Uproszczona operacja mysiego modelu krwotoku podpajęczynówkowego z perforacją wewnątrznaczyniową

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy uproszczoną operację dla wewnątrznaczyniowego perforacji mysiego modelu krwotoku podpajęczynówkowego w połączeniu z oceną neurologiczną.

Streszczenie

Model perforacji wewnątrznaczyniowej jest powszechnie stosowany jako metoda symulująca krwotok podpajęczynówkowy (SAH) w badaniach eksperymentalnych. Wszechstronny i niezawodny, wymaga skomplikowanych technik. Protokół ten upraszcza model w pewnych szczegółach, w połączeniu z oceną neurologiczną. Używamy nylonowego szwu do zapętlenia i pociągnięcia wspólnej tętnicy szyjnej (CCA), aby tymczasowo zablokować przepływ krwi, inaczej niż tradycyjne podwiązanie, które zapewnia czyste pole operacyjne. Wykorzystanie pióra do elektrokoagulacji do zespolenia naczyń krwionośnych zmniejsza ryzyko krwawienia. Co więcej, używamy filamentu z czarnym znacznikiem, aby ułatwić określenie głębokości nakłucia.

Niezakłócony postęp czarnego znacznika poza rozwidlenie tętnicy szyjnej, gdzie tętnica szyjna wspólna (CCA) rozchodzi się do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), przy minimalnym oporze, wskazuje, że włókno pomyślnie przeszło do wewnątrzczaszkowego połączenia tętnicy mózgowej przedniej (ACA) i tętnicy środkowej mózgu (MCA). Zjawisko to oznacza położenie włókna w krytycznym punkcie zbieżności naczyń mózgowych. Następnie, lekkie przesunięcie włókna do przodu w celu nakłucia naczynia krwionośnego umożliwia łatwiejszą operację perforacji wewnątrznaczyniowej u myszy, ułatwiając w ten sposób zastosowanie modelu perforacji wewnątrznaczyniowej u myszy zmodyfikowanych genetycznie. Może to mieć ogromne znaczenie dla badań molekularnych oraz badań i rozwoju farmaceutycznego.

Wprowadzenie

Krwotok pajęczynówkowy (SAH), ciężki podtyp udaru, wiąże się z wysokimi wskaźnikami zachorowalności i śmiertelności, szczególnie dotykając osoby po pięćdziesiątce. Samoistny SAH jest spowodowany głównie pęknięciem tętniaków wewnątrzczaszkowych, które występuje głównie w kręgu Willis^1,2. Klinicznie pacjenci często doświadczają piorunujących bólów głowy, dysfunkcji neurologicznych i szybkiego spadku świadomości³. Pomimo postępów w leczeniu neurokrytycznym, prawie 40% pacjentów umiera w ciągu miesiąca po krwawieniu⁴. Po tętniaku SAH może wystąpić kilka wtórnych powikłań, które prowadzą do postępującego pogorszenia neurologicznego. Jednak patofizjologia i charakterystyka kliniczna SAH są nadal słabo poznane.

Dlatego, aby lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw i ulepszyć strategie terapeutyczne, niezbędne są kompleksowe i wiarygodne modele u małych zwierząt. Do tej pory zaproponowano wiele protokołów ustanawiania modeli SAH. Na przykład jedno z podejść polega na wstrzyknięciu autologicznej krwi do cisterna magna. Inny zmodyfikowany protokół obejmuje dwa oddzielne wstrzyknięcia, z których jeden do cysterny magna, a drugi do spłuczki skrzyżowania optycznego. Autologiczne wstrzyknięcie krwi zyskało szerokie zastosowanie ze względu na swoją techniczną prostotę i korzystny wskaźnik śmiertelności^5,6. Aby osiągnąć możliwość użycia mniejszego i tańszego zwierzęcia laboratoryjnego, Barry i in. opisali pierwszy model SAH na szczurach w 1979 roku, który polegał na nakłuciu tętnicy podstawnej mikroelektrodami wolframowymi po usunięciu czaszki⁷.

W 1995 roku zaprezentowano inny model perforacji wewnątrznaczyniowej, zmodyfikowaną wersję modelu niedokrwienia mózgu Zea-Longa, którego obecna forma okazała się później najczęściej używanym modelem do badania SAH⁸. Wcześniejsze badania wykazały, że myszy i ludzie mają podobną wewnątrzczaszkową strukturę naczyniową, określaną jako koło Willisa, gdzie występuje głównie tętniak wewnątrzczaszkowy⁹. Ta metoda bez kraniotomii odtwarza mechanizmy pękania ludzkiego tętniaka poprzez precyzyjną perforację bifurkacji ICA¹⁰. Co więcej, genetycznie zmodyfikowana mysz jest często wykorzystywana w badaniach nad mechanizmami molekularnymi. Jednak ze względu na skomplikowane techniki u małych zwierząt, model perforacji wewnątrznaczyniowej jest stosowany głównie u szczurów lub królików, podczas gdy jego zastosowanie u myszy jest stosunkowo mniej powszechne. Dlatego ogromne znaczenie ma uproszczenie mysiego modelu perforacji wewnątrznaczyniowej i zmniejszenie jego wysokiej śmiertelności.

Tutaj prezentujemy uproszczoną modyfikację mysiego modelu perforacji wewnątrznaczyniowej, integrując zmodyfikowaną wersję skali oceny neurologicznej Garcii¹¹. Nasza modyfikacja zapewnia łatwy, wygodny i niezawodny model dla przyszłych badań eksperymentalnych SAH.

Protokół

C57BL/6 samców myszy (6-8 tygodni), wolnych od określonych patogenów, trzymano w pomieszczeniu dla zwierząt o regulowanej temperaturze i warunkach aklimatyzacji, utrzymywanym w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność. Myszom zapewniono nieograniczony dostęp do standardowej diety gryzoni oraz wysterylizowanej wody z kranu. Dopuszczono 2-tygodniowy okres aklimatyzacji przed rozpoczęciem eksperymentów. Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Szpitala Longhua i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Narodowego Komitetu Nauki i Technologii Chin dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Umieść mysz na poduszce grzewczej nagrzanej do 37 °C i kontynuuj utrzymywanie tej temperatury aż do zakończenia operacji.
2. Znieczulić mysz przez inhalację 2-2,5% izofluranu. Utrzymywać z 1-1,5% izofluranem podczas pracy przy natężeniu przepływu 0,4-0,6 l/min.
3. Podczas zabiegu należy nałożyć maść do oczu na oba oczy, aby złagodzić suchość oczu.
4. Umieść mysz na stole operacyjnym, ustabilizuj jej głowę, utrzymuj ją w pozycji leżącej na plecach i zabezpiecz kończyny taśmą.

2. Indukcja SAH

1. Naciąć skórę ostrzem skalpela wzdłuż środka przedniej części szyi (Ryc. 1A).
2. Wypreparuj tkankę łączną i odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną (CCA) i jej rozwidlenia.
   UWAGA: Ostrożnie chroń nerw błędny i sąsiednie gruczoły (Rysunek 1B).
3. Zapętlić CCA nylonowym szwem 6-0 i pozostawić oba końce wolne bez podwiązania (Rysunek 1C).
4. Połącz oba końce szwu z taśmą i delikatnie pociągnij szew w dół i w prawo pod kątem 45° do płaszczyzny poziomej. Przymocuj taśmę do stołu operacyjnego, aby tymczasowo zablokować CCA (Rysunek 1D).
   UWAGA: Kiedy przepływ krwi w niedrożnym naczyniu staje się nitkowaty, oznacza to udaną okluzję.
5. Podwiązywać tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) za pomocą nylonowego szwu (Rysunek 1E).
   UWAGA: Miejsce kauteryzacji powinno znajdować się jak najbliżej górnego końca, o długości około 2 mm od rozwidlenia tętnicy szyjnej.
6. Połączyć dystalną część ECA z miejscem podwiązania za pomocą pisaka do elektrokoagulacji (Rysunek 1F).
7. Powoli pociągnij ECA w dół, aż do odsłonięcia tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Ustaw ECA i ICA w linii prostej, upewniając się, że znajdują się w prawidłowej pozycji dla następnej procedury (Rysunek 1G).
8. Naostrz górną część filamentu. Punkt oznaczenia na żarniku znajduje się 8 mm od góry.
9. Wykonaj małe nacięcie nożyczkami w celu wprowadzenia filamentu do ECA. Włóż filament za pomocą kleszczy (Rysunek 1H).
10. Ostrożnie przesuwaj filament kleszkami, aż znak całkowicie przejdzie przez rozwidlenie CCA i ICA. Lekko przesuń się o 2 mm, aby nakłuć naczynie krwionośne (Rysunek 1I).
    UWAGA: Odczuwalny jest znaczny opór, co wskazuje, że osiągnięto rozwidlenie tętnicy mózgowej przedniej (ACA) i tętnicy środkowej mózgu (MCA).
11. Wycofaj żarnik natychmiast po perforacji.
12. Zabezpiecz ECA za pomocą pisaka do elektrokoagulacji (Rysunek 1J).
13. Usuń taśmę i wycofaj nylonowy szew CCA, aby przywrócić przepływ krwi. Obserwuj oczywistą pulsację CCA (Rysunek 1K).
14. Zamknij nacięcie szyi za pomocą wchłanialnych szwów 5-0.

3. Fikcyjna grupa

1. W grupie pozorowanej wykonaj tę samą operację chirurgiczną, z tą różnicą, że filament jest częściowo wysunięty w ICA i wycofany bez nakłuwania¹².

4. Koniec eksperymentu

1. Dwadzieścia cztery godziny po operacji oceń sprawność neurologiczną zgodnie ze zmodyfikowaną wersją systemu punktacji zgłoszoną przez Sugawara i wsp.¹¹(z oryginalnego Garcia et al.¹³). Wykonaj następujące sześć ocen w sposób zaślepiony: spontaniczna aktywność, ruch wszystkich kończyn, ruch kończyn przednich, wspinanie się po drucianej ścianie klatki, reakcja na dotyk po obu stronach tułowia i reakcja na stymulację wibrysami. Oceń funkcje neurologiczne za pomocą tabeli oceny zachowania (Tabela 1).
2. Znieczulić mysz wziewnym izofluranem. Umieść mysz w pozycji leżącej na plecach i przymocuj ją do stołu operacyjnego taśmą, mocując jej kończyny. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie wzdłuż linii środkowej brzucha, przetnij ścianę brzucha i odsłoń klatkę piersiową. Ostrożnie przeciąć mostek, aby odsłonić serce.
3. Ostrożnie wprowadzić igłę do infuzji do lewej komory, upewniając się, że igła jest stabilna i nie przenika do serca.
4. Rozpocznij perfuzję z wstępnie schłodzonym 1x PBS (4 °C) przy odpowiednim natężeniu przepływu (około 10 ml/min), aż wypływająca ciecz stanie się klarowna i przezroczysta, co wskazuje, że krew została całkowicie wymieniona.
5. Po zakończeniu perfuzji wyjąć igłę infuzyjną i przerwać wlew płynu. Kontynuuj pobieranie tkanki mózgowej.

5. Postępowanie pooperacyjne

1. Po zamknięciu skóry podawaj myszom lek przeciwbólowy (taki jak meloksykam, 1-2 mg/kg, wstrzyknięcie podskórne, co 24 godziny) w celu złagodzenia bólu.
2. Po operacji, w zależności od ilości utraconej krwi podczas procesu chirurgicznego, wstrzyknij dootrzewnowo 0,2-0,4 ml soli fizjologicznej myszy w celu wymiany płynu.
3. Regularnie sprawdzaj zwierzęta pod kątem spontanicznego oddychania w pierwszych godzinach po operacji i monitoruj dwa razy dziennie pod kątem wcześniej zdefiniowanych humanitarnych punktów końcowych. Myszy należy natychmiast poddać eutanazji za pomocą CO₂, jeśli okaże się, że mają problemy z oddychaniem spowodowane operacją lub spełniają jakiekolwiek punkty końcowe, w tym utratę masy ciała o >20% w stosunku do wartości wyjściowej, utrzymującą się niemożność dostępu do jedzenia/wody lub poważne deficyty neurologiczne.
   UWAGA: Zwierzę nie jest pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku i nie jest zwracane do towarzystwa innych zwierząt, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.

Wyniki

Wyniki neurologiczne
Dziewięć myszy z każdej grupy oceniono 24 h po operacji, stosując zmodyfikowany system punktacji opisany przez Sugawarę i wsp. ¹¹ w celu oceny SAH. Maksymalna możliwa liczba punktów wynosi 18. W grupie sham wszystkie n = 9 zwierząt uzyskały 18 punktów. W grupie SAH średnia liczba punktów wyniosła 11 (p < 0,0001) (Rysunek 2).

Zmiany patologiczne w mózgu
Skrzepy krwi były widoc...

Dyskusja

Podsumowując, badanie to przedstawia uproszczony i wiarygodny mysi model krwotoku podpajęczynówkowego (SAH) wywołanego przez wewnątrznaczyniowe wprowadzenie filamentu, oferując wygodne i skuteczne podejście. W porównaniu z istniejącym modelem perforacji wewnątrznaczyniowej, protokół ten jest taki sam na etapie perforacji: włókno jest wprowadzane do tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), przesuwane przez tętnicę szyjną wspólną (CCA), a następnie kierowane do tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA), gdzie jest dalej rozwijane w celu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57BL/6	Shanghai Jiesjie Laboratory Animal Co., LTD
długopis do elektrokoagulacji	Zhuoyu Angel Medical Equipment Co., Ltd	GermanV50	Nadaje się do stosowania w powierzchownych drobnych operacjach, koagulacji tkanek i kauteryzacji roślinności.
Izoflurance	RWD	R650-IE	Izofluran jest wziewnym środkiem znieczulającym miejscowo. Ma mały współczynnik podziału krew/gaz. Stosowany do znieczulenia zwierząt może wywołać znieczulenie płynnie, szybko i wygodnie, z szybką rekonwalescencją, dobrym rozluźnieniem mięśni i brakiem pobudzającego działania na współczulny układ nerwowy. Tempo metabolizmu izofluranu w wątrobie jest niskie, więc ma niewielką toksyczność dla wątroby i nie ma oczywistych skutków ubocznych nawet przy wielokrotnym stosowaniu. Aby uniknąć niekorzystnego wpływu znieczulającego gazu odlotowego na środowisko i personel laboratoryjny, zaleca się stosowanie go razem z systemem odzysku gazu.
Filament MACO	Beijing Cinontech Co.LTD	1620-A2	Najczęściej stosowany u myszy o wadze 20-25 g, końcówka szwu jest topiona w półkulisty kształt, bez powłoki polilizynowej lub silikonowej, oznaczana w odległości 9-10 mm od końcówki, dezynfekowana i może być używana bezpośrednio. Ten model ma trzy specyfikacje opakowania. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu wstępnego przed eksperymentem formalnym w celu określenia odpowiedniego modelu.
mikroskop	Olympus	BX61VS	W pełni zmotoryzowany mikroskop pionowy wyposażony w układ optyczny UIS2, przeznaczony do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i wysokiej precyzji. Funkcje obejmują zmotoryzowaną końcówkę, stolik i ostrość, a także funkcje wirtualnych slajdów do tworzenia dużych cyfrowych obrazów próbek o wysokiej rozdzielczości. Nadaje się do zaawansowanych zastosowań badawczych w patologii, biologii komórki, neuronauce i materiałoznawstwie.
nylonowy szew	Huawei Medical Supplies Co., Ltd	J1110	Niewchłanialny szew chirurgiczny wykonany z biokompatybilnych materiałów o wysokiej wytrzymałości.