Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu FLICK

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67768

⸱

6 czerwca 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać testu FLICK do oceny reakcji na leki, w tym szczegółowe instrukcje dotyczące korzystania z tego testu do obliczania wskaźników wzrostu i śmiertelności wywołanych przez lek oraz do oceny mechanizmu śmierci komórek wywołanej przez lek.

Streszczenie

Dla zrozumienia skuteczności leków, kluczową potrzebą jest scharakteryzowanie zakresu śmierci komórek wywołanej przez lek. Wysiłki zmierzające do ilościowego określenia poziomu śmierci komórek wywołanej przez leki są kwestionowane przez istnienie ponad tuzina molekularnie odrębnych form regulowanej śmierci, z których każda ma swój własny czas aktywacji i biochemiczne cechy charakterystyczne. Co więcej, w przypadku niektórych podtypów śmierci martwiczej cechy charakterystyczne są obserwowane tylko przejściowo i szybko zanikają z powodu pęknięcia komórki. W związku z tym, nawet przy użyciu kombinacji testów specyficznych dla ścieżki śmierci, trudno jest dokładnie określić ilościowo całkowitą ilość śmierci komórki lub względny udział każdego podtypu śmierci. Inną kwestią jest to, że wiele testów specyficznych dla zgonu ignoruje wpływ leków na proliferację komórek, co utrudnia interpretację, czy populacja leczona lekami powiększa się, czy maleje. Test FLICK pozwala na ilościowe określenie całkowitego poziomu śmierci komórki po stymulacji w sposób, który jest specyficzny dla śmierci, ale także w dużej mierze niezależny od typu (typów) aktywowanej śmierci. Dodatkowo test FLICK zachowuje informacje o całkowitej wielkości populacji i tempie proliferacji komórek. W tym manuskrypcie opisujemy podstawowe zastosowanie testu FLICK, sposób rozwiązywania problemów z tym testem przy użyciu różnych typów materiału biologicznego oraz sposób wykorzystania testu FLICK do ilościowego określenia udziału każdego rodzaju śmierci komórki w obserwowanej odpowiedzi na lek.

Wprowadzenie

Dla leków przeciwnowotworowych, przedkliniczna ocena wrażliwości leków zazwyczaj obejmuje testowanie, jak leki wpływają na żywotność komórek w hodowli1. Żywotność komórek po ekspozycji na lek jest produktem co najmniej dwóch oddzielnych efektów: indukowanego lekiem hamowania proliferacji komórek i aktywacji śmierci komórki2. Niestety, mimo że śmierć komórki jest krytyczną cechą, która jest wymagana do trwałej odpowiedzi na lek, standardowe podejścia nie wyjaśniają stopnia, w jakim lek aktywuje śmierć komórki3.

Typowe testy odpowiedzi na leki obejmują te, które bezpośrednio liczą komórki (np. licznik Coultera, niektóre zastosowania cytometrii przepływowej lub mikroskopii), określają zdolność komórek do proliferacji (np. test tworzenia kolonii) lub określają ilościowo aktywność metaboliczną (np. testy CellTiter-Glo, MTT oparte na tetrazolium lub MTS). Wspólną cechą tych testów jest to, że generowane dane są proporcjonalne do liczby żywych komórek. Ponieważ leki różnią się znacznie pod względem sposobu koordynowania hamowania wzrostu i śmierci komórki, liczba żywych komórek po ekspozycji na lek dostarcza niewiarygodnego wglądu w poziom śmierci komórki wywołanej przez lek3. Ponadto, ponieważ komórki nowotworowe na ogół szybko namnażają się w hodowli komórkowej, liczba żywych komórek może być znacznie zmniejszona w stosunku do populacji nieleczonej bez wywoływania śmierci komórki4. Tak więc główną wadą jest to, że stopnia śmierci komórki nie można określić ilościowo bez zmierzenia zarówno liczby żywych, jak i martwych komórek.

Dokładne określenie liczby martwych komórek po ekspozycji na lek jest trudne z kilku powodów2. Po pierwsze, istnieje ponad tuzin regulowanych ścieżek śmierci komórki5,6,7,8. Chociaż na ogół istnieją markery biochemiczne do identyfikacji każdego typu regulowanej śmierci komórki, markery te różnią się swoją specyficznością i nie można użyć pojedynczego testu do jednoczesnego ilościowego określenia wszystkich podtypów śmierci. Po drugie, czas aktywacji dla każdej formy śmierci komórki może się znacznie różnić w zależności od kontekstu, więc pełny obraz nie może się wyłonić, jeśli śmierć nie zostanie określona ilościowo w czasie9,10. Wiele testów biochemicznych do ilościowego określania śmierci komórki daje pomiar punktu końcowego, więc generowanie danych kinetycznych może być trudne i ograniczone kosztami. Trzecią komplikacją jest to, że martwa komórka sama w sobie jest przejściowym stanem pośrednim między stanem żywej komórki a zdysocjowanymi szczątkami komórki. Stabilność martwych komórek różni się w zależności od podtypu śmierci, przy czym niektóre typy, takie jak apoptoza, tworzą stosunkowo stabilne zwłoki, podczas gdy inne rodzaje śmierci powodują szybką lizę. W związku z tym metody ilościowego określania śmierci, które wymagają zbierania i liczenia martwych komórek, również zapewnią tendencyjne zrozumienie śmierci komórki. Wreszcie czwartym ograniczeniem jest to, że testy biochemiczne, które określają ilościowo stopień śmierci komórki, zazwyczaj nie dostarczają żadnego wglądu w to, jak lek zmienia proliferację. W związku z tym nie można interpretować ogólnej wielkości populacji - i, co ważne, tego, czy populacja się powiększa, czy maleje.

Niektóre testy oparte na mikroskopii, takie jak STACK i SPARKL, są skuteczne w mierzeniu żywych i martwych komórek w czasie, a te testy mogą dostarczyć wyczerpujących informacji na temat śmierci komórek wywołanej przez leki10,11. Testy te wymagają jednak specjalistycznych instrumentów, takich jak mikroskop Incucyte, co stwarza ograniczenia w przepustowości i dostępie do tych metod. Ponadto techniki oparte na mikroskopii wymagają, aby martwe komórki pozostawały w płaszczyźnie ogniskowej mikroskopu przez cały czas trwania eksperymentu, co ogranicza zdolność do ilościowego określania martwych komórek, gdy tracą przyleganie do płytki lub z czasem, gdy martwe komórki ulegają rozpadowi. Podobnie, testy oparte na mikroskopii napotykają wyzwania, gdy są stosowane w kontekście hodowli zawiesinowych, ponieważ komórki dryfują do i z danej płaszczyzny ogniskowej.

Aby rozwiązać powyższe problemy, stworzyliśmy test o nazwie FLICK (Fluorescence-based and Lysis-dependent Inference of Cell Death Kinetics)12,13. Celem testu FLICK jest określenie poziomu śmierci komórki wywołanej przez lek, niezależnie od tego, w jaki sposób komórki umierają. W metodzie FLICK wykorzystuje się barwniki nieprzepuszczalne dla komórek, których fluorescencja zależy od wiązania DNA. Kluczową cechą FLICK jest wykorzystanie tych fluoroforów do oznaczania akumulacji martwych komórek w czasie ze względu na ich dostępne DNA, a następnie mechanicznej lizy na bazie detergentu w celu przeniknięcia do żywych komórek pod koniec testu. Dane te, w połączeniu z modelowaniem matematycznym, umożliwiają kwantyfikację zarówno żywych, jak i martwych populacji komórek z ciągłą rozdzielczością czasową i bez konieczności zbierania lub przetwarzania martwych komórek. Co więcej, zastosowanie czytnika płytek do oceny fluorescencji martwych komórek pozwala na ocenę martwych komórek bez wymagania, aby martwe komórki pozostały nienaruszone, łagodząc w ten sposób uprzedzenia do martwiczych form śmierci, które skutkują pęknięciem komórki. Wreszcie, test FLICK wymaga minimalnej obsługi płytki i może szybko generować pomiary kinetyczne, co pozwala na wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. W tym protokole skupiamy się na zastosowaniu testu FLICK, w tym na tym, jak używać FLICK do wnioskowania o tempie wzrostu indukowanym lekiem, wskaźniku śmiertelności i / lub mechanizmach śmierci komórki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Optymalizacja czasu permeabilizacji dla każdej interesującej linii komórkowej

UWAGA: Opisane objętości i ilości służą do optymalizacji jednej linii komórkowej. Wartości te należy zwiększyć proporcjonalnie do liczby linii komórkowych przeznaczonych do badań.

  1. Wysiać pożądaną liczbę komórek do każdej studni 96-dołkowej płytki o czarnych ściankach i optycznym dnie. Dodać 100 µL kompletnej pożywki i pozwolić komórkom przytwierdzić się do płytki przez noc.
    UWAGA: Liczba wysianych komórek powinna zostać zoptymalizowana z uwzględnieniem szybkości wzrostu komórek, optymalnej gęstości oraz czasu trwania analizy. Typowe początkowe liczby komórek dla adhezyjnych linii komórkowych nowotworowych mierzonych przez 72 h wynoszą od 1500 do 5000 komórek na studnię. Na przykład komórki U2OS można wysiać w liczbie 2000 komórek na studnię w pożywce DMEM z 10% FBS, 2 mM glutaminą i 1% Pen-Strep i hodować przez noc w standardowych warunkach (5% CO2, 37 °C, z zachowaniem wilgotności).
  2. W stożkowatej probówce wirówkowej o pojemności 15 mL przygotować 1,5 mL 1,5% roztworu Triton-X w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Mieszać roztwór 1,5% Triton-X w wstrząsarku wortex przez 5 s z maksymalną prędkością. Umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na co najmniej 30 min.
  3. Wizualnie sprawdzić, czy Triton-X całkowicie się rozpuścił, mieszając w wstrząsarku wortex przez kilka sekund. Upewnić się, że roztwór jest jednorodny.
  4. Dodać 10 µL 1,5% roztworu Triton-X do każdej studni z wysianymi komórkami. Nie mieszać.
    UWAGA: Na tym etapie nie zaleca się mieszania poprzez wielokrotne pipetowanie ze względu na powstawanie pęcherzyków powietrza.
  5. Przenieść komórki z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych (5% CO2, 37 °C z wilgotnością) na co najmniej 1 h.
    UWAGA: Po zastosowaniu roztworu Triton-X większość linii komórkowych ulega całkowitej lizie w ciągu 2-3 h. Oczekiwanie do 24 h ma minimalny wpływ na sygnał fluorescencyjny przy użyciu barwników takich jak SYTOX Green. Zwiększenie stężenia Triton-X może skrócić czas inkubacji dla linii komórkowych trudnych do lizy.
  6. Obserwować morfologię komórek pod mikroskopem świetlnym, używając obiektywu 10x. Kontrolować komórki co godzinę, aż ciała komórek przestaną być widoczne. Zapisać czas potrzebny do permeabilizacji komórek.
    UWAGA: Jeśli dostępny jest mikroskop fluorescencyjny, lizę można wizualizować przy użyciu barwnika DNA nieprzenikającego przez błony komórkowe, takiego jak SYTOX Green. Barwnik można dodać do roztworu Triton-X w stężeniu końcowym 10x, a permeabilizację potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

2. Wybór i kalibracja barwnika do DNA

UWAGA: Wymogiem dla testu FLICK jest zastosowanie fluoroforu nieprzenikającego do wnętrza komórki, który emituje sygnał w sposób zależny od wiązania z DNA, nie wpływa na żywotność komórek i generuje sygnał skalujący się liniowo z liczbą komórek. W niniejszym protokole zastosowano SYTOX Green. Inne barwniki o podobnych właściwościach mogą być również odpowiednie do testu FLICK, jednak każdy z nich powinien zostać oceniony i skalibrowany. Przykłady znajdują się w Tabeli 1.

  1. Dla wybranego barwnika DNA należy określić zakres stężeń do przetestowania w oparciu o zalecenia producenta.
  2. Dla każdego stężenia do przetestowania, w trzech powtórzeniach, należy wysiać 40 000 komórek w 180 µL pożywki hodowlanej wzdłuż lewej kolumny płytki 96-dołkowej z czarnymi ściankami i dnem optycznym. Do pozostałych dołków należy dodać 90 µL pożywki.
    UWAGA: Służy to do stworzenia liniowego miareczkowania komórek w rzędach płytki. Końcowe stężenie w pierwszych dołkach wyniesie 20 000 komórek/dołek. Płytki z dnem optycznym nie są wymagane w przypadku czytników płytek, które odczytują fluorescencję z góry dołka. Pożywka hodowlana powinna być tą samą pożywką, której użyto do hodowli testowanych komórek. Na przykład w przypadku komórek U2OS, 40 000 komórek należy resuspenderować w 180 µL DMEM.
  3. Za pomocą pipety wielokanałowej należy wykonać seryjne rozcieńczenie 1:2, przenosząc 90 µL z lewej kolumny do sąsiedniej kolumny po prawej stronie. Pipetować 15 razy w celu wymieszania.
  4. Należy powtórzyć krok 2.3, przechodząc z drugiej kolumny do trzeciej, następnie z trzeciej do czwartej i tak dalej. Miareczkowanie należy zakończyć w przedostatniej kolumnie płytki. Ostatnią kolumnę należy pozostawić bez komórek, aby można było uzyskać sygnał tła dla pożywek hodowlanych.
  5. Z przedostatniej kolumny należy usunąć 90 µL, tak aby wszystkie dołki zawierały 90 µL pożywki z różną liczbą komórek. Pozostawić komórki do przyczepienia na 6 h w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C.
  6. Dla każdego stężenia barwnika do przetestowania należy przygotować 10-krotny roztwór barwnika DNA, rozcieńczając go w pełnej pożywce wzrostowej używanej do hodowli odpowiednich komórek. Należy przygotować 1,5 mL 1,5% roztworu Triton-X w PBS, zgodnie z opisem w kroku 1.
  7. Do każdego dołka płytki 96-dołkowej należy dodać 10 µL 10-krotnego barwnika DNA. Do każdego dołka należy dodać 10 µL 1,5% roztworu Triton-X w celu permeabilizacji komórek. Inkubować komórki w tym roztworze przez optymalny czas, który został określony w kroku 1.
    UWAGA: Po dodaniu Triton-X końcowe stężenie barwnika DNA jest nieco niższe niż 1x, ale jest to nieistotne. Po inkubacji cała płytka powinna zostać zlizowana. Ręczne miareczkowanie komórek zostanie wykorzystane do zidentyfikowania optymalnego stężenia barwnika DNA oraz optymalnych ustawień akwizycji fluorescencji.
  8. Należy zmierzyć intensywność fluorescencji na płytce z miareczkowaniem komórek. Ilość fluorescencji należy określić w zakresie ustawień akwizycji określonym przez producenta barwnika DNA. W zależności od użytego czytnika płytek, należy zmodyfikować długości fal wzbudzenia i emisji oraz/lub wzmocnienie cyfrowe (gain).
  9. Sygnał tła z każdego pomiaru należy usunąć poprzez odjęcie średniego sygnału z kolumny nie zawierającej komórek. Wartości te znajdują się w prawej kolumnie dołków na płytce do rozcieńczeń seryjnych.
  10. Należy określić liniowość każdego stężenia barwnika DNA dla każdego ustawienia akwizycji. Liniowość można określić, wykreślając liczbę komórek w funkcji sygnału fluorescencji i wykonując regresję liniową. Współczynnik determinacji (r2) informuje o stopniu liniowej zależności sygnału fluorescencji od liczby komórek.
  11. Należy wybrać ustawienia akwizycji i stężenie barwnika DNA, które zapewniają najlepszą kombinację liniowości i zakresu dynamicznego.
    UWAGA: Należy wziąć pod uwagę cały zakres liczby komórek od 0 do 20 000. Należy upewnić się, że wzmocnienie i stężenie barwnika DNA są liniowe przy niskich liczbach komórek, między 0 a 1000 komórek. Kilka ustawień instrumentu lub stężeń barwnika DNA może zapewnić silną korelację w całym zakresie. Niezbędne jest jednak, aby czułość w dolnym zakresie była wysoka, tak aby niewielkie zmiany w liczbie martwych komórek mogły być dokładnie zmierzone.

3. Wysiewanie komórek, aplikacja leku do dołków oraz pomiar fluorescencji martwych komórek w czasie w płytkach traktowanych lekiem

UWAGA: Płytki do rozcieńczania leków można projektować elastycznie, w zależności od potrzeb eksperymentalnych. Zazwyczaj płytki do rozcieńczania leków zawierają serię rozcieńczeń logarytmicznych lub półlogarytmicznych jednego lub kilku leków.

  1. Zastanów się nad optymalnym układem wysiewu dla eksperymentu. Unikaj pomiarów z zewnętrznych studzienek płytki 96-dołkowej, aby zmniejszyć szum związany ze zmiennością wzrostu, ponieważ zewnętrzne studzienki są narażone na inne temperatury, natlenienie i parowanie niż studzienki wewnętrzne płytki.
    UWAGA: Umieszczenie kontroli w różnych częściach płytki zwiększy wiarygodność danych dotyczących wzrostu. Rozważ umieszczenie studzienek kontrolnych w centrum i na krawędziach płytki.
  2. Określ liczbę płytek wymaganych do eksperymentu. Uwzględnij jedną dodatkową płytkę, którą należy poddać lizie na początku analizy, aby ustalić średnią liczbę komórek na studzienkę w momencie podania leku (tj. płytka kontrolna T0).
  3. Przygotuj zawiesinę komórkową w pełnej pożywce wzrostowej.
    1. Na podstawie liczby płytek potrzebnych do eksperymentu (obliczonej w kroku 3.2), określ wymaganą objętość zawiesiny komórkowej. Przy wysiewie 90 µL na studzienkę wymagane jest około 10 mL na płytkę. Pomnóż liczbę wymaganych płytek przez 10 mL.
      UWAGA: Wskazane jest zwiększenie tej objętości, aby uwzględnić objętość martwą zbiornika oraz straty objętości podczas pipetowania. Na przykład obliczoną objętość można pomnożyć przez 1,2.
    2. Policz komórki i przygotuj rozcieńczenie komórkowe na podstawie pożądanej liczby komórek na studzienkę. Na przykład, jeśli celem jest wysianie 2000 komórek w 90 µL pożywki na studzienkę płytki 96-dołkowej dla łącznie 3 płytek, oblicz całkowitą liczbę komórek potrzebnych do eksperymentu w następujący sposób:
      Wzór na liczenie komórek: \( \frac{2000 \text{ cells/well}}{0.09 \text{ mL/well}} \times [(3 \text{ plates} \times 10 \text{ mL}) \times 1.2] = 800,000 \text{ cells} \); ilościowe obliczanie wzrostu komórek.
      Analogicznie, jeśli policzona zawiesina komórkowa wynosi 400 000 komórek/mL, objętość zawiesiny komórkowej potrzebna do eksperymentu wyniosłaby:
      Obliczanie liczenia komórek i stężenia, wzór, 800,000 cells/400,000 cells/mL = 2 mL suspension.
    3. Skoryguj objętość pożywki do hodowli komórkowej użytej do wysiewu, odejmując objętość dodawanej policzonej zawiesiny komórkowej.
      36 mL pożywki - 2 mL zawiesiny komórkowej = 34 mL skorygowanej objętości pożywki
  4. Wymieszaj policzoną zawiesinę komórkową z odpowiednią objętością pożywki za pomocą pipety serologicznej. Przenieś tę zawiesinę komórkową do zbiornika na odczynniki z dnem w kształcie litery V.
  5. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 90 µL zawiesiny komórkowej do każdej studzienki płytek 96-dołkowych. Regularnie mieszaj zawiesinę komórkową w zbiorniku na odczynniki, stosując wielokrotne pipetowanie pipetą serologiczną, aby zapewnić utrzymanie pożądanej koncentracji komórek w jednostce objętości.
  6. Pozostaw komórki do przytwierdzenia przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C (zazwyczaj 12-24 h).
  7. Przygotuj 1,5% roztwór Triton-X w PBS, zgodnie z opisem w kroku 1. Objętość tego roztworu powinna być wystarczająca do lizy wszystkich płytek. Około 1,5 mL 1,5% Triton-X w PBS wystarcza do lizy jednej płytki 96-dołkowej.
    UWAGA: 1,5% roztwór Triton-X w PBS jest stabilny przez ponad tydzień i dla wygody może być przygotowany wcześniej.
  8. Określ ilość pożywki do hodowli komórkowej potrzebnej do przygotowania płytki z rozcieńczeniami leku. Przygotuj płytki z rozcieńczeniami leku w przezroczystych płytkach 96-dołkowych z dnem w kształcie litery U lub V.
    1. Aby upewnić się, że objętość rozcieńczonego leku jest wystarczająca do eksperymentu, zwiększ minimalną wymaganą objętość, aby uwzględnić straty podczas pipetowania. Na przykład, jeśli leki mają być dodawane w ilości 10 µL do każdej studzienki płytki 96-dołkowej, a eksperyment obejmuje trzy płytki, wymagane jest 30 µL rozcieńczonego leku na studzienkę. Przygotuj 40-50 µL pożywki z lekiem na studzienkę, aby uwzględnić straty objętości. Dodaj 1,5 mL do objętości pożywki, aby uwzględnić pożywkę potrzebną do płytki kontrolnej T0.
  9. Przygotuj 10-krotne stężenie wybranego barwnika DNA w pełnej pożywce wzrostowej. Stężenie to opiera się na stężeniu wybranym w kroku 2.11. Całkowita objętość tego roztworu jest obliczana w kroku 3.8.
  10. Używając barwnika DNA + pożywki wzrostowej z kroku 3.9, przygotuj 10-krotne stężenie każdego badanego leku. Przygotuj tylko najwyższą dawkę każdego leku na płytce z rozcieńczeniami leku i wykonaj rozcieńczenia seryjne leków pipetą wielokanałową, mieszając 15 razy między każdą studzienką.
    UWAGA: Podczas przygotowywania najwyższej dawki danego leku na płytce z rozcieńczeniami, należy uwzględnić objętość leku, aby zapewnić dokładność stężenia.
  11. Używając pipety wielokanałowej, dodaj 10 µL roztworu leku + barwnika DNA z kroku 3.10 do płytek zawierających komórki.
    UWAGA: W przypadku płytek z rozcieńczeniami leków, w których wykonano rozcieńczenie seryjne, jeśli leki są dodawane do komórek zaczynając od najniższego stężenia leku i przechodząc do najwyższego, końcówki pipety wielokanałowej nie muszą być wymieniane. Należy jednak wymieniać końcówki pipety wielokanałowej między każdą płytką oraz zawsze wtedy, gdy końcówki były używane w studzience zawierającej inny lek lub wyższe stężenie leku.
  12. Odczytaj fluorescencję dla wszystkich płytek, do których dodano leki. Odczyt ten jest odczytem T0 (tj. martwe komórki w czasie t = 0 h).
  13. Po wykonaniu odczytu fluorescencji T0 zwróć płytki do inkubatora.
  14. Do płytki kontrolnej T0 dodaj 10 µL 10-krotnego roztworu barwnika DNA przygotowanego w kroku 3.9 oraz 10 µL 1,5% roztworu Triton-X z kroku 3.7. Zwróć tę płytkę do inkubatora na czas wybrany w kroku 1.8.
  15. Odczytaj płytkę kontrolną T0 po pełnej lizie komórek, zgodnie z opisem w kroku 1.6.

4. Pomiar fluorescencji martwych komórek w czasie dla płytek poddanych działaniu leku

UWAGA: Należy zminimalizować czas przebywania płytek poza inkubatorem. Długotrwałe zmiany temperatury mogą wpływać na żywotność komórek, a ekspozycja na światło może uszkodzić fluorofory DNA, takie jak SYTOX Green.

  1. Wykonuj pomiary fluorescencji dla wszystkich płytek traktowanych lekami co 3-4 h po podaniu leku. Płytki nie muszą być odczytywane w nocy, chyba że wymagana jest bardzo precyzyjna kinetyka śmierci komórek.
    UWAGA: Punkty czasowe nie muszą być pobierane w stałych/standardowych odstępach. Zazwyczaj pomiary można wykonywać wyłącznie w normalnych godzinach pracy bez powodowania błędów w późniejszej analizie kinetyki śmierci. Kinetykę można wywnioskować, pod warunkiem że dokonano pomiarów w okresie przed wystąpieniem śmierci, podczas fazy wzrostowej oraz w fazie nasycenia/plateau.
  2. W docelowym, końcowym punkcie czasowym wykonaj pomiar fluorescencji. Natychmiast po tym dodaj 10 µL 1,5% roztworu Triton-X przygotowanego w kroku 3.7 w celu lizy komórek.
  3. Włóż płytki z powrotem do inkubatora i pozostaw komórki do przeprowadzenia permeabilizacji przez czas określony w kroku 1.
  4. Wykonaj pomiary fluorescencji po permeabilizacji. Wartość fluorescencji ta jest proporcjonalna do całkowitej liczby komórek (tj. komórek żywych + martwych) w każdym dołku.

5. Obliczanie kinetyki frakcji letalnej

UWAGA: Obliczenia opisane w niniejszym protokole można przeprowadzić w dowolnym formacie lub oprogramowaniu. Jednakże zastosowanie środowiska programistycznego, takiego jak MATLAB, R lub Python, pozwoli na szybszą i bardziej elastyczną analizę.

  1. Oblicz średnie wartości fluorescencji dla płytki kontrolnej T0, stosując średnią przyciętą o 50%. Wartość ta jest proporcjonalna do całkowitej liczby komórek przed podaniem leku.
  2. Za pomocą dopasowania krzywej i funkcji wzrostu wykładniczego oblicz kinetykę wzrostu populacji dla wszystkich studni w eksperymencie. Początkowa wielkość populacji dla każdej studni to średnia wartość fluorescencji T0 obliczona w kroku 5.1. Końcowa wielkość populacji dla każdej studni to wartość po permeabilizacji obliczona w kroku 4.4. Czas trwania analizy obejmuje okres od 0 h do punktu końcowego analizy wybranego w kroku 4.4.
  3. Wykorzystując parametry wzrostu określone w kroku 5.2, oblicz całkowitą liczbę komórek w każdym zmierzonym punkcie czasowym analizy dla każdej studni. Określ liczbę żywych komórek w każdym zmierzonym punkcie czasowym, odejmując pomiar martwych komórek od całkowitej liczby komórek obliczonej w kroku 5.2.
    UWAGA: Ze względu na niewielkie zakłócenia w analizie, liczba żywych komórek może sporadycznie przyjąć niewielką wartość ujemną. Można ją ręcznie ustawić na 0, ponieważ nie może istnieć ujemna liczba żywych komórek, co najprawdopodobniej wskazuje, że wszystkie komórki w danej studni obumarły.
  4. Oblicz frakcję letalną (LF) dla każdego punktu czasowego, dzieląc sygnał fluorescencji martwych komórek przez całkowity sygnał komórkowy dla każdego punktu czasowego.
  5. Dopasuj równanie Lag Exponential Death (LED) do danych przebiegu czasowego frakcji letalnej10. Aby uniknąć arbitralnych parametrów kinetycznych dla dawek leku, które nie wywołują istotnej letalności, zastosuj model liniowy z nachyleniem równym 0. Określ istotne poziomy letalności na podstawie szumu w analizie lub LF zaobserwowanej w warunkach bez podania leku.
  6. Odczytaj czas rozpoczęcia obumierania (DO) z równania LED. Równanie LED posiada cztery parametry: początkową LF (LFi), LF na poziomie plateau (LFp), początkową szybkość obumierania (DR) oraz DO. Wyznacz parametry te z danych, stosując regresję nieliniową (tzn. dopasowanie krzywej).
  7. Oblicz frakcyjną żywotność (FV) w punkcie końcowym analizy dla każdego leku przy każdej dawce. Odejmij końcową wartość LF od 1 lub podziel liczbę żywych komórek przez całkowitą liczbę komórek.
    UWAGA: FV można obliczyć w dowolnym punkcie czasowym, nie tylko w punkcie końcowym analizy. Dane te są wykorzystywane do oceny farmakologii dawki (np. IC50 lub EC50 leku).

6. Obliczenie wartości GR

  1. Wyznacz średnią liczbę żywych komórek dla każdego dołka na początku analizy. Oblicz tę wartość, wykorzystując odczyt T0 po permeabilizacji obliczony w kroku 3.15 i odejmując odczyt T0 dla każdego dołka zebranego w kroku 3.12. W poniższym równaniu GR (krok 6.3) wartość ta jest określana jako x0.
    UWAGA: Czasami najwyższa dawka leku może zakłócać odczyt fluorescencji barwnika DNA. W takim przypadku warto obliczyć średnią liczbę żywych komórek w czasie 0, korzystając z dołków kontrolnych.
  2. Dla dołków kontrolnych (xctrl) wyznacz średnią liczbę żywych komórek dla każdego dołka w punkcie końcowym analizy. Wyznacz średnią liczbę żywych komórek w punkcie końcowym analizy dla każdego stanu po zastosowaniu leku (x(c)).
    UWAGA: W zależności od zmienności wzrostu komórek na płytce, do normalizacji każdego dołka można zastosować różne wartości xctrl . Na przykład, jeśli wartości xctrl zmieniają się systematycznie na całej płytce, warto zastosować najbliższą wartość xctrl zamiast średniej wartości xctrl dla całej płytki.
  3. Dla każdego dołka poddanego działaniu leku oblicz znormalizowaną wartość inhibicji tempa wzrostu (GR), korzystając z następującego równania4:
    Równanie tempa wzrostu z logarytmami, przedstawiające stosunki stężeń w formule naukowej.
    Wykonaj dopasowanie krzywej, stosując 4-parametryczną regresję logistyczną. Wartość GR znajduje się w zakresie od -1 do 1.

7. Obliczanie indukowanych lekiem tempa wzrostu i śmiertelności przy użyciu metody GRADE

UWAGA: GR reprezentuje netto tempo wzrostu populacji, a nie rzeczywiste tempo proliferacji komórek. Tempo wzrostu i śmiertelności populacji indukowane lekiem można obliczyć, wykorzystując kombinację GR oraz frakcji letalnej (LF).

  1. Wyznacz czas podwojenia (τ) linii komórkowej podczas eksperymentu, wykorzystując średnią liczbę żywych komórek z odczytu kontrolnego w czasie T0 (x0), średnią liczbę żywych komórek w warunkach kontrolnych w punkcie końcowym analizy (xctrl) oraz czas trwania analizy w godzinach (t), aby rozwiązać następujące równanie:
    Wzór na stałą czasową, τ=(t/log₂(x_ctrl/x₀)), analiza równania matematycznego.
    UWAGA: Dokładne obliczenie czasu podwojenia komórek (τ) wymaga, aby komórki nieustannie się podwajały przez cały czas trwania analizy. W przypadku komórek wykazujących inhibicję kontaktową, należy je wysiać w gęstościach początkowych, które nie doprowadzą do osiągnięcia konfluencji w żądanym czasie analizy. Na przykład linia U2OS ma średni czas podwojenia wynoszący 24 h. Wysianie 2000 komórek na studzienkę w analizie trwającej 72 h jest optymalne dla interpretacji ich szybkości wzrostu.
  2. Określ zależność między szybkościami wzrostu/śmierci a wielkością populacji. W tym celu zastosuj model urodzeń/zgonów oraz symulację zainicjowaną wszystkimi prawdopodobnymi kombinacjami par szybkości wzrostu i śmierci. Symulacja ta wymaga średniej liczby żywych komórek z płytki kontrolnej T0 (x0), czasu trwania analizy (t) oraz zdefiniowanego przez użytkownika zakresu prawdopodobnych szybkości proliferacji (p) i śmierci (d).
    Wzór na liczbę żywych komórek dla analizy wzrostu komórek; równanie zawiera zmienne x₀, t, bp i d.
    wzór na kwantyfikację martwych komórek, równanie do obliczania liczby martwych komórek, x0*2^(t*p)*d
    1. Aby wyznaczyć prawdopodobne wartości szybkości wzrostu, przyjmij szybkość wzrostu nieleczonego w liczbie podwojeń populacji komórkowej na h (1/T) jako najwyższą szybkość wzrostu oraz 0 jako najniższą szybkość wzrostu. Podziel ten zakres na 500 równych segmentów. Analogiczną operację można zastosować dla szybkości śmierci, testując zakres od 0 do 1.
      UWAGA: Wszystkie kombinacje par 500 szybkości można przeprowadzić w dowolnym środowisku programistycznym, jednak w przypadku niektórych oprogramowań może to być zbyt obciążające obliczeniowo. Ograniczenie do wszystkich kombinacji par 50 szybkości wzrostu i śmierci może rozwiązać ten problem, kosztem zmniejszenia precyzji wnioskowania. Do niniejszego protokołu dołączono szablon arkusza kalkulacyjnego.
  3. Wyznacz wartości GR i LF (opisane powyżej) dla każdej symulowanej pary szybkości proliferacji (p) i śmierci (d).
    UWAGA: Kroki 7.2-7.3 wygenerują tabelę zawierającą każdą teoretyczną parę szybkości proliferacji i śmierci wraz z obliczonymi wartościami GR i LF dla tej teoretycznej pary. Będzie ona służyć jako tabela wyszukiwania do przypisania eksperymentalnie zaobserwowanej pary wartości GR i LF do pary indukowanych lekiem szybkości proliferacji i śmierci. Testowanie więcej niż 500 dyskretnych wartości dla szybkości proliferacji i śmierci pozwoli uzyskać bardziej precyzyjną wartość numerycznie, ale taki poziom precyzji prawdopodobnie przekroczy precyzję samej analizy.
  4. Oblicz odległość parzystą między każdą eksperymentalnie obliczoną parą GR/LF a każdą teoretyczną parą GR/LF w tabeli wyszukiwania. Przyjmij, że teoretyczna para o minimalnej odległości od eksperymentalnie zaobserwowanej pary wartości GR/LF stanowi rzeczywiste, indukowane lekiem szybkości proliferacji i śmierci.

8. Określanie szlaków śmierci za pomocą selektywnych chemicznych inhibitorów szlaków

UWAGA: Same inhibitory chemiczne są niewystarczające do jednoznacznego określenia mechanizmu śmierci wywołanej przez dany lek. Inhibitory chemiczne szlaków śmierci powinny być wykorzystywane do ustalenia, które odpowiedzi biochemiczne lub fenotypowe należy zbadać w kolejnych eksperymentach, które prawdopodobnie będą obejmować ocenę morfologiczną, specyficzne dla danego szlaku markery biochemiczne oraz ocenę zależności genetycznych.

  1. Zoptymalizuj dawkę każdego inhibitora śmierci komórkowej w badanej linii komórkowej, testując zakres stężeń inhibitora w obecności kanonicznego aktywatora interesujących ścieżek śmierci (Tabela 2). Idealnie wybrana dawka inhibitora nie powinna sama w sobie wpływać na żywotność komórek (sprawdź wskaźnik GR).
    UWAGA: Nie wszystkie linie komórkowe mogą aktywować wszystkie ścieżki śmierci. Podczas testowania aktywatorów/inhibitorów różnych ścieżek śmierci może być wymagana walidacja biochemiczna lub fenotypowa.
  2. Rozważ optymalny układ wysiewu dla przesiewu inhibitorów. Aby zminimalizować efekty serii, umieść każdy lek na tej samej płytce co oceniane inhibitory, z powtórzeniami na osobnych płytkach.
  3. Wysiej pożądaną liczbę komórek do każdej studzienki płytki 96-dołkowej z czarnymi ściankami i optycznym dnem, analogicznie do kroku 3.3. Zmniejsz objętość wysiewu do 80 µL, aby uwzględnić objętości inhibitora i leku.
  4. Przygotuj 10-krotne stężenie testowanych inhibitorów w pełnej pożywce i dodaj 10 µL do każdej studzienki. Poddaj komórki wstępnej inkubacji z inhibitorami ścieżek śmierci przez 2-4 h. Następnie dodaj interesujące leki i wykonaj pomiar fluorescencji, zgodnie z krokami 3-5.
  5. Oceń zmianę czasu wystąpienia śmierci (DO) i/lub maksymalną frakcję letalną, aby ocenić skuteczność inhibitorów. DO jest parametrem wywnioskowanym z modelu Lag Exponential Death (LED). Patrz kroki 5.6 - 5.7.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Stosując niniejszy protokół, zbadaliśmy wrażliwość komórek U2OS na inhibitor HDAC Belinostat. Eksperymenty te przeprowadzono z użyciem 2 µM SYTOX Green w celu znakowania martwych komórek (Rycina 1A). Odczyty kinetyczne wykonano za pomocą fluorescencyjnego czytnika płytek przy ustawieniu wzmocnienia (gain) na poziomie 130 (Rycina 1B). Na koniec analizy komórki poddano lizie w 1,5% roztworze Triton-X w PBS przez 2 h (Rycina 1C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Test FLICK jest solidną metodą generowania kompleksowej oceny wpływu leku na wzrost i śmierć populacji komórek. Ponieważ metoda ta nie zlicza bezpośrednio komórek, krytycznymi krokami w protokole są zapewnienie liniowości testu i całkowitej lizy podczas etapów przepuszczalności trytonu. Prawidłowy czas przenikania można określić wizualnie, jak podkreślono w niniejszym protokole, lub ilościowo, odczytując fluorescencję płytki w czasie i określając, kiedy sygnał się stabilizuje. Z naszego doświadczenia wynika jednak, że w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom Lee Lab za ich wkład w perspektywę naszego laboratorium w zakresie oceny reakcji na leki. Prace te były wspierane przez fundusze z National Institutes of Health dla MJL (R21CA294000 i R35GM152194).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BelinostatApexBioA4612
CamptothecinApexBioA2877
Stożkowa probówka wirówkowa, 15 mlFisher Scientific12-565-269
DMEMCorning10017CVDo wysiewu i odurzania komórek
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCDo wysiewu i leków komórek
Fisherbrand 96-Well, Mikropłytka z dnem w kształcie litery U poddana działaniu hodowli komórkowychFisher Scientific FB012932Do wysiewu i narkotyzacji komórek (płytka szpilkowa)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Przezroczysta 96-dołkowa, poddana działaniu kultur komórkowych, płaska płytka MicroplateGreiner655090Do wysiewu i narkotyzacji komórek
IncuCyte S3Essen BiosciencesBędzie działał dowolny mikroskop fazowy
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.htmlMATLAB w wersji R2023b, wymagana jest licencja
Czytnik fluorescencji mikropłytekTecanSparkDo pomiaru fluorescencji martwych komórek
PalbociclibApexBioA8316
PBSCorning21-040-CMDowolna praca PBS
Wielomodowy czytnik mikropłytek Spark Tecanhttps://www.tecan.com/spark-overviewOprogramowanie SparkControl wersja 2.2
Sterylny zbiornik, 25 mlFisher Scientific13-681-508Do wysiewu i leków komórek
Sytox Zielone barwienie kwasem nukleinowymThermo Fisher ScientificS7020Barwienie DNA do pomiaru fluorescencji martwych komórek
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APDo przepuszczalności komórek
U2OSATCCHTB-96Przykładowa linia komórkowa wykorzystana w tym protokole
Z-VAD-FMKApexBioA1902

Bibliografia

  1. Hafner, M., Niepel, M., Sorger, P. K. Alternative drug sensitivity metrics improve preclinical cancer pharmacogenomics. Nat Biotechnol. 35 (6), 500-502 (2017).
  2. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  3. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An Integrated Analysis of Population Growth and Cell Death Reveals Drug-Specific and Cancer Subtype-Specific Response Profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  4. Hafner, M., Niepel, M., Chung, M., Sorger, P. K. Growth rate inhibition metrics correct for confounders in measuring sensitivity to cancer drugs. Nat Methods. 13 (6), 1-11 (2016).
  5. Galluzzi, L., et al. Molecular mechanisms of cell death recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ. 25 (3), 486-541 (2018).
  6. Tsvetkov, P., et al. Copper induces cell death by targeting lipoylated TCA cycle proteins. Science. 375 (6586), 1254-1261 (2022).
  7. Holze, C., et al. Oxeiptosis, a ROS-induced caspase-independent apoptosis-like cell-death pathway. Nat Immunol. 19 (2), 130-140 (2018).
  8. Maltese, W. A., Overmeyer, J. H. Methuosis Nonapoptotic Cell Death Associated with Vacuolization of Macropinosome and Endosome Compartments. Am J Pathol. 184 (6), 1630-1642 (2014).
  9. Inde, Z., Forcina, G. C., Denton, K., Dixon, S. J. Kinetic Heterogeneity of Cancer Cell Fractional Killing. Cell Rep. 32 (1), 107845(2020).
  10. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic Quantification of Population Cell Death Kinetics in Mammalian Cells. Cell Syst. 4 (6), 1-18 (2017).
  11. Gelles, J. D., et al. Single-Cell and Population-Level Analyses Using Real-Time Kinetic Labeling Couples Proliferation and Cell Death Mechanisms. Dev Cell. 51 (2), 277-291.e4 (2019).
  12. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  13. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  14. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  15. Jannoo, R., Xia, Z., Row, P. E., Kanamarlapudi, V. Targeting of the Interleukin-13 Receptor (IL-13R)α2 Expressing Prostate Cancer by a Novel Hybrid Lytic Peptide. Biomolecules. 13 (2), 356(2023).
  16. Gelles, J. D., Chipuk, J. E. Why not add some SPARKL to your life (and death)! Mol Cell Oncol. 7 (1), 1685841(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza odpowiedzi na lekkwantyfikacja mierci kom rekinhibicja tempa wzrostufrakcja letalnafluorescencyjny czytnik p ytekrozcie czenia seryjneproliferacja kom rekdetekcja apoptozyodpowied na dawk
Kompleksowa analiza odpowiedzi na lek przy użyciu testu FLICK
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.