Opracowaliśmy open-source'ową wtyczkę Micro-Manager, która umożliwia obserwację na żywo dipoli fluorescencyjnych na mikroskopie oświetlenia strukturalnego. Wtyczka obsługuje obserwację zarówno orientacji dipola 2D, jak i 3D.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Wtyczka Micro-Manager o otwartym kodzie źródłowym do obrazowania dipoli fluorescencyjnych w trybie podglądu na żywo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mikroskopia polaryzacyjna fluorescencyjna (FPM) może obrazować położenie i orientację dipolową fluoroforów. Pomimo osiągnięć mikroskopii polaryzacyjnej fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, ich zależność od obserwacji po akwizycji utrudnia obserwację w czasie rzeczywistym. Spolaryzowana mikroskopia oświetlenia strukturalnego (pSIM) oferuje obrazowanie dipoli fluorescencyjnych w superrozdzielczości z dużą szybkością obrazowania i doskonale nadaje się do zastosowań z żywymi komórkami. Opracowaliśmy implementację open-source do rekonstrukcji obrazów polaryzacyjnych w czasie rzeczywistym i wyświetlania dipoli fluorescencyjnych. Dodatkowo rozszerzyliśmy metodę o mapowanie orientacji 3D (3DOM), rozszerzając jej użyteczność w złożonych badaniach biologicznych. Ponadto przedstawiliśmy dokładne wprowadzenie do rozbudowy istniejącego mikroskopu SIM o obrazowanie polaryzacyjne i dostarczyliśmy szczegółowy przewodnik konfiguracji Micro-Manager 2.0 do sterowania mikroskopem, umożliwiając podgląd obrazowania spolaryzowanego w czasie rzeczywistym. Dodatkowo dostarczyliśmy kod MATLAB do pełnej rekonstrukcji obejmujący zarówno pSIM, jak i 3DOM. Ten obszerny przewodnik ma na celu pomóc początkującym w szybkim opanowaniu i łatwym rozpoczęciu operacji.
Wprowadzenie
Mikroskopia polaryzacyjna fluorescencyjna (FPM) stała się potężną techniką jednoczesnego obrazowania zarówno położenia, jak i orientacji dipolowej fluoroforów, oferując głęboki wgląd w obrazowanie biologiczne1,2. Ułatwiając obserwację orientacji biomolekuł, FPM odkrywa skomplikowane ułożenie makrocząsteczek, takich jak aktyna3,4,5, mikrotubula5, septin6, DNA filament7-9, jądrowy kompleks porów10....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Rozszerzenie istniejącego mikroskopu oświetlenia strukturalnego do obrazowania polaryzacyjnego
- Przygotuj mikroskop SIM.
UWAGA: Zakładamy, że czytelnicy mają pewne podstawy w konfiguracji mikroskopu i posiadają już mikroskop światła strukturalnego. Jeśli nie masz odpowiedniego doświadczenia, zapoznaj się z tym artykułem, który zawiera szczegółowy opis budowy mikroskopu SIM16. Jednostka sterująca polaryzacją "HWP+WQP+LCVR" może być zastąpiona przez płytkę fali wirowej pizzy w naszej pSIM work5 lub półfalową płytę do pizzy17. - Zmierz współczynniki eksty....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Metodę pSIM można przeprowadzać na mikroskopach SIM opartych na interferencji z wykorzystaniem wiązek laserowych o polaryzacji s. Interferencja polaryzacji s jest najszerzej stosowanym typem SIM i generuje wysoko kontrastowe prążki oświetlenia. Akademicki prototyp konfiguracji mikroskopu został przedstawiony w oryginalnej pracy dotyczącej pSIM5. Jak krótko przedstawiono na Rysunku 1, przestrzenny modulator światła (SLM) generuje wiązki.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W naszym badaniu opracowaliśmy wtyczkę, która umożliwia podgląd w czasie rzeczywistym dwóch technik obrazowania polaryzacji, pSIM i 3DOM. Obie technologie mogą być stosowane w istniejącym systemie SIM z niewielkimi modyfikacjami. Przedstawiliśmy szczegółowe kroki instalacji mikroskopu pSIM i 3DOM oraz skonfigurowania Micro-Managera do sterowania mikroskopem i pokazania, jak uzyskać wyniki polaryzacji w trybie podglądu na żywo. Wyniki eksperymentalne obejmują filament aktynowy zobrazowany za pomocą pSIM i λ-DNA zobrazowan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Narodowy Kluczowy Program Badań i Rozwoju Chin (2022YFC3401100).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Koraliki fluorescencyjne 100 nm | Invitrogen | F8801 | |
| 4% roztwór formaldehydu | Invitrogen | R37814 | |
| Kamera | Tucsen | Dhyana 400BSI V3 | https://www.tucsen.com/download-software/ |
| Materiały bazowe do protez (typ I Typ utrwalający termicznie, płynny) | New Century Dental | N/A | |
| Dulbecco' s Zmodyfikowany Orzeł" s Medium | Gibco | C11995500BT | |
| Eclipse TE2000 Mikroskop odwrócony | Nikon | TE2000 E | |
| Płodowa surowica bydlęca | Gibco | 10099141C | |
| MATLAB R2019b | MathWorks | Wersja R2019b | https://ww2.mathworks.cn/downloads/ |
| MetroCon V4.0 | Kopin | Wersja 4.0 | Oprogramowanie przestrzennego modulatora światła |
| Micro-Manager 2.0 | μ Μ anager | Wersja 2.0 | Pobierz Micro-Manager Najnowsza wersja |
| MS-2000 XYZ Automated Stage | Applied Scientific Instrumentation | MIM3 | https://www.asiimaging.com/support/downloads/usb-support-on-ms-2000-wk-controllers/ |
| myDAQ | National Instruments | 781325-01 | Pliki do pobrania i sterowniki - NI |
| OBIS 561 nm LS 20 mW Laser | Coherent | 1325777 | |
| Phalloidin-AF568 | Invitrogen | A12380 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Corning | 21-040-CV | |
| Polimetakrylan metylu | Solarbio | M9810 | |
| ProLong Diamond | Invitrogen | P36980 | |
| Przestrzenny modulator światła | Kopin | SXGA-12 | |
| SYTOX pomarańczowe barwienie | kwasem nukleinowymInvitrogen | S11368 | |
| Triton X-100 | Invitrogen | HFH10 | |
| Trypsyna | Gibco | 25200056 | |
| λ-DNA | Invitrogen | S11368 |
Bibliografia
- Zhanghao, K., Gao, J., Jin, D., Zhang, X., Xi, P. Super-resolution fluorescence polarization microscopy. J Innov Opt Health Sci. 11 (01), 1730002(2018).
- Alonso, M. A., Brasselet, S. Polarization microscopy: from ensemble structural imaging....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
