Artykuł metodologiczny

Strategia podwójnej interferencji CRISPR do celowania w syntetyczne śmiertelne interakcje między niekodującymi RNA w komórkach nowotworowych

DOI:

10.3791/67752

⸱

30 maja 2025

 ,  ,  , 
1Chemical Genomics Centre of the Max Planck Society, 2Max Planck Institute of Molecular Physiology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia podwójny system CRISPRi ukierunkowany na długie, niekodujące RNA w komórkach czerniaka. Umożliwia kombinatoryczne knockdown genów i syntetyczne badania przesiewowe ze skutkiem śmiertelnym, identyfikując interakcje lncRNA specyficzne dla raka dla potencjalnych strategii terapeutycznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Długie niekodujące RNA (lncRNA) reprezentują rozległą i funkcjonalnie zróżnicowaną klasę cząsteczek RNA, z ponad 100 000 przewidywanymi w ludzkim genomie. Chociaż lncRNA są mniej konserwatywne u różnych gatunków w porównaniu z genami kodującymi białka, odgrywają kluczową rolę w regulacji genów, interakcjach chromatyny i progresji raka. Ich udział w leczeniu nowotworów sprawia, że są obiecującymi celami terapeutycznymi. Interferencja CRISPR (CRISPRi), wykorzystująca katalitycznie nieaktywny Cas9 połączony z represorem transkrypcji, takim jak KRAB-MeCP2, oferuje precyzyjną metodę celowania w jądrowe lncRNA i oceny ich funkcji. Badanie to wprowadza podwójny system CRISPRi wykorzystujący ortogonalne technologie CRISPRi ze Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes oparte na dCas9-KRAB-MeCP2, zoptymalizowane pod kątem kombinatorycznego celowania lncRNA w ludzkich komórkach czerniaka. Protokół ułatwia kombinatoryczne knockdown genów lub syntetyczne letalne badania przesiewowe par lncRNA, zapewniając nowatorskie narzędzie do badań nad rakiem. Badając syntetyczną letalność między lncRNA, podejście to może pomóc w identyfikacji interakcji lncRNA krytycznych dla przeżycia komórek nowotworowych, oferując nowe strategie terapeutyczne. Zademonstrowano funkcjonalność systemu dualnego, podkreślając jego potencjał w identyfikowaniu krytycznych interakcji lncRNA specyficznych dla nowotworu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż mniej niż 3% ludzkiego genomu koduje białka, około 80% genomu jest transkrybowane1,2. Wśród niekodujących jednostek transkrypcyjnych dziesiątki tysięcy klasyfikuje się jako długie niekodujące RNA (lncRNA) przekraczające 200 nukleotydów, a łączną liczbę ludzkich lncRNA szacuje się na ponad 100 0003,4. W przeciwieństwie do genów kodujących, lncRNA są mniej konserwatywne u różnych gatunków. Biorąc pod uwagę, że ludzie dzielą 99% swojego genomu z naczelnymi, takimi jak szympansy, przypuszcza się, że lncRNA mają znacznie większy wpływ na ewolucję fenotypową5,6. Odkrycia te wskazują na ważne funkcje komórkowe lncRNA. Chociaż regulacja lncRNA i ich interakcje z białkami wiążącymi RNA i innymi RNA pozostają nie w pełni poznane, a wiele lncRNA nie zostało jeszcze w pełni opisanych, jasne jest, że lncRNA wykazują specyficzne dla komórek i tkanek wzorce ekspresji w zdrowiu i chorobie, takie jak rak7,8,9,10. Są one zaangażowane w różne funkcje, w tym regulację transkrypcji genów, udział w interakcjach chromatyny11, przetwarzanie RNA12, stabilizacja RNA13 oraz regulacja translacji14.

W nowotworach, bardzo zróżnicowane komórkowe lncRNA wpływają na rozwój guza i przerzuty poprzez regulację ekspresji genów, podkreślając ich potencjał jako cennych celów terapeutycznych15. Poza wykrywaniem lncRNA jako biomarkerów w próbkach nowotworowych16, celowanie w lncRNA specyficzne dla nowotworu w celu zakłócenia ich dalszych funkcji ma znaczący potencjał zarówno w zastosowaniach klinicznych, jak i badaniach podstawowych. Podejścia oparte na RNA do wyjaśnienia ról lncRNA obejmują oligonukleotydy antysensowne (ASO), krótkie RNA spinki do włosów i małe interferujące RNA (siRNA)17,18. Podczas gdy siRNA jest powszechnie wykorzystywane do badań przesiewowych wyciszania genów, knockdown oparty na siRNA jest ograniczony do cytoplasm19. Jednak lncRNA często działa w jądrze.

Alternatywnie, interferencja CRISPRi (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) może być wykorzystana do hamowania lncRNA w ludzkich nowotworach20. Co więcej, badania przesiewowe CRISPRi obejmujące cały genom można łatwo zaprogramować i ukierunkować na szeroki zakres genów kodujących i niekodujących w celu zbadania ich funkcjonalnego wpływu21,22. W CRISPRi katalityczny niedobór Cas9 (dCas9) jest łączony z domeną represora transkrypcji, taką jak domena pola powiązanego z Krüppelem (KRAB) class<="xref">23. Represja genów przez dCas9-KRAB jest kierowana przez przewodnik RNA (gRNA) do obszaru zainteresowania. CRISPRi kontroluje geny na poziomie DNA, co prowadzi do wyższej wydajności i pożądanych fenotypów funkcji utraty w przeciwieństwie do interferencji RNA, która jest aktywna na poziomie posttranskrypcyjnym24. W odpowiedzi na ograniczoną skuteczność KRAB w wyciszaniu celów, wprowadzono fuzję KRAB i MeCP2 z dCas9 jako bardziej efektywną strategię tłumienia25.

Chociaż wyciszanie pojedynczego genu może wpływać na żywotność raka, syntetyczne podwójne lub wielokrotne śmiertelne interakcje mogą uratować komórki rakowe przed śmiercią komórki26. Syntetyczna śmiertelność obejmuje dwa lub więcej genów, z których każdy może kompensować funkcję drugiego. Aby przezwyciężyć problemy z ekranami knockdown pojedynczego genu, obiecujące podejście oferują podwójne strategie CRISPR ukierunkowane na śmiertelne pary genów kodujących białka27.

Tutaj prezentujemy protokół kombinatorycznego wykorzystania ortogonalnego kierowania opartego na CRISPRi lncRNA lub innych niekodujących par RNA za pomocą Staphylococcus aureus i Streptococcus pyogenes dCas9 połączonych z KRAB-MeCP2 w ludzkich komórkach czerniaka (zobacz Rysunek 1). Protokół może być wykorzystany do kombinatorycznego klasycznego knockdownu CRISPR lub jako oparte na CRISPRi badania przesiewowe syntetycznych par letalnych w raku. Zastosowanie dwóch różnych gatunków dCas9, SpCas9 i SaCas9, w podejściu CRISPRi pozwala na niezależne ukierunkowanie odrębnych loci genomowych przy minimalnej reaktywności krzyżowej, zwiększając specyficzność i elastyczność przy jednoczesnym zapewnieniu wysokiej selektywności w stosunku do celu. Wykorzystywane są różne motywy sąsiadujące z protospacerem (PAM): NGG dla SpCas9 i NNGRRT dla SaCas9. Podwójny system dCas9 rozwiązuje takie wyzwania, jak ograniczona kompatybilność z sgRNA, umożliwiając precyzyjną, jednoczesną modulację i zmniejszając konkurencję między złożonymi sgRNA-RNP przy użyciu jednego typu dCas9. Ta innowacja zwiększa solidność i wszechstronność badań przesiewowych w podwójnej bibliotece sgRNA. Podsumowując, dostarczamy w pełni funkcjonalny podwójny system CRISPRi w komórkach czerniaka jako model raka.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Schemat podwójnego systemu CRISPRi do zwalczania syntetycznych śmiertelnych oddziaływań niekodujących RNA. (A) Procedura klonowania podwójnego wektora gRNA. (B) Komórki HEK293 transfekowano plazmidem otoczkowym VSV-G, pakując plazmid PAX2 i wektor transferowy w celu wytworzenia lentiwirusów do późniejszej transdukcji do komórek 501-mel. Lentiwirusy zawierające informację genetyczną dla SpdCas9-KRAB-MeCP2 (niebieski) i SadCas9-KRAB-MeCP2 (czerwony) zostały zintegrowane z komórkami 501-mel jednocześnie. Po doborze antybiotyków przeprowadzono drugą transdukcję lentiwirusową w celu zintegrowania pożądanych podwójnych gRNA (kolor oliwkowy). (C) Komórki 501-mel wykazujące ekspresję wariantów dCas9 oddziałują z odpowiadającymi im gRNA, aby wyciszyć ekspresję genu docelowego, powodując śmierć komórki rakowej. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzka linia komórkowa czerniaka 501-mel (RRID: CVCL_4633) została dzięki uprzejmości Laboratorium Aifantis (Uniwersytet Nowojorski). Linia komórkowa Lenti-X 293T HEK została zakupiona od Takara Bio. Te linie komórkowe hodowano w zmodyfikowanej pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco o wysokiej zawartości glukozy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 w sterylnych warunkach. Komórki były pasażowane, aż osiągnęły 80%-90% konfluencji. Linie komórkowe były regularnie badane pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą.

1. Projektowanie gRNA za pomocą internetowej platformy do projektowania gRNA

  1. Zaprojektuj jedno gRNA specyficzne dla SpCas9 i jedno gRNA specyficzne dla SaCas9 dla każdego docelowego lncRNA, aby ocenić, który wariant daje lepsze wyniki knockdownu.
  2. Celuj w pożądane lncRNA, tutaj RP11-120D5.1 (RP11) i XLOC_030781 (XLOC), używając najbardziej wydajnego gRNA dla każdego S. pyogenes (gRNA-sp) Cas9 i S. aureus (gRNA-sa) Cas9.
    UWAGA: GRNA S. pyogenes można wyekstrahować z Petroulia et al.28.
  3. Postępuj zgodnie z zaleceniami specyficznymi dla lokalizacji, aby nadać priorytet najwyższej aktywności na celu, wyrażonej przez wysokie wyniki w zakresie celu, jednocześnie minimalizując dopasowania poza celem, zgodnie z sugestiami narzędzi do projektowania gRNA.
    1. Wybierz genom GRCh38 (hg, Homo sapiens). Wybierz lokację PAM dla określonego SpCas9 (NGG) i SaCas9 (NNGRRT).
    2. Użyj metody punktacji off-target od Hsu et al.29. Umieść gRNA w oknie od -150 pz do +50 pz wokół miejsca rozpoczęcia transkrypcji, aby uzyskać optymalną wydajność.
    3. Wybierz gRNA z najwyższym wynikiem on-target i off-target (patrz Tabela uzupełniająca 1).
  4. Połącz niecelujące lub zaszyfrowane kontrolne gRNA, tutaj przeciwko Rosa26, z każdym docelowym gRNA, aby utworzyć podwójny wektor gRNA, ukierunkowany na jeden lncRNA. Połączenie docelowych gRNA w jednym plazmidzie umożliwia specyficzną dla miejsca modyfikację obu miejsc docelowych.
    UWAGA: Podwójny wektor gRNA zawierający kontrolne gRNA i docelowe gRNA umożliwia knockdown jednego docelowego lncRNA, podczas gdy podwójne wektory gRNA zawierające gRNA skierowane do miejsc umożliwiają jednoczesne knockdown docelowych lncRNA.

2. klonowanie gRNA

  1. Wykonaj PCR z rozszerzeniem nakładania się przy użyciu dwóch fragmentów DNA zawierających sekwencję gRNA. Użyj startera do przodu U6 i startera wstecznego H1 (patrz Tabela Uzupełniająca 2) do amplifikacji, zgodnie z opisem Najm et al.27.
    1. Przygotuj 50 μl reakcji PCR z 25 μl 2x wysokiej jakości mieszanki wzorcowej PCR z buforem HF i 1 μl każdego fragmentu DNA zawierającego gRNA S. pyogenes lub S. aureus. Reakcję należy przeprowadzić w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 98 °C przez 30 s, następnie 15 cykli denaturacji w temperaturze 98 °C przez 5 s, wyżarzanie w temperaturze 55 °C przez 10 s i wydłużenie w temperaturze 72 °C przez 15 s.
    2. Dodać 2,5 μl startera U6 i 2,5 μl startera odwrotnego H1 po zakończeniu początkowych 15 cykli i poddać reakcję dodatkowym 20 cyklom w tych samych warunkach, z końcowym przedłużeniem przez 5 minut w temperaturze 72 °C.
    3. Oczyść produkty PCR za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Trawić 1 μg zmodyfikowanego plazmidu przy użyciu 1 μl enzymu restrykcyjnego BsmB1 i 1 μl 10x buforu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w reakcji 10 μl.
    5. Sklonuj produkty PCR do strawionego plazmidu dual-gRNA-Zeo-GFP (patrz rysunek uzupełniający 1 i plik uzupełniający 1) przy użyciu protokołu reakcji składania DNA HiFi, jak opisano w innych30.
    6. Przekształć chemicznie kompetentne komórki E. coli, mieszając 50 μl kultury bakterii z 4 μl produktu montażowego zgodnie z instrukcjami producenta.

3. Produkcja lentiwirusa

UWAGA: Z aktywnymi lentiwirusami należy radzić sobie na wszystkich etapach, przestrzegając odpowiednich wytycznych bezpieczeństwa. Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2, aby zapobiec zagrożeniom związanym z nieuniknionym tworzeniem się aerozoli. Wszystkie prace poza szafą bezpieczeństwa, takie jak wirowanie, należy wykonywać w szczelnych pojemnikach aerozolowych i wirnikach zatwierdzonych do stosowania z organizmami grupy ryzyka 2. Przez cały czas przebywania w miejscu pracy należy nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice jednorazowe i okulary ochronne. Powierzchnie robocze muszą być potraktowane roztworem dezynfekującym, a inne odpady muszą być również potraktowane roztworem dezynfekującym, aby mogły pozostać w szczelnie zamkniętej szafce w świetle UV przez co najmniej 240 minut. Zużyte pipety serologiczne i końcówki do pipet należy przepłukać w roztworze dezynfekującym przed wyrzuceniem do butelek nadających się do sterylizacji w autoklawie. Następnie odpady należy wyrzucić do pojemnika na odpady S2. Odpady S2 zostaną dezaktywowane w autoklawie. Transdukowane linie komórkowe mogą być przetwarzane w warunkach S1 nie wcześniej niż 2 dni po transdukcji i tylko po co najmniej dwóch pełnych zmianach pożywki hodowlanej na pożywkę wolną od wirusa.

  1. Policz komórki Lenti-X 293T HEK mieszając 10 μl komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w hemocytometrze. Płytka 4 x 106 komórek Lenti-X 293T HEK na płytkę 10 cm, aby osiągnąć ~80% zbieżności następnego dnia.
  2. Pracuj w laboratorium klasy 2 od tego kroku. Zmieszać 500 μl odpowiedniego podłoża transfekcyjnego z wektorem transferowym 11,25 μg SpdCas9-KRAB-MeCP2 (patrz plik uzupełniający 2), plazmidem otoczkowym VSV-G o masie 5,5 μg i wektorem pPAX2 o grubości 16,5 μg. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Dla drugiego wariantu dCas9 należy użyć wektora transferu SadCas9-KRAB-MeCP2 (patrz plik uzupełniający 3).
  3. W osobnej probówce zmieszać 500 μl pożywki o obniżonej surowicy z 36 μl odczynnika PEI (podstawówka: 1 mg/ml). Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Połącz mieszaniny i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie dodawać mieszaninę kroplami do pożywki komórkowej (6 ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Upewnij się, że komórki pozostają połączone, aby uniknąć zmniejszenia wydajności lentiwirusa.
  5. Po 12-15 godzinach wyrzucić pożywkę do autoklawowalnej butelki na odpady za pomocą pipety serologicznej. Od teraz należy płukać materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu. Dodać 5 ml świeżej pożywki DMEM do transfekowanych komórek za pomocą nowej pipety.
  6. Pobrać lentiwirusy, przenosząc supernatant za pomocą pipety serologicznej do probówki kanonicznej o pojemności 50 ml 48 godzin po transfekcji. Przechowuj probówkę kanoniczną w lodówce. Dodać 5 ml świeżej pożywki do komórek i inkubować komórki przez kolejne 24 godziny.
  7. Powtórzyć pobieranie lentiwirusów, przenosząc supernatant do tej samej probówki kanonicznej o pojemności 50 ml zawierającej pierwszy pobior. Ponownie dodać 5 ml świeżej pożywki, inkubować przez 24 godziny, a następnie przenieść supernatant do probówki kanonicznej o pojemności 50 ml. Połączone supernatanty z pierwszego, drugiego i trzeciego zbioru przechowywać w probówce kanonicznej o pojemności 50 ml w temperaturze 4 °C do czasu filtracji i odwirowania.
  8. Odwirować złożony sklarowany supernatant przez 5 minut w temperaturze 500 x g i temperaturze 4 °C w aerozolowych pojemnikach i wirnikach zatwierdzonych do stosowania z organizmami należącymi do grupy ryzyka 2 do osadzania oderwanych komórek i szczątków. Przefiltrować supernatant przez sterylne filtry strzykawkowe 0,2 μm do hodowli komórek.
  9. Stężyć przefiltrowany supernatant w temperaturze 1 000 x g i temperaturze 4 °C, używając odśrodkowego zespołu filtrującego o odpowiedniej wartości granicznej masy cząsteczkowej od 100 kDa do około 500 μl. Przechowywać porcje wirusa o objętości 50-100 μl w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

4. Transdukcja lentiwirusa i selekcja stabilnych transfekowanych komórek

UWAGA: Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2.

  1. Umieścić komórki 501-mel na płytce 6-dołkowej w proporcji 2 x 105 komórek/basenik z końcową objętością kultury 2 ml, 1 dzień przed transdukcją.
  2. Zastąp pożywkę hodowlaną 2 ml wstępnie podgrzanej pożywki DMEM uzupełnionej polibrenem o końcowym stężeniu 6 μg/ml.
  3. Od teraz wymagana jest praca w laboratorium klasy 2. Dodać jednocześnie do komórek 50 μl lentiwirusów zawierających SpdCas9-KRAB-MeCP2 i SadCas9-KRAB-MeCP2 do komórek. Wypłucz materiały eksploatacyjne, w tym pipety serologiczne i końcówki do pipet, roztworem dezynfekującym przed wyrzuceniem ich do odpadów autoklawu. Delikatnie wstrząsnąć płytką i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
  4. Wylać pożywkę do butelki nadającej się do sterylizacji w autoklawie za pomocą pipety serologicznej i dodać 2 ml świeżej pożywki zawierającej blastycydynę (10 μg/ml) i puromycynę (2 μg/ml) 16 godzin po transdukcji.
  5. Kontynuuj selekcję, zastępując pożywkę świeżą pożywką o pojemności 2 ml zawierającą blasticydynę (10 μg/ml) i puromycynę (2 μg/ml) po 2 dniach. Z transdukowanymi komórkami należy obchodzić się w warunkach S1 po 7 dniach od transdukcji.
    UWAGA: Selekcja antybiotyków musi być przeprowadzana do momentu, gdy wszystkie nietransdukowane komórki kontrolne umrą. Alternatywne strategie selekcji mogą być stosowane w zależności od kasety rezystancyjnej w wektorze przenoszenia. W razie potrzeby zoptymalizuj stężenia antybiotyków za pomocą krzywej zabijania. Szczegółowa selekcja klonów pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej lub seryjnego rozcieńczania i posiewu, a następnie kwantyfikacja białek, może być wymagana w celu uzyskania populacji komórek, które wyrażają fuzje dCas9 na wystarczających poziomach.

5. Kwantyfikacja białek i analiza Western blot

  1. Policz stabilne transfekowane komórki 501-mel, mieszając 10 μl komórek z 10 μl roztworu błękitu trypanowego w hemocytometrze. Odwirować 1 x 106 komórek przez 5 minut w temperaturze 500 x g i 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 1 ml lodowatego PBS.
  2. Powtórzyć wirowanie i ponownie zawiesić osad komórkowy w 50 μl buforu RIPA zawierającego inhibitory proteazy. Inkubować na lodzie przez 15 minut i usuwać resztki komórek przez odwirowywanie w temperaturze 13 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Przechowywać supernatant w temperaturze -20 °C lub natychmiast użyć do ilościowego oznaczania białka, zgodnie z opisem innych31.
  3. Wymieszaj 10 μg białka z 4 x buforem LDS, 50 mM DTT i napełnij do 20 μl wodą destylowaną. Oddziel białka na 10% żelu separacyjnym za pomocą SDS-PAGE na bazie Tris/glicyny pod napięciem 135 V przez 1 godzinę, jak opisano wcześniej32. Przenieś białka do membrany PVDF pod napięciem 90 V przez 90 minut z transferem w mokrym zbiorniku.
  4. Inkubować błonę w buforze blokującym (5% beztłuszczowego mleka w TBS-T) przez 1 godzinę przy 180 obr./min w temperaturze pokojowej.
  5. Dodać mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH w proporcji 1:10 000 do bufora blokującego jako kontrolę wewnętrzną. Dodać pierwszorzędowe przeciwciało anty-Cas9 (S. pyogenes) lub anty-Cas9 (S. aureus) w rozcieńczeniu 1:1000 do buforu blokującego i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając.
  6. Przemyć membranę 3x buforem TBST przez 10 min każdy. Inkubować z drugorzędowym przeciwciałem anty-mysim HRP (1:10 000) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Myć 3x buforem TBST przez 10 min każdy. Wykrywanie sygnałów za pomocą substratu ECL i systemu obrazowania.

6. Test żywotności podwójnej represji LncRNA

UWAGA: Zawsze wykonuj pracę z wirusami w szafie bezpieczeństwa klasy 2.

  1. Nasiona 0,1 x 105 komórek zawierających stabilne transfekowane SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB 7 dni po transdukcji na 96-dołkowej płytce w 100 μl wstępnie podgrzanego podłoża DMEM 1 dzień przed transdukcją.
  2. W dniu transdukcji zastąpić pożywkę hodowlaną 100 μl wstępnie podgrzanej pożywki DMEM uzupełnionej polibrenem o końcowym stężeniu 6 μg/ml. Od teraz wymagana jest praca w laboratorium klasy 2. Dodać odpowiednią ilość lentiwirusów do komórek.
    UWAGA: Objętość lentiwirusów zawierających podwójny wektor gRNA musi być zbadana za pomocą GFP w celu wygenerowania krzywej liniowej poprzez miareczkowanie lentiwirusów.
  3. Zastąp pożywkę świeżą pożywką zawierającą 500 μg/ml zeocyny, 5 μg/ml blasticydyny i 1 μg/ml puromycyny 16 godzin po transdukcji.
  4. Wykonaj detekcję luminescencji 5 dni po transdukcji za pomocą testu żywotności komórek zgodnie z instrukcjami producenta.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kasety ekspresji SadCas9-KRAB-MeCP2 i SpdCas9-KRAB-MeCP2 zostały zintegrowane z komórkami 501-mel jednocześnie za pomocą transdukcji z równą ilością lentiwirusów. Ponieważ ten protokół CRISPRi opiera się na ekspresji wariantów dCas9-KRAB-MeCP2, analiza Western blot jest idealna do potwierdzenia ich obecności na poziomie białka. Po wzbogaceniu dodatnio transfekowanych komórek pobrano próbki do analizy Western blot w celu potwierdzenia obecności ortologów dCas9-KRAB-MeCP2. Po udanej transdukcji oczekuje się, że pojedyncze prążko odpowiadające białku fuzyjnemu SpdCas9-KRAB-MeCP2 (202 kDa) i białku fuzyjnemu SadCas9-KRAB-MeCP2 (170 kDa) zostanie potwierdzone, jak pokazano w Figura 2A, przy użyciu przeciwciał specyficznych dla odpowiednich ortologów Cas9. Jeśli jednak Western blot nie jest wykonalny, qPCR można zastosować do weryfikacji białek fuzyjnych na poziomie mRNA.

Po wygenerowaniu komórek 501-mel stabilnie wyrażających funkcjonalne represory, przeprowadzono drugą transdukcję lentiwirusową przy użyciu podwójnego wektora gRNA. Wcześniej wykazano, że RP11 i XLOC są regulowane w górę w krótkoterminowych hodowlach czerniaka z przerzutami, a indywidualne celowanie w CRISPRi wykazało ich wpływ na proliferację i przeżycie komórek28. W związku z tym wybraliśmy tę parę lncRNA do oceny jako dowód słuszności koncepcji syntetycznej śmiertelnej niekodującej kombinacji RNA, przewidując skumulowany, łatwy do zaobserwowania fenotyp wzrostu w zmodyfikowanych komórkach.

Aby zbadać efekty podwójnego CRISPRi w komórkach nowotworowych za pomocą testów żywotności, oba docelowe lncRNA muszą być skutecznie tłumione. qPCR jest najbardziej odpowiednią metodą do potwierdzenia tej represji poprzez pomiar ich poziomów transkryptów. Oceniliśmy funkcjonalność opracowanego podwójnego protokołu CRISPRi, określając poziomy RNA i badając żywotność komórek podczas celowania w potencjalnie śmiertelną parę RP11 i XLOC. W związku z tym wprowadzono różne gRNA ukierunkowane na RP11 i XLOC w celu obniżenia docelowych poziomów RNA. Represję RNA badano przy użyciu docelowych gRNA dla SadCas9-KRAB-MeCP2 lub SpdCas9-KRAB-MeCP2, testowanych indywidualnie i w połączeniu z kontrolnym gRNA ukierunkowanym na Rosa26 (patrz Figura 2B). Chociaż gRNA skierowane indywidualnie na XLOC lub RP11 skutecznie tłumiły swoje odpowiednie cele, jednoczesne powalenie zarówno XLOC, jak i RP11 osiągnięto tylko za pomocą pary XLOC-sa/RP11-sp.

Ponieważ poziomy RNA XLOC i RP11 zostały skutecznie zredukowane w linii komórkowej 501-mel za pomocą wybranej pary gRNA XLOC-sa/RP11-sp, przeprowadzono test żywotności podwójnej represji lncRNA (patrz Rysunek 2C). Po 5 dniach żywotność komórek wynosiła 81% i 89% kontroli Rosa26, gdy docelowe gRNA były używane indywidualnie. Połączenie RP11-sp i XLOC-sa spowodowało dalszą znaczącą redukcję w porównaniu z samym RP11-sp, przy żywotności komórek na poziomie 59% kontroli Rosa26.

figure-results-1
Rysunek 2: Funkcjonalność systemu podwójnej represji lncRNA. (A) Przeprowadzono analizę Western blot w celu wykrycia wariantów dCas9-KRAB-MeCP2 w zmodyfikowanych komórkach 501-mel przy użyciu przeciwciał anty-Cas9. Jako kontrolę użyto komórek 501-mel typu dzikiego (WT) bez transdukcji (patrz rysunek uzupełniający 3, rysunek uzupełniający 4, rysunek uzupełniający 5, rysunek uzupełniający 6 dla surowego blota). (B) Analiza poziomów RNA RP11 i XLOC w oparciu o qPCR w stosunku do komórek kontrolnych Rosa26 po transdukcji podwójnych gRNA do zmodyfikowanych komórek 501-mel. GAPDH został użyty jako gen sprzątania. Dane są wyrażone jako średnia ± SD. (C) Test żywotności podwójnej represji lncRNA przeprowadzono po zintegrowaniu podwójnych gRNA ze zmodyfikowanymi komórkami 501-mel w trzech niezależnych transdukcjach. Wartości luminescencji znormalizowano do kontroli Rosa26. Wyniki dotyczące żywotności są wyrażone jako średnia (n = 3) ± SEM. Przeprowadzono niesparowany test t. Gwiazdka (*) wskazuje na istotną różnicę przy p < 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Mapa plazmidu. Mapa została stworzona we współpracy z Benchling (https://benchling.com/). Wykorzystane plazmidy w protokole zostały zmodyfikowane z Addgene #96921 i #110824. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Rysunek uzupełniający 2: Analiza Western blot
Wyrażenie dCas9-KRAB. (A) Wyrażenie SadCas9-KRAB w komórkach 501-mel 6 dni po transfekcji. (B) Sekwencyjna transdukcja SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB w komórkach 501-mel doprowadziła do zmniejszenia ekspresji SadCas9-KRAB 3 tygodnie po transfekcji. (C) Jednoczesna transdukcja SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB w komórkach 501-mel spowodowała zmniejszenie ekspresji SadCas9-KRAB 3 tygodnie po transfekcji. (D) Ekspresję SpdCas9-KRAB można zaobserwować po jednoczesnej transdukcji SadCas9-KRAB i SpdCas9-KRAB. LV. Objętość lentiwirusów użytych w μL. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Surowe dane Western blot SaCas9-KRAB. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Surowe dane Western blot SpCas9-KRAB. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: GAPDH_SpCas9-KRAB surowe dane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: GAPDH_SaCas9-KRAB surowe dane. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 1: Wykorzystane sekwencje RNA przewodnika. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca 2: Wykorzystane sekwencje DNA. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Plik FASTA dual-grna-zeo-gfp. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: plik FASTA dSpCas9-krab-mecp2. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plik FASTA dSaCas9-krab-mecp2.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wdrożyliśmy strategię celowania w podwójny lncRNA w komórkach czerniaka przy użyciu CRISPRi na bazie dCas9-KRAB-MeCP2 z dwóch ortogonalnych gatunków. Wykorzystując ten system, udało nam się stłumić syntetyczną śmiertelną parę lncRNA, RP11 i XLOC, co doprowadziło do zwiększonej śmierci komórki, w przeciwieństwie do sytuacji, gdy były one tłumione indywidualnie. Jednak systemy CRISPRi niosą ze sobą ryzyko represji genów poza celem, co może mieć wpływ na interpretację wyników. Chociaż walidacja eksperymentalna nie została przeprowadzona, zminimalizowaliśmy potencjalne efekty poza celem podczas projektowania gRNA in silico.

Zmienność wydajności transdukcji może mieć wpływ na odtwarzalność. W związku z tym zoptymalizowaliśmy transdukcję, stosując równe ilości lentiwirusów, określone za pomocą standardowej kalibracji krzywej przy użyciu różnych stężeń lentiwirusa. Jednak zwiększony rozmiar ładunku nowo zaprojektowanego wektora może nakładać ograniczenia na wydajność pakowania lentiwirusa, potencjalnie zmniejszając wydajność transdukcji, szczególnie w trudnych do transdukcji liniach komórkowych. W rezultacie, osiągnięcie wystarczającej transdukcji i silnej ekspresji dCas9 może w niektórych przypadkach wymagać wysokich mian wirusa. Dodatkowo, niewystarczający knockdown można obejść poprzez częste monitorowanie poziomów białka dCas9-KRAB-MeCP2 i ekspresji RNA docelowych lncRNA. Alternatywnie dostępne są wersje dCas9 z tylko jednym systemem represorów, aby przezwyciężyć to ograniczenie, jednak kosztem zmniejszonej wydajności25.

Tylko kombinacja XLOC-sa-RP11-sp wykazała udaną aktywność, podczas gdy odwrotna konfiguracja XLOC-sp-RP11-sa była nieskuteczna. Prawdopodobnym wyjaśnieniem tej różnicy w skuteczności knockdown jest wzajemne oddziaływanie między swoistością PAM a dostępnością chromatyny33. Biorąc pod uwagę, że SaCas9 i SpCas9 rozpoznają odrębne sekwencje PAM, miejsce docelowe dla SpCas9 w orientacji XLOC-sp-RP11-sa może nie mieć optymalnego PAM, zmniejszając w ten sposób jego powinowactwo wiązania i późniejszą aktywność. Co więcej, przestrzenne rozmieszczenie dwóch wariantów białka fuzyjnego dCas9 może wpływać na architekturę i dostępność chromatyny34,35, potencjalnie ograniczając rekrutację maszynerii transkrypcyjnej lub powiązanych czynników regulacyjnych w konfiguracji XLOC-sp-RP11-sa. Odkrycia te sugerują, że względne umiejscowienie SaCas9 i SpCas9 w danym kontekście genomowym może krytycznie wpłynąć na ich skuteczność funkcjonalną, co uzasadnia dalsze badania nad zoptymalizowanymi strategiami modulacji opartymi na CRISPR.

Opracowany protokół można dostosować do celowania lub badania przesiewowego innych syntetycznych letalnych niekodujących par RNA poprzez modyfikację podwójnego wektora gRNA. Gdy interesująca nas linia komórkowa stabilnie wyraża oba warianty dCas9, możliwe stają się różne podejścia. Podczas gdy RNAi, ASO i shRNA mogą być wykorzystywane do wyciszania genów, CRISPRi oferuje prostszą metodologię badań przesiewowych, a jego połączenie z małymi związkami chemicznymi lub inhibitorami jest również możliwe. Zastępując podwójny wektor gRNA podwójną biblioteką gRNA, protokół ten pozwala na systematyczne badania przesiewowe syntetycznych par letalnych lub innych zależności genetycznych w komórkach nowotworowych, zwiększając w ten sposób precyzję celowania w komórki rakowe.

Chociaż udało nam się osiągnąć integrację wariantów dCas9-KRAB-MeCP2 poprzez transdukcję lentiwirusową, alternatywne metody stabilnej transfekcji można również zastosować do włączenia pożądanych enzymów do komórek 501-mel. Jest to szczególnie istotne, ponieważ z naszego doświadczenia wynika, że wyciszenie dużych konstruktów, takich jak dCas9-KRAB-MeCP2, może nastąpić w czasie36,37. Alternatywnie, dCas9-KRAB okazał się być mniejszą alternatywą23. Z naszego doświadczenia wynika, że transdukcja mniejszymi białkami fuzyjnymi dCas9-KRAB pochodzącymi z ortologów Cas9 doprowadziła do zmniejszenia ekspresji białka podczas długotrwałej hodowli (patrz rysunek uzupełniający 2). W związku z tym stała ekspresja białka powinna być regularnie monitorowana w powtarzających się punktach czasowych. Dodatkowo, transdukcja dwóch dużych białek fuzyjnych wraz z markerami selekcyjnymi i podwójnymi kasetami ekspresji gRNA może indukować stres komórkowy lub może osiągnąć zdolność pakowania lentiwirusa.

Osiągnięcie 100% skuteczności knockdown w podwójnym CRISPRi może być wyzwaniem ze względu na nieoptymalną konstrukcję gRNA lub niewystarczającą ekspresję dCas9. Aby temu zaradzić, należy przetestować wiele gRNA na cel przy użyciu zaawansowanych narzędzi projektowych w celu zidentyfikowania najskuteczniejszych sekwencji. Ponadto optymalizacja ekspresji dCas9-KRAB-MeCP2 poprzez ulepszone projektowanie wektorów i charakterystykę klonalnych linii komórkowych może zwiększyć skuteczność knockdownu.

Alternatywne strategie integracji systemu CRISPRi obejmują wykorzystanie wektorów transpozazy lub integracji kierowanej przez CRISPR w celu osiągnięcia stabilnej insercji do miejsc genomowych "bezpiecznej przystani", które są znane z utrzymywania stabilnej ekspresji w czasie38. Jednak wiele typów komórek, w tym komórki czerniaka, jest trudnych do transfekcji39, co sprawia, że transdukcja lentiwirusowa jest preferowaną metodą. Elektroporacja enzymów opartych na transpozazie lub Cas może stanowić alternatywny sposób integracji konstruktów dCas9-KRAB-MeCP2 z komórkami czerniaka40. Wdrożenie indukowalnego systemu nokautu byłoby korzystne dla aktywacji ekspresji dCas9-KRAB-MeCP2 w razie potrzeby, a nie ekspresji konstytutywnej w celu zminimalizowania stresu komórkowego.

Wreszcie, opracowane podejście nie ogranicza się do komórek czerniaka, ale może zostać rozszerzone na dowolny typ komórek, w których badana jest syntetyczna śmiertelność. Podejście to ma być wyraźnie skalowane w kierunku metody badań przesiewowych biblioteki gRNA. Jednak ze względu na zwiększoną złożoność kombinatoryczną, np. z więcej niż trzema gRNA na parę genów, w tym kontrolą i co najmniej 300-krotnym pokryciem, tylko subtranskryptomiczna frakcja ekspresji lncRNA może być praktycznie ukierunkowana. Dlatego użytkownicy muszą starannie wybrać kandydatów, biorąc pod uwagę takie czynniki, jak poziomy ekspresji lncRNA i ich znane znaczenie w określonych kontekstach komórkowych przed przystąpieniem do badań przesiewowych w bibliotece. Niemniej jednak kombinatoryczna wszechstronność tego podejścia sprawia, że jest ono cennym narzędziem do badania syntetycznych śmiertelnych interakcji i innych zależności genetycznych lncRNA w różnych typach nowotworów i potencjalnie innych chorobach. Rozszerza to obecnie dostępny zestaw narzędzi do badania tych interakcji sieciowych w komórkach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jochen Imig jest obecnie finansowany przez CGCIII przez Pfizer Inc. CGCIII jest sponsorowany przez Pfizer Inc., Merck KGaA i AstraZeneca PLC. Sponsorzy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu, wykonywaniu, interpretacji ani pisaniu badania. Wszyscy autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Stefanowi Raunserowi (Instytut Fizjologii Molekularnej im. Maxa Plancka, Dortmund) za dostęp do przestrzeni laboratoryjnej poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2. Specjalne podziękowania dla Erica Wanga za jego wkład intelektualny oraz dla wszystkich byłych i obecnych członków laboratorium Imig za ich cenne dyskusje. Jochen Imig jest obecnie finansowany przez CGCIII przez firmę Pfizer Inc. w CGC III.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 100 kDaMWCO MilliporeUFC910024
mysie przeciwciało monoklonalne anty-Cas9 (S. aureus) (6H4)Technologia sygnalizacji komórkowej48989
przeciwciało monoklonalne anty-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3)Technologia sygnalizacji komórkowej14697
mysie przeciwciało monoklonalne anty-GAPDH Sigma AldrichG8795
Anti-Mouse IgG (cała cząsteczka)– Przeciwciało peroksydazy wytwarzane w królikuSigma AldrichA9044
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System Bio-Rad
Chlorowodorek blastycydyny SSigma Aldrich15205-25MG
Test żywotności komórek luminescencyjnych CellTiter-GloPromegaG7570
Wirówka Eppendorf5804R
Eppendorf5415R
CFX Connect System wykrywania PCR w czasie rzeczywistymBio-Rad
Klarowność Western Podłoże ECL, 500 mlInkubator CO2 Bio-Rad1705061
Model CB 170Binder
cOmplete Inhibitor proteazy KoktajlRoche11697498001
Esp3I (BsmB1) Enzym restrykcyjnyThermo ScientificER0451
Falcon 10 ml Piper serologicznyCorning356551
Falcon 25 ml pipeta serologicznaCorning357525
Falcon 5 ml pipeta serologicznaCorning356543
Płodowa surowica bydlęcaSigma AldrichF9665-500ML
Gibco Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s pożywka (DMEM), wysoka zawartość glukozy, pirogronianGibco41966029
Ludzka linia komórkowa czerniaka 501-melzostała uprzejmie dostarczona przez Aifantis Lab (New York University)RRID: CVCL_4633
Immobilon -P PVDF MembraneMilliporeIPVH00010
Lenti-X 293T HEK CellTakara Bio632180
Mini Trans-Blot Cell Bio-Rad
Mini-PROTEAN Tetra Handcast SystemBio-Rad
NEBuilder HiFi Reakcja montażu DNA New England BiolabsE2621
Beztłuszczowe mleko w proszku Biomol54650
NuPAGE LDS Bufor do próbek (4x)InvitrogenNP0008
One Shot Stbl Chemicznie kompetentny E. coliInvitrogenC737303
Opti-MEM I Zredukowane podłoże surowicyGibco31985062
probówki PCR 0,5 ml (płaska nakrętka)VWR International732-3207
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Corning45000-446
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix z buforem HFThermo ScientificF531L
Pierce BCA Zestaw do oznaczania białek Thermo Scientific23225
PolybreneSigma AldrichTR-1003-G
Polietyleninina, rozgałęzionaSigma Aldrich408727
Dichlorowodorek PuromycynySanta Cruz Biotechnologysc-108071A
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCR Qiagen28104
Probówka do mikrowirówek SafeSeal 1,5 mlSarstedt72,706
Chlorek sodu, 5 M roztwór wodny, wolny od RNazAlfa AesarJ60434.AE
dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL3771
Filtr strzykawkowy PES 33mm 0,2 μ MFisher Scientific15206869
TC Naczynie 100, StandardSarstedt8,33,902
TC Talerz 6 dołków, standard, FSarstedt83,39,20,005
Baza TrisRoche10708976001
TWEEN 20Sigma AldrichP9416-50ML
Wirówka System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  2. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  3. Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. Towards a deeper annotation of human lncRNAs. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).
  4. Fang, S., et al. NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs. Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).
  5. Lin, J., et al. Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression. eLife. 12, RP89001.2(2023).
  6. Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species. Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).
  7. Melé, M., et al. Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals. Science. 348 (6235), 660-665 (2015).
  8. Cabili, M. N., et al. Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses. Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).
  9. Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. Long noncoding RNAs in cancer metastasis. Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).
  10. Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk. J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).
  11. Jain, A. K., et al. LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56. Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).
  12. Bergmann, J. H., et al. Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs. Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).
  13. Kretz, M., et al. Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR. Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).
  14. Yoon, J. H., et al. LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation. Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).
  15. Huarte, M. The emerging role of lncRNAs in cancer. Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).
  16. Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty. NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).
  17. Zong, X., et al. Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides. Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).
  18. Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. RNAi factors are present and active in human cell nuclei. Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).
  19. Zeng, Y., Cullen, B. R. RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm. RNA. 8 (7), 855-860 (2002).
  20. Yang, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers. RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).
  21. Liu, S. J., et al. CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells. Science. 355 (6320), aah7111(2017).
  22. Tsung, K., et al. CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion. PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).
  23. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  24. Boettcher, M., McManus, M. T. Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR. Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).
  25. Yeo, N. C., et al. An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation. Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).
  26. Parrish, P. C. R., et al. Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome. Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).
  27. Najm, F. J., et al. Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens. Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).
  28. Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. bioRxiv. , (2024).
  29. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  30. New England Biolabs. NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2. , (2020).
  31. Cortés-Ríos, J., et al. Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times. Anal Biochem. 608, 113904(2020).
  32. Junior, N. Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1. , (2019).
  33. Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies. Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).
  34. Schep, R., et al. Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance. Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).
  35. Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells. ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).
  36. Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus. Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).
  37. Ellis, J. Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors. Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).
  38. Shrestha, D., et al. Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors. Genome Biol. 23 (1), 199(2022).
  39. Chu, Z., et al. Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units. J Control Release. 367, 197-208 (2024).
  40. Han, S. Y., et al. Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines. Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Dual CRISPRiSynthetic Lethal ScreeningLong Non Coding RNAsGene KnockdownLentiviral TransductionCell Viability AssaydCas9 KRAB MeCP2Combinatorial Targeting

Powiązane artykuły