Method Article

Metoda wysokoprzepustowa do obserwacji fenotypów ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/67761

⸱

June 20th, 2025

 , 
1Département de biologie, Faculté des sciences, Université de Sherbrooke

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia szybką i skuteczną metodę identyfikacji czynników genetycznych zaangażowanych w różne typy ruchliwości u Pseudomonas aeruginosa.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zachowania ruchowe często odgrywają istotną rolę w zdolności bakterii do wykorzystywania zasobów dostępnych w jej środowisku. Dotyczy to szczególnie wszechstronnego patogenu Pseudomonas aeruginosa, który może wykazywać różnorodne typy ruchliwości, w tym rojność i drganie, które są ważnymi cechami patogennymi przyczyniającymi się do kolonizacji powierzchni, tworzenia biofilmu i unikania obrony gospodarza. Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół wysokoprzepustowościowy dotyczący motoryki badającej zachowania motoryczności P. aeruginosa. Protokół pozwala na jednoczesne testowanie wielu szczepów P. aeruginosa z całej genomowej biblioteki mutantów, na przykład, aby zidentyfikować i przeanalizować czynniki genetyczne zaangażowane w jego ruchliwość. Podejście to daje możliwość kompleksowego badania ruchliwości oraz wgląd w mechanizmy molekularne leżące u podstaw motoryczności P. aeruginosa . Opisany tutaj protokół może być również modyfikowany, aby uwzględniać różne typy testów ruchliwości oraz inne gatunki bakterii, co stanowi potężną podstawę do poszerzania wiedzy o zachowaniach bakterii w różnych kontekstach.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa to oportunistyczny patogen, który może kolonizować różnorodne środowiska dzięki swojej niezwykłej wszechstronności metabolicznej 1,2. Ta wszechstronność jest kluczowa dla przejścia od planktonicznego trybu wzrostu do biofilmów, co przyczynia się do ich zdolności do rozwoju w szerokim zakresie nisz, od wody po ludzkie ciało 3,4,5. Przejście między tymi trybami wzrostu ułatwia szerokia zdolność poruszania się po tych środowiskach z wykorzystaniem różnych typów ruchliwości, w tym pływania, rojów i drgań 1,6. Każdy typ ruchliwości jest pośredniczony przez różne mechanizmy i struktury komórkowe, co pozwala P. aeruginosa reagować na sygnały środowiskowe 7,8. Ruchliwość pływania jest napędzana przez pojedynczy wiciec polarny i wykorzystywana do przemieszczania się przez płynne medium w kierunku składników odżywczych, na przykład9. Ruchliwość rojowa to skoordynowany ruch ułatwiony przez produkcję wici i biosurfaktantów, co pozwala koloniom rozprzestrzeniać się po półstałych powierzchniach10,11. Wreszcie, ruchliwość drgań jest niezależna od wici. Zamiast tego drganie jest pośredniczone przez pili typu IV (T4P) i używane do poruszania się po powierzchniach12,13. Ruchliwość drgająca przyczynia się również do wczesnych etapów tworzenia biofilmu P. aeruginosa, zapewniając początkowe przyczepienie powierzchniowe. Po początkowym przyczepieniu drganie pozwala bakteriom przemieszczać się po powierzchniach i tworzyć mikrokolonie, które następnie mogą przekształcić się w dojrzałe biofilmy 1,4,13.

Tradycyjnie testy ruchliwości bakteryjnej wykonuje się pojedynczo, po jednym szczepie, na miękkiej płycie agarowej lub przy użyciu metod mikroskopowych 6,14,15. Półstałe media są stosowane od wielu lat w badaniach ruchliwości bakterii. Obecnie techniki te są nadal stosowane do identyfikacji fenotypów motoryki u bakterii. Na przykład tradycyjnie ruchliwość rojowa obserwuje się przez inokulację 2,5 μL kultury P. aeruginosa w centrum szalki Petriego zawierającej podłoże M9 przy stężeniu agaru0,5%-0,8%. Ruchliwość drgającą zwykle mierzy się na podstawie rozprzestrzeniania się bakterii na powierzchni styku między agarem (w 1%) a podstawą szalki Petriego po zaszczepieniu P. aeruginosa przez podłoże hodowlane. Duży halo rozwoju kolonii międzymiąższowej powstaje po 48 godzinach inkubacji, podczas gdy szczepy niedrgawające nie wytwarzają takiej strefy ekspansji kolonii 1,17,18.

Niedawno podejścia mutagenezy transpozonów odkryły nowe geny zaangażowane w ruchliwość lub tworzenie biofilmu u P. aeruginosa 19,20,21. Na przykład nowe geny zaangażowane w ruchliwość drgań odkryto przy użyciu biblioteki mutantów transpozonów o wysokiej gęstości w P. aeruginosa19. Kolejnym przydatnym narzędziem w genomice funkcjonalnej jest wykorzystanie uporządkowanych kolekcji mutantów22,23. Kolekcja Keio24, zawierająca delecje pojedynczych genów dla wszystkich nieistotnych genów w Escherichia coli, jest prawdopodobnie najbardziej znaną kolekcją mutantów i była wykorzystywana do definiowania genów wpływających na różne fenotypy od wzrostu w różnych ośrodkach25 do morfologii komórkowej26 i więcej. Takie zbiory dostępne są także dla Salmonella enterica serovar Typhimurium27, Bacillus subtilis28, P. aeruginosa29 oraz wielu innych gatunków. Te zbiory doskonale nadają się także do badania ruchliwości w całym genomie, co doprowadziło do opracowania metody wysokoprzepustowej do badania ruchliwości P. aeruginosa. Tutaj metoda została przetestowana poprzez ocenę wkładu mutantów P. aeruginosa zarówno w ruchliwość drgawek, jak i rojów na płytkach o wysokiej gęstości. Ta metoda o wysokiej przepustowości może być stosowana dla różnych fenotypów motoryczności i nadaje się także do badania ruchliwości innych bakterii.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Ogólny przebieg pracy tej procedury przedstawiono na Rysunku 1.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Przepływ pracy eksperymentalnej. (1) Przygotuj niezbędną ilość ośrodka motorykalnego w zależności od rodzaju motoryki interesującej w eksperymentach. (2) Za pomocą ręcznego lub zautomatyzowanego systemu replikatora przygotować płyty źródłowe dla biblioteki mutantów insertowanych transpozonów P. aeruginosa w kolekcji mutantów przy odpowiedniej gęstości, z naciskiem na precyzję i jednolitą inokulację we wszystkich dołkach płyt. (3) Przenieść próbki z płyt źródłowych kolekcji mutantów na płytki ruchliwości. (4) Po inkubacji obserwować i analizować fenotypy ruchliwości oraz identyfikować geny zaangażowane w ruchliwość interesującą nas za pomocą wysokiej jakości obrazów. (5) Wykonanie tradycyjnych testów motoryczności w celu potwierdzenia trafień zidentyfikowanych w eksperymentach z wysokoprzepustową motorykością. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Płyty rojowe - medium M9Płytki drgające - media LBPłyty źródłowe - media LB
200 ml roztworu soli M9 5x10 g NaCl10 g NaCl
10 ml 20% glukozy10 g tryptonu10 g tryptonu
25 mL kwasów kazamino5 g ekstraktu drożdżowego5 g ekstraktu drożdżowego
1 mL 1M MgSO410 g Agaru15 g Agar
500 mL agaru 1%Dodaj dH2O do 1LDodaj dH2O do 1L
Dodaj dH2O do 1LGentamicyna (końcowe stężenie 15 μg/mL)

Tabela 1: Kompozycja mediów dla różnych płyt używanych w testie.

1. Przygotowanie płytek do podłoża hodowlanego

UWAGA: Zobacz Tabelę Materiałów , aby przygotować roztwory zapasowe i warunki magazynowania. Talerze powinny być wypełniane na wyrównanej powierzchni. Podczas suszenia talerze powinny być płaskie na powierzchni (czyli nie ułożone w stosy). Zapewnia to równomierne wyschnięcie medium na płytce. Każda płytka uniwellowa o typowym odcinku może działać, ale płytki o większych wymiarach wewnętrznych (bez ścian wewnętrznych), takie jak płyty Singer Instruments Plus czy płytki do hodowli tkanek VWR z pojedynczym dołkiem, bez obróbki, ułatwiają pracę z większą gęstością kolonii na płytę.

  1. Przygotuj odpowiednią ilość podłoża do eksperymentów zgodnie z przepisem w Tabeli 1. Utrzymuj podłoże w temperaturze ~45 °C-50 °C, aby zapobiec zastygnięciu agaru.
    1. Do płytek źródłowych przygotuj płytki o pojemności 59 funtów (bulionu lizogenicznego) zawierających 1,5% agaru i 15 μg/mL gentamycyny, co jest potrzebne do odtworzenia pełnej biblioteki PA14 – 59 x 25 mL =~ 1500 mL. Przygotuj kolejne 15 płytek agaru LB 1,5% i gentamycyny 15 μg/mL, aby powiększyć skalę biblioteki w formacie 384-gęstości-15 x 25 mL = ~400 mL.
    2. Płytki drgające: Jeśli pracujesz w formacie 96 gęstości, przygotuj 59 płytk drgających (LB 1% agar). Przygotuj 15 drgających płyt, jeśli pracujesz w formacie 384-gęstości.
    3. Talerze rojowe: Przygotuj 15 (format 384 gęstości) lub 59 (format 96) talerzy rojowych (agar M9-glukoza 0,5%)
  2. Zdejmij pokrywkę z talerza i wlej 25 mL medium na talerz. Równomiernie rozprowadzaj podłoże na talerzu, delikatnie podnosząc każdy róg płyty jeden po drugim. Powtórz ten ruch 2x-3x. Zamknij pokrywkę z powrotem na talerzu.
  3. Pozwól płytom zastygnąć i wyschnąć w temperaturze pokojowej (RT) przez noc. Jeśli talerze nie są używane od razu, włóż je do hermetycznych worków i przechowuj w suchym miejscu. Można je przechowywać przez 3 tygodnie.

2. Przygotowanie płyt źródłowych biblioteki mutantów transpozonów P. aeruginosa

UWAGA: Płytki źródłowe odnoszą się do płytek LBA-gentamycyny zawierających kopię biblioteki PA14, które później służą do inokulacji płytek motorycznych. Biblioteka mutantów transpozonowych P. aeruginosa (biblioteka PA14) to zestaw 59 zamrożonych płytek z 96 dołkami29. Kroki przygotowania płyt źródłowych dla każdego formatu opisane są poniżej. Protokół ten jest adaptowalny dla laboratoriów, które nie mają dostępu do replikatora Rotor+. Badacze mogą z powodzeniem wykonywać te same procedury eksperymentalne, używając ręcznych replikatorów, takich jak sprężynowe replikatory 96-pinowe, używane tutaj do replikacji zamrożonych płyt biblioteki PA14 w ciągu pierwszego dnia (patrz Tabela materiałów) lub innych replikatorów 96-pinowych. Ręczne replikatory trzeba sterylizować i pozostawić do ostygnięcia między każdym użyciem.

  1. Dzień 1: Replikacja biblioteki PA14 z 59 zamrożonych płyt z 96 dołkami na płyty źródłowe
    1. Sterylizuj sprężynowy replikator 96-pinowy, umieszczając go na płytce grzewczo w maksymalnej temperaturze przez 8 minut. Po sterylizacji pozwól replikatorowi wystarczająco się ochłodzić (~10 min), aby nie zabijać bakterii.
    2. Weź jedną płytę źródłową. Używając sterylnego replikatora 96-pinowego, ostrożnie zanurz piny replikatora w jednej 96-dołkowej płycie, a następnie przenieś komórki bezpośrednio na powierzchnię płyty źródłowej. Powtarzaj to, aż wszystkie 59 zamrożonych płytek 96-dołkowych biblioteki PA14 zostaną zreplikowane na płyty źródłowe.
    3. Inkubuj płyty źródłowe o 96 gęstościach w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
      UWAGA: Jeśli metoda jest stosowana w formacie 96 gęstości, te płytki źródłowe mogą być następnie użyte do inokulacji płytek ruchliwości.
  2. Dzień 2: Skalowanie z formatu 96 do 384 gęstości
    UWAGA: Dzień 2 można pominąć, jeśli pracujemy przy gęstości 96.
    1. Po inkubacji pozostawij płytki (płaskie na powierzchni, nie ułożone w stos) w temperaturze pokojowej (~1 godzinę) do ostygnięcia. Jeśli na pokrywkach pojawi się kondensacja, usuń ją delikatną ściereczką, aby zapobiec spadaniu kropel wody na płytki, co może powodować zanieczyszczenie krzyżowe między koloniami.
    2. Skonfiguruj replikator z następującymi parametrami, aby zapewnić dokładny transfer kolonii. Włącz replikator. W sekcji Wybierz tryb działania, wybierz Wybierz i Uruchom Przechowywane Programy.
    3. W sekcji Wybierz płyty źródłowe wybierz PlusPlate 96 Agar. W sekcji Wybierz tarcze docelowe wybierz PlusPlate 384 Agar. W sekcji Wybierz pady wybierz Short Pin 96.
    4. W sekcji Replikuj opcje programu wybierz Ogólne i kliknij Recykluj > Brak.
    5. W sekcji Źródło wybierz Przesunięcie i kliknij Losowy > Domyślny Promień. W sekcji Cel wybierz Przypinanie i dostosuj ciśnienie do 20%. Zostaw wszystkie pozostałe ustawienia domyślne.
    6. Włóż krótki pin RePads 96 do odpowiedniej komory.
    7. Umieść płytkę źródłową i celu na wyznaczonej platformie replikatora. Umieść na platformie płyty źródłowe o gęstości 96 (płyty 1, 2, 3 i 4) oraz nową pustą płytę źródłową (płyty LBA). Korzystając z wybranych parametrów, robot do przypinania mikrobiologicznej matrycy przenosi kolonie z płyt o 96-gęstości na nową płytkę o gęstości 384. Naciśnij Run.
    8. Wymień wszystkie płyty na platformie (kolejne cztery płyty źródłowe o gęstości 96 oraz nową pustą płytę źródłową) i powtarzaj to do momentu, gdy wszystkie płyty zostaną powiększene. Do ostatniego zestawu tablic użyj tablic 57, 58, 59 i 1. Każda płyta o gęstości 384 będzie składać się z naprzemiennych kolonii z czterech płyt o 96 gęstościach (patrz Rysunek 2). Inkubuj płytki LBA o gęstości 384 w temperaturze 37 °C przez 16-18 godzin.
      UWAGA: Te płytki źródłowe o gęstości 384 mogą być następnie użyte do inokulacji płyty ruchliwości, aby wykonać protokół przy gęstości 384. Na każdym etapie po inkubacji płytki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 3 tygodnie.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Skalowanie z płyt o 96 gęstości do płyt o gęstości 384. Kolonie z czterech płyt źródłowych o 96 gęstościach są przenoszone i łączone w jedną płytę o gęstości 384. Każdy kwadrant płytki o gęstości 384 odpowiada jednej z oryginalnych płytek 96-dołkowych (czerwonej, niebieskiej, żółtej i zielonej), zachowując pozycję każdego mutanta. Stworzone w BioRender. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Eksperyment z ruchliwością o wysokiej przepustowości

UWAGA: Protokół został tutaj wykonany w formacie 384-gęstości, ale ten sam protokół można dostosować do formatu 96-gęstościowego poprzez modyfikację parametrów replikatora, aby przenieść się z płyt źródłowych na płytki ruchliwości, używając wyboru 96 zamiast 384.

  1. Po inkubacji pozostawij płytki (płaskie na powierzchni, nie ułożone w stos) w temperaturze pokojowej (~1 godzinę) do ostygnięcia. Jeśli na pokrywkach pojawi się kondensacja, usuń ją delikatną ściereczką, aby zapobiec spadaniu kropelek wody na płytki, co może powodować krzyżowe zanieczyszczenie między koloniami.
  2. Pobierz odpowiednią liczbę płytek (59 dla formatu 96 gęstości lub 15 dla formatu 384 gęstości) do pożądanego testu: M9-glukozowe 0,5% płytki agarowe do rojów, LB i 1% do drgania.
  3. Skonfiguruj replikator z następującymi parametrami, aby zapewnić dokładny transfer kolonii.
    1. Włącz replikator. W sekcji Wybierz tryb działania, wybierz Wybierz i Uruchom Przechowywane Programy. W sekcji Wybierz płyty źródłowe wybierz PlusPlate 384 Agar.
    2. W sekcji Wybierz tarcze docelowe wybierz PlusPlate 384 Agar. W sekcji Wybierz pady wybierz Short Pin 384. W sekcji Replikuj opcje programu wybierz Ogólne > Recykluj > Brak.
    3. W programach Singer wybierz Replikuj wiele.
    4. W sekcji Źródło wybierz Przesunięcie > Losowy > Domyślny Promień. W sekcji Cel wybierz Przypięcie i dostosuj ciśnienie do 2%. Zostaw wszystkie pozostałe ustawienia domyślne.
  4. Włóż krótki pin RePads 384 do odpowiedniej komory.
  5. Umieść płytkę źródłową i celu na wyznaczonej platformie replikatora. Umieść płyty źródłowe o gęstości 384 oraz puste płyty ruchliwości na platformie. Naciśnij Run Używając wybranych parametrów, robot do przypinania matryc mikrobiologicznych przenosi kolonie z płyt źródłowych o gęstości 384 na płytki ruchliwości. Każda płyta o gęstości 384 będzie składać się z kopii jednej płyty źródłowej o gęstości 384.
  6. Upewnij się, że transfer jest równomierny i że wszystkie kolonie są odpowiednio przypięte do powierzchni agaru płytek ruchliwości. Włóż zaszczepione płytki motoryki do plastikowych worków. Ostrożnie umieść worki z talerzami w inkubatorze ustawionym na 37 °C przez 18 godzin.
    UWAGA: Talerze umieszcza się w workach, aby utrzymać wilgotność i zapobiec nierównomiernemu wysychaniu. Umieść talerze w inkubatorze z pokrywkami skierowanymi do góry.
  7. Po wysywaniu sprawdź płytki ruchliwości pod kątem równomiernego wzrostu kolonii i braku skażenia.
  8. Dzień 3: Obrazowanie płytek motoryki
    UWAGA: Singer Instruments PhenoBooth służy do rejestrowania obrazów o wysokiej rozdzielczości płyt ruchliwości. Wykorzystuje aparat naukowy klasy i generuje obrazy o rozdzielczości 23 megapikseli. Zawiera pięć kanałów oświetleniowych do rejestrowania wysokorozdzielczych obrazów kolonii z szalek Petriego i prostokątnych płyt. Działają także inne wysokiej jakości obrazowce.
    1. Po okresie inkubacji płytki motoryczności są gotowe do procesu obrazowania. Włącz Phenobooth i kliknij ikonę odpowiadającą oprogramowaniu Phenobooth.
    2. Otwiera się strona Select Project; kliknij na Nowy Projekt > Liczenie Kolonii. Wybierz pożądaną ścieżkę pliku , aby przechowywać obrazy w polu Lokalizacja. W polu Rozdzielczość wybierz 5626 x 4220. Kliknij OK, urządzenie jest gotowe do robienia zdjęć.
    3. Po zdjęciu pokrywki włóż płytkę do czytnika ze średnią stroną do góry. Upewnij się, że płytka jest prawidłowo ustawiona przed zamknięciem czytnika, aby nie zaciąć się płyty.
    4. Ustaw parametr na białe światło w zakładce Oświetlenie. Kliknij na Podgląd. Dostosuj ustawienia ekspozycji w zakładce ustawień PhenoBooth, aby uzyskać optymalne parametry do obserwacji fenotypów ruchliwości.
    5. Kliknij na Acquire (Zdobyć); Uchwycone obrazy pojawią się po lewej stronie ekranu. Po zakończeniu zamknij oprogramowanie (wszystkie przechwycone obrazy zostaną zapisane w wcześniej wybranym pliku na zakładce Lokalizacja).
      UWAGA: Phenobooth zapisuje obrazy w formacie JPEG, ale w dalszych etapach analizy obrazy mogą być w formacie TIFF, JPEG lub PNG.

4. Analiza fenotypów motoryki

UWAGA: Analiza obrazów jest przeprowadzana zgodnie ze szczegółowym opisem French i in.30,31. Skrypt do analizy danych jest dostępny na31(ImageJ Macro).

  1. W skrócie, obrazy są przetwarzane w ImageJ32, który generuje wartość dla każdej kolonii na płycie ruchliwości. Najpierw przekonwertuj obrazy do formatu 8-bitowego i segmentuj kolonie oraz powiązane z nimi obszary ruchliwości od tła za pomocą polecenia threshold. Narysuj obszar zainteresowania (ROI) wokół każdej kolonii i zmierz obszar ruchliwości. Generuje to tabelę zawierającą zintegrowaną wartość gęstości dla każdej studni, zorganizowaną według wierszy. Tabela ta może być zapisana jako plik CSV do dalszej analizy.
    1. Uruchom makro w ImageJ i otwórz folder zawierający obrazy.
    2. Po zaleceniu zmiany obrotu tablicy poprzez zmianę kąta płytki za pomocą opcji Podglądu, aby tablica była prosta. Gdy będziesz zadowolony, kliknij przycisk OK .
    3. Następnie przesuwaj prostokąt wokół kolonii i użyj go do przycinania części płyty zawierającej kolonie. Gdy będziesz gotowy, kliknij przycisk OK .
    4. Następny prompt zdefiniuje siatkę używaną do narysowania ROI wokół każdej kolonii oraz pomiaru powierzchni ruchliwości. Wybierz odpowiednią gęstość kolonii. Dostosuj różne parametry, jeśli trzeba, tak aby każdy okrąg otaczał kolonię. Gdy będziesz gotowy, aktywuj Okej? i kliknij przycisk OK . To zmierzy obszar ruchliwości każdej kolonii i zapisze plik CSV do folderu zawierającego dane.
  2. Połącz ten plik CSV z legendą płyty, również uporządkowaną według wierszy, aby zidentyfikować każdy obszar ruchliwości z odpowiednim mutantem. Niższe wartości gęstości zintegrowanej odpowiadają mutantom, którzy nie byli ruchomi lub wykazywali zmniejszoną ruchliwość.

5. Tradycyjne testy motoryki w celu weryfikacji trafień

UWAGA: Po obserwacji mutantów z zatrzymaną ruchliwością w protokole wysokoprzepustowej ruchliwości ważne jest, aby indywidualnie zweryfikować uzyskane trafienia. Indywidualny protokół ruchliwości różni się od tego stosowanego do testów o wysokiej przepustowości, ale użyte nośniki są takie same.

  1. Test ruchliwości rojowej
    UWAGA: Ruchliwość rojowa jest przeprowadzana zgodnie ze szczegółowym opisem Ha i in.16.
    1. Krótko podaj roztwór agaru w autoklawie z użyciem M9 (0,5% agaru), glukozy, kwasów kazamino i MgSO4. Wlej schłodzony, wymieszany agar na płytki Petriego (25 mL na talerz).
    2. Zaszczepić 2,5 μL nocnej hodowli bakteryjnej. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 18 godzin z powiekami skierowanymi do góry, aby obserwować fenotypy ruchliwości.
  2. Test ruchliwości drgającej
    UWAGA: Ruchliwość drgającą wykonywana jest zgodnie ze szczegółowym opisem Haleya i in.33,34.
    1. Krótko mówiąc, autoklaw agar LB 1% (patrz Tabela 1). Wlej schłodzony, wymieszany agar LB 1% na płytki Petriego (25 mL na talerz).
    2. Zaszczep bakterie na dnie drgających płytek (1% agar). Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin, a następnie w RT przez kolejne 48 godzin. Usuń agar z płyty i zwizualizuj strefę drgań, barwiąc szalkę Petriego 1% kryształowym fioletem.
    3. Sfotografuj szalki Petriego za pomocą PhenoBooth z tymi samymi parametrami opisanymi w kroku 3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zastosowaliśmy ten protokół do scharakteryzowania wpływu inaktywacji genów na ruchliwość P. aeruginosa w wysokiej przepustowości. Tutaj szczegółowo opisaliśmy jego zastosowanie do badania ruchliwości rojów i drgań w zbiorze delecji P, obejmującej cały genom. szczep aeruginosa PA14 (biblioteka PA14). Protokół oferuje dużą wszechstronność i łatwość użycia, umożliwiając modyfikacje różnych etapów protokołu, takie jak wykorzystanie różnych mediów kulturowych lub kolekcji mutantów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisany tutaj protokół o wysokiej przepustowości motorykalności pozwala nam precyzyjnie i reprodukowalnie przetwarzać i analizować fenotyp motoryki wielu kolonii. W porównaniu z tradycyjnymi metodami manualnymi, to półautomatyczne podejście zwiększa skalowalność i przepustowość testów ruchliwości, umożliwiając ocenę ruchliwości bakterii w całym genomie. Protokół został zoptymalizowany do użycia z biblioteką PA14, ale test ten może być stosowany z dowolną uporządkowaną biblioteką mutantów, taką jak kolekcja Keio dla E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak ujawnień.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy laboratorium Surette na Uniwersytecie McMaster za udostępnienie kopii biblioteki PA14. Dziękujemy dr. Fabrice Jean-Pierre za pomocne uwagi dotyczące manuskryptu. Prace te zostały wsparte przez Natural Science and Engineering Research Council of Canada (RGPIN-2019-06044) oraz grant początkowy dla nowych badaczy z Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS; #295613). J.-P.C. posiada stypendium Chercheur boursier junior 2 przyznane przez Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQS).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 płyt odwiertowych   Corning    3701 
Agar Fisher Scientific    BP1423-2 Końcowe stężenie 0,5% dla ruchliwości rojowej lub 1% odpowiednio dla ruchliwości drgającej.  
Kwasy kasaminowe;  Fisher Scientific    223050 Przygotuj zapas w 20% wody. Filtr sterylizuje 0,22 μ m filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C. Końcowe stężenie 0,5% w minimalnym medium M9. 
Crystal violet Biologia Basic   CB0331Przygotuj roztwór 1% w wodzie.
D-glukoza   Biologia Basic   GB0219 Przygotuj 20% bulionu (1,1 M) w wodzie i wysterylizuj przez autoklaw. Końcowe stężenie 0,2% w M9 minimalnym medium.
Filtropur S 0,2 Sarstedt 83.1826.001
siarczan gentamycyny   Biologia Basic   GB0217 Przygotuj bulion 30 mg/ml w wodzie. Filtr sterylizuje 0,22 μ M filtruj i przechowuj w temperaturze 4 i deg; C – końcowe stężenie na płytach 15 & micro; g/mL..    
Pętla inokulacyjna i igła Fisher Scientific  22363597
M9 Minimal soli, 5X Fisher Scientific  248510Przygotuj 1 milion zapasów w wodzie i wysterylizuj autoklawem. Końcowe stężenie 1 mM w minimalnym medium M9.  
Siarczan magnezu (MgSO4)    Fisher Scientific  M63-500  Przygotuj 1 M MgSO4 w wodzie. Filtr sterylizuje 0,22 μ M przefiltruj i przechowuj w temperaturze pokojowej. Końcowa koncentracja 
PA14 Biblioteka Mutantów Insertion Transposon   Liberati i in., 2006 (patrz odniesienie 29)59 płyt z 96 dołkami dla całej kolekcji. Każda jamka zawiera pojedynczego mutanta w LB z 25% glicerolem.
Szalka Petriego 92x16mm Sarstedt 82.1473.001
PhenoBooth+ Instrumenty wokalne https://www.singerinstruments.com/solution/phenobooth/specification/ Rozpuść 11,3 g proszku w 200 mL oczyszczonej wody. Autoklaw, 121 stopni i stopień; C przez 15 min 
Plastikowa strzykawka 10 mL Fisher Scientific  14955459
Rotor+     Instrumenty wokalne https://www.singerinstruments.com/resource/rotor-had/ 
Krótkie piny RePads 384 gęstości Instrumenty wokalne   REP-004 
Krótkie zawory na zawory 96 gęstości   Instrumenty wokalne   REP-002 
Chlorek sodu (NaCl) & nbsp;  Fisher Scientific  BP358-212 
Sprężynowy replikator 96-pinowyEnzyScreen   CR1000 
Chirurgiczne ostrze nierdzewne nr 25 Fisher Scientific  08-918-5F
Trypton Oxoid   LP0042B 
Tablice UniwellaInstrumenty wokalne   PlusTablice: PLU-003   Wymiar płyty: 54 & razy; 34 & razy; 38 cm – bez ścian wewnętrznych, co zapewnia większe wymiary wewnętrzne.
Tablice UniwellaVWRPłytki posiewki tkanek jednodołkowo: 75780-348Te same wymiary co PlusPlates.
Ekstrakt drożdżowy  Fisher Scientific  248510 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Burrows, L. L. Pseudomonas aeruginosa twitching motility: type IV pili in action. Annu Rev Microbiol. 66, 493-520 (2012).
  2. Khan, F., Pham, D. T. N., Oloketuyi, S. F., Kim, Y. M. Regulation and controlling the motility properties of Pseudomonas aeruginosa. Appl Microbiol Biotechnol. 104 (1), 33-49 (2020).
  3. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa new insights into pathogenesis and host defenses. Pathog Dis. 67 (3), 159-173 (2013).
  4. Ribbe, J., Baker, A. E., Euler, S., O'Toole, G. A., Maier, B. Role of cyclic Di-GMP and exopolysaccharide in type IV pilus dynamics. J Bacteriol. 199, e00859-e00916 (2017).
  5. Arora, S. K., Neely, A. N., Blair, B., Lory, S., Ramphal, R. Role of motility and flagellin glycosylation in the pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa burn wound infections. Infect Immun. 73 (7), 4395-4398 (2005).
  6. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  7. Limoli, D. H., et al. Interspecies interactions induce exploratory motility in Pseudomonas aeruginosa. eLife. 8, e47365(2019).
  8. Breidenstein, E. B. M., Fuente-Núñez, C., de la Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: all roads lead to resistance. Trends Microbiol. 19 (8), 419-426 (2011).
  9. Toutain, C. M., Zegans, M. E., O'Toole, G. A. Evidence for two flagellar stators and their role in the motility of Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187 (2), 771-777 (2005).
  10. Köhler, T., Curty, L. K., Barja, F., van Delden, C., Pechère, J. C. Swarming of Pseudomonas aeruginosa is dependent on cell-to-cell signaling and requires flagella and requires flagella and pili. J Bacteriol. 182 (21), 5990-5996 (2000).
  11. Tremblay, J., Richardson, A. P., Lépine, F., Déziel, E. Self-produced extracellular stimuli modulate the Pseudomonas aeruginosa swarming motility behaviour. Environ Microbiol. 9 (10), 2622-2630 (2007).
  12. Kühn, M. J., et al. Mechanotaxis directs Pseudomonas aeruginosa twitching motility. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (30), e2101759118(2021).
  13. Talà, L., Fineberg, A., Kukura, P., Persat, A. Pseudomonas aeruginosa orchestrates twitching motility by sequential control of type IV pili movements. Nat Microbiol. 4 (5), 774-780 (2019).
  14. Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. J Bacteriol. 31 (6), 575-580 (1936).
  15. Turnbull, L., Whitchurch, C. B. Motility assay: Twitching motility. Methods Mol Biol. 1149, 73-86 (2014).
  16. Ha, D. -G., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A. Plate-based assay for swarming motility in Pseudomonas aeruginosa. Methods Mol Biol. 1149, 67-72 (2014).
  17. Semmler, A. B. T., Whitchurch, C. B., Mattick, J. S. A re-examination of twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Microbiology. 145 (Pt 10), 2863-2873 (1999).
  18. Henrichsen, J. Twitching Motility. Annu Rev Microbiol. 37, 81-93 (1983).
  19. Nolan, L. M., et al. A global genomic approach uncovers novel components for twitching motility-mediated biofilm expansion in Pseudomonas aeruginosa. Microb Genom. 4 (11), e000229(2018).
  20. Overhage, J., Lewenza, S., Marr, A. K., Hancock, R. E. W. Identification of genes involved in swarming motility using a Pseudomonas aeruginosa PAO1 mini-Tn5-lux mutant library. J Bacteriol. 189 (5), 2164-2169 (2007).
  21. De Bleeckere, A., et al. High throughput determination of the biofilm prevention concentration for Pseudomonas aeruginosa biofilms using a synthetic cystic fibrosis sputum medium. Biofilm. 5, 100106(2023).
  22. Brochado, A. R., Typas, A. High-throughput approaches to understanding gene function and mapping network architecture in bacteria. Curr Opin Microbiol. 16 (2), 199-206 (2013).
  23. Hertzberg, R. P., Pope, A. J. High-throughput screening: new technology for the 21st century. Curr Opin Chem Biol. 4 (4), 445-451 (2000).
  24. Baba, T., et al. Construction of Escherichia coli K-12 in-frame, single-gene knockout mutants: the Keio collection. Mol Syst Biol. 2, 2006.0008(2006).
  25. Tong, M., et al. Gene dispensability in Escherichia coli grown in thirty different carbon environments. mBio. 11 (6), e02259-e02320 (2020).
  26. French, S., Côté, J. P., Stokes, J. M., Truant, R., Brown, E. D. Bacteria getting into shape: genetic determinants of E. coli morphology. mBio. 8, e01977-e02016 (2017).
  27. Porwollik, S., et al. Defined single-gene and multi-gene deletion mutant collections in Salmonella enterica sv Typhimurium. PLoS One. 9 (7), e99820(2014).
  28. Koo, B. M., et al. Construction and analysis of two genome-scale deletion libraries for Bacillus subtilis. Cell Syst. 4 (3), 291-305.e7 (2017).
  29. Liberati, N. T., et al. An ordered, nonredundant library of Pseudomonas aeruginosa strain PA14 transposon insertion mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (8), 2833-2838 (2006).
  30. French, S., et al. A robust platform for chemical genomics in bacterial systems. Mol Biol Cell. 27 (6), 1015-1025 (2016).
  31. French, S., Guo, A. B. Y., Brown, E. D. A comprehensive guide to dynamic analysis of microbial gene expression using the 3D-printed PFIbox and a fluorescent reporter library. Nat Protoc. 15 (2), 575-603 (2020).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Haley, C. L., Kruczek, C., Qaisar, U., Colmer-Hamood, J. A., Hamood, A. N. Mucin inhibits Pseudomonas aeruginosa biofilm formation by significantly enhancing twitching motility. Can J Microbiol. 60 (3), 155-166 (2014).
  34. Déziel, E., Comeau, Y., Villemur, R. Initiation of biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa 57RP correlates with emergence of hyperpiliated and highly adherent phenotypic variants deficient in swimming, swarming, and twitching motilities. J Bacteriol. 183 (4), 1195-1204 (2001).
  35. Gao, P., et al. oprC impairs host defense by increasing the quorum-sensing-mediated virulence of Pseudomonas aeruginosa. Front Immunol. 11, 1696(2020).
  36. Rosenau, F., et al. Lipase LipC affects motility, biofilm formation and rhamnolipid production in Pseudomonas aeruginosa. FEMS Microbiol Lett. 309 (1), 25-34 (2010).
  37. Anyan, M. E., et al. Type IV pili interactions promote intercellular association and moderate swarming of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (50), 18013-18018 (2014).
  38. Burdman, S., Bahar, O., Parker, J. K., De La Fuente, L. Involvement of type IV pili in pathogenicity of plant pathogenic bacteria. Genes. 2 (4), 706-735 (2011).
  39. Lewis, K. A., et al. Nonmotile subpopulations of Pseudomonas aeruginosa repress flagellar motility in motile cells through a type IV pilus- and pel-dependent mechanism. J Bacteriol. 204 (5), e00528-e00621 (2022).
  40. Chang, C. Y. Surface sensing for biofilm formation in Pseudomonas aeruginosa. Front. Microbiol. 8, 2671(2018).
  41. Zegadło, K., et al. Bacterial motility and its role in skin and wound infections. Int J Mol Sci. 24 (2), 1707(2023).
  42. Jurado-Martín, I., Sainz-Mejías, M., McClean, S. Pseudomonas aeruginosa: An audacious pathogen with an adaptable arsenal of virulence factors. Int J Mol Sci. 22 (6), 3128(2021).
  43. Qin, S., et al. Pseudomonas aeruginosa: pathogenesis, virulence factors, antibiotic resistance, interaction with host, technology advances and emerging therapeutics. Sig Transduct Target Ther. 7 (1), 199(2022).
  44. Piskovsky, V., Oliveira, N. M. Bacterial motility can govern the dynamics of antibiotic resistance evolution. Nat Commun. 14 (1), 5584(2023).
  45. Xu, J., Koizumi, N., Nakamura, S. Crawling motility on the host tissue surfaces is associated with the pathogenicity of the zoonotic spirochete Leptospira. Front Microbiol. 11, 1886(2020).
  46. Rasmussen, L., et al. A high-throughput screening assay for inhibitors of bacterial motility identifies a novel inhibitor of the Na+-driven flagellar motor and virulence gene expression in Vibrio cholerae. Antimicrob Agents Chemother. 55 (9), 4134-4143 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Pseudomonas AeruginosaBacterial MotilitySwarming MotilityTwitching MotilityHigh Throughput ProtocolMotility AssayGenome Wide MutantBiofilm FormationColony Pinning RobotImageJ Analysis

Related Articles