Artykuł metodologiczny

Stworzenie trójwymiarowego modułu kokultury komórek nabłonkowych z wykorzystaniem błon nanowłóknistych

DOI:

10.3791/67780

⸱

27 grudnia 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medicine, Ajou University, 2Department of Medical Sciences, The Graduate School, Ajou University, 33D Immune System Imaging Core Center, Ajou University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj pokazujemy, jak komórki nabłonkowe hodowane z fibroblastami w dwuwarstwowym systemie opartym na błonie nanowłóknistej mogą stabilnie przylegać do błony i rosnąć na niej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniczne przeszkody w hodowli komórek nabłonkowych obejmują dedyferencjację i utratę funkcji. Biomimetyczne trójwymiarowe (3D) metody hodowli komórek mogą zwiększyć wydajność hodowli komórkowych. W pracy przedstawiono zaawansowany dwuwarstwowy system hodowli przeznaczony do hodowli komórek nabłonka jako warstw tkankopodobnych z kulturą fibroblastów w środowisku 3D. Błony nanowłókniste (NM) z alkoholu poliwinylowego (PVA) i poli(ε-kaprolaktonu) (PCL) wytworzono metodą elektroprzędzenia i wykorzystano jako fizjologicznie istotną macierz zewnątrzkomórkową do hodowli odpowiednio komórek nabłonkowych i fibroblastów. W górnych studzienkach wkładowych hodowano komórki nabłonka płuc na PVA NM, a w dolnych komorach hodowano fibroblasty na PCL NM. Taka konfiguracja eliminuje bezpośredni kontakt komórka-komórka i ułatwia badanie sygnalizacji parakrynnej, w której pośredniczą czynniki rozpuszczalne. Mikroskopia konfokalna została wykorzystana do analizy rozmieszczenia, wzorca wzrostu i ekspresji białek wewnątrzkomórkowych, w tym zona occludens w komórkach nabłonkowych. Techniki układania w stosy Z umożliwiły szczegółowe rekonstrukcje 3D, zapewniając precyzyjny wgląd w integralność ciasnych połączeń i organizację przestrzenną w warstwie nabłonkowej. Skaningowa mikroskopia elektronowa (SEM) pozwoliła ocenić charakterystykę morfologiczną typów komórek na błonach nanowłóknistych. Obrazowanie SEM ujawniło skomplikowane struktury powierzchni komórek i interakcje z nanowłóknami, oferując kompleksową perspektywę na architekturę komórkową i interakcję komórki ze strukturą nanowłóknistą. Test Cell Counting Kit-8 (CCK-8) jest prostą metodą pomiaru tempa wzrostu komórek nabłonka i fibroblastów w czasie. Zapewnia zachowania proliferacyjne i potencjalne synergiczne efekty kokulturacji tych komórek. Odkrycia te podkreślają skuteczność prostego systemu kohodowli indukcyjnej do jednoczesnej hodowli fibroblastów i komórek nabłonkowych, co ma kluczowe znaczenie w różnych kontekstach fizjologicznych i farmakologicznych, w tym regeneracji tkanki nabłonkowej, mikrośrodowiska guza z komórkami śródbłonka, immunologicznego i innymi komórkami zrębu, testem toksyczności i testem aktywności leku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przez dziesięciolecia, klasyczna dwuwymiarowa (2D) monowarstwowa kultura była niezbędna do zrozumienia infekcji, farmakologii i toksykologii1,2. Należy jednak wziąć pod uwagę złożoność, dynamiczne interakcje między wieloma kompozycjami oraz trójwymiarową (3D) architekturę mikrośrodowiska tkankowego. W związku z tym hodowla komórkowa 2D ma ograniczenia w naśladowaniu struktur podobnych do tkanek3,4. Na przykład brakuje sygnalizacji komórka-komórka i komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM), która jest niezbędna w różnicowaniu, proliferacji i funkcjach komórkowych w mikrośrodowisku vivo. Z tych powodów opracowano systemy hodowli komórkowych 3D5. Komórki w hodowli 3D rosną i wchodzą w interakcje z otaczającą macierzą zewnątrzkomórkową w trzech wymiarach. Ponadto opracowano podejście oparte na kokulturze 3D, składające się z więcej niż jednego typu komórek, aby wypełnić lukę między uproszczonymi modelami pojedynczych komórek in vitro a dynamicznymi interakcjami komórkowymi zachodzącymi in vivo6. Systemy kokultury 3D zyskały popularność w badaniach nad komunikacją komórka-komórka i interakcjami komórka-macierz zewnątrzkomórkowa (ECM)7,8,9,10. Obecne systemy kokultury 3D mają kilka form i można je podzielić na kokulturę bezpośrednią i pośrednią8,9. W kokulturze bezpośredniej na różne funkcje komórek w hodowanych komórkach może wpływać głównie bezpośredni kontakt, a nie efekty parakrynne. Dla porównania, pośrednia kokultura ma większą przewagę w badaniu interakcji parakrynnych poprzez wykorzystanie barier lub warstw do oddzielania różnych typów komórek.

Różne materiały i metody są wykorzystywane do produkcji biomimetycznych rusztowań naśladujących ECM przy użyciu substancji biokompatybilnych i biodegradowalnych10. Struktura rusztowania nanowłóknistego naśladuje konfigurację natywnego ECM w tkankach biologicznych, zapewniając architekturę 3D dla hodowli komórkowych11,12. Elektroprzędzone membrany nanowłókniste (NM) zostały wykorzystane w bezpośredniej i pośredniej kokulturze różnych typów komórek13,14,15.

Komórki nabłonkowe tworzą fizyczną barierę głównych organów, podczas gdy fibroblasty są dominującymi komórkami zrębu, które pośredniczą w przebudowie ECM i regulują sąsiedni nabłonek6,16,17. Komórki nabłonkowe i fibroblasty oddziałują odpowiednio z lamininą w błonie podstawnej i fibronektyną w macierzy śródmiąższowej poprzez receptory integryny na powierzchni komórki18. Gdy komórki nabłonkowe są hodowane na poli(alkoholu winylowego) (PVA) NM o średnicach 150 - 250 nm i mikroporach, tworzą one wielowarstwy zamiast agregatów komórkowych i sferoidów, a ich wzorce wzrostu są podobne do tych w komórkach w tkance nabłonkowej19. Dla porównania, NM z poli(kaprolaktonu) (PCL) o średnicach 400-1,500 nm i mikroporach 10-50 μm zapewniają podobną wymiarowość przestrzenną do macierzy śródmiąższowej dla wzrostu hodowanych fibroblastów13,14. Ze względu na swoją biokompatybilność, membrany PVA i PCL są powszechnie stosowanymi polimerami w inżynierii tkankowej20,21.

To badanie wprowadza zaawansowany dwuwarstwowy system hodowli wykorzystujący porowate elektroprzędzone NM do hodowli komórek nabłonkowych jako warstw tkankopodobnych i fibroblastów w strukturze 3D. Protokół można podzielić na pięć kluczowych etapów: wytwarzanie nanowłókien, analiza po usieciowaniu i ocena jakości włókien, przygotowanie studni hodowli z membraną, wysiewanie komórek i kokultura 3D oraz testy komórek hodowanych w 3D.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wytwarzanie wodoodpornych nanowłókien PVA

  1. Odważyć 0,02 g poli(kwasu akrylowego) (PAA) i 1 g PVA, a następnie dodać je do czystej szklanej butelki zawierającej pręt magnetyczny. Do butelki dodać 7,8 ml wody destylowanej, umieścić butelkę na mieszadle talerzowym i ustawić temperaturę na 84 °C, prędkość na 500 obr./min, a czas na 12 godzin.
  2. Poczekaj, aż butelka ostygnie do temperatury pokojowej przed dodaniem 0,2 ml aldehydu glutarowego (GA). Umieść butelkę na mieszadle talerzowym i ustaw prędkość na 500 obr./min, czas na 30 min, a temperaturę na temperaturę pokojową.
  3. Użyj strzykawki o pojemności 5 ml do elektrowirowania, oddziel tłoki od beczek i wyczyść małe plastikowe zanieczyszczenia wewnątrz beczek i końcówki tłoków.
  4. Za pomocą igieł zablokuj przepływ cieczy, a następnie wlej roztwór PVA do każdej beczki (objętość: 2,5-3 ml każda). Zmontować tłoki, a następnie usunąć igły.
    UWAGA: W roztworze może znajdować się bąbelek, więc poczekaj, aż bąbelek zniknie. Zajmuje to 10-30 minut.
  5. Złóż nową metalową igłę o wadze 27 G, a następnie umieść ją w elektroprzędzarce.
  6. Dobrze owiń kolektor folią.
  7. Pozwól, aby panel wtryskiwaczy powrócił do pierwotnego położenia. Użyj następujących ustawień dla maszyny: (każda pompa) objętość wtrysku: 2 ml, szybkość wtrysku: 6 μl/min, prędkość rolki: 100 obr./min, odległość końcówki od kolektora: 14 cm. Sprawdź przepływ cieczy dla każdej pompy.
  8. Uruchomić maszynę z potencjałem elektrycznym około 12 kV.
  9. Upewnij się, że wilgotność wynosi 40 - 50% na początku i 25 - 30% na końcu procesu. Użyj nawilżacza, gdy wilgotność spadnie i umieść naczynia zawierające wodę destylowaną w urządzeniu dzień przed elektrowirowaniem, aby zwiększyć wilgotność.
    UWAGA: Jest to kluczowy czynnik w pomyślnym wytwarzaniu nanowłókien PVA.
  10. Regularnie sprawdzaj przepływ. Jeśli igła jest zablokowana, tymczasowo zatrzymaj maszynę. Użyj chusteczki laboratoryjnej, aby usunąć kroplę i poczekaj, aż pojawi się nowa kropla. Jeśli nie, zmień igłę, a następnie kontynuuj pracę maszyny.
  11. Proces wytwarzania nanowłókien PVA trwa ~6 godzin. Po zakończeniu procesu elektroprzędzenia należy odłączyć folię zawierającą matę włóknistą od kolektora i przechowywać matę z nanowłókien w środku osuszającym pod próżnią.

2. Obróbka membrany nanowłóknistej PVA parą kwasu solnego (HCl) i ocena jakości włókien

UWAGA: Stabilność wodna NM PVA jest dobrze zachowana po reakcji sieciowania przez opary HCl. Proces ten jest zoptymalizowany pod kątem odpowiedniej grubości, wielkości porów i chropowatości NM. PVA jest bardzo hydrofilowym polimerem, a elektroprzędzone nanowłókna PVA są niestabilne w kontakcie z wodą i wilgotnych warunkach. Nanocząsteczki PVA należy poddać działaniu oparów HCl zaraz po wytworzeniu polimeru PVA.

  1. Pokrój matę z nanowłókien na kawałki o pożądanym rozmiarze dla wkładu trans-well.
  2. Przygotuj małe naczynie zawierające 1,5 ml czystego HCl. Umieść naczynie zawierające HCl i kawałki nanowłókien w komorze próżniowej i zamknij pokrywkę.
    UWAGA: Para HCl jest używana jako środek po usieciowaniu, aby nanowłókno było stabilne w wodzie.
  3. Otwórz zawór podłączony do pompy próżniowej, odczekaj 10 s, aż opary HCl uniosą się, a następnie zamknij zawór. Membrany należy traktować oparami HCl przez 2 minuty.
  4. Po potraktowaniu parą HCl dodaj kilka kropli wody destylowanej (DW) do membran, umieść je na szkiełku podstawowym i usuń membranę z folii. Po wyschnięciu na powietrzu przez 20 minut membrany w naturalny sposób przylegają do szkiełka.
  5. Pokryj membrany na taśmie węglowej cienką warstwą złota za pomocą powlekarki z automatycznym napylaniem. Uzyskiwanie obrazów ze skaningowego mikroskopu elektronowego (SEM).
  6. Po usieciowaniu PVA NM z HCl, przemyj je 3x 1x PBS i sprawdź pH po namoczeniu ich w pożywkach hodowlanych, aby potwierdzić brak resztkowego HCl.

3. Wytwarzanie nanowłókien PCL i ocena jakości nanowłókien

  1. Odważ 1,5 g PCL i dodaj go do czystej szklanej butelki. Dodać 8,5 ml chloroformu do butelki, umieścić butelkę na mieszadle talerzowym i rozpuścić PCL w chloroformie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej.
  2. Powtórz kroki od 1.3 do 1.9, z wyjątkiem kroków 1.7 i 1.8, ustaw szybkość wtrysku na 8 μl/min, a napięcie na 17.5 kV.
    UWAGA: Produkcja PCL trwa ~ 3,5 godziny.
  3. Wytnij mały kawałek membrany i pokryj kawałki w procesie automatycznego napylania przez 5 minut. Uzyskaj obrazy SEM.

4. Montaż dwóch warstw membran w trans-studzience

UWAGA: W tym protokole używamy płytki 24-dołkowej i odpowiedniej płytki wkładanej. PVA NM jest przymocowany do studzienki wkładu, podczas gdy PCL NM jest przymocowany do dolnej studzienki.

  1. Pokrój matę z nanowłókien na okrągłe kawałki o średnicy 10 mm i 13 mm odpowiednio dla NM PVA i PCL.
  2. Użyj polidimetylosiloksanu (PDMS) Sylgard 184 jako środka adhezyjnego do przymocowania membran do wkładu i studzienki komory. Przed użyciem wymieszać Sylgard 184 Base (część A) i Curing Agent (część B) w plastikowym kubku w stosunku masowym 10:1. Za pomocą czystego szkiełka szkiełkowego energicznie mieszaj roztwór PDMS przez 2-3 minuty, aż cała mieszanina wypełni się bąbelkami. Pozwól bąbelkowi się uformować i zniknąć na 10 minut przed użyciem; W międzyczasie pozwól szkiełku ogrzać się do 100 °C.
  3. Rozłóż PDMS na szklanym szkiełku podstawowym i lekko zanurz dolną krawędź wkładki w PDMS. Trzymaj wkładkę do góry nogami na podgrzewaczu do szkiełek, aby PDMS stwardniał (~10-15 min). Dokładnie sprawdź za pomocą końcówki o pojemności 200 μl, aby upewnić się, że PDMS nie jest lepki.
  4. Kawałki PVA NM należy traktować zgodnie z opisem w krokach od 2.2 do 2.4.
  5. Delikatnie dociśnij wkładkę do elementu PVA NM tak, aby spód wkładki był skierowany w stronę nanowłókna elementu membrany. Dodaj kroplę wody destylowanej do środka studzienki i użyj kleszczy, aby usunąć folię. Umieść wkładkę w nowej 24-dołkowej płytce i pozostaw membranę do wyschnięcia.
  6. Mocując element PCL NM do dolnej studzienki, należy zanurzyć końcówkę o pojemności 200 μl w mieszaninie PDMS i dokładnie umieścić ją w czterech rogach i pośrodku.
  7. Umieść płytkę na podgrzewaczu do szkiełek i pozwól PDMS stwardnieć przez 5-7 minut, aby zapewnić jakość montażu.
  8. Umieść kawałek PCL NM w studzience zawierającej PDMS, tak aby strona membrany z nanowłókien była przymocowana do PDMS. Użyj małej, czystej szczoteczki, aby lekko docisnąć foliową stronę elementu membrany, aby uzyskać pełne mocowanie. Dodaj 0,2 ml 70% etanolu do studzienki, aby łatwo usunąć folię.
  9. Wysterylizuj wkładkę i dolną studzienkę w konfiguracji trans-well w świetle UV przez noc.
    UWAGA: Zmieszany PDMS można przechowywać w temperaturze -20 °C do dalszego wykorzystania. UWAGA: Płytkę z membraną nanowłóknistą PCL można przechowywać w suchym miejscu, ale przed użyciem musi być zwilżona 70% etanolem.
  10. Następnego dnia dobrze umyj wkładkę i dno, dodając odpowiednio 200 μl i 500 μl 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 3 x 10 min. Wkładka i dolna studzienka są gotowe do użycia.

5. Sadzenie komórek i składanie dwóch warstw dla modelu kokultury

UWAGA: Komórki MLE-12 były hodowane w 1x Zmodyfikowanym Pożywce Orła (DMEM)/F12 firmy Dulbecco z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% antybiotykiem penicyliny/streptomycyny. Komórki NIH3T3 hodowano w 1x DMEM o wysokim poziomie glukozy z 10% FBS i 1% antybiotykiem penicylina/streptomycyna.

  1. Utrzymuj komórki w naczyniu hodowlanym o średnicy 150 mm. Gdy są w 70-80% zlewne, przemyj komórki 10 ml 1x PBS i trypsynizuj je 2 ml podgrzanego 0,05% roztworu trypsyny/EDTA przez 3 minuty w temperaturze 37 °C.
  2. Delikatnie postukaj w naczynie, aby usunąć komórki od dołu, a następnie dodaj 8 ml kompletnej pożywki hodowlanej do każdego rodzaju komórki, aby zneutralizować enzym trypsyny. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odwirować przy 400 × g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Wybarwić komórki za pomocą Cell-Tracker, aby obserwować rozkład wysianych komórek na NM (więcej szczegółów w sekcji 6).
  3. Zawiesić osad komórkowy w 5 ml kompletnego podłoża DMEM/F12. Określ liczbę komórek i dostosuj do 6 × 106 komórek MLE-12 / ml i 8 × 105 komórek NIH3T3 / ml.
    UWAGA: Kompletna pożywka DMEM / F12 jest używana do kohodowli z komórkami MLE-12 i NIH3T3.
  4. Napełnij dolną studzienkę 500 μl kompletnego podłoża DMEM/F12 (studzienka bez PCL). Przenieś wkładkę z membraną nanowłóknistą PVA do basenika trans i dodaj 50 μl zawiesiny komórek MLE-12. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Jednocześnie napełnij dolną studzienkę z membraną nanowłóknistą PCL 500 μl zawiesiny komórek NIH3T3 i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  6. Po 2 godzinach zmontować wkładkę zawierającą ogniwa MLE-12 i dolną studzienkę zawierającą ogniwa NIH3T3 w układzie trans-dołkowym. Jest to model kokultury z komórkami MLE-12 jako górną warstwą i komórkami NIH3T3 jako dolną warstwą. Kokulturacja komórek w dwuwarstwowych błonach przez żądany czas.

6. Test dystrybucji komórek

  1. Przygotować 5 μM czerwonego i zielonego roztworu Cell-Tracker w łącznej objętości 2 ml kompletnego podłoża DMEM/F12.
  2. Po trypsynizacji należy wymieszać komórki MLE-12 z wcześniej przygotowanym czerwonym roztworem Cell-Tracker oraz NIH3T3 z zielonym roztworem Cell-Tracker. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 30 minut, aby zapewnić optymalne oznakowanie komórek. Dodać 8 ml kompletnej pożywki DMEM/F12 do próbek i odwirować przy 400 × g przez 5 min.
    UWAGA: Cell Tracker nie może wpływać na żywotność i proliferację komórek. W związku z tym komórki barwione Cell-Tracker mogą być hodowane aż do konfluencji. Intensywność fluorescencji w barwionych komórkach może zmniejszyć się 4-5 dni po hodowli.
  3. Powtórz kroki od 5.3 do 5.6.
  4. Podczas obserwacji pod mikroskopem konfokalnym przenieś wkładkę z płytki 24-dołkowej na płytkę 12-dołkową.
    UWAGA: Minimalizuje to odległość między soczewką obiektywu a komórkami, umożliwiając obserwację morfologii komórek.

7. Obserwacje konfokalne komórek kokulturowanych w 3D

UWAGA: Przyczepienie komórek nabłonkowych do NM PVA jest słabe w porównaniu do tego z fibroblastów do NM PCL. Stare pożywki należy wyrzucić ręcznie za pomocą aspiracji pipetami i delikatnie dodać nowe podłoże lub roztwór do ścianki studzienek. Podczas procesu barwienia staraj się nie dopuścić do wyschnięcia membran.

UWAGA: Przyczepność komórek można poprawić poprzez powlekanie lamininy lub włączenie peptydów motywów wiążących integryny do nanowłókien PVA19.

  1. Przenieść wkładkę na nową płytkę 24-dołkową. Wyrzuć stare podłoże i dodaj 150 μl 4% roztworu paraformaldehydu (PFA). Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Usuń 4% roztwór PFA i przemyj przylegające komórki 150 μl 1x PBS.
  3. W celu zablokowania i przepuszczalności dodać 150 μl 5% normalnej surowicy koziej i 0,2% Triton X-100 rozcieńczony w 1x PBS i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przygotuj sprzężone z Alexa Fluor 594 anty-zona occludens Ab (1:400) i Phalloidin-iFlour 488 (1:1,000), rozcieńczając je w odczynniku rozcieńczalnika przeciwciał. Usunąć roztwór blokujący, dodać 150 μl roztworu fluoroforu do studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Roztwory przeciwciał należy przygotować z najwyższą precyzją, ponieważ będzie to miało bezpośredni wpływ na jakość wyników. Unikaj ekspozycji na światło.
  5. Odrzucić roztwór przeciwciała i przemyć komórki 150 μl 1x PBS przez 10 minut.
  6. Dodać 150 μl Hoechst 33342 rozcieńczonego w 1x PBS (1:1,000) i inkubować przez 10 minut; unikać ekspozycji na światło.
  7. Usunąć roztwór Hoechst 33342 i przemyć przylegające komórki 150 μl 1x PBS przez 10 minut.
  8. Przygotuj czyste szkiełko podstawowe i dodaj dokładną ilość wodnego żelu montażowego. Użyj kleszczyków ze spiczastymi końcówkami, aby delikatnie oderwać membrany od otaczającej krawędzi. Umieść membrany na żelu montażowym, upewniając się, że strona zawierająca ogniwa jest skierowana do góry. Dodaj dokładną ilość żelu montażowego i przykryj szkiełkiem maskującym. Uszczelnij szkiełka lakierem do paznokci, zapewniając precyzyjne i całkowite uszczelnienie.
  9. Obserwuj komórki pod mikroskopem konfokalnym, korzystając z następujących ustawień obrazowania: Kontrola mocy lasera: 405 Intensywność 10; Kontrola mocy lasera: 488 Intensywność 10; Kontrola mocy lasera: 561 Intensywność 10; Czułość detektora: 420LP (wartość 600); Czułość detektora: 525/50 (wartość 700); Czułość detektora: 561LP (wartość 750).

8. Test przyczepiania komórek do nanowłókien

  1. Wyrzuć stare podłoże i umyj komórki 150 μl 1x PBS.
  2. Utrwal komórki za pomocą 150 μl 3% GA rozcieńczonego w 1x PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Umyj komórki 150 μl 1x PBS w ciągu 10 minut.
  4. Utrwalić komórki wtórnie, dodając 150 μl 1% tetratlenku osmu (OsO4) rozcieńczonego w 1x PBS przez 1 h.
    UWAGA: OsO4 i jego opary są szkodliwe. Musi być używany w dygestorium.
  5. Wyrzucić roztwór i przemyć komórki 300 μl 1x PBS przez 2 x 10 min.
  6. Odwodnić komórki stopniowanym etanolem od 50%, 70%, 90% i 95% do 100% przez 10 minut w każdym etapie. Wykonaj ostatni etap odwadniania, dodając świeży 100% etanol przez 10 minut.
  7. Całkowicie wysusz komórki i błony na powietrzu. Użyj kleszczyków ze spiczastymi końcówkami, aby odłączyć membrany i umieść membrany na uchwycie próbki za pomocą dwustronnego kranu. Wykonaj rozpylanie jonowe przez 5 minut, a następnie obserwuj komórki pod SEM w powiększeniu 2,000x.

9. Test wzrostu komórek

UWAGA: W tym protokole test CCK-8 jest używany do ilościowego określenia szybkości wzrostu komórek zgodnie z instrukcjami producenta.

  1. Przygotować mieszaninę CCK-8, mieszając 9 części wstępnie podgrzanego DMEM/F12 (objętościowo) z 1 częścią odczynnika CCK-8. Po usunięciu starych pożywek hodowlanych dodać 150 μl mieszaniny CCK-8 do studzienki zawierającej komórki.
  2. Przenieś wkładkę na nową płytkę 24-dołkową, aby oddzielić ją od dolnej studzienki zawierającej komórki. Inkubować komórki przez 45 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Zebrać supernatant i przenieść go do probówki o pojemności 1,5 ml. Wirować przy 1 800 × g przez 3 min.
  4. Dodać 100 μl supernatantu z probówki mikrowirówkowej do płytki 96-dołkowej. Odczyt gęstości optycznej (OD) przy 450 nm.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kluczowe etapy hodowli komórek nabłonka płuc MLE-12 i fibroblastów NIH3T3 poprzez konstruowanie dwuwarstwowego modelu opartego na błonie nanowłóknistej (Rysunek 1). Model ten nadaje się do obrazowania żywych komórek, immunohistochemii i końcowej analizy ilościowej współhodowanych komórek. Inne typy komórek mogą być również wykorzystywane poprzez optymalizację gęstości komórek i warunków wzrostu.

SEM pokazuje równomierny rozkład wytworzonych nanowłókien PVA bez tworzenia się koralików (Rysunek 2A). Średnica nanowłókien PVA wahała się od 150 nm do 230 nm (180 ± 25 nm, średnia ± odchylenie standardowe (SD)). Nanowłókna w elektroprzędzonych NM PCL były losowo zorientowane i strukturalnie przypominały kolagen (Rysunek 2B). Większość włókien w NM PCL miała średnicę od 300 nm do 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). W związku z tym membrana nanowłóknista PVA miała mniejsze rozmiary porów niż membrana nanowłóknista PCL.

Przed wysiewem, komórki MLE-12 i NIH3T3 zostały zabarwione odpowiednio czerwonym i zielonym Cell-Tracker i były monitorowane przez cały proces kokultury. Jak pokazano na Rysunek 3, można było wyraźnie zaobserwować rozkład przestrzenny komórek MLE-12 w komorze insertowej i komórek NIH3T3 w dolnej komorze. Analiza fokusowa wykazała, że komórki NIH3T3 były rozproszone i wykrywane na różnych głębokościach (102 ± 20 μm), podczas gdy komórki MLE-12 tworzyły warstwy o grubości 80 ± 10 μm. SEM wykazuje przyczepienie komórek do błon. Komórki NIH3T3 infiltrują błonę nanowłóknistą PCL i rozciągają się wzdłuż osi nanowłókien, podczas gdy komórki MLE-12 przylegały do powierzchni błony nanowłóknistej PVA i wykazywały agregację (Rysunek 4). Następnie zbadaliśmy organizację cytoszkieletu komórek NIH3T3 i komórek MLE-12 poprzez barwienie aktyną. Komórki NIH3T3 hodowane na membranie nanowłóknistej PCL wykazują rozkład pocisków włókien aktyny przypominający komórki w tkance, a barwienie aktyną w komórkach MLE-12 hodowanych na membranie nanowłóknistej PVA pokazuje okrągłe agregaty bez rozprzestrzeniania się komórkowego (Rysunek 5).

Porównano rozkład i wzorzec wzrostu komórek MLE-12 w monokulturze i kokulturze. Komórki zabarwione na czerwono Cell-Tracker w monokulturze na NM PVA tworzyły agregaty, ale komórki w warunkach kokultury utrzymywały równomierny rozkład na błonie (Rysunek 6A). W analizie 3D obrazów mikroskopii konfokalnej wzór wzrostu współhodowanych komórek MLE-12 na NM PVA wykazuje warstwowe przyleganie hodowanych komórek do błony o większej gęstości komórek zlewających się, w porównaniu z komórkami hodowanymi pod nieobecność fibroblastów (Rysunek 6B). Ponadto adhezja między komórkami i ekspresja strefowej okludyny (ZO)-1 na powierzchni komórek (wskazana strzałka), ale nie w agregatach komórkowych, były bardziej widoczne w warunkach kokultury niż w hodowli bez fibroblastów (Figura 6C).

Proliferacja komórek na błonach została zmierzona za pomocą testu CCK-8. Proliferacja komórek NIH3T3 i MLE-12 zwiększała się z czasem (Ryc. 7). Jednak na błonach zaobserwowano niższe tempo wzrostu komórek niż na płytce hodowlanej (dane nie pokazane). Współhodowane komórki NIH3T3 i MLE-12 na NM wykazują stabilne tempo wzrostu w porównaniu z komórkami monokulturowymi na płytce hodowlanej.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ilustrujący metodę kohodowli fibroblastów NIH3T3 i komórek nabłonkowych MLE-12 w dwuwarstwowym systemie opartym na rusztowaniach. Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy; PCL = poli(ε-kaprolakton). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Struktura nanowłókien PVA i PCL. (A) PVA i (B) membrany nanowłókniste PCL zostały wytworzone metodą elektroprzędzenia. Strukturę i średnicę nanowłókien mierzy się za pomocą SEM powierzchni membrany. Podziałka = 1 μm (A), 10 μm (B). Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy; PCL = poli(ε-kaprolakton). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: W systemie kokultury, przestrzenny rozkład komórek NIH3T3 na membranie nanowłóknistej PCL i komórek MLE-12 na membranie nanowłóknistej PVA. Komórki NIH3T3 (4 × 105) barwiono Cell-Tracker Green, a komórki MLE-12 (3 × 105) barwiono Cell-Tracker Red. Wysiewane komórki hodowano przez 24 godziny i obserwowano za pomocą obrazu Z w mikroskopie konfokalnym. Liczby są podane w μm; Strzałki pokazują wymiary z x (szerokość), y (długość), z (głębokość). Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy; PCL = poli(ε-kaprolakton). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Adhezja i morfologia komórek NIH3T3 na membranie nanowłóknistej PCL i komórek MLE-12 na membranie nanowłóknistej PVA. Komórki hodowano na błonach przez 24 godziny i obserwowano za pomocą SEM w powiększeniu 2000x. Podziałka = 15 μm. Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy; PCL = poli(ε-kaprolakton). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Włókna naprężeniowe aktyny w komórkach NIH3T3 na membranie nanowłóknistej PCL i komórkach MLE-12 na membranie nanowłóknistej PVA. Komórki NIH3T3 (4 × 105) i komórki MLE-12 (3 × 105 komórek) wysiewano odpowiednio na błonach nanowłóknistych PCL i PVA. Po 48 godzinach hodowli komórki wybarwiono falloidyną-iFlour 488 i obserwowano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Podziałka = 50 μm. Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy; PCL = poli(ε-kaprolakton); FITC = izotiocyjanian fluoresceiny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Wzór wzrostu współhodowanych komórek MLE-12 na membranie nanowłóknistej PVA. (A) Zabarwione na czerwono komórki MLE-12 Cell-Tracker (3 × 105 komórek) wysiewano na błonie nanowłóknistej PVA i hodowano samodzielnie (komórki -NIH3T3) oraz z komórkami NIH3T3 w systemie dwuwarstwowym (+komórki NIH3T3) przez 48 godzin. (B) Monokulturowe i kokulturowe komórki MLE-12 przez 48 godzin barwiono Hoechst 33342 (niebieski) i Phalloidin-iFlour 488 i obserwowano za pomocą mikroskopu konfokalnego. Obrazy 3D są wyświetlane przy użyciu funkcji powierzchni oprogramowania Imaris. (C) Komórki MLE-12 hodowano przez 48 godzin i znakowano fluorescencyjnie Phalloidin-iFlour 488 i przeciwciałem anty-ZO-1 (czerwonym). Podziałka = 50 μm. Skróty: PVA = alkohol poliwinylowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Tempo wzrostu komórek w dwuwarstwowym systemie kokultury. Komórki NIH3T3 (4 × 105) i komórki MLE-12 (3 × 105) są hodowane wspólnie przez wskazany czas. Wzrost komórek we wkładce i studzience dolnej mierzy się za pomocą testu CCK-8. Dane przedstawiono jako średnią ± SD (n = 3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przejście od hodowli 2D do modeli kultur 3D stanowi znaczący postęp w opracowywaniu modeli kokultury in vitro . Model hodowli 3D musi naśladować mikrośrodowisko tkankowe, w którym komórki mogą się namnażać, agregować i różnicować22. Wykorzystanie modeli kokultury 3D opartych na rusztowaniach usprawnia replikację architektury tkankowej. W tym badaniu system trans-well oparty na NM zapewnia pośrednią kokulturę 3D dwóch typów komórek. PCL NM z dużymi porami w dolnej komorze umożliwia infiltrację komórkową i naśladuje macierz śródmiąższową. Rusztowanie to wspomaga wzrost i organizację przestrzenną fibroblastów. Zastosowanie membrany nanowłóknistej PVA w górnej komorze pozwala na tworzenie się komórek nabłonka MLE-12 w warstwie. Średnica i wielkość porów błony nanowłóknistej PVA sprawiają, że jest ona idealnym podłożem do wspomagania adhezji i wzrostu komórek nabłonka, który naśladuje komórki nabłonkowe na błonie podstawnej w tkankach nabłonkowych19.

Białka adhezyjne, takie jak fibronektyna i laminina, są kluczowymi białkami w ECM, które łączą komórki z włókienkami kolagenowymi23. Komórki nabłonkowe oddziałują z lamininą poprzez receptory integrynowe na ich powierzchni18. Komórki MLE-12 wysiane na PVA NM przylegały i rosły trójwymiarowo na membranie. Jednak wiązanie komórek nabłonkowych z porowatym PVA NM było niskie, co powodowało agregację, ponieważ brakuje im specyficznych motywów biologicznych oddziałujących z hodowanymi komórkami. W naszym systemie kokultury bezpośredni kontakt komórka-komórka między komórkami NIH3T3 i MLE-12 jest nieobecny, a komunikacja odbywa się wyłącznie poprzez sygnalizację parakrynną. Obecność współhodowanych komórek NIH3T3 może stabilizować przyłączenie komórek MLE-12 do błony przez cały okres hodowli. Ta stabilizacja może być przypisana wydzielaniu rozpuszczalnych czynników przez fibroblasty, w tym kolagenu, fibronektyny, lamininy i różnych czynników wzrostu24. Dla porównania, w modelu guza z bezpośrednią kokulturą fibroblastów i komórek rakowych w rusztowaniu nanowłóknistym PCL, fibroblasty zmieniają właściwości ECM poprzez przebudowę macierzy25.

Komórki nabłonkowe spoczywają na błonie podstawnej, która działa jako podpora wzrostu i selektywnie przepuszczalna warstwa. Obecnie opracowywanych jest kilka strategii technologicznych, w tym technologia organoidów, w celu tworzenia złożonych modeli 3D tkanek nabłonkowych26. Struktura organoidów utrudnia jednak stosowanie konwencjonalnych testów27. Ponadto konwencjonalna mikroskopia do zbierania danych eksperymentalnych jest skomplikowana ze względu na fakt, że organoidy są hodowane, gdy są osadzone w matrycy hydrożelowej3D 27. W tym badaniu komora wkładu została oddzielona od komory dolnej, aby ułatwić precyzyjną obserwację komórek nabłonka hodowanych na PVA NM. Co więcej, organoidy 3D są wytwarzane w wyniku różnicowania komórek macierzystych. W związku z tym hodowla komórek macierzystych zajmuje dużo czasu i jest złożoną procedurą w porównaniu z systemem kokulturacji, a niejednorodność organoidów jest zgłaszana28.

W porównaniu z monokulturą, kokultura komórek nabłonkowych i fibroblastów poprawia przyczepność do rusztowania oraz utrzymuje stabilny wzrost i funkcję hodowanych komórek nabłonka. Ponadto materiały uzupełniające, w tym czynniki wzrostu i cytokiny, nie są konieczne w pożywce hodowlanej ze względu na rozpuszczalne czynniki wydzielane przez współhodowane fibroblasty. Pomimo zalet stosowania rusztowań nanowłóknistych w kokulturze komórkowej poprzez zapewnienie wsparcia strukturalnego, nie są one w stanie zapewnić ECM otaczających komórek hodowlanych w porównaniu z biokompatybilnymi hydrożelami29. W ten sposób ograniczenie to można osiągnąć za pomocą ogniw na NM z nadwarstwionymi hydrożelami.

Podsumowując, prosty system kohodowli inkubacyjnej do jednoczesnej hodowli fibroblastów i komórek nabłonkowych ma kluczowe znaczenie w różnych kontekstach fizjologicznych i farmakologicznych, w tym w regeneracji tkanki nabłonkowej, mikrośrodowisku guza, oznaczeniu toksyczności i badaniu aktywności leku. System kokultury 3D oparty na membranie nanowłóknistej zostanie oprzyrządowany i zaprojektowany do wysokoprzepustowych badań przesiewowych wchłaniania i transportu leków.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant z Koreańskiego Projektu Badawczo-Rozwojowego Technologii Zdrowia za pośrednictwem Koreańskiego Instytutu Rozwoju Przemysłu Zdrowia (KHIDI), finansowany przez Ministerstwo Zdrowia i Opieki Społecznej, Republika Korei (HR16C0001); Projekt Zwiększania Potencjału Badawczego Nauk Podstawowych poprzez grant Koreańskiego Instytutu Nauk Podstawowych (National Research Facilities and Equipment Center) finansowany przez Ministerstwo Edukacji (2019R1A6C1010003); oraz Narodową Fundację Badawczą Dotacje dla Korei (NRF) finansowane przez rząd koreański (MSIT) (2022R1A4A5032702).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,05% Trypsyna/EDTAWelgeneLS015-01
100x Penicyna/StreptomycynaGibco10378016
20x roztwór PBSLPSCBP007A
4% ParaformaldehydBiosesangPC2031-050-00
Alexa Fluor-594 sprzężone przeciwciało ZO-1Invitrogen339194
Rozcieńczalnik do przeciwciał OP QuantoEpredia10129-576
Zestaw testowy CCK-8DonginbioCCK-3000
Naczynie do hodowli komórkowych (150x20)SPL20151
CellTracker Zielony CMFDAInvitrogenC7025
CellTracker Czerwony CMTPXInvitrogenC34552
ChloroformSamchunC0584
Rurka stożkowaSPL50050
Szkło nakrywkoweCorningCLS2980245
DMEM o wysokiej zawartości glukozyWelgeneLM001-05
DMEM/F12WelgeneLM 002-05
DURAN Podstawy eksykatora z kołnierzem płaskim, gwint śrubowyDWK Nauki Przyrodnicze 7.022 260
Szklana pokrywka eksykatora DURAN i Zawór odcinającyDaihan ScienceSM.2444061
DURAN Zawór odcinający z wrzecionem PTFEDWK Nauki Przyrodnicze 
ElektroprzędzarkaNanoNCESR200RD
Alkohol etylowy, PureSigma Aldrich459844
FBSSigma AldrichTMS-013-BKR 
Moduł fluorescencyjnego laserowego skanera konfokalnego K1-fluoNanoscope Systems
Gel/mountBiomeda Corp.M01
Roztwór aldehydu glutarowegoSigma Aldrich340855
Hoechst 33342InvitrogenH1399
Dysza metalowa 27GNanoNC
Lakier do paznokciNature republic
Normalna surowica koziaVector LaboratoriesS-1000
Tetroxide osmuSigma Aldrich201030
Phalloidin-iFlour 488abcamab176753
Plastikowy zamek do Syringe_Lure (10 ml)HENKE SASS WOLFAL10
Poli(kwas akrylowy)Sigma Aldrich323667
Poli(alkohol winylowy)Sigma Aldrich341584
PolikaprolaktonSigma Aldrich440744
Pure HCLDuksan1129
Skaningowa Mikroskopia ElektronowaSECSNE-4500M
Szkło szkiełkoweMarienfeld SuperiorK15663717
Sylgard 184 zestawomniscienceOMNI.05255
Czytnik wielomodowy Synergy H1Biotek
Triton X-100Sigma AldrichX100
10322671

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kämpfer, A. A. M., et al. Development of an in vitro co-culture model to mimic the human intestine in healthy and diseased state. Toxicol In Vitro. 45 (Pt 1), 31-43 (2017).
  2. Barrila, J., et al. Three-dimensional organotypic co-culture model of intestinal epithelial cells and macrophages to study Salmonella enterica colonization patterns. npj Microgravity. 3, 10(2017).
  3. Breslin, S., O'Driscoll, L. Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery. Drug Discov Today. 18 (5-6), 240-249 (2013).
  4. Krause, S., et al. A novel 3D in vitro culture model to study stromal epithelial interactions in the mammary gland. Tissue Eng Part C: Methods. 14, 261-271 (2008).
  5. Urzì, O., et al. Three-dimensional cell cultures: The bridge between in vitro and in vivo models. Int J Mol Sci. 24 (15), 12046(2023).
  6. Duell, B. L., Cripps, A. W., Schembri, M. A., Ulett, G. C. Epithelial cell coculture models for studying infectious diseases: benefits and limitations. J Biomed Biotech. 2011, 852419(2011).
  7. Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. J. R. Soc. Interface. 11 (96), 20140065(2014).
  8. Liu, R., et al. From 2D to 3D co-culture systems: A review of co-culture models to study the neural cells interaction. Int J Mol Sci. 23 (21), 13116(2022).
  9. Vis, M. A. M., Ito, K., Hofmann, S. Impact of culture medium on cellular interactions in in vitro co-culture systems. Front Bioeng Biotechnol. 8, 911(2020).
  10. Kook, Y. M., Jeong, Y., Lee, K., Koh, W. G. Design of biomimetic cellular scaffolds for co-culture system and their application. J Tissue Eng. 8, 2041731417724640(2017).
  11. Stocco, T. D., et al. Nanofibrous scaffolds for biomedical applications. Nanoscale. 10 (26), 12228-12255 (2018).
  12. Gao, X., Han, S., Zhang, R., Liu, G., Wu, J. Progress in electrospun composite nanofibers: composition, performance and applications for tissue engineering. J Mater Chem B. 7 (45), 7075-7089 (2019).
  13. Kim, T. E., et al. Three-dimensional culture and interaction of cancer cells and dendritic cells in an electrospun nano-submicron hybrid fibrous scaffold. Int J Nanomedicine. 11, 823-835 (2016).
  14. Oh, Y. S., Choi, M. H., Shin, J. I., Maza, P. A. M. A., Kwak, J. Y. Coculturing of endothelial and cancer cells in a nanofibrous scaffold-based two-layer system. Int J Mol Sci. 21 (11), 4128(2020).
  15. Lee, S. J., et al. Bacterial infection-mimicking three-dimensional phagocytosis and chemotaxis in electrospun poly(ε-caprolactone) nanofibrous membrane. Membranes. 11 (8), 569(2021).
  16. DeLeon-Pennell, K. Y., Barker, T. H., Lindsey, M. L. Fibroblasts: The arbiters of extracellular matrix remodeling. Matrix Biol. 91-92, 1-7 (2020).
  17. Lühr, I., et al. Mammary fibroblasts regulate morphogenesis of normal and tumorigenic breast epithelial cells by mechanical and paracrine signals. Cancer Lett. 325 (2), 175-188 (2012).
  18. Humphries, J. D., Byron, A., Humphries, M. J. Integrin ligands at a glance. J Cell Sci. 119 (19), 3901-3903 (2006).
  19. Tran, T. X. T., et al. Synthetic Extracellular Matrix of Polyvinyl Alcohol Nanofibers for Three-Dimensional Cell Culture. J Funct Biomater. 15, 262(2024).
  20. Oun, A. A., Shin, G. H., Rhim, J. -W., Kim, J. T. Recent advances in polyvinyl alcohol-based composite films and their applications in food packaging. Food Packaging Shelf Life. 34, 100991(2022).
  21. Zhang, W., et al. Applications of poly(caprolactone)-based nanofibre electrospun scaffolds in tissue engineering and regenerative medicine. Curr Stem Cell Res Ther. 16 (4), 414-442 (2021).
  22. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  23. Rosso, F., Giordano, A., Barbarisi, M., Barbarisi, A. From cell-ECM interactions to tissue engineering. J Cell Physiol. 199 (2), 174-180 (2004).
  24. Malakpour-Permlid, A., et al. Identification of extracellular matrix proteins secreted by human dermal fibroblasts cultured in 3D electrospun scaffolds. Sci Rep. 11, 6655(2021).
  25. Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: a powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncol Lett. 14 (6), 6999-7010 (2017).
  26. Torras, N., García-Díaz, M., Fernández-Majada, V., Martínez, E. Mimicking epithelial tissues in three-dimensional cell culture models. Front Bioeng Biotechnol. 6, 197(2018).
  27. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. 8 (2), 352-361 (2015).
  28. Huch, M., Knoblich, J. A., Lutolf, M. P., Martinez-Arias, A. The hope and the hype of organoid research. Development. 144 (6), 938-941 (2017).
  29. Luo, L., Liu, L., Ding, Y., Dong, Y., Ma, M. Advances in biomimetic hydrogels for organoid culture. Chem Commun. (Camb). 59 (64), 9675-9686 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Three Dimensional CocultureEpithelial CellsNanofibrous MembranesElectrospinning TechniquePolyvinyl Alcohol MembranePolycaprolactone MembraneFibroblast CocultureParacrine SignalingConfocal MicroscopyScanning Electron Microscopy

Powiązane artykuły