, eadm6869(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tissue ClearingBrain Spinal CordMouse Brain ExtractionCentral Nervous SystemWhole Organ ImagingFluorescent ImagingNeural Structure VisualizationParaformaldehyde FixationLipid RemovalLight Sheet Microscopy

Powiązane artykuły