Method Article

Optymalizacja dostarczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą rusztowania z biodrukowanym w 3D rdzeniem i osłonką do leczenia ran przewlekłych

DOI:

10.3791/67764

⸱

February 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory for Stem Cell and Regenerative Medicine, Natural and Medical Sciences Research Center, University of Nizwa, 2Doctoral Programme in Biomedicine, Faculty of Medicine, University of Helsinki

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia protokół wytwarzania rusztowań drukowanych biologicznie w 3D do przewlekłego gojenia ran. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są izolowane z mezenchymalnych komórek macierzystych i ładowane do rdzenia (alginianu) za pomocą osłonki wykonanej z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Taka konstrukcja umożliwia kontrolowaną degradację rusztowania i wydajne uwalnianie pojazdów elektrycznych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia szczegółowy protokół wytwarzania rusztowań z 3D-biodrukowanymi w celu przyspieszenia gojenia się przewlekłych ran. Protokół polega na izolowaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC), znanych ze swoich właściwości regeneracyjnych i immunomodulujących. Te pojazdy elektryczne są następnie włączane w unikalną konstrukcję rusztowania. Rusztowanie posiada rdzeń złożony z alginianu załadowanego EV, otoczony osłoną wykonaną z karboksymetylocelulozy i liazy alginianowej. Ta innowacyjna konstrukcja zapewnia kontrolowaną degradację rusztowania, jednocześnie sprzyjając wydajnemu i kontrolowanemu uwalnianiu EV w miejscu rany. Protokół obejmuje kluczowe kroki, w tym przygotowanie i charakterystykę pojazdów elektrycznych, formułowanie biotuszy do biodruku 3D oraz optymalizację parametrów drukowania w celu osiągnięcia pożądanej architektury rdzeń-osłona. Łącząc integralność strukturalną i bioaktywność, rusztowanie ma na celu wyeliminowanie ograniczeń konwencjonalnych opatrunków na rany, oferując ukierunkowane podejście do przyspieszenia regeneracji tkanek i zmniejszenia stanu zapalnego w ranach przewlekłych. Metoda ta zapewnia powtarzalną i skalowalną strategię opracowywania zaawansowanych biomateriałów o potencjalnych zastosowaniach klinicznych w leczeniu ran przewlekłych. W protokole podkreślono również kluczowe kwestie związane z osiąganiem spójnych wyników, zapewniając zdolność adaptacji do przyszłych zastosowań terapeutycznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewlekłe rany, często związane z nadmiernym stanem zapalnym, wymagają szybkiego leczenia, aby zapobiec poważnym powikłaniom, takim jak infekcje i martwica tkanek, które mogą prowadzić do amputacji. Pomimo postępów, obecne metody leczenia są nadal kosztowne, niewygodne, mają skutki uboczne i ograniczoną skuteczność, co podkreśla potrzebę stosowania większej liczby opatrunków leczniczych1,2,3. Opracowanie nowej generacji opatrunków przeznaczonych specjalnie do leczenia ran przewlekłych ma zasadnicze znaczenie dla sprostania tym wyzwaniom. Co więcej, złożona natura gojenia się ran wymaga materiałów opatrunkowych o różnych właściwościach, w tym nawilżaniu, elastyczności, przyczepności, bioaktywności i biodegradowalności4. Badanie to ma na celu opracowanie bioinżynieryjnego opatrunku na rany, który integruje pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z rusztowaniem wydrukowanym biologicznie w 3D, aby zapewnić kontrolowane środowisko terapeutyczne i przyspieszyć gojenie się ran przewlekłych.

EV pochodzące z komórek macierzystych wspomagają przewlekłe gojenie się ran poprzez promowanie reakcji przeciwzapalnych, wzrostu komórek, migracji i tworzenia naczyń krwionośnych5. Dodatkowo, EV mogą dostarczać bioaktywne cząsteczki, w tym leki małocząsteczkowe, konstrukty genów i białek do leczenia ran przewlekłych6. Co więcej, ich zdolność do ochrony ładunku przed degradacją enzymatyczną poprawia stabilność i biodostępność środków terapeutycznych, oferując wyraźne zalety w porównaniu z konwencjonalnymi czynnikami wzrostu i lekami małocząsteczkowymi, które często szybko ulegają degradacji in vivo7. Pomimo tych zalet, skuteczne i trwałe dostarczanie pojazdów elektrycznych do tkanek docelowych pozostaje poważnym wyzwaniem.

Rusztowania do biodruku 3D mogą służyć jako platforma dostarczania dla pojazdów elektrycznych, aby zwiększyć ich efekty terapeutyczne8. Rusztowania te naśladują naturalne środowiska komórkowe i pozwalają na kontrolowane uwalnianie EVs9,10. Chronią również EV przed degradacją, zwiększając stabilność ich mikroRNA i białek11. Han i in. wykazali, że pojazdy elektryczne mogą być skutecznie uwalniane z biodrukowanych rusztowań GelMA w 3D. To uwolnienie doprowadziło do poprawy przyczepiania komórek i zwiększonej ekspresji genów związanych ze szlakami mechanotransdukcji w mezenchymalnych komórkach macierzystych ludzkiej poduszeczki tłuszczowej policzków (hBFP-MSC) wysiewanych na rusztowaniach12. Born i wsp., optymalizując stężenie środka sieciującego, osiągnęli kontrolowane uwalnianie EV. Podejście to wykazało skuteczność w promowaniu angiogenezy i oferuje obiecującą metodę regulowanego dostarczania EVs13.

Bioprinting 3D-Liner umożliwia tworzenie złożonych, wielomateriałowych struktur poprzez drukowanie materiału rdzenia zamkniętego w osłonie. Rdzeń może zawierać komórki, czynniki wzrostu lub leki, podczas gdy osłonka zapewnia mechaniczne wsparcie i ochronę lub działa jako bariera. Metoda ta ma zastosowanie w inżynierii tkankowej i medycynie regeneracyjnej, takich jak tworzenie sieci naczyniowych, naśladowanie naturalnych struktur tkankowych i tworzenie systemów dostarczania leków. Pozwala to na precyzyjną kontrolę nad rozmieszczeniem i składem materiału, zwiększając funkcjonalność i znaczenie biologiczne konstruktów. W porównaniu z alternatywnymi technikami, biodruk 3D z rdzeniem i osłoną zapewnia precyzyjną kontrolę nad dystrybucją i składem materiału, poprawiając funkcjonalność i znaczenie biologiczne konstruktów14,15.

Inżynieryjna degradacja w opatrunkach na rany oferuje takie korzyści, jak zmniejszenie dyskomfortu podczas zmian, wilgotne środowisko do gojenia i kontroli infekcji, terminowe dostarczanie terapii i optymalna regeneracja tkanek16,17,18. Hydrożele alginianowe (Alg) i karboksymetylocelulozowe (CMCh) są biokompatybilne i skuteczne w dostarczaniu pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) do ran, przyspieszając gojenie poprzez komunikację komórkową i zmniejszając stan zapalny18. W tym badaniu EV zostały zintegrowane z rdzeniem Alg, podczas gdy osłona CMCh i AlgLyase (AlgLyase) została użyta, aby umożliwić szybką degradację opatrunku i dostarczanie EVs. Ta konstrukcja osłony rdzenia ułatwia szybkie uwalnianie pojazdów elektrycznych w odpowiedzi na degradację rusztowania, zwiększając ich skuteczność terapeutyczną i rozwiązując ograniczenia istniejących metod leczenia ran przewlekłych. Głównym celem tego badania jest opracowanie bioinżynieryjnego opatrunku, który przyspiesza gojenie się ran poprzez integrację kontrolowanego uwalniania EV z responsywnie degradowalnym rusztowaniem, co ostatecznie poprawi wyniki leczenia ran przewlekłych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi ustalonymi przez Narodową Komisję Bioetyki oraz Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Nizwa. Zgoda etyczna dla tego badania została udzielona na podstawie zezwolenia ID: VCGSR, AREC/01/2023. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach laboratoryjnych, zapewniając optymalną kontrolę środowiska, prawidłowe odżywianie i kompleksową opiekę w celu ochrony ich dobrostanu przez cały czas trwania badania. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt były ściśle przestrzegane zgodnie z polityką instytucjonalną, międzynarodowymi standardami opieki nad zwierzętami i wytycznymi ARRIVE.

1. Hodowla komórkowa

  1. Pobrać fiolkę z MSCs (przejście #2) z magazynu ciekłego azotu i obchodzić się z nią przy użyciu technik aseptycznych, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Szybko rozmrozić komórki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, upewniając się, że zostaną usunięte, gdy tylko pozostanie mały fragment lodu.
  2. Przygotuj kompletną pożywkę, w skład której wchodzi MSC SFM Basal Media, uzupełniona 1% (v/v) MSC SFM XenoFree, 1% (v/v) GlutaMAX i 0,01% (v/v) gentamycyny. Dodać 1 ml podgrzanej (37 °C) kompletnej pożywki w ilości 3 do 5 kropli co 5 s do fiolki, a następnie delikatnie wymieszać. Przenieść całą zawartość fiolki z MSCs do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 4 ml wstępnie podgrzanej, kompletnej pożywki, w warunkach aseptycznych, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.
  3. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio wyważona.
  4. Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki. Następnie przenieść komórki do kolby T25 zawierającej 4 ml kompletnej pożywki.
  5. Delikatnie przechylić kolbę, aby upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  6. Zmieniaj podłoże co 2 dni, zastępując je świeżym, wstępnie podgrzanym, kompletnym podłożem. Używaj delikatnego pipetowania, aby uniknąć rozerwania komórek. Po osiągnięciu zbiegu 70%-80% należy odessać zużytą pożywkę z kolby T25.
  7. Umyj komórki 3 ml świeżego PBS, aby usunąć pozostałości. Upewnij się, że kolba jest całkowicie pokryta podczas prania.
  8. Dodać 1 ml 0,25% roztworu trypsyny do kolby T25, inkubować w temperaturze 37 °C przez 3-7 minut i uważnie monitorować oderwanie pod mikroskopem przy 4-krotnym powiększeniu.
  9. W razie potrzeby delikatnie postukać w kolbę, aby zapewnić całkowite odłączenie komórek. Dodaj wstępnie podgrzaną, kompletną pożywkę do kolby i pipetuj w górę iw dół po powierzchni, aby ułatwić odłączenie komórek. Następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
  10. Odwirować probówkę o masie 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad komórkowy w świeżym, kompletnym podłożu i policzyć komórki za pomocą hemocytometru Neubauera. Przenieść komórki do kolby T75. Zapewnić gęstość wysiewu 5 000 komórek/cm2 dla optymalnego wzrostu.
  11. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Po 72 godzinach inkubacji komórek zebrać kondycjonowane podłoże z komórek do izolacji EVs. Zużyć natychmiast po pobraniu.

2. Izolacja EV

  1. Odwirować 13 ml zebranej kondycjonowanej pożywki o stężeniu 800 x g przez 15 minut w celu usunięcia resztek komórkowych. Delikatnie przefiltrować supernatant za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm, aby usunąć duże cząstki.
  2. Dodać 5 ml buforu strącającego do przefiltrowanej pożywki kondycjonowanej i dokładnie wymieszać, aby wymieszać. Upewnij się, że roztwór jest jednorodny.
  3. Mieszaninę inkubować przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić wytrącenie się pojazdów elektrycznych. Odwirować mieszaninę przy stężeniu 3,220 g przez 30 minut w temperaturze 20 °C. Sprawdzić równowagę probówek.
  4. Ostrożnie wyrzucić supernatant, nie naruszając osadu. Ponownie odwirować osad przy 3,220 x g przez 5 sekund, aby usunąć resztki cieczy.
  5. Delikatnie odpipetuj granulkę EV w 200 μl PBS, aby uniknąć uszkodzenia EV. Zmierz stężenie białka EV zgodnie z instrukcjami producenta (zestaw do oznaczania białek BCA).
  6. Wykonaj Western blotting w celu wykrycia markerów specyficznych dla EV (CD63, CD81 i CD9), aby zweryfikować fenotyp EV18. Analiza potwierdziła obecność tych markerów, potwierdzając tożsamość EVs19.
  7. Aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia RNazą, zaleca się stosowanie go bezpośrednio, bez dodatkowego przechowywania. W razie potrzeby przechowuj pojazdy elektryczne w temperaturze -80 °C do dalszego użytku. Podziel zawiesinę EV na 40 μl objętości, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.

3. Oznakowanie pojazdów elektrycznych za pomocą PKH-26

  1. Przygotowanie buforu
    1. Rozpuścić 0,238 g HEPES w około 90 ml sterylnej ultraczystej wody w sterylnym pojemniku. Użyj świeżo przygotowanego roztworu HEPES. Dodać 0,85 g NaCl do roztworu HEPES.
    2. Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH lub HCl, w zależności od potrzeb, za pomocą skalibrowanego pH-metru. Dodaj wodę dejonizowaną, aby uzyskać całkowitą objętość do 100 ml. Przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm, aby go wysterylizować.
  2. Rozcieńczyć 4 μl barwnika PKH-26 w 1 ml przygotowanego buforu. Dokładnie wymieszać pipetą, aby zapewnić jednorodność.
  3. Zawiesić oczyszczone EV w 1 ml PBS w stężeniu 700 μg/ml. Dodać 1 ml zawiesiny EVs do 1 ml przygotowanego roztworu PKH-26. W przypadku grupy kontrolnej z samym barwnikiem dodać 1 ml kompletnej pożywki bez EV do 1 ml roztworu PKH-26. Wszystkie kolejne kroki są wykonywane również dla grupy kontrolnej, aby uwzględnić potencjalną niespecyficzną agregację lub tworzenie miceli.
  4. Dokładnie wymieszaj EVs, delikatnie odwracając rurkę 10x-15x. Inkubować mieszaninę przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej, zapewniając równomierną ekspozycję EV na barwnik.
  5. Przygotować 2 ml świeżego 1% roztworu BSA, używając sterylnej ultraczystej wody i dodać go do 2 ml otrzymanej mieszaniny w celu wygaszenia reakcji etykietowania. Delikatnie wymieszaj, aby zapobiec agregacji.
  6. Skoncentruj EV oznaczone PKH-26 zgodnie z wyżej wymienionym protokołem (kroki 2.2-2.7). Ponownie zawiesić oznaczone EV w 300 μl PBS. Odpipetować próbkę EVs z oznaczeniem PKH-26 do probówki filtrującej o mocy 30 kDa.
  7. Odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Na tym etapie wolny barwnik PKH-26 i małe cząsteczki przejdą przez membranę do filtratu, podczas gdy EV znakowane PKH-26 zostaną zatrzymane w retentacie.
  8. Po wstępnym odwirowaniu odrzucić filtrat i dodać 300 μl PBS do retentatu. Delikatnie zawiesić EV w PBS, pipetując w górę i w dół.
  9. Ponownie odwirować próbkę o masie 3,220 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu zmycia pozostałego wolnego barwnika lub małych cząsteczek.
  10. Potwierdzić brak PKH-26 w roztworze filtratu za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Jeśli zostanie wykryty jakikolwiek barwnik, powtórz kroki prania.
  11. Zebrać górny roztwór za pomocą mikropipety i wyjąć filtr z probówki zbiorczej. Ostrożnie odwróć filtr (odwróć go do góry nogami).
  12. Odwirować odwrócony filtr o sile 800 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pomoże to zebrać zatrzymane PKH-26-EV z membrany filtracyjnej do nowej probówki zbiorczej. W następnym kroku skorzystaj bezpośrednio z PKH-26-EV.

4. 3D Bio-printing

  1. Przygotowanie biotuszy
    1. Przygotuj świeży 4,5% (w/v) roztwór alg sodu, używając sterylnej ultraczystej wody. Mieszać przez noc w temperaturze 60 °C, aby roztwór całkowicie się rozpuścił.
    2. Rozpuść CMCh w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać 3,8% (w/v) roztwór. Przygotuj świeże. Mieszać przez noc w temperaturze 60 °C do całkowitego rozpuszczenia.
    3. Odwirować przygotowane biotusze o stężeniu 3 220 x g przez 10 minut w temperaturze 25°C, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, które mogą zakłócać proces drukowania.
    4. Wymieszać przygotowane 3 ml roztworu Alg z oznakowanymi EV lub kontrolą samą z barwnikiem za pomocą mieszalnika strzykawkowego, aby uzyskać stężenie 0,01% (w/v) EV. Zapewnij równomierne rozprowadzenie poprzez delikatne mieszanie.
    5. Za pomocą mieszalnika strzykawkowego połączyć 1 ml CMCh ze świeżo przygotowanym roztworem AlgLyase w sterylnej ultraczystej wodzie, aby uzyskać końcowe stężenie 0,5 mU/ml.
  2. Jak pokazano w Rysunek 1A, jednocześnie załaduj biotusz Alg/Exo do części rdzeniowej i biotusz CMCh/AlgLyase do części osłonowej zestawu strzykawki rdzeń/osłona.
  3. Pozostaw biotusze na 15 minut przed wydrukowaniem.
  4. Konfiguracja drukarki 3D bio
    1. Korzystając z oprogramowania 3D-bioprinter, utwórz konstrukcję rusztowania, wybierając kształt cylindryczny z ukośnym wzorem wypełnienia. W tym celu należy ustawić średnicę i wysokość cylindra odpowiednio na 20 mm i 1,1 mm. Skonfiguruj wielkość porów na 1 mm.
    2. Ustaw prędkość pompowania dyszy rdzenia i osłony na 1 mm/s przy grubości 0,25 mm na warstwę i ustaw prędkość ruchu na 6 mm/s. Wydrukuj cztery warstwy o grubości 0,25 mm na warstwę w temperaturze pokojowej.
  5. Rozpocznij drukowanie na folii poliestrowej.
  6. Użyj nawilżacza z chlorkiem wapnia w aerozolu (2.2%), aby usieciować rusztowanie podczas procesu wytłaczania. Umieść dyszę nawilżacza w odległości około 20 cm od głowicy wytłaczającej, aby zapewnić skuteczne sieciowanie bez naruszania konstrukcji rusztowania. W celu dalszego sieciowania zanurzyć rusztowanie w roztworze chlorku wapnia (2,2%) na 10 minut.
  7. Opłucz rusztowanie 3x sterylną, ultraczystą wodą, aby usunąć nadmiar chlorku wapnia i niezwiązanego biotuszu.
  8. Upewnij się, że rusztowanie jest przechowywane w sterylnym środowisku w temperaturze 4 °C, aby zachować integralność i funkcjonalność rusztowania przez okres do trzech miesięcy.

5. Śledzenie wydania EV

  1. Stworzenie kolistego modelu rany skórnej
    1. Znieczulenie samców heterozygotycznych myszy z cukrzycą Akita (8 tygodni) poprzez podanie dootrzewnowego wstrzyknięcia ketaminy (70 mg / kg) i ksylazyny (10 mg / kg). Umieść znieczulone zwierzę na poduszce grzewczej lub kocu. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, oceniając brak reakcji odruchowych (np. szczypanie palca u nogi) i monitoruj częstość oddechów. Aby zapobiec wysuszeniu rogówki podczas znieczulenia, nałóż sterylną weterynaryjną maść okulistyczną na oczy.
    2. Przygotuj obszar skóry grzbietowej, najpierw goląc go za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia. Unikaj podrażnień lub obrażeń skóry. Zdezynfekuj ogolony obszar trzema naprzemiennymi rundami peelingu na bazie jodu i alkoholu.
    3. Za pomocą sterylnego stempla do biopsji skóry zaznacz okrągły obszar o średnicy 6 mm na skórze, a następnie wytnij zaznaczoną tkankę nożyczkami chirurgicznymi, aby utworzyć ranę skórną o pełnej grubości na grzbietowej powierzchni każdej myszy.
    4. Delikatnie umieść biodrukowane rusztowanie 3D zawierające EV z oznaczeniem PKH bezpośrednio na łożysku rany. Upewnij się, że rusztowanie całkowicie zakrywa powierzchnię rany z minimalnymi kieszeniami powietrznymi, lekko naciskając sterylnymi kleszkami. Upewnij się, że zwierzę jest ściśle obserwowane po zabiegu i pozostaje pod opieką, dopóki w pełni nie odzyska przytomności i nie będzie w stanie utrzymać pozycji leżącej mostka.
  2. Obrazowanie fluorescencyjne
    1. Po 2 godzinach, 4 godzinach, 8 godzinach, 24 godzinach od implantacji znieczulić myszy za pomocą izofluranu. W celu indukcji znieczulenia umieść myszy w komorze systemu obrazowania in vivo (IVIS) i wystaw je na działanie 2%-3% izofluranu w tlenie. Nałóż maść okulistyczną na oczy myszy, aby zapobiec wysuszeniu. Po znieczuleniu przenieś myszy do systemu IVIS i utrzymuj je za pomocą 1%-2% izofluranu w tlenie dostarczanym przez kanały nosowe. Sprawdź, czy zwierzęta są w pełni znieczulone i stabilne przed przystąpieniem do obrazowania.
    2. Użyj systemu IVIS do wychwytywania sygnałów fluorescencyjnych z pojazdów elektrycznych oznaczonych PKH uwalnianych z rusztowania. W kreatorze obrazowania wybierz opcję Obrazowanie fluorescencyjne i aktywuj filtry wzbudzenia i emisji dla barwnika PKH. Dostosuj ustawienia kamery, w tym pole widzenia i wysokość obiektu, aby zoptymalizować wykrywanie sygnału. Zapewnij spójne pozycjonowanie we wszystkich punktach czasowych obrazowania, aby umożliwić dokładne porównania. Rozpocznij pobieranie obrazów i zapisz wynikowe dane.
    3. Określ ilościowo natężenie sygnału fluorescencyjnego za pomocą oprogramowania IVIS. Umożliwi to śledzenie uwalniania pojazdów elektrycznych w czasie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uwolnienie in vivo EV z rusztowań Alg-EVs/CMCh i Alg-EVs/CMCh-AlgLyase jest przedstawione w Rysunek 1B,C. Zgodnie z przewidywaniami, rusztowanie Alg-EVs/CMCh-AlgLyase wykazało szybszy profil uwalniania w porównaniu z Alg-EVs/CMCh, szczególnie w punktach czasowych 2 h i 4 h. Uwalnianie EV z hydrożeli jest regulowane przez kombinację mechanizmów fizykochemicznych, w tym dyfuzji, pęcznienia, erozji i degradacji20. Wykorzystując Alglyazę, rusztow...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym aspektem protokołu jest konstrukcja rusztowania z rdzeniem i osłoną, która jest niezbędna do osiągnięcia wydajnej dostawy pojazdów elektrycznych. Konstrukcja zawiera Alg jako materiał rdzenia i połączenie CMCh z Alglyase jako osłoną. Taka konfiguracja ułatwia kontrolowane i szybkie uwalnianie pojazdów elektrycznych. Materiał rdzenia, Alg, otacza pojazdy elektryczne, zapewniając ich ochronę i lokalne dostarczanie. Osłona, składająca się z CMCh i Alglyase, umożliwia przyspieszoną degradację rdzenia Alg, co ma klu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalne podziękowania dla Saida Al-Hashmi i Abdulrahmana Almharbiego z Happy Production za ich doskonałą pracę przy filmowaniu. Wyrażamy również naszą wdzięczność Ministerstwu Szkolnictwa Wyższego, Badań Naukowych i Innowacji oraz Uniwersytetowi w Nizwa za wsparcie finansowe i zapewnienie niezbędnych środków.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
23 G Fioletowa precyzyjna stożkowa dyszaCellinkKT0000002000Aby zapewnić precyzyjne wytłaczanie biotuszy przy minimalnym zatykaniu
Liaza alginianowa (AlgLyase)Sigma AldrichA1603-100MGAlgyase to enzym, który rozkłada alginian.
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 30 kDa MWCOMerckUFC9030Służy do mycia BCA z oznaczeniem PKH-26 EVs
Zestaw testowyThermo Scientific10678484Do oznaczania stężenia białka/EV
Bioprinting SystemRegematV1Do wytwarzania rusztowania osłonki rdzeniowej
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)sigma-aldrich05470-5GAby zatrzymać reakcję PKH 26 
Chlorek wapniaSigma AldrichC3306-100GDo sieciowania i stabilizacji biotuszy w inżynierii tkankowej
WirówkaSigma2-16PSłuży do izolacji EVs
Wirówka 5810 REppendorf22625101Służy do hodowli komórkowych
Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy IITelstarBio II AdvanceHodowla komórkowa
CryoCube  Seria F570 - Zamrażarka ULTEppendorfF571240035Do przechowywania mikroskopu
fluorescencyjnegoEV OLYMPUS IX73P1F Służy do sprawdzania pozostałości PKH-26 w filtracie
Gentamycyna (50 mg/mL)Thermofisher15750Antybiotyk do pożywek do hodowli komórkowych
GlutaMAX-I CTS, (100X), płynThermofisherA12860Suplement do pożywek do hodowli komórkowych
HClSigma Aldrich7647-01-0Przygotowanie buforu 
HEPESCarl RothSztuka. Nie.  6763.3Przygotowanie buforu 
Karboksymetyloceluloza o wysokiej lepkości (CMCh)BDH27929 4TCMCh jest rozpuszczalną w wodzie pochodną celulozy.
InkubatorNowy Brunszwik  NB-170RHodowla komórkowa
Obrazowanie InvivoPerkinElmerIVIS Lumina XRMS Series III Aby śledzić uwalnianie pojazdów elektrycznych, in vivo
Mieszadło magnetyczneSalvisLABMC35Do przygotowania biotuszy
miRCURY Zestawy egzosomów do izolacji egzosomówQiagen76743Izolacja Evs
NaOhDaejung1310-73-2Przygotowanie buforu 
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo ScientificJ61196. APHodowla komórkowa
PKH 26MCE154214-55-8Czerwony barwnik fluorescencyjny do oznaczania EVs
Alginian sodu (Alg)Sigma AldrichA0682-100GNaturalny polisacharyd pochodzący z brązowych wodorostów.
Chlorek sodu (NaCl)Carl RothArt-Nr-P029.1Preparat buforowy 
StemPro BM Mezenchymalne komórki macierzysteThermofisherA1382901Mezenchymalne komórki macierzyste
StemPro MSC SFM XenoFreeThermofisherA1067501Pożywka do hodowli komórkowych
Trypsyna 0,25%Thermofisher25050014Dysocjacja komórek
Vortex-MixerDaihan ScientificVM-10Służy do mieszania buforu strącającego z kondycjonowaną pożywką

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Falanga, V., et al. Chronic wounds. Nat Rev Disease Primers. 8 (1), 50(2022).
  2. Tran, H. Q., Shahriar, S. S., Yan, Z., Xie, J. Recent advances in functional wound dressings. Adv Wound Care. 12 (7), 399-427 (2023).
  3. Shao, M., et al. Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: Recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 34 (5), 385-452 (2017).
  4. Rezvani Ghomi, E., Khalili, S., Nouri Khorasani, S., Esmaeely Neisiany, R., Ramakrishna, S. Wound dressings: Current advances and future directions. J Appl Poly Sci. 136 (27), 47738(2019).
  5. Ding, J. Y., et al. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in skin wound healing: Roles, opportunities and challenges. Military Med Res. 10 (1), 36(2023).
  6. Sharma, D., Kumar, A., Mostafavi, E. Extracellular vesicle-based biovectors in chronic wound healing: Biogenesis and delivery approaches. Mol Ther Nucleic Acids. 32, 822-840 (2023).
  7. Vader, P., Mol, E. A., Pasterkamp, G., Schiffelers, R. M. Extracellular vesicles for drug delivery. Adv Drug Delivery Rev. 106, 148-156 (2016).
  8. Han, P., Ivanovski, S. 3d bioprinted extracellular vesicles for tissue engineering-a perspective. Biofabrication. 15 (1), 013001(2022).
  9. Annabi, N., et al. 25th anniversary article: Rational design and applications of hydrogels in regenerative medicine. Adv Mater. 26 (1), 85-124 (2014).
  10. Zheng, Y., Pan, C., Xu, P., Liu, K. Hydrogel-mediated extracellular vesicles for enhanced wound healing: The latest progress, and their prospects for 3d bioprinting. J Nanobiotechnol. 22 (1), 57(2024).
  11. Keener, A. B. How extracellular vesicles can enhance drug delivery. Nature. 582 (7812), S14-S14 (2020).
  12. Han, P., et al. 3d bioprinted small extracellular vesicles from periodontal cells enhance mesenchymal stromal cell function. Biomater Adv. 158, 213770(2024).
  13. Born, L. J., et al. Sustained released of bioactive mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles from 3d-printed gelatin methacrylate hydrogels. J Biomed Mater Res A. 110 (6), 1190-1198 (2022).
  14. Kjar, A., Mcfarland, B., Mecham, K., Harward, N., Huang, Y. Engineering of tissue constructs using coaxial bioprinting. Bioact Mater. 6 (2), 460-471 (2021).
  15. Gao, Q., He, Y., Fu, J. Z., Liu, A., Ma, L. Coaxial nozzle-assisted 3d bioprinting with built-in microchannels for nutrients delivery. Biomaterials. 61, 203-215 (2015).
  16. Deshayes, S., Kasko, A. M. Polymeric biomaterials with engineered degradation. J Poly Sci A Poly Chem. 51 (17), 3531-3566 (2013).
  17. Xu, Q., et al. Injectable hyperbranched poly (β-amino ester) hydrogels with on-demand degradation profiles to match wound healing processes. Chem Sci. 9 (8), 2179-2187 (2018).
  18. Vakilian, S., et al. Engineered local delivery of extracellular vesicles loaded with si-tnf-α, via a core-sheath 3d-bio-printed scaffold as an effective wound dressing. J Drug Delivery Sci Technol. 101, 106189(2024).
  19. Mirsanei, Z., et al. Synergistic effects of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles and dexamethasone on macrophage polarization under inflammatory conditions. Inflammopharmacology. 32 (2), 1317-1332 (2024).
  20. Ma, Y., Brocchini, S., Williams, G. R. Extracellular vesicle-embedded materials. J Controlled Release. 361, 280-296 (2023).
  21. Jia, Q., Zhao, H., Wang, Y., Cen, Y., Zhang, Z. Mechanisms and applications of adipose-derived stem cell-extracellular vesicles in the inflammation of wound healing. Front Immunol. 14, 1214757(2023).
  22. Lou, P., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics for the regeneration of chronic wounds: Current knowledge and future perspectives. Acta Biomater. 119, 42-56 (2021).
  23. Cai, Y., Chen, K., Liu, C., Qu, X. Harnessing strategies for enhancing diabetic wound healing from the perspective of spatial inflammation patterns. Bioactive Mater. 28, 243-254 (2023).
  24. Li, Z., et al. Multifunctional hydrogel-based engineered extracellular vesicles delivery for complicated wound healing. Theranostics. 14 (11), 4198(2024).
  25. Cabral, J., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Extracellular vesicles as modulators of wound healing. Adv Drug Delivery Rev. 129, 394-406 (2018).
  26. Moghadasi Boroujeni, S., Mashayekhan, S., Vakilian, S., Ardeshirylajimi, A., Soleimani, M. The synergistic effect of surface topography and sustained release of tgf-β1 on myogenic differentiation of human mesenchymal stem cells. J Biomed Mater Res A. 104 (7), 1610-1621 (2016).
  27. Jayaraman, P., et al. Controlled release of drugs in electrosprayed nanoparticles for bone tissue engineering. Adv Drug Delivery Rev. 94, 77-95 (2015).
  28. Huang, X., Brazel, C. S. On the importance and mechanisms of burst release in matrix-controlled drug delivery systems. J Controlled Release. 73 (2-3), 121-136 (2001).
  29. Smith, A. M., Senior, J. J. Alginate hydrogels with tuneable properties. Adv Biochem Eng Biotechnol. 178, 37-61 (2021).
  30. Yan, X., Sha, X. Nanoparticle-mediated strategies for enhanced drug penetration and retention in the airway mucosa. Pharmaceutics. 15 (10), 2457(2023).
  31. Pant, B., Park, M., Park, S. -J. Drug delivery applications of core-sheath nanofibers prepared by coaxial electrospinning: A review. Pharmaceutics. 11 (7), 305(2019).
  32. Pinheiro, A., et al. Extracellular vesicles: Intelligent delivery strategies for therapeutic applications. J Controlled Release. 289, 56-69 (2018).
  33. Yoshioka, M., Kayo, T., Ikeda, T., Koizuni, A. A novel locus, mody4, distal to d7mit189 on chromosome 7 determines early-onset niddm in nonobese c57bl/6 (akita) mutant mice. Diabetes. 46 (5), 887-894 (1997).
  34. Fang, R. C., et al. Limitations of the db/db mouse in translational wound healing research: Is the noncnzo10 polygenic mouse model superior. Wound Repair Regen. 18 (6), 605-613 (2010).
  35. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  36. Sellers, R. S. Translating mouse models: Immune variation and efficacy testing. Toxicol Pathol. 45 (1), 134-145 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular Vesicle Delivery3D Bioprinted ScaffoldChronic Wound ManagementMesenchymal Stem CellsCore Sheath ScaffoldExtracellular Vesicle IsolationBioink FormulationScaffold Cross LinkingWestern BlottingDiabetic Wound Healing

Related Articles