Method Article

Wtyczka Micro-Manager o otwartym kodzie źródłowym do obrazowania dipoli fluorescencyjnych w trybie podglądu na żywo

DOI:

10.3791/67755

⸱

March 14th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1College of Engineering, Eastern Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, College of Future Technology, Peking University, 3National Biomedical Imaging Center, Peking University, 4Zhejiang Provincial Engineering Research Center for Organelles Diagnostics and Therapy

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy open-source'ową wtyczkę Micro-Manager, która umożliwia obserwację na żywo dipoli fluorescencyjnych na mikroskopie oświetlenia strukturalnego. Wtyczka obsługuje obserwację zarówno orientacji dipola 2D, jak i 3D.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia polaryzacyjna fluorescencyjna (FPM) może obrazować położenie i orientację dipolową fluoroforów. Pomimo osiągnięć mikroskopii polaryzacyjnej fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, ich zależność od obserwacji po akwizycji utrudnia obserwację w czasie rzeczywistym. Spolaryzowana mikroskopia oświetlenia strukturalnego (pSIM) oferuje obrazowanie dipoli fluorescencyjnych w superrozdzielczości z dużą szybkością obrazowania i doskonale nadaje się do zastosowań z żywymi komórkami. Opracowaliśmy implementację open-source do rekonstrukcji obrazów polaryzacyjnych w czasie rzeczywistym i wyświetlania dipoli fluorescencyjnych. Dodatkowo rozszerzyliśmy metodę o mapowanie orientacji 3D (3DOM), rozszerzając jej użyteczność w złożonych badaniach biologicznych. Ponadto przedstawiliśmy dokładne wprowadzenie do rozbudowy istniejącego mikroskopu SIM o obrazowanie polaryzacyjne i dostarczyliśmy szczegółowy przewodnik konfiguracji Micro-Manager 2.0 do sterowania mikroskopem, umożliwiając podgląd obrazowania spolaryzowanego w czasie rzeczywistym. Dodatkowo dostarczyliśmy kod MATLAB do pełnej rekonstrukcji obejmujący zarówno pSIM, jak i 3DOM. Ten obszerny przewodnik ma na celu pomóc początkującym w szybkim opanowaniu i łatwym rozpoczęciu operacji.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia polaryzacyjna fluorescencyjna (FPM) stała się potężną techniką jednoczesnego obrazowania zarówno położenia, jak i orientacji dipolowej fluoroforów, oferując głęboki wgląd w obrazowanie biologiczne1,2. Ułatwiając obserwację orientacji biomolekuł, FPM odkrywa skomplikowane ułożenie makrocząsteczek, takich jak aktyna3,4,5, mikrotubula5, septin6, DNA filament7-9, jądrowy kompleks porów10 i białka błonowe11. Jego szybkie, nieinwazyjne i kompatybilne z żywymi komórkami możliwości pozwalają na śledzenie dynamiki rotacji molekularnej z wysoką rozdzielczością czasową11,12. Po zintegrowaniu z sondami bioforce, FPM nie tylko mapuje wielkości sił w rozdzielczości subkomórkowej, ale także mierzy kierunki sił, pogłębiając w ten sposób nasze zrozumienie procesów biomechanicznych poprzez ujawnienie kierunku sił13.

W ostatnich dziesięcioleciach mikroskopia polaryzacyjna o wysokiej rozdzielczości przeszła szybką ewolucję. Godnym uwagi postępem w tej dziedzinie jest mikroskopia lokalizacji orientacji pojedynczej cząsteczki, zwana również SMOLM, która może zlokalizować zarówno położenie, jak i orientację fluoroforów, umożliwiając w ten sposób wielowymiarową lokalizację. Pomiar polaryzacji w SMOLM można wykonać za pomocą modulacji wzbudzenia polaryzacji7, wielokanałowej detekcji polaryzacji class<="xref">3, lub zaprojektowanej funkcji rozproszenia punktów wrażliwych na polaryzację (PSF)14. Pomimo tego, że SMOLM osiąga rozdzielczość przestrzenną rzędu kilkudziesięciu nanometrów i mierzy polaryzację pojedynczych cząsteczek, cierpi z powodu wydłużonego czasu obrazowania. Wynika to z powtarzających się cykli mrugania i lokalizacji fluoroforu, które stanowią wyzwanie dla obrazowania z szybkością wideo i zastosowań w żywych komórkach.

Natomiast mikroskopia z polaryzacją oświetlenia strukturalnego (pSIM) oferuje rozdzielczość przestrzenną około do 100 nm, w połączeniu z pozyskiwaniem informacji o polaryzacji za pomocą tego samego zestawu danych SIM. Warto zauważyć, że pSIM może osiągać prędkości obrazowania z szybkością wideo i jest wysoce kompatybilny z obrazowaniem żywych komórek, bez rygorystycznych wymagań dotyczących cząsteczek fluorescencyjnych. Niedawno, pSIM z powodzeniem ujawnił strukturę pierścienia aktynowego w periodycznym szkielecie związanym z błoną (MPS)5 i umożliwił mapowanie sił biologicznych w superrozdzielczości13.

Jednak pSIM wymaga rekonstrukcji obrazu po akwizycji, co uniemożliwia wizualizację wyników polaryzacji w czasie rzeczywistym. Opóźnienie to utrudnia natychmiastową obserwację zjawisk biologicznych, uniemożliwiając naukowcom szybkie uchwycenie interesujących zjawisk biologicznych i dokonywanie korekt w czasie rzeczywistym próbek i warunków obrazowania. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy implementację open-source, która ułatwia pozyskiwanie obrazów oraz rekonstrukcję i wyświetlanie wyników polaryzacji w czasie rzeczywistym, opartą na platformie ImageJ i Micro-Manager (https://github.com/KarlZhanghao/live-pol-imaging).

Ponadto, podczas gdy pSIM został ograniczony do dostarczania informacji o polaryzacji 2D w płaszczyźnie, ostatnio rozszerzyliśmy jego możliwości o mapowanie orientacji 3D przy użyciu prawie tego samego sprzętu15, określane jako mapowanie orientacji 3D (3DOM). To oprogramowanie typu open source zapewnia również kontrolę, rekonstrukcję i wizualizację 3DOM. Moduły rekonstrukcji i wizualizacji są również kompatybilne z aplikacją do śledzenia orientacji pojedynczej cząsteczki. Wszystkie te funkcje zwiększają użyteczność obrazowania polaryzacyjnego w złożonych badaniach biologicznych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Rozszerzenie istniejącego mikroskopu oświetlenia strukturalnego do obrazowania polaryzacyjnego

  1. Przygotuj mikroskop SIM.
    UWAGA: Zakładamy, że czytelnicy mają pewne podstawy w konfiguracji mikroskopu i posiadają już mikroskop światła strukturalnego. Jeśli nie masz odpowiedniego doświadczenia, zapoznaj się z tym artykułem, który zawiera szczegółowy opis budowy mikroskopu SIM16. Jednostka sterująca polaryzacją "HWP+WQP+LCVR" może być zastąpiona przez płytkę fali wirowej pizzy w naszej pSIM work5 lub półfalową płytę do pizzy17.
  2. Zmierz współczynniki ekstynkcji polaryzacji w trzech kierunkach pasków, ładując różne wzorce do przestrzennego modulatora światła (SLM). Umieść i obróć polaryzator zaraz za obiektywem i użyj miernika mocy, aby zmierzyć moc lasera. W przypadku pSIM obróć płytkę falową, aby utrzymać polaryzację s w trzech kierunkach ze współczynnikiem ekstynkcji > 10.
  3. W przypadku 3DOM obróć HWP2, aby utrzymać polaryzację p w sześciu kierunkach. Zastąp maskę przestrzenną SIM maską przestrzenną 3DOM, aby umożliwić przejście wiązek 1-rzędowych o sześciu kierunkach (patrz Rysunek 1B).
    UWAGA: polaryzacja s jest wymagana w pSIM, podczas gdy polaryzacja p jest wymagana w 3DOM. Szczegółowa konfiguracja znajduje się w innym miejscu dla pSIM5 i 3DOM15.

2. Konfiguracja Micro-Managera

  1. Pobierz wersję Micro-Manager 2.0 z oficjalnej strony internetowej, zainstaluj oprogramowanie, postępując zgodnie z instrukcjami.
  2. Przygotuj odpowiednie sterowniki urządzeń i oprogramowanie, aby pomyślnie połączyć się z systemem Micro-Manager. W tym systemie mikroskopu użyj Micro-Manager do sterowania kamerą, stolikiem translacyjnym, laserem, płytą DAQ i mikroskopem.
    UWAGA: Obsługiwane instrumenty są wymienione w https://micro-manager.org/Device_Support. Zapoznaj się z tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat instrumentów, które mają być podłączone. Zainstaluj sterowniki lub oficjalne/pomocnicze oprogramowanie i podłącz instrument do komputera za pomocą USB.
  3. Dodaj instrumenty do Micro-Manager za pomocą Kreatora konfiguracji sprzętu.
    1. Otwórz oprogramowanie i wybierz Brak z początkowej listy rozwijanej.
    2. Wybierz urządzenia | Kreator konfiguracji sprzętu... | Utwórz nową konfigurację i kliknij przycisk Dalej, aby przejść do strony konfiguracji.
    3. Znajdź wtyczkę Camera / Laser / Stage / DAQ / microscope na rozwijanej liście sprzętu i kliknij Dodaj | Zgadzam się | Następny.
    4. Przejdź do Wybierz urządzenia domyślne i wybierz ustawienie automatycznej migawki. Ustaw Domyślną kamerę, Domyślną migawkę i Domyślny stopień ostrości. Klikaj przycisk Dalej, aż zostanie osiągnięty zapisz konfigurację i wyjście, a następnie zapisz nazwę pliku konfiguracyjnego. Kliknij przycisk Zakończ.
  4. Typowe ustawienia szablonu
    1. Zapisz szablon dla trybu na żywo i trybu przyciągania karty SIM.
    2. Ustaw czas ekspozycji i tryb wyzwalania w następujący sposób: wybierz Grupa ' +' w ustawieniach konfiguracji, nazwij nazwę grupy jako "Tryb", wybierz Ekspozycja i tryb wyzwalania, kliknij OK.
    3. Wybierz Preset '+', aby dodać różne presety dla grupy 'Mode'. Nazwij jedno ustawienie wstępne "na żywo" dla ustawień ekspozycji w trybie na żywo, a drugie "SIM" dla trybu SIM. Na przykład w trybie "na żywo" ustaw czas ekspozycji na 15 ms, natomiast w trybie SIM snap ustaw 10 ms dla czasu ekspozycji, a tryb wyzwalania to Standardowy (nakładanie się).
      UWAGA: Plik konfiguracyjny (MMConfig_psim_demo.cfg) znajduje się w naszym repozytorium kodu, który można załadować bezpośrednio przez Micro-Manager 2.0.

3. Kalibracja systemu za pomocą koralików fluorescencyjnych

  1. Zanurz szkiełka nakrywkowe w 75% etanolu, spłucz je 3x wodą dejonizowaną (ddH2O) i wysusz
    2. .
  2. Zmieszać kulki fluorescencyjne o długości fali 100 nm (rozcieńczone w stosunku 1:1 000 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami [PBS]) i odpipetować zawiesinę bezpośrednio na szkiełka nakrywkowe. Inkubować przez 5-10 minut w ciemnym otoczeniu, a następnie delikatnie przemyć PBS.
  3. Dodaj 20 μl podłoża mocującego na szkiełko mikroskopowe i umieść na nim szkiełko nakrywkowe, uważając, aby uniknąć pęcherzyków powietrza. Utrzymuj temperaturę na poziomie 4 °C i trzymaj szkiełko w ciemności, aby szkiełko z kulkami fluorescencyjnymi 100 nm było przygotowane do kalibracji systemu.
  4. W przypadku pSIM uzyskaj trzy obrazy trzech różnych faz koralików fluorescencyjnych. Niestandardowy kod MATLAB (Bead_calib.m) pobiera obrazy jako dane wejściowe i wyprowadza dwa obrazy kalibracyjne (calib1.tif, calib2.tif) do dalszej analizy.
    UWAGA: Jak pokazano wcześniej5, eksperyment z pSIM można przeprowadzić na większości komercyjnych systemów. Zarówno w mikroskopach domowych jak i komercyjnych SIM kalibracja systemu jest wymagana w celu wyeliminowania błędu pomiaru dipoli fluorescencyjnych, spowodowanego nierównomiernym oświetleniem w trzech kierunkach wzoru. Eksperyment kalibracyjny zakłada polaryzację izotropową kulek fluorescencyjnych i wymaga tylko surowych obrazów podczas akwizycji karty SIM. Szczegółowa procedura kalibracji jest zawarta w naszym autorskim work5. Wyjście dwóch obrazów kalibracyjnych calib1.tif i calib2.tif jest wymagane do rekonstrukcji pSIM, która wskazuje energię oświetlenia pikselowego w kierunku wzoru 2; 3 odnosi się do kierunku wzoru 1.

4. Przygotowanie próbki: aktyna w stałych komórkach

  1. Zanurzyć szkiełka nakrywkowe w 75% etanolu, spłukać szkiełka nakrywkowe 3x za pomocąddH2O. Umieścić szkiełka nakrywkowe na sześciodołkowej płytce do hodowli komórkowych.
  2. Hodowla komórek U2OS (linia komórkowa ATCC HTB-96) w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełniona 10% (v/v) płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na szkiełkach nakrywkowych, aż osiągną około 75% konfluencji.
  3. Delikatnie umyj komórki 3x PBS. W celu utrwalenia komórek zastosuj 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po utrwaleniu ponownie umyć komórki 3x PBS.
  4. Aby zwiększyć przepuszczalność błony, należy potraktować komórki 0,1% Triton X-100 w PBS przez 5 minut, a następnie przemyć komórki 3 razy PBS.
  5. Rozpuść fluorescencyjną falloidynę w 150 μl DMSO dla roztworu podstawowego (66 μM). Przygotować roztwór roboczy barwnika falloidyny, rozcieńczając 5 μl roztworu podstawowego w 995 μl PBS. Inkubować komórki w ciemności z roztworem roboczym barwnika falloidyny w temperaturze pokojowej przez ~ 1 godzinę. Myć komórki przez 3 x 3 minuty za pomocą PBS.
  6. Dodać 20 μl podłoża montażowego na szkiełko mikroskopowe. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku bez żadnych pęcherzyków powietrza. Przechowywać szkiełko w temperaturze 4 °C i przechowywać w ciemnym miejscu.

5. Przygotowanie próbki: λ-DNA in vitro

  1. Rozpuść 0,5 g metakrylanu polimetylu w 10 ml materiałów bazowych do protez. Po dokładnym rozpuszczeniu równomiernie nałóż roztwór na powierzchnię szkiełka, a następnie poczekaj, aż odparuje, aby utworzyć film.
  2. Rozcieńczyć 0,3 μl λ-DNA i 32 μl 1,000x SYTOX Orange Nucleic Acid Stain, w 968 μl PBS. Dodaj 1 μl przygotowanego roztworu do szkiełka i pozostaw do wyschnięcia.
  3. Uszczelnić szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym za pomocą elementu mocującego, aby chronić i zakonserwować próbkę. Przechowywać szkiełko w temperaturze 4 °C w ciemnym miejscu.

6. Obrazowanie

  1. Umieść szkiełko nakrywkowe na uchwycie próbki i dostosuj do płaszczyzny ogniskowej w trybie na żywo. Wybierz zwrot z inwestycji 512 x 512 pikseli i dostosuj czas ekspozycji oraz intensywność lasera.
  2. Otwórz niezależne oprogramowanie sterujące przestrzennego modulatora światła i wybierz odpowiednią ścieżkę sekwencji wzoru oświetlenia dla pSIM / 3DOM lub trybu live.
    UWAGA: W przypadku pSIM wzór oświetlenia obejmuje trzy różne kąty polaryzacji i trzy różne fazy. W przypadku 3DOM wzór oświetlenia obejmuje sześć różnych kątów polaryzacji.
  3. Wybierz tryb przechwytywania karty SIM, wybierz Multi-D Acq., wybierz Punkty czasowe i ustaw liczbę (9 lub 6 obrazów dla pSIM lub 3DOM) i interwał (0 ms) w otwartym oknie. Kliknij przycisk Pobierz!
  4. Kliknij TriggerSLM.bsh (plik konfiguracyjny znajduje się w naszym repozytorium kodu), karta akwizycyjna MyDaq aktywuje przestrzenny modulator światła w celu wykonania zdjęć.

7. Wtyczka podglądu na żywo pSIM i 3DOM

  1. Skonfiguruj FakeCamera i ścieżkę dostępu do obrazu: załaduj skrypt (MMConfig_FakeCam_demo.cfg), klikając Urządzenia | Załaduj konfigurację sprzętową.... Konfigurowanie lokalnego katalogu obrazów w obszarze Urządzenia | Przeglądarka właściwości urządzeń... | Maska ścieżki kamery (Rysunek 2A-C).
    UWAGA: Część skryptu dotycząca akwizycji zależy od konfiguracji sprzętowej, dlatego udostępniliśmy wersję (MMConfig_FakeCam_demo.cfg) wykorzystującą urządzenie FakeCamera do odczytywania lokalnych obrazów na dysku twardym w celu demonstracji. Użytkownicy mogą wprowadzać zmiany w naszej wersji. Pamiętaj o zmianie ścieżki odczytu obrazu (maska Camera-Path).
  2. Ustaw panel szybkiego dostępu, klikając Narzędzia | Panel szybkiego dostępu | Utwórz nowy panel. Kliknij ikonę Ustawienia w lewym dolnym rogu, naciśnij przycisk "Uruchom skrypt" w górnej części, która może załadować pliki "psim.bsh" i "3DOM.bsh" (Rysunek 2D) .
    UWAGA: System Panelu Szybkiego Dostępu umożliwia użytkownikom tworzenie niestandardowych okien i łatwy dostęp do kontrolek w Micro-Managerze, które są najczęściej potrzebne. Można również dodać 'Live', 'Snap' lub inne kanały, jak pokazano na Rysunek 2D.
  3. Biorąc za przykład pSIM, przeprowadź rekonstrukcję obrazu polaryzacji w czasie rzeczywistym, klikając na 'psim.bsh'; obserwuj obrazy zrekonstruowane w czasie rzeczywistym z wynikami polaryzacji (Rysunek 2E). Pamiętaj, aby zmienić ścieżkę obrazów kalibracji w pliku 'psim.bsh' (calibPath = " ścieżka do pliku obrazów kalibracji").
    UWAGA: Wtyczka podglądu na żywo to skrypt beanshell (psim.bsh i 3DOM.bsh), który można uruchomić w Panelu skryptów. Wtyczka pobiera dziewięć obrazów dla pSIM lub sześć obrazów dla 3DOM i oblicza wyniki mapowania orientacji na podstawie obrazów szerokiego pola. Obrazy mapowania orientacji są wyświetlane w celu dostarczenia informacji o polaryzacji w czasie rzeczywistym, co ułatwia natychmiastową kontrolę, pomimo niskiej rozdzielczości.

8. Analiza danych z rekonstrukcją w superrozdzielczości

  1. Zainstaluj MATLAB R2019b ze strony internetowej (patrz Tabela materiałów).
  2. Otwórz oprogramowanie; do rekonstrukcji pSIM uzyskaj dziewięć obrazów, składających się z trzech różnych faz dla każdego z trzech kątów orientacji. Upewnij się, że nazwy dziewięciu obrazów są od "1.tif" do "9.tif", umieść je w pliku o nazwie "Wejście" i uruchom program o nazwie "PSIM.m". Obserwuj zrekonstruowany obraz szerokokątny, obraz SIM i obraz pSIM za pomocą koła kolorów.
    UWAGA: Rekonstrukcja dla pSIM wymaga dwóch kroków: kroku SIM i kroku PM. Dane są analizowane przez niestandardowy program MATLAB w celu łatwiejszego debugowania. Pobierz kod rekonstrukcji z folderu "reconr" w usłudze GitHub.
  3. W przypadku 3DOM uchwyć sześć różnych figur kierunków polaryzacji. Połącz ze sobą sześć obrazów, nazwij wynikowy plik "Raw_data.tif" i uruchom program o nazwie "Recon_3DOM.m". Obserwuj zrekonstruowany obraz szerokokątny i obraz 3DOM z wynikami azymutalnymi i wynikami kąta biegunowego.
    UWAGA: Podczas procesu rekonstrukcji może wystąpić błąd '--'funkcja lub zmienna 'bfopen' nie jest rozpoznawana'. 'BFOPEN' to funkcja w bibliotece bioformatów i jest powszechnie używana do otwierania i odczytywania plików graficznych. Wpisz addpath ("path_to_bioformats_toolbox") w oknie poleceń MATLAB. Zastąp ciąg "path_to_bioformats_toolbox" rzeczywistą ścieżką do folderu biblioteki. Dodaliśmy również zależność Bio-Formats do repozytorium GitHub.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda pSIM może być wykonywana na mikroskopach SIM w oparciu o interferencję za pomocą wiązek laserowych spolaryzowanych w kształcie litery s. Interferencja polaryzacji s jest najczęściej używanym typem karty SIM i generuje paski świetlne o wysokim kontraście. Akademicki prototyp zestawu mikroskopowego jest zawarty w oryginalnej pracy pSIM5. Krótko wprowadzony w Rysunek 1, przestrzenny modulator światła (SLM) generuje wiązki dyfrakcyj...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W naszym badaniu opracowaliśmy wtyczkę, która umożliwia podgląd w czasie rzeczywistym dwóch technik obrazowania polaryzacji, pSIM i 3DOM. Obie technologie mogą być stosowane w istniejącym systemie SIM z niewielkimi modyfikacjami. Przedstawiliśmy szczegółowe kroki instalacji mikroskopu pSIM i 3DOM oraz skonfigurowania Micro-Managera do sterowania mikroskopem i pokazania, jak uzyskać wyniki polaryzacji w trybie podglądu na żywo. Wyniki eksperymentalne obejmują filament aktynowy zobrazowany za pomocą pSIM i λ-DNA zobrazowan...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2022YFC3401100).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Koraliki fluorescencyjne 100 nmInvitrogenF8801
4% roztwór formaldehyduInvitrogenR37814
KameraTucsenDhyana 400BSI V3https://www.tucsen.com/download-software/
Materiały bazowe do protez (typ I Typ utrwalający termicznie, płynny)New Century DentalN/A
Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s MediumGibcoC11995500BT
Eclipse TE2000 Mikroskop odwróconyNikonTE2000 E
Płodowa surowica bydlęcaGibco10099141C
MATLAB R2019bMathWorksWersja R2019bhttps://ww2.mathworks.cn/downloads/
MetroCon V4.0KopinWersja 4.0Oprogramowanie przestrzennego modulatora światła
Micro-Manager 2.0μ Μ anagerWersja 2.0Pobierz Micro-Manager Najnowsza wersja
MS-2000 XYZ Automated StageApplied Scientific InstrumentationMIM3https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/
myDAQNational Instruments781325-01Pliki do pobrania i sterowniki - NI
OBIS 561 nm LS 20 mW LaserCoherent1325777
Phalloidin-AF568InvitrogenA12380
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiCorning21-040-CV
Polimetakrylan metyluSolarbioM9810
ProLong DiamondInvitrogenP36980
Przestrzenny modulator światłaKopinSXGA-12
SYTOX pomarańczowe barwieniekwasem nukleinowymInvitrogenS11368
Triton X-100InvitrogenHFH10
TrypsynaGibco25200056
λ-DNAInvitrogenS11368

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
  2. Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging to single-molecule 3D orientation and localization microscopy. Optica. 10 (11), 1486-1510 (2023).
  3. Valades Cruz, C. A., et al. Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy. Pro Natl Acad Sci USA. 113 (7), E820-E828 (2016).
  4. Zhanghao, K., et al. Super-resolution dipole orientation mapping via polarization demodulation. Light Sci Appli. 5 (10), e16166(2016).
  5. Zhanghao, K., et al. Super-resolution imaging of fluorescent dipoles via polarized structured illumination microscopy. Nat Commun. 10 (1), 4694(2019).
  6. Vrabioiu, A. M., Mitchison, T. J. Structural insights into yeast septin organization from polarized fluorescence microscopy. Nature. 443 (7110), 466-469 (2006).
  7. Backer, A. S., Lee, M. Y., Moerner, W. E. Enhanced DNA imaging using super-resolution microscopy and simultaneous single-molecule orientation measurements. Optica. 3 (6), 659-666 (2016).
  8. Backer, A. S., et al. Single-molecule polarization microscopy of DNA intercalators sheds light on the structure of S-DNA. Sci Adv. 5 (3), eaav1083(2019).
  9. Hulleman, C. N., et al. Simultaneous orientation and 3D localization microscopy with a Vortex point spread function. Nat Commun. 12 (1), 5934(2021).
  10. Kampmann, M., Atkinson, C. E., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Mapping the orientation of nuclear pore proteins in living cells with polarized fluorescence microscopy. Nat Struct Mol Biol. 18 (6), 643-649 (2011).
  11. Lazar, J., Bondar, A., Timr, S., Firestein, S. J. Two-photon polarization microscopy reveals protein structure and function. Nat Methods. 8 (8), 684-690 (2011).
  12. Dong, B., et al. Parallel Three-Dimensional Tracking of Quantum Rods Using Polarization-Sensitive Spectroscopic Photon Localization Microscopy. ACS Photonics. 4 (7), 1747-1752 (2017).
  13. Blanchard, A., et al. Turn-key mapping of cell receptor force orientation and magnitude using a commercial structured illumination microscope. Nat Commun. 12 (1), 4693(2021).
  14. Toprak, E., et al. Defocused orientation and position imaging (DOPI) of myosin V. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (17), 6495-6499 (2006).
  15. Zhong, S., et al. Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution using polarization modulation. PhotoniX. 5 (1), 12(2024).
  16. Young, L. J., Ströhl, F., Kaminski, C. F. A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors. J Vis Exp. (111), e53988(2016).
  17. Huang, X., et al. long-term, super-resolution imaging with Hessian structured illumination microscopy. Nat Biotechnol. 36 (5), 451-459 (2018).
  18. Ando, R., et al. StayGold variants for molecular fusion and membrane-targeting applications. Nat Methods. 21 (4), 648-656 (2024).
  19. Hirano, M., et al. A highly photostable and bright green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 40 (7), 1132-1142 (2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Polarization MicroscopyPolarized Structured IlluminationSuper Resolution ImagingFluorescent DipolesLive Cell ImagingMicro Manager PluginReal Time Reconstruction3D Orientation MappingPolarization ImagingMATLAB Reconstruction Code
Video Coming Soon

Related Articles