Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67757

⸱

13 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Suzhou Industrial Park Center for Disease Control and Prevention, 2Suzhou Medical College of Soochow University, 3MOE Education Key Laboratory of Geriatric Diseases and Immunology

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

Narażenie matki na drobny pył zawieszony (PM2.5), o średnicy aerodynamicznej 2.5 μm lub mniejszej, zostało powiązane z samoistnym poronieniem i różnymi chorobami wrodzonymi u ludzi. Mechanizmy leżące u podstaw tej przyczyny pozostają jednak niejasne. Zarodki danio pręgowanego są szeroko stosowane do badania toksyczności rozwojowej PM2,5, ale pomiar wewnętrznych poziomów wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych (WWA), głównych toksycznych składników PM2,5, stanowi wyzwanie. W tym badaniu opracowaliśmy szybką, łatwą, tanią, skuteczną, wytrzymałą i bezpieczną metodę wysokosprawnej chromatografii cieczowej (QuEChERS-HPLC) do oceny wewnętrznych poziomów 16 WWA wymienionych na liście priorytetowych zanieczyszczeń amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska (EPA). Zarodki danio pręgowanego traktowano ekstrahowalną materią organiczną (EOM) z PM2,5 przez 2-72 godziny po zapłodnieniu (hpf). Do przygotowania próbek wykorzystano metodę QuEChERS, a do analiz jakościowych i ilościowych WWA wykorzystano HPLC-FLD/DAD (HPLC z detektorem fluorescencyjnym i detektorem diodowym). Udało nam się wykryć sześć WWA (fenantren, antracen, fluoren, acenaften, fluoranten i piren) w zarodkach danio pręgowanego narażonych na PM2,5. Metoda ta ma kluczowe znaczenie dla badania mechanizmów toksyczności rozwojowej indukowanej przez PM2,5.

Wprowadzenie

Drobny pył zawieszony (PM2.5), o średnicy aerodynamicznej 2.5 μm lub mniejszej. jest głównym czynnikiem ryzyka środowiskowego. Ze względu na swoje niewielkie rozmiary PM2,5 jest w stanie przedostać się do układu krążenia i przeniknąć przez barierę matczyno-płodową. Badania epidemiologiczne powiązały narażenie matki na PM2,5 ze spontanicznym poronieniem i różnymi chorobami wrodzonymi1,2,3,4. Jednak mechanizmy leżące u podstaw embrionalnej toksyczności PM2,5 nie są dobrze poznane. WWA, główny toksyczny składnik PM2,5, są wysoce toksyczne dla ludzi ze względu na swoje właściwości mutagenne i rakotwórcze5,6. Spośród setek WWA, 16 zostało sklasyfikowanych jako zanieczyszczenia o wysokim priorytecie przez amerykańską Agencję Ochrony Środowiska (EPA).

Danio rerio, jest potężnym modelowym organizmem kręgowców ze względu na swoje genetyczne podobieństwo do ludzi, szybki rozwój, wysoki wskaźnik reprodukcji i łatwość utrzymania. Przezroczystość zarodków danio pręgowanego pozwala na bezpośrednią obserwację całego ciała pod mikroskopem, umożliwiając szczegółowe badania. Rozpuszczone WWA mogą przenikać do zarodków danio pręgowanego poprzez dyfuzję7. W wielu badaniach wykorzystano zarodki danio pręgowanego do zbadania toksycznych skutków i mechanizmów ekstrahowalnej materii organicznej (EOM) z PM2.58,9,10,11. Jednak większość z tych badań scharakteryzowała tylko 16 priorytetowych WWA w EOM, bez wykrycia wewnętrznych poziomów WWA w zarodkach danio pręgowanego12. Wyzwanie to może wynikać z niewielkich rozmiarów zarodków danio pręgowanego i złożoności macierzy embrionalnej.

Metoda Szybkiej, Łatwej, Taniej, Skutecznej, Wytrzymałej i Bezpiecznej (QuEChERS) jest innowacyjną techniką przygotowania próbek używaną do analizy pozostałości pestycydów, leków weterynaryjnych i innych zanieczyszczeń w próbkach żywności i środowiska13,14. W połączeniu z wysokosprawną chromatografią cieczową (HPLC), metoda ta została wykorzystana do wykrycia pestycydów u danio pręgowanego15. WWA, które zawierają dwa lub więcej pierścieni benzenowych, mają silne właściwości fluorescencyjne, dzięki czemu szczególnie nadają się do wykrywania za pomocą detektorów fluorescencyjnych. W tym badaniu opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę QuEChERS-HPLC do oceny poziomów 16 WWA w zarodkach danio pręgowanego narażonych na EOM.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przykładowe traktowanie

  1. Kolekcja PM2.5
    1. Zbieraj PM2,5 na filtrach z membraną kwarcową 47 mm.
      UWAGA: PM2,5 został zebrany w miejskim Suzhou w Chinach.
  2. Ekstrakcja EOM
    1. Pokrój filtr na kawałki i umieść w stożkowej szklanej kolbie ze 150 ml acetonitrylu.
    2. Ultradźwięki podsycić kolbę w temperaturze 35 °C przez 1 godzinę i przenieść ekstrakt do czterech probówek o pojemności 50 ml.
    3. Wirować przy 7 000 × g przez 20 minut, następnie przenieść supernatant do wyparki obrotowej i zagęścić go do około 5 ml.
    4. Odparować do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C i rozpuścić pozostałość w dimetylosulfotlenku (DMSO).
  3. Leczenie zarodków danio pręgowanego
    1. Utrzymuj danio pręgowanego w systemie recyrkulacyjnym w 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym ciemnym cyklu w temperaturze 28 °C16.
    2. Zebrać zapłodnione jaja (200 zarodków w grupie) i przenieść je na szklane szalki Petriego (szkło sodowo-wapniowe, 80 x 15 mm) z 30 ml wody z systemu recyrkulacyjnego.
    3. Dodać 30 μl EOM (10 mg/ml) do szklanej szalki Petriego zawierającej 200 zarodków w 2 godziny po zapłodnieniu (hpf). Nieleczone grupy służą jako ślepe kontrole.
      UWAGA: Końcowe stężenie EOM wynosi 10 mg/l, w oparciu o wskaźnik wad rozwojowych serca (rysunek uzupełniający S1).
    4. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 28 °C.

2. Przygotowanie próbki QuEChERS

  1. Wyjąć z inkubatora szalki z zarodkami w temperaturze 72 hpf. Umyj zarodki 3x czystą wodą.
  2. Przenieś zarodki do probówek o pojemności 1,5 ml (w zależności od grupy) i usuń nadmiar wody.
  3. Umieść probówki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 30 minut, aby liofilizować embyros17 i liofilizować je. Następnie zmiel zarodki za pomocą szklanej pałeczki.
  4. Dodaj 25 μl 16 zmieszanego roztworu wzorcowego WWA (2,0 μg / ml) do grupy kontrolnej DMSO, aby przetestować odzyskiwanie szczytów.
  5. Dodać 1 ml n-heksanu i wirować przez 30 s, a następnie ultradźwięki w temperaturze 35 °C przez 30 minut.
  6. Odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki.
  7. Powtórz kroki 2.5 i 2.6.
  8. Odparować zebrane supernatanty do sucha pod przepływem azotu w łaźni wodnej o temperaturze 35 °C.
  9. Dodaj 1 ml acetonitrylu i wiruj przez 30 s.
  10. Dodaj 10 mg pierwszorzędowej aminy drugorzędowej (PSA), 45 mg siarczanu magnezu i 15 mg szczeliwa C18, a następnie wiruj przez 30 sekund.
  11. Odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut i przenieść supernatant do świeżej probówki.
  12. Powtórzyć krok 2.9 i odwirować przy 7 000 × g przez 5 minut. Przenieść supernatant do świeżej probówki.
  13. Odparować supernatant do 0,5 ml w azocie.
  14. Przefiltruj przez mikroporowatą membranę 0,22 μm.

3. Oznaczanie WWA za pomocą HPLC

  1. Przygotować serię roztworów roboczych (w zakresie od 1 do 500 ng/ml) dla 16 WWA zmieszanego z acetonitrylem i wstrzyknąć je do chromatografu cieczowego, używając acetonitrylu i wody jako fazy ruchomej.
    1. Wstrzyknąć 20 μl i zastosować następującą procedurę elucji: 0-18,5 min, 40% acetonitrylu do 100% acetonitrylu; 18,5-28 min, 100% acetonitrylu; 28-29,5 min, 100% do 40% acetonitrylu; czas zatrzymania: 32 min; temperatura kolumny: 25 °C; natężenie przepływu: 1,8 ml/min. Wykreślić krzywą wzorcową ze stężeniami masowymi wzorcowych roztworów roboczych na osi x i odpowiadającymi im obszarami pików na osi y, obejmujący zakres od 5 ng/ml do 500 ng/ml.
      UWAGA: Długości fal wzbudzenia/emisji WWA można znaleźć w tabeli uzupełniającej S1.
  2. Wstrzyknąć oczyszczoną próbkę (z kroku 2.14) do chromatografu cieczowego za pomocą detektora fluorescencyjnego (FLD) i detektora diodowego (DAD).
  3. Zidentyfikuj obecność WWA, porównując czasy retencji i mierząc powiązane obszary pików.
    UWAGA: Stężenia masowe WWA zostały określone przy użyciu wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej z kroku 3.1.1.
  4. Obliczyć wewnętrzne stężenia 16 WWA na podstawie zmierzonych stężeń masowych próbek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Cała procedura ekspozycji na EOM, przygotowania próbek i detekcji PAH została przedstawiona na Rysunku 1. W przypadku HPLC-FLU/DAD za akceptowalny uznano stosunek sygnału do szumu wynoszący 3:1, przy zakresie detekcji od 0,3 do 5,0 ng/mL. Granice wykrywalności metody mieściły się w przedziale od 3,0 × 10-4 do 5,0 × 10-3 ng/organizm. Wszystkie krzywe kalibracyjne wykazały wysoką liniowość (r2 > 0,999). Wartości precyzji określone przy użyciu ekstraktów uzys...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zarodki danio pręgowanego są potężnym modelem kręgowców do badań toksyczności rozwojowej, ale ich niewielki rozmiar komplikuje wykrywanie półlotnych związków organicznych (SVOC), takich jak WWA. Podczas przygotowywania próbek kluczowe znaczenie ma zapobieganie zanieczyszczeniu zarodków danio pręgowanego. Właściwe czyszczenie próbek jest kluczowym krokiem w celu uniknięcia przenoszenia związków z pożywki ekspozycyjnej do ekstraktu próbki. Niepełne mycie może prowadzić do przeszacowania, podczas gdy nadmierne mycie może po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana finansowo przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (numer grantu: 81972999) oraz Suzhou Science and Technology Development Plan (Podstawowe Badania nad Zastosowaniami Medycznymi, SKY2023036 i SKY2023115).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16 Mieszanina WWA roztwory wzorcowe o2si Smart Solutions (Karolina Południowa, USA)110124-0616 Mieszane roztwory wzorcowe WWA  obejmuje naftalen (Nap), acenaftylen (Acy), ace-naften (Ace), fluoren (Flo), fenantren (Phe), antracen (Ant), fluoranten (grypa), piren (Pyr), benzo [a] antracen (BaA), chryzen(Chr), benzo [b] fluoranten (BbF), benzo [k] fluoranten (BkF),benzo [a] piren (BaP), inden [1,2,3-cd] piren (IcdP), dibenz [a, h]antracen (DahA), benzo [g,h,i] perylen (BghiP).
1260 Infinity II LC SystemAgilent Technologies (Santa Clara, Stany Zjednoczone)FLD(G1321A); DAD SL (G1315C)
AcetonitrylScharlab (Barcelona,Hiszpania)AC03661000rozpuszczalnik
CNWBOND HC-C18 SPE ANPEL Laboratory Technologies (Shanghai) Inc. (Szanghaj, CHINY)Szczeliwo SBEQ-CA0801C18 to szczeliwo z odwróconymi fazami o dobrej równowadze między hydrofilowym i hydrofobowym, które może dobrze adsorbować i oddzielać polarne i niepolarne związki organiczne
Ziemia okrzemkowaAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)12214013Do separacji, oczyszczania i usuwania zanieczyszczeń organicznych‌
Dyspersyjny SPE 15 mL, ENAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)5982-5056Filtr do oczyszczania próbek
ANPEL Laboratory Technologies (Szanghaj) Inc. (Szanghaj, CHINY)SCAA-104Filtr igłowy fazy organicznej (nylon), 0,22 i mikro; m
HexaneScharlab (Barcelona, Hiszpania)HE02481000rozpuszczalnik
MilliporeMerck (New Jersey, USA)Przygotuj ultraczystą wodę
Organomation - N-EVAP Nitrogen EvaporatorsOrganomation (Massachusetts, USA)Rozpuszczalniki do odparowywania
Sorvall ST4 PlusThermo Fisher Scientific (Waltham, USA)wirowanie
  Vortex- Genie 2 (G560E)Scientific Industries (Nowy Jork, USA)Vortex
ZORBAX Eclipse PAHAgilent Technologies, Inc (Santa Clara, USA)959990-918Ta kolumna jest powszechnie stosowana w systemach HPLC w celu uzyskania precyzyjnej i wiarygodnej analizy WWA.
.

Bibliografia

  1. Wang, H., et al. Association of maternal exposure to ambient particulate pollution with incident spontaneous pregnancy loss. Ecotoxicol Environ Saf. 224, 112653(2021).
  2. Grippo, A., et al. Air pollution exposure during pregnancy and spontaneous abortion and stillbirth. Rev Environ Health. 33 (3), 247-264 (2018).
  3. Tanner, J. P., et al. Associations between exposure to ambient benzene and pm2. 5 during pregnancy and the risk of selected birth defects in offspring. Environ Res. 142, 345-353 (2015).
  4. Feng, Y., et al. Global air pollution exposure and congenital anomalies: An updated systematic review and meta-analysis of epidemiological studies. Int J Environ Health Res. 34 (5), 2333-2352 (2024).
  5. Lin, Y., et al. Sources, transformation, and health implications of pahs and their nitrated, hydroxylated, and oxygenated derivatives in PM2.5 in Beijing. J Geophys Res-Atmos. 120 (14), 7219-7228 (2015).
  6. Chen, Y., et al. Determining priority sources of PM2.5-bound polycyclic aromatic hydrocarbons by their contribution to disability adjusted life years. Atmos Environ. 248, 118202(2021).
  7. Carls, M. G., et al. Fish embryos are damaged by dissolved pahs, not oil particles. Aquat Toxicol. 88 (2), 121-127 (2008).
  8. He, Y., et al. Developmental toxicity of the organic fraction from hydraulic fracturing flowback and produced waters to early life stages of zebrafish (Danio rerio). Environ Sci Technol. 52 (6), 3820-3830 (2018).
  9. Ren, F., et al. AHR-mediated ROS production contributes to the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Sci Total Environ. 719, 135097(2020).
  10. Manjunatha, B., Deekshitha, B., Seo, E., Kim, J., Lee, S. J. Developmental toxicity induced by particulate matter (PM2.5) in zebrafish (Danio rerio) model. Aquat Toxicol. 238, 105928(2021).
  11. Chen, J., Zhang, M., Aniagu, S., Jiang, Y., Chen, T. PM2.5 induces cardiac defects via AHR-SIRT1-PGC-1α mediated mitochondrial damage. Environ Toxicol Pharmacol. 106, 104393(2024).
  12. Zhang, H., et al. Crosstalk between AHR and Wnt/β-catenin signal pathways in the cardiac developmental toxicity of PM2.5 in zebrafish embryos. Toxicology. 355, 31-38 (2016).
  13. González-Curbelo, M., et al. Evolution and applications of the QuECHERS method. TrAC Trends Anal Chem. 71, 169-185 (2015).
  14. Wilkowska, A., Biziuk, M. Determination of pesticide residues in food matrices using the qQuECHERS methodology. Food Chem. 125 (3), 803-812 (2011).
  15. Zhao, C., et al. Acute toxicity and bioconcentration of pyrimorph in zebrafish, Brachydanio rerio. Pest Manag Sci. 67 (9), 1178-1183 (2011).
  16. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  17. Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR J. 53 (2), 192-204 (2012).
  18. Ji, C., et al. AHR-mediated m6A RNA methylation contributes to PM2.5-induced cardiac malformations in zebrafish larvae. J Hazard Mater. 457, 131749(2023).
  19. Alegbeleye, O. O., Opeolu, B. O., Jackson, V. A. Polycyclic aromatic hydrocarbons: A critical review of environmental occurrence and bioremediation. Environ Manage. 60 (4), 758-783 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

wykrywanie WWAprzygotowanie próbekdetektor fluorescencyjnydetektor macierzy diodowejekstrahowalna materia organicznatoksyczność rozwojowa
Zmodyfikowana metoda QuEChERS-HPLC do wykrywania wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych w zarodkach danio pręgowanego narażonych na działanie drobnych cząstek stałych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.