Artykuł metodologiczny

Skuteczna metoda ekstrakcji nabłonka ludzkiego jajowodu do analiz pojedynczych komórek

DOI:

10.3791/67753

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles, 2Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research, University of California, Los Angeles, 3Molecular Biology Institute, University of California, Los Angeles, 4Department of Bioengineering, University of California, Los Angeles, 5Department of Microbiology, Immunology and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles, 6Parker Institute for Cancer Immunotherapy, University of California, Los Angeles, 7The Jonsson Comprehensive Cancer Center, University of California Los Angeles, 8The VA Greater Los Angeles Healthcare System, 9Department of Medical and Molecular Pharmacology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje jednodniową metodę izolacji komórek nabłonka ludzkiego jajowodu. Izolowane komórki nabłonkowe można siać w hodowli dwuwymiarowej (2D) lub dysocjować do zawiesin jednokomórkowych i wykorzystywać w dalszych eksperymentach, w tym cytometrii przepływowej i sekwencjonowaniu RNA pojedynczej komórki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie jajowody są nieodłącznym elementem reprodukcji. Zadaniem jajowodów jest umożliwienie tranzytu plemników, komórki jajowej, a jeśli zapłodnienie się powiedzie, zarodka. Komórki nabłonkowe, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię jajowodów, są integralną częścią zarówno prawidłowych, jak i nieprawidłowych procesów jajowodowych, w tym inicjacji choroby. Po menopauzie jajowody przestają odgrywać znaczącą rolę w organizmie, a skład komórek śródnabłonkowych ulega zmianie. Opisujemy metodę, w której te komórki nabłonkowe można wyizolować ze świeżych jajowodów przy minimalnym zanieczyszczeniu komórek zrębu do zawiesiny jednokomórkowej. Komórki te mogą być hodowane w hodowli lub wykorzystywane do dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek. Ten protokół izolacji można osiągnąć w ciągu 4-6 godzin i daje żywe komórki, które można wykorzystać do natychmiastowej dalszej analizy. Ten skuteczny protokół ułatwia izolację komórek nabłonka jajowodów ze wzbogaconą populacją nabłonka.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jajowody są zbudowane z wielu części. Od jajnika do macicy jajowód składa się z fimbrii, bańki, przesmyku i części śródściennej. Fimbie rozciągają się od końca jajowodu, gdzie chwytają komórkę jajową uwolnioną przez jajnik. Komórka jajowa następnie przemieszcza się przez bańkę, gdzie najprawdopodobniej zostanie zapłodniona, do przesmyku, a na koniec jest przenoszona do macicy przez część śródścienną1. Najbardziej wewnętrzna błona śluzowa jajowodu, która ułatwia transport komórki jajowej, składa się z warstwy nabłonka światła, w tym komórek rzęskowych i wydzielniczych. Komórki rzęskowe są zwykle bardziej skoncentrowane w fimbriach2. Odgrywają integralną rolę w fizycznym przemieszczaniu komórki jajowej przez jajowód z jajnika do macicy. Ich przydatki pozwalają komórkom rzęskowym nie tylko przesuwać komórkę jajową, ale także usuwać stres genotoksyczny po owulacji3.

Komórki nabłonkowe jajowodu wydzielają płyn, który pomaga w odżywianiu i tworzeniu gamet4. Proporcja komórek rzęskowych i wydzielniczych wzdłuż nabłonka jajowodu różni się w stanie pomenopauzalnym wraz ze spadkiem liczby komórek rzęskowych, ponieważ jajowód nie pełni już krytycznej funkcji w transporcie5. Ponadto, w przypadku braku estrogenu, uważa się, że jajowody stają się szczątkowe1,6. Zakłada się, że ta utrata komórek rzęskowych w jajowodzie zwiększa ryzyko rozwoju raka surowiczego7. Ponadto uważa się, że komórki nabłonka wydzielniczego jajowodu powodują zmiany w surowiczym raku śródnabłonkowym jajowodów (STIC), dobrze znanym prekursorze najbardziej agresywnego podtypu raka jajnika jajowodowego, raka surowiczego o wysokim stopniu złośliwości7,8.

Celem tego protokołu jest wyizolowanie komórek nabłonkowych z ludzkich jajowodów i rozdzielenie ich na zawiesiny jednokomórkowe. Protokół ten pozwala uzyskać wzbogaconą populację nabłonka pojedynczych komórek, którą można wykorzystać do wielu analiz. Jak pokazano w tym manuskrypcie, przeprowadziliśmy analizę cytometrii przepływowej i posialiśmy komórki w 2D po izolacji. Analiza cytometrii przepływowej wykazuje obecność pojedynczych komórek, które są w większości żywotne i mają charakter nabłonkowy. W tych analizach uwzględniliśmy cztery markery: e506 dla żywotności, EpCAM dla komórek nabłonkowych, CD45 dla komórek odpornościowych i CD10 dla komórek zrębu. Martwe komórki wykluczono za pomocą markera żywotności e506, a komórki odpornościowe bramkowano za pomocą CD45. Możliwe jest, że zawiesina ma populację komórek odpornościowych; jednakże, aby uzyskać stosunkowo czystą populację komórek nabłonkowych, komórki CD45-dodatnie można zubożyć za pomocą zestawu do zubożenia CD45. Co więcej, po posianiu w hodowli komórki CD45-dodatnie często nie namnażają się. Komórki wyizolowane tą metodą i wyhodowane w 2D wykazują przylegające populacje nabłonka przypominające bruk. Metoda ta może być wykorzystana do generowania preparatów komórkowych, które można przekształcić w jednokomórkowe biblioteki RNA.

Badania mające na celu określenie linii komórkowej nabłonka jajowodu, zmian w tych liniach podczas różnych faz życia reprodukcyjnego oraz wywoływania zdarzeń prowadzących do złośliwej transformacji i genezy stały się bardziej widoczne w ciągu ostatnich czterech lat6,9,10,11,12. Protokół ten przyniesie znaczne korzyści badaniom w tej dziedzinie, zapewniając skuteczny sposób izolowania nabłonka jajowodów i przetwarzania ich w pojedyncze komórki.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zaadaptowany z opisanej wcześniej metody izolacji komórek nabłonka macicy13,14. Świeże próbki pozbawionych identyfikacji jajowodów zostały pobrane za pomocą zatwierdzonego przez IRB protokołu #10-0727 Uniwersytetu Kalifornijskiego w Los Angeles (UCLA) i strawione do zawiesiny jednokomórkowej w ciągu około 4-6 godzin.

1. Pobieranie i przygotowanie jajowodów

  1. Zbierz świeże ludzkie jajowody (Rysunek 1A) w pożywkach dysocjacyjnych (DMEM [4,5 g / L D-glukozy] zawierające 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml L-glutaminy i 5 ml penicyliny / streptomycyny) w probówkach o pojemności 15 ml lub 50 ml i transportuj na lodzie do laboratorium.
  2. Przenieś jajowody na sterylną szalkę Petriego zawierającą świeże podłoże dysocjacyjne.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym wypreparuj tłuszcz, tkankę łączną i wszelkie naczynia otaczające rurki za pomocą cienkich kleszczyków punktowych i nożyczek Vannas Tubingen (Rysunek 1B).
  4. Pod mikroskopem preparacyjnym przeciąć nożyczkami płaszczyznę koronalną jajowodów, aby utworzyć małe cylindry o średnicy ~3–5 mm każdy (Ryc. 1C), używając cienkich kleszczyków punktowych do stabilizacji tkanki.

2. Izolacja i dysocjacja komórek nabłonkowych

  1. Ostrożnie odessać pożywkę dysocjacyjną z naczynia.
  2. Umyj kawałki chusteczki 2x zimną 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanem (PBS), delikatnie pipetując ~2 ml, aby przykryć kawałki i lekko obracając płytkę.
  3. Odessać końcowe 1x PBS przepłukać, inkubować kawałki tkanek przez 5 minut w zimnym 5 mM kwasie etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze pokojowej i powtórzyć w sumie dwie inkubacje. Odessać 5mM EDTA po każdej inkubacji.
  4. Zawiesić fragmenty tkanek w zimnym 1% roztworze trypsyny/zrównoważonej soli Hanksa (HBSS) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 40 minut (Rysunek 1D).
  5. Odessać 1% trypsyny/HBSS i umyć kawałki tkanki 2x w zimnym podłożu dysocjacyjnym, aby dezaktywować trypsynę.
  6. Inkubować fragmenty tkanek w 2 ml pożywki dysocjacyjnej z 0,4 mg DNazy przez co najmniej 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Może być konieczny dłuższy okres inkubacji, ale nie należy przekraczać 45 minut przed rozpoczęciem kroku 2.7.
  7. Pod mikroskopem preparacyjnym, jeszcze w pożywce z DNazą, przytrzymaj fragment jajowodu, światło równoległe do dna naczynia, na miejscu za pomocą kleszczy. Drugą ręką kilkakrotnie naciskaj kleszczami na fragment jajowodu, aby usunąć komórki nabłonkowe ze światła jajowodu. Upewnij się, że wokół tkanki widoczna jest aureola komórek, gdy komórki są uwalniane ze światła probówki. Powtórz dla każdego fragmentu jajowodu w naczyniu (Ryc. 1E).
  8. Przenieść pożywkę zawierającą komórki do sterylnej probówki o pojemności 15 ml, przemyć szalkę Petriego pożywką dysocjacyjną co najmniej 2 razy i połączyć popłuczyny z probówką o pojemności 15 ml. Wyrzuć fragmenty rurki zrębu.
  9. Zbierać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml pożywki dysocjującej.
  10. Policz komórki, dzieląc 10 μl zawiesiny komórek i mieszając 1:1 z błękitem trypanowym. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek (Rysunek 1F).

3. Trawienie do zawiesiny jednokomórkowej

  1. Ponownie zawiesić komórki w 9 ml pożywki dysocjującej, 1 ml kolagenazy 8 mg/ml (typ 1) i 0,4 mg DNazy. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30–45 minut w wytrząsarce orbitalnej z prędkością 200 obr./min (Rysunek 1G).
  2. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki dysocjacyjnej w celu zmycia kolagenazy.
  3. Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 100 μm do probówki o pojemności 50 ml (Rysunek 1H).
  4. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut.
  5. Jeśli osad komórkowy wydaje się czerwony, przeprowadź lizę czerwonych krwinek (RBC) zgodnie z opisem w krokach 3.6–3.8. Jeśli osad ogniwa nie jest czerwony, przejdź do kroku 3.9.
  6. Rozcieńczyć 500 μl buforu do lizy RBC w 4,5 ml ultraczystej wody.
  7. Odessać pożywkę, dodać 5 ml rozcieńczonego buforu do lizy RBC i inkubować na lodzie przez 3 minuty.
  8. Aby zatrzymać lizę RBC, dodaj 45 ml 1x PBS do probówki o pojemności 50 ml.
  9. Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 500 × g przez 5 minut.
  10. Policz komórki, podając 10 μl zawiesiny komórek i mieszając ją 1:1 z błękitem trypanowym. Odpipetować 10 μl mieszaniny do szkiełka zliczającego w komorze i włożyć ją do licznika komórek (Rysunek 1I).

4. Barwienie metodą cytometrii przepływowej

  1. Podzielić 250 000 komórek na dwie oddzielne probówki z okrągłym dnem polistyrenu o pojemności 5 ml do pierwotnego sprzężonego przeciwciała i kontroli izotypu do wykorzystania w cytometrii przepływowej ze znacznikiem powierzchniowym.
    UWAGA: Można użyć mniejszej liczby komórek, aby dostosować się do liczby komórek i liczby komórek potrzebnych do dalszej analizy. Aby osiągnąć optymalne wyniki przepływu, analiza powinna obejmować co najmniej 50 000 komórek.
  2. Rozcieńczyć przeciwciało (np. anty-ludzkie EpCAM i CD10) i izotyp zgodnie z zalecanym przez producenta rozcieńczeniem w 1x PBS. Obejmują utrwalany barwnik żywotności (e506) i sprzężone przeciwciało anty-ludzkie CD45 w celu wyeliminowania żywych ludzkich komórek odpornościowych. Przygotować wystarczającą ilość mieszaniny przeciwciał na co najmniej 50 μl na probówkę. Pozostaw w ciemności na lodzie do kroku 4.4.
  3. Umyj komórki 1 ml 1x PBS. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Zassać 1x PBS. Zawiesić osad w panelu przeciwciał lub izotypów i inkubować w temperaturze 4 °C przez 15 minut w ciemności.
  5. Po inkubacji rozcieńczyć w 1 ml 1 x PBS i zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Odessać 1x PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μL 1x PBS.

5. Zbieranie danych z cytometrii przepływowej

  1. Zaloguj się do komputera FACS.
    UWAGA: Przedstawiamy protokół z wykorzystaniem referencyjnego cytometru przepływowego (patrz Tabela materiałów). W przypadku innych cytometrów przepływowych należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta. Ustawienie napięcia cytometru przepływowego zostało wstępnie skonfigurowane w celu uzyskania optymalnej wydajności z ludzkimi PBMC, eliminując potrzebę regulacji napięcia przed każdym uruchomieniem FACS.
  2. Jeśli urządzenie jest w trybie akwizycji, przejdź do kroku 5.3. Jeśli urządzenie jest w trybie analizy danych, przejdź do trybu akwizycji, naciskając przycisk zasilania w prawym górnym rogu. Gdy wyświetli się wyskakujące okienko, naciśnij przycisk z napisem tryb akwizycji.
  3. W lewym dolnym rogu, jeśli na urządzeniu pojawi się komunikat Wymagana kalibracja, przejdź do kroku 5.3.1. Jeśli urządzenie odczytuje Kalibracja ok, przejdź do kroku 5.4.
    1. Aby skalibrować urządzenie, wyjmij koraliki kalibracyjne z lodówki o temperaturze 4 °C i odwiruj.
    2. Umieść 1 kroplę koralików kalibracyjnych w probówce z okrągłym dnem o pojemności 5 ml z polistyrenu i umieść probówkę w pojedynczym uchwycie na probówkę.
    3. Naciśnij przycisk kodu kreskowego w prawym górnym rogu i zeskanuj butelkę z koralikami kalibracyjnymi. Pojawi się wyskakujące okienko. Jeśli wszystko jest skonfigurowane, kliknij przycisk Tak | OK i pozwól kalibracji działać.
    4. Jeśli kalibracja się powiedzie, wyloguj się i zaloguj ponownie do trybu akwizycji. Przejdź do kroku 5.4.
  4. Kliknij pozycję Otwórz | nowy obszar roboczy w lewym górnym rogu.
  5. Wybierz stojak Chill 5; wybierz trzy studnie. Wybierz pierwszą studnię i oznacz ją (np. FTX Ab). Wybierz następną studnię i nadaj jej unikalny opis (np. FTX Iso). Wybierz ostatnią studzienkę i nadaj jej opis bleach.
    UWAGA: Zawsze dołączaj próbkę wybielacza po każdych 4-5 próbkach eksperymentalnych, aby zapewnić terminowe czyszczenie próbek komórek.
  6. Wybierz wszystkie studnie i ustaw warunki eksperymentalne w następujący sposób: ustawienia instrumentu: ludzkie PBMC; Natężenie przepływu: wysokie; Wymieszaj próbkę: delikatne mieszanie; Tryb: standardowy; całkowita objętość próbki 200 μl; Wychwyt próbki 150 μl; Adnotacja: przeciwciała wejściowe i ich znakowanie fluoroforowe.
  7. Wybierz edytuj | opcje i nadaj plikowi nazwę w polu description| apply | ok.
  8. Wyjmij ruszt z lodówki i umieść go na tacy z kodem kreskowym skierowanym w stronę urządzenia. Umieść probówki z próbkami w stojaku, aby odzwierciedlić kolejność próbek na ekranie i naciśnij przycisk odtwarzania, aby rozpocząć eksperyment.
  9. Po zakończeniu eksperymentu podłącz USB, wybierz Plik | Kopiuj, rozwiń folder prywatny, wybierz eksperyment i kliknij przycisk kopiuj i wysuń.
  10. Po zebraniu danych użyj oprogramowania do analizy arkusza danych.
  11. Zacznij od kontroli izotypu. Użyj narzędzia wielokąta, aby zaznaczyć komórki na wykresie rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC).
  12. Wyeliminowanie martwych komórek poprzez zmianę osi Y na e506 i osi X na FSC. Użyj narzędzia wielokąta, aby wybrać populację żywych komórek z ujemnym wynikiem e506.
  13. Kliknij dwukrotnie wybraną populację. Zmień oś Y na ludzką CD45. Użyj narzędzia Wielokąt, aby zaznaczyć populację komórek. Jest to ludzka populacja komórek CD45-ujemnych.
  14. Kliknij dwukrotnie populację komórek CD45-ujemnych. Zmień oś Y na histogram i oś X na ludzki EpCAM. Użyj narzędzia do zaznaczania zakresu, aby kliknąć na końcu histogramu i zaznaczyć puste miejsce aż do końca wykresu. Reprezentuje to populację EpCAM-dodatnią. Powtórz dla ludzkiego barwienia CD10.
  15. Przeciągnij bramkowanie izotypu pod obszar roboczy przeciwciała. Komórki CD45-dodatnie zostaną bramkowane, a populacje EpCAM-dodatnie i CD10-dodatnie zostaną wybrane.
  16. Aby utworzyć reprezentatywne histogramy, wybierz edytor układu. Przeciągnij żądane histogramy na stronę układu. Aby porównać barwienie izotypu i przeciwciała, nałóż histogram izotypu na histogram przeciwciała. Bramka komórek dodatnich na podstawie kontroli izotypu.

6. Immunocytochemia

  1. Hodowla komórek po ostatnim etapie izolacji w żądanej komorze szklanej szkiełkuje do zlewania się.
  2. Aby utrwalić komórki, dodaj 500 μl zimnego 4% paraformaldehydu (PFA) Inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  3. Odessać 4% PFA i przemyć 3x 1x PBS.
  4. Aby przepuszczalność komórek, dodaj co najmniej 200 μl 0,25% Triton-X do PBS i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  5. Podczas przepuszczalności należy przygotować bufor blokujący (4% normalna surowica kozia [NGS] dla przeciwciał niewytwarzanych u kóz).
  6. Odessać 0,25% Triton-X i przemyć 3x 1x PBS.
  7. Dodać co najmniej 200 μl buforu blokującego (4% NGS w PBS). Blokuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  8. Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenia przeciwciał w 1% NGS w 1x PBS zgodnie z zaleceniami producenta.
  9. Po zablokowaniu dodać co najmniej 200 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny
    UWAGA: Niektóre przeciwciała pierwszorzędowe mogą preferować inkubację w temperaturze 4 °C przez noc; Sprawdź kartę charakterystyki przeciwciał.
  10. Przygotować drugorzędowe roztwory przeciwciał w 1% NGS w 1x PBS. Zawiń probówki w folię aluminiową i przygotuj roztwory w ciemności, ponieważ przeciwciała drugorzędowe są wrażliwe na światło. Przechowywać w ciemności, aż będzie gotowy.
  11. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć 3x 1x PBS.
  12. Dodać co najmniej 200 μl roztworu przeciwciał drugorzędowych. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 1 h.
    UWAGA: Podczas poniższych kroków staraj się, aby slajd był jak najbardziej w ciemności.
  13. Po wtórnej inkubacji przeciwciał przemyć 3x 1x PBS.
  14. Wyjmij komory, po prostu wyjmując je ręcznie lub używając narzędzia dołączonego do prowadnic. Postępuj zgodnie ze wskazówkami wydrukowanymi na opakowaniu szkiełka komory w celu wyjęcia.
  15. Dodaj kroplę 4',6-diamidyno-2-fenyloindolowej surowicy (DAPI) i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu. Ogranicz liczbę pęcherzyków i upewnij się, że wszystkie komórki są zakryte. Opcjonalny krok: użyj lakieru do paznokci wokół krawędzi, aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe.
  16. Położyć szkiełko płasko w pudełku na szkiełka do wyschnięcia i umieścić w temperaturze 4 °C do momentu wykonania obrazu.
  17. Obraz na mikroskopie wyposażonym w prawidłową fluorescencję opartą na wtórnej koniugacji przeciwciał w celu zapewnienia czystego obrazu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dołączyliśmy siedem kolekcji jajowodów, w których wyizolowaliśmy wzbogaconą populację komórek nabłonkowych (Rysunek 2A i Rysunek uzupełniający S1A). Aby ocenić żywotność i wzbogacenie komórek nabłonkowych w tej metodzie zawiesiny pojedynczej komórki, przeprowadzono cytometrię przepływową. Aby zmierzyć żywotność komórek, komórki wybarwiono markerem żywotności e506. Pozwoliło to również na wyeliminowanie wszystkich zanieczyszczeń i martwych komórek podczas analizy.

Aby określić skład komórek wyizolowanych tą metodą, próbki zostały wybarwione markerem komórek nabłonkowych (EpCAM), markerem komórek zrębu (CD10) i markerem komórek odpornościowych (CD45). Jak widać na Rysunek 2B, wyizolowaliśmy żywotną i wzbogaconą populację komórek nabłonkowych z tkanki jajowodu. Żywotność próbki wynosiła średnio 82%. Dla wszystkich próbek, po bramkowaniu komórek CD45-dodatnich, zaobserwowaliśmy wzbogaconą populację komórek nabłonkowych z komórkami EpCAM-dodatnimi stanowiącymi średnio 80% próbki. Stwierdzono pewne zanieczyszczenie komórek zrębu, ale średnio tylko 7,8%. Rysunek 2C pokazuje wyizolowane komórki w 2D 4-6 dni po posianiu. Oczywiste jest, że komórki nabłonkowe zostały wyizolowane, ponieważ tworzyły spójne, przylegające skupiska przypominające bruk. W Supplemental Rysunek S1B, komórki zostały posiane po izolacji i hodowane przez 2-6 dni. Do scharakteryzowania komórek rosnących w kulturze wykorzystano immunocytochemię. Większość komórek w hodowli była wybarwiona dodatnio na obecność EpCAM i markera komórek wydzielniczych, PAX8. Tylko kilka komórek zidentyfikowano jako witamino-dodatnie. Komórki rzęskowe były widziane w hodowli jako uchwycone na wideo, pokazane na dodatkowym filmie S1.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat eksperymentalny. (A) Dochodzi do pozyskania jajowodów. (B) Nadmiar tłuszczu i tkanki łącznej jest usuwany. (C) Rurki są cięte na kawałki ~3-5 mm. (D) Kawałki przemywa się w PBS, następnie inkubuje w EDTA 2x przez 5 minut i inkubuje w 1% trypsynie przez 40 minut w temperaturze 4 °C. (E) Za pomocą dwóch par kleszczy, jednej do trzymania, a drugiej do pchania, usuwa komórki nabłonkowe z kawałków jajowodu. (F) Przenieś komórki do probówki o pojemności 15 ml, odwiruj i policz. (G) Zawiesić w DMEM, kolagenazie i DNazie. Trawić przez 30-45 min. (H) Odcedzić na sitku o wielkości 100 μm. (I) Zbiór przez odwirowanie i liczenie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka izolowanych komórek nabłonkowych. (A) Tabela informacji klinicznych pacjenta i wyników cytometrii przepływowej. (B) Po izolacji przeprowadzono cytometrię przepływową, aby wykazać, że wyizolowano wzbogaconą populację komórek nabłonkowych (EpCAM-dodatni). Kontrola ujemna izotypu jest oznaczona kolorem czarnym, a wynik eksperymentu jest oznaczony kolorem różowym. (C) Komórki zostały posiane po izolacji. Zdjęcia zostały wykonane 4-6 dni po poszyciu. Podziałka = 100 μm. Skróty: AUB = Nieprawidłowe krwawienie z macicy; EIN = śródnabłonkowa neoplazja endometrium. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uzupełniające Rysunek S1: Dodatkowa charakterystyka izolowanych komórek nabłonkowych w hodowli. (A) Tabela z informacjami klinicznymi dla pacjentów. (B) Izolowane komórki hodowano i barwiono pod kątem EpCAM, markera komórek wydzielniczych (PAX8) i markera komórek zrębu (Vimentin) 2-6 dni po posiewie w celu scharakteryzowania typu komórki w hodowli. Podziałka = 50 μm. Skróty: EIN: śródnabłonkowa neoplazja endometrium; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dodatkowe wideo S1: Wideo przedstawiające bicie komórek rzęskowych zostało wykonane w 30-krotnym powiększeniu, aby zademonstrować komórki rzęskowe w hodowli. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje duże zainteresowanie badaniem nabłonka jajowodów, ponieważ jajowody odgrywają znaczącą rolę w reprodukcji i są miejscem pochodzenia większości HGSOC. W tym celu wielu badaczy opisało protokoły izolacji komórek jajowodu zarówno w modelach ludzkich, jak i mysich 10,11,12,15,16,17,18,19,20,21. Opisana przez nas metoda ekstrakcji i wzbogacania komórek nabłonka jajowodu uzupełnia istniejące protokoły izolacji komórek jajowodu. Chociaż w ramach tych protokołów istnieją nakładające się na siebie metody, istnieją dwa ogólne typy metod zgłaszane u myszy i ludzi. Pierwszy polega na rozdrobnieniu i enzymatycznym trawieniu całego jajowodu, co daje całkowitą zawiesinę komórkową 10,12,15,16,17. Drugi polega na złuszczaniu się z mieszaniem lub skrobaniem, w wyniku czego powstają arkusze tkanki 11,18,19,20,21. Obie metody umożliwiają analizę komórek nabłonkowych za pomocą dalszych eksperymentów, takich jak cytometria przepływowa, sekwencjonowanie i hodowla in vitro. Główną zaletą naszej metody jest to, że protokół daje populację komórek jajowodu, które są już wzbogacone o komórki nabłonkowe poprzez trawienie enzymatyczne i mechaniczne etapy pchania. Ta populacja wzbogacona o nabłonek może być dalej trawiona, w wyniku czego powstaje zawiesina jednokomórkowa, która może być wykorzystywana do wielu zastosowań, takich jak cytometria przepływowa, hodowla 2D, immunocytochemia i sekwencjonowanie RNA pojedynczych komórek.

Kluczowe kroki, które według nas wpływają na wydajność komórek, obejmują czas, przez jaki fragmenty jajowodu inkubują się w 1% trypsyny/HBSS i DMEM/DNazie. Nadmierna inkubacja w którymkolwiek roztworze spowoduje degradację komórek i znacznie zmniejszy ich żywotność. Jednak niewystarczający czas inkubacji zahamuje zdolność badacza do wypchnięcia wielu komórek nabłonkowych podczas kroku 2.6 protokołu, ponieważ będą one nadal przylegać do siebie. Ważne jest również, aby stosować 1% roztwór trypsyny, ponieważ zarówno niższe, jak i wyższe stężenia roztworów trypsyny zmniejszały wydajność żywotnych komórek nabłonka jajowodów. Łącząc izolację chemiczną i mechaniczną oraz etap trawienia (krok protokołu 3.1), możemy wykładniczo skrócić czas potrzebny na przejście od zawiesiny tkankowej do jednokomórkowej. Zapewnia to dobrą rentowność i czas na przeprowadzenie dalszej analizy tego samego dnia.

W kroku 1.4 protokołu bardzo ważne jest, aby upewnić się, że kawałki przeciętego jajowodu mają grubość 3-5 mm. Jeśli kawałki są zbyt duże, trudno będzie wykonać krok protokołu 2.7 i ostatecznie zmniejszyć wydajność komórek, ponieważ konieczny będzie dłuższy czas inkubacji w DMEM/DNazie.

Chociaż zawiesina komórkowa jest wzbogacona o komórki nabłonkowe, zanieczyszczenie komórek zrębu jest nieuniknione. Jeśli preparat ma być czysto nabłonkowy, można przeprowadzić sortowanie za pomocą cytometrii przepływowej i opisanych przez nas markerów w celu wyizolowania komórek nabłonka i zubożenia komórek zrębu.

W badaniu wykorzystano jajowody po menopauzie. Jednak metoda ta została z powodzeniem zastosowana w naszym laboratorium na jajowodach przed menopauzą. Główną różnicą między jajowodami przed i po menopauzie jest skład komórek nabłonka rzęskowego i wydzielniczego1. Protokół ten działa na wszystkich etapach rozrodu.

Ten skuteczny protokół ułatwi badanie typów komórek nabłonka jajowodu, w tym nakreślenie linii komórkowych, ich dynamicznych zmian podczas cykli rozrodczych, a także po menopauzie oraz ich rolę w inicjowaniu surowiczego raka jajnika o wysokim stopniu złośliwości.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy: Ruegg L, James-Allan LB i DiBernardo G są częściowo wspierani przez projekty Greater Los Angeles Veterans Association 1I01BX006019-01A2 i I01BX006411-01 do Memarzadeh S. Autor Ochoa C jest wspierany przez UCLA Eli and Edythe Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research Rose Hills Foundation Graduate Scholarship Training Program. Pragniemy podziękować Laboratorium Patologii Translacyjnej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles, a w szczególności Ko Kiehle i Chloe Yin za pomoc w pobieraniu tkanek. Chcemy również podziękować Kenowi Yamauchi i rdzeniowi BSCRC Microscopy za ich pomoc w obrazowaniu. Rysunek 1 został utworzony za pomocą BioRender.com (numer umowy JL27QWDYNT). Na koniec chcielibyśmy podziękować Felicii Cordea i rdzeniowi cytometrii przepływowej BSCRC za pomoc w cytometrii przepływowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1% trypsyna Thermo Scientific J63993.09
100 &mikro; m Sitko komórkoweCorning431752
4% paraformaldehydMikroskopia elektronowa Sciences15710-S
5 mL probówki z okrągłym dnemCorning352008
60 mm płytka do hodowli komórkowejCorning CLS430589-500EA
6-dołkowa płytka do hodowli komórkowychCorning353046
Anty-CD10BioLegend312212
Anty-CD326 (Ep-CAM)BioLegend324218
Anty-CD45 BioLegend304026
Anti-EpCAMAbcamab223582
Anty-IgG2a PerCP BioLegend400250
Anti-PAX8Sigma-Aldrich363M-15
Anti-VimentinAgilent TechnologiesM072501-2
System prowadnic komorowychThermo Scientific 154917PK
Kolagenaza Thermo Scientific 
DMEMThermo Naukowy 10569-010
DNase ISigma10104159001
EDTASigma3690
eFluor 506Invitrogen65-0866-14
FBSSigmaF2442
Szczypce punktowe VWR102091-526Dowolne kleszcze precyzyjne, które wybierzesz, będą działać
Fixable Viability Dye eFluor 506Invitrogen65-0866-14
Wersja oprogramowania FlowJo 9 BD BiosciencesOprogramowanie do analizy danych
GlutaMAXGibco35050-061
HBSSThermo Scientific 14175-095
Cytometr przepływowy MACSQuant Analyzer 10 Kulki kalibracyjne Miltenyi Biotec
MACSQuantMiltenyi Biotec130-093-607
Mammocult Stemcell Technologies5620
Normalna surowica koziaFisher ScientificPI31873
PBS Thermo Scientific 14190-144
Penicylina-Streptomiocyna Gibco15140-122
PerCP Sprzężony CD45BioLegend304026
Bufor do lizy czerwonych krwinek Tonbo BiosciencesTNB-4300-L100 
Triton X-100Thermo Naukowy BP151-100
Nożyczki sprężynowe Vannas-Tubingen Narzędzia Fine Science15003-08
VECTASHIELD z DAPIFisher Scientific NC9524612
17100017

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Crow, J., Amso, N. N., Lewin, J., Shaw, R. W. Morphology and ultrastructure of fallopian tube epithelium at different stages of the menstrual cycle and menopause. Hum Reprod. 9 (12), 2224-2233 (1994).
  2. Patek, E., Nilsson, L., Johannisson, E. Scanning electron microscopic study of the human fallopian tube. Report II. Fetal life, reproductive life, and postmenopause. Fert Steril. 23 (10), 719-733 (1972).
  3. Coan, M., et al. Exploring the role of fallopian ciliated cells in the pathogenesis of high-grade serous ovarian cancer. Int J Mol Sci. 19 (9), 2512(2018).
  4. Leese, H., Tay, J., Reischl, J., Downing, S. Formation of fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction. 121 (3), 339-346 (2001).
  5. Donnez, J., Casanas-Roux, F., Ferin, J., Thomas, K. Changes in ciliation and cell height in human tubal epithelium in the fertile and post-fertile years. Maturitas. 5 (1), 39-45 (1983).
  6. Lengyel, E., et al. A molecular atlas of the human postmenopausal fallopian tube and ovary from single-cell RNA and ATAC sequencing. Cell Rep. 41 (12), 111838-111838 (2022).
  7. Tao, T., et al. Loss of tubal ciliated cells as a risk for "ovarian" or pelvic serous carcinoma. Am J Cancer Res. 10 (11), 3815(2020).
  8. Li, J., Fadare, O., Xiang, L., Kong, B., Zheng, W. Ovarian serous carcinoma: recent concepts on its origin and carcinogenesis. J Hematol Oncol. 5 (1), 8(2012).
  9. Hu, Z., et al. The repertoire of serous ovarian cancer non-genetic heterogeneity revealed by single-cell sequencing of normal fallopian tube epithelial cells. Cancer Cell. 37 (2), 226-242.e7 (2020).
  10. Dinh, H. Q., et al. Single-cell transcriptomics identifies gene expression networks driving differentiation and tumorigenesis in the human fallopian tube. Cell Rep. 35 (2), 108978(2021).
  11. Ulrich, N., et al. Cellular heterogeneity of human fallopian tubes in normal and hydrosalpinx disease states identified using scRNA-seq. Dev Cell. 57 (7), 914-929.e7 (2022).
  12. Brand, J., et al. Fallopian tube single cell analysis reveals myeloid cell alterations in high-grade serous ovarian cancer. iScience. 27 (3), 108990-108990 (2024).
  13. Memarzadeh, S., et al. Cell-autonomous activation of the PI3-kinase pathway initiates endometrial cancer from adult uterine epithelium. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (40), 17298-17303 (2010).
  14. Cunha, G. R. Stromal induction and specification of morphogenesis and cytodifferentiation of the epithelia of the mullerian ducts and urogenital sinus during development of the uterus and vagina in mice. J Exp Zool. 196 (3), 361-369 (1976).
  15. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32 (1873-5061), 51-60 (2018).
  16. Karst, A. M., Drapkin, R. Primary culture and immortalization of human fallopian tube secretory epithelial cells. Nat Protoc. 7 (9), 1755-1764 (2012).
  17. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protocols. 3 (1), 101164(2022).
  18. Radecki, K. C., Lorenson, M. Y., Carter, D. G., Walker, A. M. Microdissection and dissociation of the murine oviduct: Individual segment identification and single cell isolation. J Vis Exp. (177), e63168(2021).
  19. Feng, L., et al. Protocol for the detection of organoid-initiating cell activity in patient-derived single fallopian tube epithelial cells. Methods Mol Bio. 2429, 445-454 (2022).
  20. Kessler, M., et al. The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids. Nat Commun. 6 (1), 8989(2015).
  21. Fotheringham, S., Levanon, K., Drapkin, R. Ex vivo culture of primary human fallopian tube epithelial cells. J Vis Exp. (51), e2728(2011).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja kom rek nab onkowychzawiesina pojedynczych kom reksekwencjonowanie RNA pojedynczych kom rekcytometria przep ywowatrawienie mechanicznetrawienie enzymatycznekom rki EpCAM dodatniezanieczyszczenie kom rkami zr burak jajnika

Powiązane artykuły