Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.
Artykuł metodologiczny
Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Danio pręgowany stał się ważnym organizmem modelowym do badań translacyjnych na ludziach, testowania toksyczności małych cząsteczek i zanieczyszczeń środowiska, odkrywania leków terapeutycznych i innych zastosowań badań biomedycznych. Przedstawiony protokół ma na celu zapewnienie jasnego przewodnika do badań przesiewowych leków i badań toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium (w wieku 3-7 dni po zapłodnieniu, dpf). Opublikowano kilka metodologii opisujących badania toksyczności na larwach danio pręgowanego, choć brakowało w nich znormalizowanego protokołu dotyczącego m.in. czasu ekspozycji, szybkości zmian pożywki i oceny morfologii. Eksperymentalnie określiliśmy idealny wiek larw do przeprowadzenia eksperymentów, rozmiary płytek, które najlepiej sprawdzają się w tym wieku, szybkość zmian pożywki, która zapewnia wiarygodne wyniki przy jednoczesnym ograniczeniu marnotrawstwa badanego związku oraz system oceny morfologii, który jest łatwo mierzalny w sposób statystyczny. Manuskrypt szczegółowo opisuje protokół badania toksyczności u larw zebry danio pręgowanego w wieku od 3 do 7 dpf, mający na celu wypełnienie luki w testach toksyczności leków i podjęcie pierwszego kroku w kierunku znormalizowanej metody podobnej do badania ostrej toksyczności zarodków ryb.
Wprowadzenie
Danio rerio) ostatnio pojawiły się jako potężny organizm modelowy kręgowców, stając się coraz bardziej popularne wśród badań nad rozwojem badań biomedycznych1. Około 70% ludzkich genów kodujących białka ma co najmniej jeden ortolog danio pręgowanego, a ~82% genów powodujących choroby u ludzi ma co najmniej jeden gen ortologiczny u danio pręgowanego2. Ochrona genetyczna w połączeniu z podobnymi podstawowymi wzorcami i morfologią narządów sprawiają, że danio pręgowany jest interesującym modelem do badań nad chorobami człowieka, pozwalającym na porównania międzygatunkowe na poziomie molekularnym1,2,3, co ma kluczowe znaczenie dla rozwoju leków.
Danio pręgowany rozwija się szybko, pączek ogonowy tworzy się po 10 godzinach od zapłodnienia (hpf), a pierwsze somity pojawiają się po 16 hpf. Zarodki wyłaniają się z kosmówki po ~2-3 dniach od zapłodnienia (dpf). Po 4 dpf ich przewód pokarmowy jest w pełni rozwinięty, a po 5 dpf ich pęcherz pławny napompował się, co pozwala im swobodnie pływać i polować na pożywienie. Pomimo zdolności do żerowania przez 5 dpf, larwy, które nie są karmione, mogą przetrwać wyłącznie na składnikach odżywczych pochodzących z żółtka do co najmniej 7 dpf, omijając potrzebę zewnętrznego karmienia, które może powodować zanieczyszczenie i zakłócać badania przesiewowe leków, toksykologię i testy behawioralne4. Do 7 dpf larwy rozwijają również kompletny plan ciała z kilkoma podstawowymi układami narządów, w tym sercem i naczyniami krwionośnymi, mięśniami i kośćmi5,6. Zarodki danio pręgowanego są również zapładniane ex vivo, rozwijają się zewnętrznie i są optycznie przezroczyste we wczesnych stadiach życia, co czyni je wysoce dostępnymi do edycji genów i badań przesiewowych małych cząsteczek3. Dodatkowo, ich mały rozmiar i wysoki wskaźnik płodności pozwalają na włączenie większej liczby powtórzeń, co zwiększa moc statystyczną, a także na zastosowanie płytek wielodołkowych, co pozwala zaoszczędzić na objętości leku i zwiększa przepustowość.
Badanie przesiewowe nowych małych cząsteczek w modelu zwierzęcym jest ważne dla określenia zdolności leków do wywoływania zarówno korzystnych, jak i niekorzystnych efektów, a tym samym określenia, które związki są zdolne do dalszych testów, a inne, które mogą wymagać modyfikacji w celu zmiany ich aktywności. W ramach procesu badań przesiewowych leków należy określić stężenie śmiertelne 50 (LC50) docelowego związku/ów. Zapewnia to stężenie robocze, które powoduje śmierć u 50% badanych zwierząt w ramach wstępnych badań toksyczności.
Istnieje standardowy protokół do badania toksyczności na zarodkach danio pręgowanego do 96 godzin po zapłodnieniu (hpf), a mianowicie test ostrej toksyczności zarodków ryb (FET) (TG236)7. W teście FET nowo zapłodnione jaja są wystawione na działanie pięciu stężeń substancji chemicznej przez okres do 96 godzin i obserwowane pod kątem oznak śmiertelności, a mianowicie (i) krzepnięcia jaj, (ii) braku tworzenia somitów, (iii) braku oderwania się pąka ogonowego od woreczka żółtkowego oraz (iv) braku bicia serca. Badanie pozwala na określenie toksyczności ostrej i LC50. Ponadto zaleca również między innymi rozmiary komór testowych do wykorzystania do badań przesiewowych (płytki 24-dołkowe), rozmieszczenie jaj w komorze testowej oraz warunki przetrzymywania, zapewniając ważne i powtarzalne wyniki7.
Chociaż test FET nadaje się do testowania toksyczności w stadium embrionalnym, nie przekracza 4 dpf. W przypadku fenotypów, które zaczynają się rozwijać mniej więcej w tym momencie (np. mineralizacja klasy notochord6), badania przesiewowe leków muszą być prowadzone dalej niż 4 dpf, aby umożliwić ocenę morfologiczną takiej tkanki. Ponadto zalecamy, aby ekspozycja na lek rozpoczęła się co najmniej dzień przed rozwojem fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. O ile nam wiadomo, nie istnieje żaden znormalizowany protokół podobny do FET do badań przesiewowych leków u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium, szczególnie u danio pręgowanego w wieku od 3 do 7 dpf. Chociaż opublikowano kilka badań opisujących testowanie narkotyków na larwach danio pręgowanego powyżej 4 dpf, brakuje spójności w zastosowanej metodologii, w tym wielkości komór testowych, liczbie biologicznych i technicznych powtórzeń, szybkości zmian pożywki, czasie ekspozycji i ocenianych wadach morfologicznych8,9,10,11,12,13. Z tego powodu opracowaliśmy zatwierdzony protokół standaryzowanych testów toksyczności, a następnie obserwację wizualną zmian morfologicznych larw danio pręgowanego przy 3-7 dpf. Proponowany protokół może być następnie wykorzystany do innych dalszych testów fenotypowania, takich jak analiza behawioralna, profilowanie ekspresji genów i histomorfometria.
Protokół
Danio pręgowany był traktowany zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Wydziałową Komisję Etyki Badań Naukowych (FREC) oraz Wspólny Podkomitet Sektorowy ds. Badań nad Zwierzętami FREC (JFARSS) Uniwersytetu Maltańskiego. Schemat blokowy proponowanego protokołu można znaleźć w Rysunek 1.
1. Produkcja, zbieranie i utrzymanie jaj
- Umieść ryby w zbiornikach hodowlanych dzień wcześniej, co najmniej godzinę po ostatnim karmieniu, z przegrodami oddzielającymi samce i samice. Aby uzyskać lepsze wyniki produkcji jaj, użyj wyższego stosunku samic do samców. Umieść rybę w pomieszczeniu wyposażonym w cykl 14 h:10 h światło/ciemność i w temperaturze otoczenia 27-28 °C.
UWAGA: Zbiornik hodowlany o pojemności 1 litra może pomieścić trzy dorosłe ryby, podczas gdy zbiornik hodowlany o pojemności 1,7 litra może pomieścić pięć dorosłych ryb. - Następnego ranka, po nadejściu światła, wymień wodę w zbiornikach hodowlanych i usuń przegrody. W przypadku, gdy zbiornik hodowlany nie jest łatwo nachylony, umieść go w pozycji pochyłej, aby zapewnić dostęp do płytkiej wody w celu promowania krycia. W przypadku powolnej produkcji jaj i aktywności godowej należy wymieniać wodę w zbiornikach hodowlanych co 45 minut. Pozostaw rybę do krycia na maksymalnie 3 godziny lub w razie potrzeby.
- Po zakończeniu krycia delikatnie ściśnij wszystkie samice, które nie złożyły jaj, aby zapobiec długotrwałemu wiązaniu jaj. Umieść ryby z powrotem w odpowiednich zbiornikach.
- Zebrać jaja w zbiornikach hodowlanych za pomocą sitka siatkowego, spłukać wodą z zarodków (E3) i umieścić na szalce Petriego z E3. Aby przygotować E3, zmieszaj 16,67 ml 60x E3 (300 mM NaCl; 10 mM KCl; 20 mM CaCl2,2H 2O; 20 mM MgSO4,7H 2O) z 1 ml 0,01% błękitu metylenowego i 982 ml wody dejonizowanej. Usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub zanieczyszczenia. Upewnij się, że szalki Petriego nie są zatłoczone, z 50 jajami na szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i 120 jaj na szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm.
- Jaja należy przechowywać w inkubatorze ustawionym na temperaturę 28,5 °C i wyposażonym w cykl dzień/noc 14 godz. i 10 godzin. Przy 1 dpf odśwież E3 i usuń niezdolne do życia jaja, aby ograniczyć rozwój grzybów.
2. Przygotowanie płytki testowej
- W temperaturze 3 dpf przenieść jeden zdrowo wyglądający, wykluty zarodek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl ustawionej na objętość 100 μl.
UWAGA: Nie należy wykorzystywać zarodków, które nie wykluły się, ponieważ może to spowodować zmienny wychwyt związku. Korzystanie z zarodków, które wydają się zdrowe, również ogranicza stronniczość podczas testów. Rozmiar końcówki pipety pozwala na łatwe pobranie zarodka danio pręgowanego bez powodowania jakichkolwiek uszkodzeń fizycznych. Ponadto mikropipeta pozwala na lepszą kontrolę objętości dozowanej do studzienki w przeciwieństwie do pipety transferowej. - Na płytce 12-dołkowej należy przygotować pożądane stężenie (stężenia) dla każdej badanej substancji chemicznej w oddzielnych studzienkach (w tym przypadku bosutynib w zakresie stężeń od 100 μM do 6,25 μM). Do każdej studzienki dodać niezbędną objętość badanej substancji chemicznej za pomocą mikropipet i uzupełnić do 2,4 ml przy użyciu E3.
UWAGA: Należy przeprowadzić przegląd literatury w celu określenia odpowiednich stężeń, które należy stosować w odniesieniu do odpowiednich badanych substancji chemicznych. Jeżeli brak jest dostępnych informacji, można przeprowadzić próbę kilku stężeń, aż do ustalenia odpowiedniego zakresu stężeń. Należy użyć co najmniej pięciu stężeń, przy czym najwyższe stężenie powoduje 100% śmiertelność, a najniższe stężenie nie powoduje zauważalnego efektu7. - Przygotować kontrolę nośnika w zależności od rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia podstawowej badanej substancji chemicznej.
UWAGA: Wiele badanych związków nie jest rozpuszczalnych w wodzie i z tego powodu należy je rozpuścić w określonych rozpuszczalnikach ("nośnikach"), takich jak etanol lub dimetylosulfotlenek (DMSO), aby wytworzyć roztwór wodny. DMSO nie powinien przekraczać stężenia 1%, gdy jest stosowany jako kontrola nośnika, co jest stężeniem uznanym za bezpieczne u danio pręgowanego14. - Za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl usunąć roztwór E3 znajdujący się na płytce 96-dołkowej i zastąpić go 100 μl odpowiedniego badanego podłoża. Pamiętaj, aby przetestować łącznie 24 larwy na stężenie. Za pomocą jedno- lub 8-kanałowej mikropipety o pojemności 200 μl należy przenieść badane substancje chemiczne do odpowiednich studzienek na płytkę badawczą. Obejmuje kontrole (np. E3, nośnik chemiczny, kontrole dodatnie itp.).
UWAGA: Układ płytek mieści do czterech różnych badanych substancji chemicznych lub czterech różnych stężeń tej samej substancji chemicznej. Przykład płytek testowych ustawionych do badania pięciu stężeń tej samej substancji chemicznej (np. Bosutinibu) wraz z kontrolami jest pokazany na Rysunek 1. - Po 24 godzinach od ekspozycji należy przeprowadzić ocenę morfologiczną (zgodnie z opisem w sekcji 3) i zmianę pożywki o połowę, usuwając 50 μl pożywki i zastępując ją świeżo przygotowaną pożywką. Usuń i zapisz wszelkie martwe larwy w tym procesie. Larwy należy przechowywać w inkubatorze nastawionym na temperaturę 28,5 °C i wyposażonym w cykl dzień/noc trwający 14 godzin: 10 godzin. Powtarzaj proces do 7 dpf.
3. Ocena morfologiczna
- Za pomocą stereoskopowego mikroskopu świetlnego obserwować poszczególne badane larwy w odpowiednim powiększeniu.
UWAGA: Przykłady wad morfologicznych, które można ocenić, przedstawiono w tabeli 1. - Niech morfologia zostanie oceniona przez dwóch niezależnych oceniających, przy czym trzeci z nich jest konsultowany w przypadku nieporozumień między dwoma oceniającymi.
- Oceń morfologię za pomocą metody binarnej (tj. obecny/nieobecny), gdzie "nieobecny" oznacza normalną morfologię (ocenianą jako "0"), a "obecny" wskazuje na obecność nieprawidłowości morfologicznej (oceniany jako "1"). Rysunek 2 pokazuje przykłady danio pręgowanego przy 5 dpf po 2 dniach ekspozycji na lek, w tym niedotkniętego danio pręgowanego (Rysunek 2A), danio pręgowanego z łagodnym obrzękiem osierdzia (Rysunek 2B), ciężki obrzęk osierdzia z krwotokiem żółtkowym i wydłużeniem żółtka (Rysunek 2C), opóźniony rozwój ze zmniejszoną pigmentacją, pęcherzem pławnym i całkowitą długością (Rysunek 2D), spuchnięte żółtko i załamana płetwa ogonowa (Ryc. 2E), brak płetwy ogonowej (Ryc. 2F), zakrzywiona struna grzbietowa (Rycina 2G), obcięcie (Rycina 2H) i śmierć z martwicą (Rycina 2I). Oceniaj wszystkie nieprawidłowe fenotypy jako "1", a zdrowe danio pręgowane jako "0".
4. Wyznaczanie LC50
- Po dokonaniu oceny morfologii należy sporządzić wykres łącznej śmiertelności procentowej przy 7 dpf w stosunku do stężenia. Przykład jest pokazany w Rysunek 3. Użyj krzywej stężenia, aby oszacować stężenie, które powoduje 50% śmiertelności.
- Po oszacowaniu stężenia LC50 powtórz eksperyment opisany powyżej, wystawiając 24 larwy replik na 96-dołkowej płytce na to pojedyncze oszacowane stężenie LC50.
5. Repliki techniczne
- Powtórz całą procedurę, używając wybranych pięciu stężeń tej samej substancji chemicznej co najmniej dwa razy więcej przy dwóch różnych okazjach, aby upewnić się, że wyniki są powtarzalne.
Wyniki
Nieprawidłowości można analizować indywidualnie lub skumulowanie w czasie trwania eksperymentu aż do 7 dpf. Maksymalną ocenę morfologiczną dla danej nieprawidłowości można wykorzystać do obliczenia odsetka nieprawidłowości morfologicznych w stosunku do liczby użytych larw. Na przykład, jeśli w 7. dniu oceny morfologiczne obrzęku osierdzia wynoszą odpowiednio 19 i 20 dla oceniającego 1 i 2, z maksymalną możliwą liczbą 24 (co oznacza, że 19 lub 20 z 24 larw wykazuje obrzęk osierdzia), wynik procentowy można obliczyć w następujący sposób:
Tabela uzupełniająca S1 przedstawia wyniki oceny morfologii (obu oceniających) w 4 dpf po testach toksyczności związku Bosutinib, inhibitora tyrozynowej kinazy wskazanego w leczeniu przewlekłej białaczki szpiczastej15. Tę samą ocenę morfologii powtórzono dla eksponowanych ryb w wieku od 5 dpf do 7 dpf. Związek testowano w zakresie stężeń od 100 µM do 6,25 µM. Przeprowadzono trzy powtórzenia techniczne w różnych punktach czasowych, a średnią skumulowaną śmiertelność w 7 dpf wykorzystano do wyznaczenia LC50, czyli stężenia, przy którym przeżywa 50% larw. LC50 można wyznaczyć dla dowolnego punktu czasowego ekspozycji. Zalecamy jednak obliczenie tej wartości w 7 dpf.
Skumulowaną średnią śmiertelność w 7. dniu po zapłodnieniu (dpf) wykorzystano do wygenerowania krzywej LC50, przedstawionej na Rysunku 3. Dla Bosutinibu stężenie LC50 oszacowano na 37,95 µM.
UWAGA: Ta szacowana koncentracja LC50 odnosi się ściśle do tego systemu modelowego i może być następnie wykorzystana w dalszych analizach fenotypowych.
Rycina 1: Schemat proponowanego przesiewania leków w larwach w 3-7 dpf. Płytki testowe z 96 dołkami są przygotowane do badania pięciu stężeń związku Bosutinib w zakresie od 100 µM do 6,25 µM. Skrót: dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 2: Reprezentatywne wady morfologiczne zaobserwowane u larw danio pręgowanego w 5 dpf wystawionych na działanie różnych stężeń substancji chemicznych (w 2 dni po ekspozycji). (A) Kontrolne (zdrowe) danio pręgowane, (B) Larwa danio pręgowanego z łagodnym obrzękiem osierdzia, (C) Danio pręgowane z ciężkim obrzękiem osierdzia i krwotokiem do worka żółtkowego, (D) Danio pręgowane z opóźnieniem rozwojowym, zmniejszoną pigmentacją, małym pęcherzem pławny, (E) Danio pręgowane z obrzękniętym żółtkiem i zagiętą płetwą ogonową, (F) Danio pręgowane z brakiem płetwy ogonowej, (G) Danio pręgowane z zakrzywioną notochordą, (H) Danio pręgowane z uciętym ogonem oraz (I) Martwe danio pręgowane z martwicą. Wady zaznaczono czerwonymi grotami strzałek. Paski skali = 1 mm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: LC50 krzywa przedstawiająca zależność stężenia od procentowej śmiertelności. Przetestowano pięć stężeń: 100 µM, 50 µM, 25 µM, 12.5 µMi 6.25 µM, przy czym śmiertelność wyniosła odpowiednio 100%, 100%, 29,2%, 12,5% i 12,5%. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Defekty morfologiczne | Opis |
| Obrzęk osierdzia | Gromadzenie się płynu wokół serca z rozciągnięciem serca i zaburzeniami krążenia krwi |
| Tętno (uderzeń na minutę) | Zmniejszona liczba uderzeń na minutę |
| Żółtko | Obecność lub brak obrzęku worka żółtkowego lub krwawienia, które mogą wystąpić równocześnie z wadami serca |
| Wydłużenie żółtka | Żółtko obrzęknięte, cienkie lub nieobecne |
| Zakrzywiona notochorda | Obecność załamania lub pofalowania notochordu i/lub zakrzywienie ogona |
| Pęcherz pławny | Obecność, brak lub częściowy rozwój pęcherza pławnego |
| Pigmentacja | Mniejsza liczba melanocytów lub ich brak w porównaniu z nieleczonymi rybami w tym samym wieku |
| Nekroza | Obecność (łagodna lub ciężka) lub brak martwicy w dowolnej części ciała |
| Opóźniony rozwój | Opóźniony rozwój lub zahamowanie wzrostu w porównaniu z kontrolnymi osobnikami typu dzikiego w tym samym wieku. |
| Reakcja na dotyk | Opóźniona lub brak odpowiedzi po wywołaniu odruchu przestrachu (np. przy użyciu końcówki do pipety) |
| Truncacja | Brak tylnej części ciała danio pręgowanego (tj. brak formowania się ogona) |
| Płetwy | Obecność lub brak płetwy ogonowej, którym może towarzyszyć cienkie przedłużenie żółtka |
| Zredukowana oś ciała | Ryby, które wyglądają prawidłowo, lecz po pomiarze okazują się mieć mniejszą długość ciała |
Tabela 1: Lista wizualnych defektów morfologicznych, które można zaobserwować po badaniach nad ekspozycją na leki.
Tabela uzupełniająca S1: Reprezentatywne wyniki morfologiczne dla Bosutinibu w 4. dniu po zapłodnieniu (1 dzień po ekspozycji). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Dyskusja
Danio pręgowany stał się ważnym modelem badań przesiewowych leków. Próbując określić metodologię przeprowadzania badań toksyczności, znaleźliśmy kilka kontrastujących ze sobą metod z różnych laboratoriów 8,9,10,11,12,13. Opisane metody wykorzystują larwy w różnym wieku, zmienne ramy czasowe eksperymentów, różne tempo zmian pożywki i różne systemy punktacji morfologicznej. Metodą prób i błędów ustaliliśmy opisaną metodologię, która zapewniła wiarygodne i powtarzalne wyniki.
Wybór rozmiaru talerza
Początkowo eksperymenty przeprowadzono na 24-dołkowej płytce, aby upewnić się, że larwy mają wystarczająco dużo miejsca do poruszania się i wzrostu. Płytki umieszczono z 10 larwami na studzienkę, dwoma dołkami na stężenie i 1 ml roztworu leku na studzienkę. Taki układ nie zapewniał powtarzalnych wyników, co prowadziło do wniosku, że larwy nie wchłaniały równych ilości leku ze studni. Następnie przeprowadzono próby na 96-dołkowej i 48-dołkowej płytce z jedną larwą na studzienkę, co wykazało, że larwy w 96-dołkowych płytkach nie wykazywały żadnych problemów ze wzrostem. W związku z tym eksperymenty kontynuowano na 96-dołkowej płytce, wykorzystując mniej miejsca i objętości leku.
Dzienna zmiana podłoża
Ponieważ danio pręgowany wchłania lek z pożywki, ustaliliśmy, że do utrzymania stałego stężenia leku w pożywce potrzebny jest pewien stopień zmiany podłoża. Co więcej, zmiana podłoża usuwa potencjalne odpady nagromadzone w studni, które mogą stanowić toksyczne środowisko i prowadzić do stronniczych wyników. Przeprowadzono badanie z bosutynibem, w którym ustawiono trzy płytki dla tego samego leku, jedną bez codziennej zmiany pożywki, jedną z codzienną połową zmiany pożywki i jedną z pełną dzienną zmianą pożywki. Podczas gdy płytka bez zmiany pożywki wykazywała zwiększoną śmiertelność, płytki z połową i pełną zmianą pożywki dały ten sam wynik o 7 dpf. W związku z tym zdecydowano się na dzienną zmianę o połowę średniej. Taki wybór zapewnia mniejsze zużycie drogiego i ograniczonego materiału testowego, który może być wymagany do dalszych eksperymentów.
Czas ekspozycji
Wiek użytych larw testowych i czas ekspozycji na lek wybrany w tym protokole był zależny od fenotypu będącego przedmiotem naszego zainteresowania, jakim jest mineralizacja kości. Ponieważ tworzenie kości rozpoczyna się przy ~4 dpf, zdecydowaliśmy się rozpocząć od danio pręgowanego przy 3 dpf, aby ustalić, czy badane substancje chemiczne wpłynęły na początek rozwoju kości. Następnie zakończyliśmy badania ekspozycji na leki na poziomie 7 dpf, ponieważ wysoki stopień śmiertelności obserwowano od 8 dpf w związku z brakiem karmienia, które mogłoby zniekształcić wyniki. Niemniej jednak ramy czasowe mogą być dostosowywane w zależności od charakteru badania i fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania.
Ograniczenia
Metodologia ta ma pewne ograniczenia. Przenoszenie danio pręgowanego o wartości 3 dpf na wielodołkowe płytki testowe jest czasochłonne. Usuwanie pożywki ze studzienek bez zbierania larw jest równie pracochłonne. Pożywkę należy powoli usuwać z każdej studzienki za pomocą pipety jednokanałowej, upewniając się, że larwy nie zostaną uszkodzone w tym procesie. Ponadto, podczas gdy codzienna wymiana połowy pożywki uzupełnia badany związek i zapewnia usunięcie odpadów z odwiertu, nie gwarantuje to utrzymania stabilnego stężenia leku w studni przez 5 dni ekspozycji. Podczas gdy analiza wysokosprawnej chromatografii cieczowej może dostarczyć dalszych informacji na temat rzeczywistej ilości leku wchłanianego przez każdą larwę, test nie kwalifikuje się już jako wysokoprzepustowa metoda przesiewowa.
Podsumowując, metodologia ta ma na celu wypełnienie luki w testach toksyczności przy użyciu danio pręgowanego powyżej 4 dpf, podejmując kroki w kierunku znormalizowanego protokołu mającego zastosowanie do linii do danio pręgowanego typu dzikiego, zmutowanego i transgenicznego, który jest na równi z FET na etapie embrionalnym. Otwiera to możliwości dla innych dalszych testów fenotypowania, które mogą nie być możliwe na wcześniejszych etapach.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Autorzy są wspierani przez projekty ZeEBRA (R&I-2019-018), fundusz Programu Rozwoju Technologii (TDP), STRONG (R&I-2024-007L), fundusz TDPLite, NASDAC (SINO-MALTA-2022-08), grant Współpracy Naukowej i Technologicznej oraz DEMONSTROWAĆ (R&I-2018-007A), grant Go2Market, wszystkie finansowane przez XjenzaMalta dla i w imieniu Fundacji na rzecz Nauki i Technologii. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do mikrowirówek 1,5 ml | Starlab | E1415-1510 | |
| 10 µ Mikropipeta L (P10) | Gilson | F144802 | |
| 10/20 i mikro; L końcówki do pipet | Starlab | S1110-3810 | |
| 1000 µ Mikropipeta L (P1000) | Gilson | F123602 | |
| 1000 &mikro; L końcówki do pipet | Starlab | S1111-6001 | |
| 12-dołkowa płytka | Starlab | CC7672-7512 | Sterylna, pojedynczo owinięta, niepoddana obróbce, z pokrywką |
| 20 i mikro; L mikropipeta (P20) | Gilson | F123600 | |
| 200 i mikro; Mikropipeta L (P200) | Gilson | F123601 | |
| 200 i mikro; Pipeta wielokanałowa L | Gilson | F81024 | |
| 200 & mikro; L końcówki do pipet | Starlab | S1113-1006 | |
| 96-dołkowa płytka | Starlab | CC7672-7596 | Sterylne, pojedynczo owinięte, z płaskim dnem, bez obróbki, z pokrywką |
| Zbiorniki hodowlane z wewnętrznym pochyłym dnem, przegrodami i pokrywami | Tecniplast | ZB17BTISLOP, ZB17BTE, ZB17BTL, ZB17BTD | Nachylony zbiornik wewnętrzny |
| Sitko siatkowe | / | / | |
| Rękawice nitrylowe | Mercator | / | / |
| szalka Petriego | Starlab | CC7672-3394/CC7672-3359 | 100 x 20 mm lub 60 x 15 mm |
| Leica M205 FCA Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjny | Leica | 10450826 | |
| Inkubator chłodzony Peltierem z 2 półkami z modułem świetlnym zimny biały | Memmert | IPP110ecoplus, T8 | Wyposażony w cykl |
| Dimetylosulfotlenek | Biochem Chemopharma | 504341000 | Aby przygotować 1% roztwór w E3 |
| Dwuwodny chlorek wapnia | Biochem Chemopharma | 303080500 | Aby przygotować E3 |
| Siarczan magnezu siedmiowodny | Biochem Chemopharma | 313060500 | przygotować E3 |
| Chlorek potasu | Biochem Chemopharma | 316030500 | Aby przygotować E3 |
| SCREEN-WELL Biblioteka Wnt Pathway (Bosutinib) | Enzo | BML-2838-0500 | |
| Chlorek sodu | Fisher Scientific | S/3161/53 | Do przygotowania E3 |
Bibliografia
- Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
- Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
- Keenan, S. R., Currie, P. D. The developmental phases of zebrafish myogenesis. J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).
- Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).
- OECD. Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET). , (2013).
- Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization. Molecules. 22 (12), 2068(2017).
- He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva. Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).
- Huang, H. X., et al. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening. Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).
- Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish. J Vis Exp. (158), e60996(2020).
- Nishimura, Y., et al. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing. Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).
- Hayot, G., et al. Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system. J Vis Exp. (203), e66153(2024).
- Hoyberghs, J., et al. DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay. Front Toxicol. 3, 804033(2021).
- Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia. Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).
Przedruki i uprawnienia
