Artykuł metodologiczny

Badania przesiewowe małych cząsteczek i badania toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium rozwoju

DOI:

10.3791/67759

⸱

7 marca 2025

 ,  , 
1Department of Applied Biomedical Science, Faculty of Health Sciences, University of Malta, 2Department of Anatomy, Faculty of Medicine and Surgery, University of Malta, 3Centre for Molecular Medicine and Biobanking, University of Malta

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje procedurę badania przesiewowego leków u larw danio pręgowanego 3-7 dni po zapłodnieniu, po której następuje ocena morfologiczna.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany stał się ważnym organizmem modelowym do badań translacyjnych na ludziach, testowania toksyczności małych cząsteczek i zanieczyszczeń środowiska, odkrywania leków terapeutycznych i innych zastosowań badań biomedycznych. Przedstawiony protokół ma na celu zapewnienie jasnego przewodnika do badań przesiewowych leków i badań toksyczności u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium (w wieku 3-7 dni po zapłodnieniu, dpf). Opublikowano kilka metodologii opisujących badania toksyczności na larwach danio pręgowanego, choć brakowało w nich znormalizowanego protokołu dotyczącego m.in. czasu ekspozycji, szybkości zmian pożywki i oceny morfologii. Eksperymentalnie określiliśmy idealny wiek larw do przeprowadzenia eksperymentów, rozmiary płytek, które najlepiej sprawdzają się w tym wieku, szybkość zmian pożywki, która zapewnia wiarygodne wyniki przy jednoczesnym ograniczeniu marnotrawstwa badanego związku oraz system oceny morfologii, który jest łatwo mierzalny w sposób statystyczny. Manuskrypt szczegółowo opisuje protokół badania toksyczności u larw zebry danio pręgowanego w wieku od 3 do 7 dpf, mający na celu wypełnienie luki w testach toksyczności leków i podjęcie pierwszego kroku w kierunku znormalizowanej metody podobnej do badania ostrej toksyczności zarodków ryb.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio rerio) ostatnio pojawiły się jako potężny organizm modelowy kręgowców, stając się coraz bardziej popularne wśród badań nad rozwojem badań biomedycznych1. Około 70% ludzkich genów kodujących białka ma co najmniej jeden ortolog danio pręgowanego, a ~82% genów powodujących choroby u ludzi ma co najmniej jeden gen ortologiczny u danio pręgowanego2. Ochrona genetyczna w połączeniu z podobnymi podstawowymi wzorcami i morfologią narządów sprawiają, że danio pręgowany jest interesującym modelem do badań nad chorobami człowieka, pozwalającym na porównania międzygatunkowe na poziomie molekularnym1,2,3, co ma kluczowe znaczenie dla rozwoju leków.

Danio pręgowany rozwija się szybko, pączek ogonowy tworzy się po 10 godzinach od zapłodnienia (hpf), a pierwsze somity pojawiają się po 16 hpf. Zarodki wyłaniają się z kosmówki po ~2-3 dniach od zapłodnienia (dpf). Po 4 dpf ich przewód pokarmowy jest w pełni rozwinięty, a po 5 dpf ich pęcherz pławny napompował się, co pozwala im swobodnie pływać i polować na pożywienie. Pomimo zdolności do żerowania przez 5 dpf, larwy, które nie są karmione, mogą przetrwać wyłącznie na składnikach odżywczych pochodzących z żółtka do co najmniej 7 dpf, omijając potrzebę zewnętrznego karmienia, które może powodować zanieczyszczenie i zakłócać badania przesiewowe leków, toksykologię i testy behawioralne4. Do 7 dpf larwy rozwijają również kompletny plan ciała z kilkoma podstawowymi układami narządów, w tym sercem i naczyniami krwionośnymi, mięśniami i kośćmi5,6. Zarodki danio pręgowanego są również zapładniane ex vivo, rozwijają się zewnętrznie i są optycznie przezroczyste we wczesnych stadiach życia, co czyni je wysoce dostępnymi do edycji genów i badań przesiewowych małych cząsteczek3. Dodatkowo, ich mały rozmiar i wysoki wskaźnik płodności pozwalają na włączenie większej liczby powtórzeń, co zwiększa moc statystyczną, a także na zastosowanie płytek wielodołkowych, co pozwala zaoszczędzić na objętości leku i zwiększa przepustowość.

Badanie przesiewowe nowych małych cząsteczek w modelu zwierzęcym jest ważne dla określenia zdolności leków do wywoływania zarówno korzystnych, jak i niekorzystnych efektów, a tym samym określenia, które związki są zdolne do dalszych testów, a inne, które mogą wymagać modyfikacji w celu zmiany ich aktywności. W ramach procesu badań przesiewowych leków należy określić stężenie śmiertelne 50 (LC50) docelowego związku/ów. Zapewnia to stężenie robocze, które powoduje śmierć u 50% badanych zwierząt w ramach wstępnych badań toksyczności.

Istnieje standardowy protokół do badania toksyczności na zarodkach danio pręgowanego do 96 godzin po zapłodnieniu (hpf), a mianowicie test ostrej toksyczności zarodków ryb (FET) (TG236)7. W teście FET nowo zapłodnione jaja są wystawione na działanie pięciu stężeń substancji chemicznej przez okres do 96 godzin i obserwowane pod kątem oznak śmiertelności, a mianowicie (i) krzepnięcia jaj, (ii) braku tworzenia somitów, (iii) braku oderwania się pąka ogonowego od woreczka żółtkowego oraz (iv) braku bicia serca. Badanie pozwala na określenie toksyczności ostrej i LC50. Ponadto zaleca również między innymi rozmiary komór testowych do wykorzystania do badań przesiewowych (płytki 24-dołkowe), rozmieszczenie jaj w komorze testowej oraz warunki przetrzymywania, zapewniając ważne i powtarzalne wyniki7.

Chociaż test FET nadaje się do testowania toksyczności w stadium embrionalnym, nie przekracza 4 dpf. W przypadku fenotypów, które zaczynają się rozwijać mniej więcej w tym momencie (np. mineralizacja klasy notochord6), badania przesiewowe leków muszą być prowadzone dalej niż 4 dpf, aby umożliwić ocenę morfologiczną takiej tkanki. Ponadto zalecamy, aby ekspozycja na lek rozpoczęła się co najmniej dzień przed rozwojem fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania. O ile nam wiadomo, nie istnieje żaden znormalizowany protokół podobny do FET do badań przesiewowych leków u larw danio pręgowanego we wczesnym stadium, szczególnie u danio pręgowanego w wieku od 3 do 7 dpf. Chociaż opublikowano kilka badań opisujących testowanie narkotyków na larwach danio pręgowanego powyżej 4 dpf, brakuje spójności w zastosowanej metodologii, w tym wielkości komór testowych, liczbie biologicznych i technicznych powtórzeń, szybkości zmian pożywki, czasie ekspozycji i ocenianych wadach morfologicznych8,9,10,11,12,13. Z tego powodu opracowaliśmy zatwierdzony protokół standaryzowanych testów toksyczności, a następnie obserwację wizualną zmian morfologicznych larw danio pręgowanego przy 3-7 dpf. Proponowany protokół może być następnie wykorzystany do innych dalszych testów fenotypowania, takich jak analiza behawioralna, profilowanie ekspresji genów i histomorfometria.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany był traktowany zgodnie z dyrektywą UE 2010/63/UE. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Wydziałową Komisję Etyki Badań Naukowych (FREC) oraz Wspólny Podkomitet Sektorowy ds. Badań nad Zwierzętami FREC (JFARSS) Uniwersytetu Maltańskiego. Schemat blokowy proponowanego protokołu można znaleźć w Rysunek 1.

1. Produkcja, zbieranie i utrzymanie jaj

  1. Umieść ryby w zbiornikach hodowlanych dzień wcześniej, co najmniej godzinę po ostatnim karmieniu, z przegrodami oddzielającymi samce i samice. Aby uzyskać lepsze wyniki produkcji jaj, użyj wyższego stosunku samic do samców. Umieść rybę w pomieszczeniu wyposażonym w cykl 14 h:10 h światło/ciemność i w temperaturze otoczenia 27-28 °C.
    UWAGA: Zbiornik hodowlany o pojemności 1 litra może pomieścić trzy dorosłe ryby, podczas gdy zbiornik hodowlany o pojemności 1,7 litra może pomieścić pięć dorosłych ryb.
  2. Następnego ranka, po nadejściu światła, wymień wodę w zbiornikach hodowlanych i usuń przegrody. W przypadku, gdy zbiornik hodowlany nie jest łatwo nachylony, umieść go w pozycji pochyłej, aby zapewnić dostęp do płytkiej wody w celu promowania krycia. W przypadku powolnej produkcji jaj i aktywności godowej należy wymieniać wodę w zbiornikach hodowlanych co 45 minut. Pozostaw rybę do krycia na maksymalnie 3 godziny lub w razie potrzeby.
  3. Po zakończeniu krycia delikatnie ściśnij wszystkie samice, które nie złożyły jaj, aby zapobiec długotrwałemu wiązaniu jaj. Umieść ryby z powrotem w odpowiednich zbiornikach.
  4. Zebrać jaja w zbiornikach hodowlanych za pomocą sitka siatkowego, spłukać wodą z zarodków (E3) i umieścić na szalce Petriego z E3. Aby przygotować E3, zmieszaj 16,67 ml 60x E3 (300 mM NaCl; 10 mM KCl; 20 mM CaCl2,2H 2O; 20 mM MgSO4,7H 2O) z 1 ml 0,01% błękitu metylenowego i 982 ml wody dejonizowanej. Usuń wszelkie niezapłodnione jaja lub zanieczyszczenia. Upewnij się, że szalki Petriego nie są zatłoczone, z 50 jajami na szalkę Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i 120 jaj na szalkę Petriego o wymiarach 150 mm x 15 mm.
  5. Jaja należy przechowywać w inkubatorze ustawionym na temperaturę 28,5 °C i wyposażonym w cykl dzień/noc 14 godz. i 10 godzin. Przy 1 dpf odśwież E3 i usuń niezdolne do życia jaja, aby ograniczyć rozwój grzybów.

2. Przygotowanie płytki testowej

  1. W temperaturze 3 dpf przenieść jeden zdrowo wyglądający, wykluty zarodek do każdego dołka na 96-dołkowej płytce za pomocą mikropipety o pojemności 1 000 μl ustawionej na objętość 100 μl.
    UWAGA: Nie należy wykorzystywać zarodków, które nie wykluły się, ponieważ może to spowodować zmienny wychwyt związku. Korzystanie z zarodków, które wydają się zdrowe, również ogranicza stronniczość podczas testów. Rozmiar końcówki pipety pozwala na łatwe pobranie zarodka danio pręgowanego bez powodowania jakichkolwiek uszkodzeń fizycznych. Ponadto mikropipeta pozwala na lepszą kontrolę objętości dozowanej do studzienki w przeciwieństwie do pipety transferowej.
  2. Na płytce 12-dołkowej należy przygotować pożądane stężenie (stężenia) dla każdej badanej substancji chemicznej w oddzielnych studzienkach (w tym przypadku bosutynib w zakresie stężeń od 100 μM do 6,25 μM). Do każdej studzienki dodać niezbędną objętość badanej substancji chemicznej za pomocą mikropipet i uzupełnić do 2,4 ml przy użyciu E3.
    UWAGA: Należy przeprowadzić przegląd literatury w celu określenia odpowiednich stężeń, które należy stosować w odniesieniu do odpowiednich badanych substancji chemicznych. Jeżeli brak jest dostępnych informacji, można przeprowadzić próbę kilku stężeń, aż do ustalenia odpowiedniego zakresu stężeń. Należy użyć co najmniej pięciu stężeń, przy czym najwyższe stężenie powoduje 100% śmiertelność, a najniższe stężenie nie powoduje zauważalnego efektu7.
  3. Przygotować kontrolę nośnika w zależności od rozpuszczalnika użytego do rozpuszczenia podstawowej badanej substancji chemicznej.
    UWAGA: Wiele badanych związków nie jest rozpuszczalnych w wodzie i z tego powodu należy je rozpuścić w określonych rozpuszczalnikach ("nośnikach"), takich jak etanol lub dimetylosulfotlenek (DMSO), aby wytworzyć roztwór wodny. DMSO nie powinien przekraczać stężenia 1%, gdy jest stosowany jako kontrola nośnika, co jest stężeniem uznanym za bezpieczne u danio pręgowanego14.
  4. Za pomocą mikropipety o pojemności 200 μl usunąć roztwór E3 znajdujący się na płytce 96-dołkowej i zastąpić go 100 μl odpowiedniego badanego podłoża. Pamiętaj, aby przetestować łącznie 24 larwy na stężenie. Za pomocą jedno- lub 8-kanałowej mikropipety o pojemności 200 μl należy przenieść badane substancje chemiczne do odpowiednich studzienek na płytkę badawczą. Obejmuje kontrole (np. E3, nośnik chemiczny, kontrole dodatnie itp.).
    UWAGA: Układ płytek mieści do czterech różnych badanych substancji chemicznych lub czterech różnych stężeń tej samej substancji chemicznej. Przykład płytek testowych ustawionych do badania pięciu stężeń tej samej substancji chemicznej (np. Bosutinibu) wraz z kontrolami jest pokazany na Rysunek 1.
  5. Po 24 godzinach od ekspozycji należy przeprowadzić ocenę morfologiczną (zgodnie z opisem w sekcji 3) i zmianę pożywki o połowę, usuwając 50 μl pożywki i zastępując ją świeżo przygotowaną pożywką. Usuń i zapisz wszelkie martwe larwy w tym procesie. Larwy należy przechowywać w inkubatorze nastawionym na temperaturę 28,5 °C i wyposażonym w cykl dzień/noc trwający 14 godzin: 10 godzin. Powtarzaj proces do 7 dpf.

3. Ocena morfologiczna

  1. Za pomocą stereoskopowego mikroskopu świetlnego obserwować poszczególne badane larwy w odpowiednim powiększeniu.
    UWAGA: Przykłady wad morfologicznych, które można ocenić, przedstawiono w tabeli 1.
  2. Niech morfologia zostanie oceniona przez dwóch niezależnych oceniających, przy czym trzeci z nich jest konsultowany w przypadku nieporozumień między dwoma oceniającymi.
  3. Oceń morfologię za pomocą metody binarnej (tj. obecny/nieobecny), gdzie "nieobecny" oznacza normalną morfologię (ocenianą jako "0"), a "obecny" wskazuje na obecność nieprawidłowości morfologicznej (oceniany jako "1"). Rysunek 2 pokazuje przykłady danio pręgowanego przy 5 dpf po 2 dniach ekspozycji na lek, w tym niedotkniętego danio pręgowanego (Rysunek 2A), danio pręgowanego z łagodnym obrzękiem osierdzia (Rysunek 2B), ciężki obrzęk osierdzia z krwotokiem żółtkowym i wydłużeniem żółtka (Rysunek 2C), opóźniony rozwój ze zmniejszoną pigmentacją, pęcherzem pławnym i całkowitą długością (Rysunek 2D), spuchnięte żółtko i załamana płetwa ogonowa (Ryc. 2E), brak płetwy ogonowej (Ryc. 2F), zakrzywiona struna grzbietowa (Rycina 2G), obcięcie (Rycina 2H) i śmierć z martwicą (Rycina 2I). Oceniaj wszystkie nieprawidłowe fenotypy jako "1", a zdrowe danio pręgowane jako "0".

4. Wyznaczanie LC50

  1. Po dokonaniu oceny morfologii należy sporządzić wykres łącznej śmiertelności procentowej przy 7 dpf w stosunku do stężenia. Przykład jest pokazany w Rysunek 3. Użyj krzywej stężenia, aby oszacować stężenie, które powoduje 50% śmiertelności.
  2. Po oszacowaniu stężenia LC50 powtórz eksperyment opisany powyżej, wystawiając 24 larwy replik na 96-dołkowej płytce na to pojedyncze oszacowane stężenie LC50.

5. Repliki techniczne

  1. Powtórz całą procedurę, używając wybranych pięciu stężeń tej samej substancji chemicznej co najmniej dwa razy więcej przy dwóch różnych okazjach, aby upewnić się, że wyniki są powtarzalne.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieprawidłowości mogą być obserwowane indywidualnie lub kumulatywnie na osi czasu eksperymentu do godziny 7 dpf. Maksymalny wynik morfologii dla danej nieprawidłowości można wykorzystać do obliczenia nieprawidłowości morfologicznych jako procentu liczby wykorzystanych larw. Na przykład, jeśli w dniu 7 wyniki morfologii obrzęku osierdzia wynoszą 19 i 20 odpowiednio dla osób z punktacją 1 i 2 z możliwego wyniku 24, co oznacza, że 19 lub 20 larw z 24 wykazuje obrzęk osierdzia, wynik procentowy można obliczyć jako:

figure-results-1

Tabela uzupełniająca S1 pokazuje wyniki oceny morfologii (obu oceniających) przy 4 dpf po testach toksyczności dla związku Bosutinib, inhibitora kinazy tyrozynowej wskazanego w leczeniu przewlekłej białaczki szpikowej15. Ta sama ocena morfologiczna jest powtarzana dla narażonych ryb w wieku od 5 dpf do 7 dpf. Związek badano w zakresie stężeń od 100 μM do 6,25 μM. Przeprowadzono trzy powtórzenia techniczne w różnych punktach czasowych, a średni skumulowany wskaźnik śmiertelności przy 7 dpf wykorzystano do określenia LC50, stężenia, przy którym przeżywa 50% larw. LC50 można określić w dowolnym punkcie czasowym ekspozycji. Zalecamy jednak obliczenie tego przy 7 dpf.

Skumulowana średnia śmiertelność na poziomie 7 dpf została wykorzystana do wygenerowania krzywej LC50, którą można zobaczyć w Rysunek 3. W przypadku bosutynibu stężenie LC50 oszacowano na 37,95 μM.

UWAGA: To szacowane stężenie LC50 ściśle odnosi się do tego systemu modelowego i może być następnie wykorzystane do dalszych testów fenotypowania.

figure-results-2
Rysunek 1: Schemat proponowanego badania przesiewowego na obecność narkotyków u larw przy 3-7 dpf. 96-dołkowe płytki testowe są przeznaczone do badania pięciu stężeń w zakresie od 100 μM do 6,25 μM dla związku Bosutinib. Skrót: dpf = dni po zapłodnieniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2: Reprezentatywne defekty morfologiczne obserwowane u larw danio pręgowanego przy 5 dpf wystawionych na działanie różnych stężeń chemicznych (po 2 dniach od ekspozycji). (A) Zegmunty (niedotknięty chorobą), B) larwy danio pręgowanego wykazujące łagodny obrzęk osierdzia, C) danio pręgowany z ciężkim obrzękiem osierdzia i krwotokiem żółtkowym, (D) danio pręgowany z opóźnieniem rozwoju, zmniejszoną pigmentacją, małym pęcherzem pławnym, (E) danio pręgowany z opuchniętym żółtkiem i załamaną płetwą ogonową, (F) danio pręgowany bez płetwy ogonowej, G) danio pręgowany z zakrzywioną struną grzbietową, ( H) Danio pręgowany ze ściętym ogonem i (I) Martwy danio pręgowany z martwicą. Wady są oznaczone czerwonymi grotami strzałek. Podziałka = 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 3: Krzywa LC50 pokazująca stężenie w stosunku do % śmiertelności. Pięć badanych stężeń wynosiło 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12,5 μM i 6,25 μM, przy czym % śmiertelności wynosiło odpowiednio 100%, 100%, 29,2%, 12,5% i 12,5%. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

go
Wady morfologiczneopis
Obrzęk osierdziaNagromadzenie płynu wokół serca z rozciągniętym sercem i nieprawidłowym krążeniem krwi
Bicie serca (na minutę)Zmniejszona liczba uderzeń na minutę
żółtkoObecność lub brak obrzęku żółtka lub krwotoku, które mogą wystąpić jednocześnie z wadami serca
Przedłużenie żółtkaŻółtko, które jest spuchnięte, cienkie lub nie ma
Zakrzywiona struna grzbietowaObecność załamanej lub pofałdowanej struny grzbietowej i/lub zakrzywionego ogona
pęcherz pławnyObecność, brak lub częściowy rozwój pęcherza pławnego
pigmentacjaMniej melanocytów lub ich brak w porównaniu z nieleczonymi rybami w tym samym wieku
martwicaObecność (łagodnej lub ciężkiej) lub brak martwicy w jakiejkolwiek części ciała
Opóźniony rozwójOpóźniony rozwój lub zatrzymany w porównaniu z kontrolami typu dzikiego w tym samym wieku.
Reakcja na dotykOpóźniona reakcja lub brak reakcji po zaskoczeniu (np. przy użyciu końcówki do pipety)
ObcinaniaBrak tylnego ciała danio pręgowanego (tj. uformowanie ogona)
PłetwyObecność lub brak płetwy ogonowej, której może towarzyszyć cienkie przedłużenie żółtka
Zredukowana oś nadwoziaRyby, które wyglądają normalnie, ale po zmierzeniu są krótsze

Tabela 1: Lista wizualnych wad morfologicznych, które można zaobserwować po badaniach ekspozycji na leki.

Tabela uzupełniająca S1: Reprezentatywne wyniki morfologiczne dla Bosutinibu po 4 dpf (1 dzień po ekspozycji). Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Danio pręgowany stał się ważnym modelem badań przesiewowych leków. Próbując określić metodologię przeprowadzania badań toksyczności, znaleźliśmy kilka kontrastujących ze sobą metod z różnych laboratoriów 8,9,10,11,12,13. Opisane metody wykorzystują larwy w różnym wieku, zmienne ramy czasowe eksperymentów, różne tempo zmian pożywki i różne systemy punktacji morfologicznej. Metodą prób i błędów ustaliliśmy opisaną metodologię, która zapewniła wiarygodne i powtarzalne wyniki.

Wybór rozmiaru talerza
Początkowo eksperymenty przeprowadzono na 24-dołkowej płytce, aby upewnić się, że larwy mają wystarczająco dużo miejsca do poruszania się i wzrostu. Płytki umieszczono z 10 larwami na studzienkę, dwoma dołkami na stężenie i 1 ml roztworu leku na studzienkę. Taki układ nie zapewniał powtarzalnych wyników, co prowadziło do wniosku, że larwy nie wchłaniały równych ilości leku ze studni. Następnie przeprowadzono próby na 96-dołkowej i 48-dołkowej płytce z jedną larwą na studzienkę, co wykazało, że larwy w 96-dołkowych płytkach nie wykazywały żadnych problemów ze wzrostem. W związku z tym eksperymenty kontynuowano na 96-dołkowej płytce, wykorzystując mniej miejsca i objętości leku.

Dzienna zmiana podłoża
Ponieważ danio pręgowany wchłania lek z pożywki, ustaliliśmy, że do utrzymania stałego stężenia leku w pożywce potrzebny jest pewien stopień zmiany podłoża. Co więcej, zmiana podłoża usuwa potencjalne odpady nagromadzone w studni, które mogą stanowić toksyczne środowisko i prowadzić do stronniczych wyników. Przeprowadzono badanie z bosutynibem, w którym ustawiono trzy płytki dla tego samego leku, jedną bez codziennej zmiany pożywki, jedną z codzienną połową zmiany pożywki i jedną z pełną dzienną zmianą pożywki. Podczas gdy płytka bez zmiany pożywki wykazywała zwiększoną śmiertelność, płytki z połową i pełną zmianą pożywki dały ten sam wynik o 7 dpf. W związku z tym zdecydowano się na dzienną zmianę o połowę średniej. Taki wybór zapewnia mniejsze zużycie drogiego i ograniczonego materiału testowego, który może być wymagany do dalszych eksperymentów.

Czas ekspozycji
Wiek użytych larw testowych i czas ekspozycji na lek wybrany w tym protokole był zależny od fenotypu będącego przedmiotem naszego zainteresowania, jakim jest mineralizacja kości. Ponieważ tworzenie kości rozpoczyna się przy ~4 dpf, zdecydowaliśmy się rozpocząć od danio pręgowanego przy 3 dpf, aby ustalić, czy badane substancje chemiczne wpłynęły na początek rozwoju kości. Następnie zakończyliśmy badania ekspozycji na leki na poziomie 7 dpf, ponieważ wysoki stopień śmiertelności obserwowano od 8 dpf w związku z brakiem karmienia, które mogłoby zniekształcić wyniki. Niemniej jednak ramy czasowe mogą być dostosowywane w zależności od charakteru badania i fenotypu będącego przedmiotem zainteresowania.

Ograniczenia
Metodologia ta ma pewne ograniczenia. Przenoszenie danio pręgowanego o wartości 3 dpf na wielodołkowe płytki testowe jest czasochłonne. Usuwanie pożywki ze studzienek bez zbierania larw jest równie pracochłonne. Pożywkę należy powoli usuwać z każdej studzienki za pomocą pipety jednokanałowej, upewniając się, że larwy nie zostaną uszkodzone w tym procesie. Ponadto, podczas gdy codzienna wymiana połowy pożywki uzupełnia badany związek i zapewnia usunięcie odpadów z odwiertu, nie gwarantuje to utrzymania stabilnego stężenia leku w studni przez 5 dni ekspozycji. Podczas gdy analiza wysokosprawnej chromatografii cieczowej może dostarczyć dalszych informacji na temat rzeczywistej ilości leku wchłanianego przez każdą larwę, test nie kwalifikuje się już jako wysokoprzepustowa metoda przesiewowa.

Podsumowując, metodologia ta ma na celu wypełnienie luki w testach toksyczności przy użyciu danio pręgowanego powyżej 4 dpf, podejmując kroki w kierunku znormalizowanego protokołu mającego zastosowanie do linii do danio pręgowanego typu dzikiego, zmutowanego i transgenicznego, który jest na równi z FET na etapie embrionalnym. Otwiera to możliwości dla innych dalszych testów fenotypowania, które mogą nie być możliwe na wcześniejszych etapach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy są wspierani przez projekty ZeEBRA (R&I-2019-018), fundusz Programu Rozwoju Technologii (TDP), STRONG (R&I-2024-007L), fundusz TDPLite, NASDAC (SINO-MALTA-2022-08), grant Współpracy Naukowej i Technologicznej oraz DEMONSTROWAĆ (R&I-2018-007A), grant Go2Market, wszystkie finansowane przez XjenzaMalta dla i w imieniu Fundacji na rzecz Nauki i Technologii. Rysunek 1 został stworzony przy użyciu BioRender.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 mlStarlabE1415-1510
10 µ Mikropipeta L (P10)GilsonF144802 
10/20 i mikro; L końcówki do pipetStarlabS1110-3810
1000 µ Mikropipeta L (P1000)GilsonF123602 
1000 &mikro; L końcówki do pipetStarlabS1111-6001
12-dołkowa płytkaStarlabCC7672-7512Sterylna, pojedynczo owinięta, niepoddana obróbce, z pokrywką
20 i mikro; L mikropipeta (P20)GilsonF123600 
200 i mikro; Mikropipeta L (P200)GilsonF123601 
200 i mikro; Pipeta wielokanałowa L GilsonF81024
200 & mikro; L końcówki do pipetStarlabS1113-1006
96-dołkowa płytkaStarlabCC7672-7596Sterylne, pojedynczo owinięte, z płaskim dnem, bez obróbki, z pokrywką
Zbiorniki hodowlane z wewnętrznym pochyłym dnem, przegrodami i pokrywamiTecniplastZB17BTISLOP, ZB17BTE,  ZB17BTL, ZB17BTDNachylony zbiornik wewnętrzny
Sitko siatkowe//
Rękawice nitryloweMercator//
szalka Petriego StarlabCC7672-3394/CC7672-3359100 x 20 mm lub 60 x 15 mm
Leica M205 FCA Stereoskopowy mikroskop fluorescencyjnyLeica10450826
Inkubator chłodzony Peltierem z 2 półkami z modułem świetlnym zimny białyMemmertIPP110ecoplus, T8Wyposażony w cykl
DimetylosulfotlenekBiochem Chemopharma504341000Aby przygotować 1% roztwór w E3
Dwuwodny chlorek wapniaBiochem Chemopharma303080500Aby przygotować E3
Siarczan magnezu siedmiowodnyBiochem Chemopharma313060500przygotować E3
Chlorek potasuBiochem Chemopharma316030500Aby przygotować E3
SCREEN-WELL  Biblioteka Wnt Pathway (Bosutinib)EnzoBML-2838-0500
Chlorek soduFisher ScientificS/3161/53Do przygotowania E3
dzień/noc Aby

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Teame, T., et al. The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models. Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).
  2. Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
  3. Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
  4. Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding. Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).
  5. Keenan, S. R., Currie, P. D. The developmental phases of zebrafish myogenesis. J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).
  6. Tonelli, F., et al. Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders. Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).
  7. OECD. Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET). , (2013).
  8. Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization. Molecules. 22 (12), 2068(2017).
  9. He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva. Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).
  10. Huang, H. X., et al. Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening. Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).
  11. Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish. J Vis Exp. (158), e60996(2020).
  12. Nishimura, Y., et al. Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing. Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).
  13. Hayot, G., et al. Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system. J Vis Exp. (203), e66153(2024).
  14. Hoyberghs, J., et al. DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay. Front Toxicol. 3, 804033(2021).
  15. Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia. Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Drug DiscoveryMorphology ScoringEnvironmental Pollutants96 Well PlatePericardial EdemaStereo Light Microscope

Powiązane artykuły