Artykuł metodologiczny

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

1.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67786

⸱

9 maja 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cleveland Clinic Fertility Center

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Streszczenie

Trójwymiarowa architektura pęcherzyka jajnikowego i złożone interakcje między składnikami komórek somatycznych a oocytem, które są niezbędne do dojrzewania cytoplazmatycznego i jądrowego, są trudne do utrzymania w konwencjonalnych dwuwymiarowych (2-D) systemach hodowli. Opisujemy nowatorski model hodowli 3D wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków jajnikowych myszy. Technika enkapsulacji kwasu hialuronowego umożliwia trójwymiarowy wzrost mieszków włosowych i zatrzymanie czynników troficznych w bliskiej odległości od rozwijających się mieszków włosowych. Ten hydrożel jest bardzo wszechstronny i może być stosowany zarówno do izolowanych pęcherzyków, jak i fragmentów tkanki jajnikowej. Właściwości lepkosprężyste żelu HA umożliwiają regulację sztywności i podatności na formowanie w oparciu o stężenie żelu. Pęcherzyki przedantralne rozwijające się w tym modelu hodowli są w stanie zakończyć dojrzewanie mejotyczne w ciągu 10-12 dni od hodowli i owulować oocyt metafazy II po wywołaniu hCG. W artykule tym opisano również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych poprzez witryfikację.

Wprowadzenie

Folikulogeneza u ludzi in vitro pozostaje wyzwaniem nawet cztery dekady po pierwszym porodzie z zapłodnienia in vitro. Do tej pory nadal brakuje metodologii hodowli ludzkich pęcherzyków jajnikowych, która wspierałaby produkcję zdolnego do życia zarodka, w wyniku którego urodziłoby się zdrowedziecko1. Optymalne właściwości fizyczne niezbędne do wzrostu ludzkich mieszków włosowych in vitro nie zostały jeszcze określone. Nienaruszony jajnik jest wypełniony tysiącami pęcherzyków na różnych etapach rozwoju, a regulacja ich wzrostu jest złożonym procesem (ryc. 1)2. Oocyty w stadium pęcherzyków rozrodczych (GV) z ludzkich pęcherzyków przedantralnych potrzebują nawet 30 dni w hodowli, aby osiągnąć dojrzałość mejotyczną i osiągnąć metafazę II etap3. Dwukierunkowa komunikacja między oocytem a otaczającymi komórkami ziarnistymi poprzez połączenia szczelinowe ma kluczowe znaczenie dla dojrzewania cytoplazmatycznego i jądrowego 4,5,6.

Konwencjonalne systemy hodowli 2D nie są idealne do hodowli pęcherzyków, zwłaszcza w większych modelach ssaków, które wymagają dłuższego czasu w hodowli. Pęcherzyki przyczepiają się do naczynia, a połączenie między komórkami ziarnistymi a oocytem staje się słabsze, gdy komórki ziarniste migrują. Trójwymiarowe (3-D) systemy hodowli mieszków włosowych pojawiły się zatem jako sposób na ściślejsze naśladowanie fizjologii in vivo 7,8.

Enkapsulacja pęcherzyków w macierzy w celu promowania wzrostu 3D była jednym z podejść do zachowania architektury pęcherzyków podczas hodowli in vitro (IVC). Biomatryce z polimerów naturalnych (takich jak kolagen, agaroza, fibryna, alginian i kwas hialuronowy), a także polimerów syntetycznych (takich jak glikol polietylenowy, alkohol poliwinylowy i kwas poliglikolowy), zostały przetestowane 7,9,10,11,12,13 . Wykazano, że właściwości mechaniczne biomatrycy wpływają na dyfuzję składników odżywczych, różnicowanie komórek nabłonkowych, tworzenie antrum, a także wydzielanie hormonów14. Kolagen, jako część naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej komórki (ECM), jest jedną z najwcześniejszych testowanych matryc i początkowo był obiecujący 15,16,17. Jednak logistyka standaryzacji preparatów kolagenu, słabe właściwości mechaniczne i stabilność ograniczyły jego zastosowanie18. Agaroza została przetestowana na kompleksach wzgórek-oocyty (COC) uwalnianych z pęcherzyków antralnych, a także pęcherzyków pierwotnych19,20. Niedawno wydrukowana trójwymiarowa forma agarozowa okazała się obiecująca dla hodowli mieszków włosowych bez rusztowań21. Kapsułkowanie alginianem wapnia, po raz pierwszy zgłoszone w 2003 roku, było do tej pory najszerzej badanym systemem dla IVC22. Został przetestowany na pęcherzykach myszy, bydła, małp i ludzi 23,24,25,26,27. W przypadku alginianu wapnia mieszki włosowe są pojedynczo ładowane do mikrokropel polimeru i wystawiane na działanie chlorku wapnia w celu wytworzenia kulki żelu. Ekstrakcja mieszków włosowych ze stopki wymaga leczenia środkiem chelatującym. Ta matryca ma jednak pewne wady. Alginian jest polisacharydem wyizolowanym z glonów i chociaż zapewnia wsparcie, nie jest częścią naturalnej macierzy zewnątrzkomórkowej pęcherzyka. Dane wskazują na większą częstość występowania wad wrzeciona po IVC w alginianie28. Późniejsze modyfikacje systemu poprzez połączenie alginianu z fibryną lub innymi składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) pomogły uczynić system alginianu wapnia bardziej efektywnym29,30.

Coraz więcej dowodów wskazuje na to, że macierz zewnątrzkomórkowa jest kluczowym modulatorem wzrostu komórek 10,31,32 . Nie tylko zapewnia wsparcie, ale odgrywa kluczową rolę w przyczepianiu, funkcjonowaniu, wzroście i komunikacji komórek. Jednym z głównych składników ECM jest hialuronian, naturalnie występujący glikozaminoglikan. W pęcherzyku jajnikowym hialuronian jest wytwarzany przez komórki ziarniste i przyczynia się do integralności strukturalnej i funkcji rozwijającego się pęcherzyka33,34. Włączenie hialuronianu do modelu hodowli pęcherzyków może zatem pomóc w stworzeniu bardziej fizjologicznego środowiska i zwiększeniu produkcji funkcjonalnie kompetentnych komórek jajowych.

W pracy opisano nowatorskie zastosowanie kwasu hialuronowego sprzężonego z tyraminą jako biomatrycy do hodowli świeżych i mrożonych pęcherzyków jajnikowych oraz dojrzewania komórek jajowych in vitro (IVM). Szczegółowo opisujemy również techniki kriokonserwacji mieszków włosowych przez witryfikację na dwóch typach urządzeń. Jedna metoda polega na bezpośrednim zanurzeniu w ciekłym azocie, podczas gdy w drugiej metodzie mieszki włosowe są zamykane w słomce przed zanurzeniem. Głównym celem jest wykazanie, że pomimo różnic, zarówno metodologie, jak i urządzenia mogą być niezawodnie wykorzystywane do kriokonserwacji mieszków włosowych.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi protokołami Cleveland Clinic dotyczącymi wykorzystania i opieki nad zwierzętami oraz zgodnie z wytycznymi i przepisami National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych.

1. Przygotowanie podłoża

UWAGA: Pożywki opisane poniżej będą używane do różnych etapów tej procedury: obchodzenia się z tkanką jajnikową (OT), trawienia kolagenazy OT, hodowli mieszków włosowych (FCM) i witryfikacji. Przygotuj całe podłoże w kapturze do hodowli tkankowej przy użyciu sterylnej techniki.

  1. Pożywka do pracy z tkanką jajnikową
    1. Uzupełnij 20 ml pożywki Leibovitz (L-15) 0,1% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w 50 ml kolbie do hodowli tkankowej (T-50).
    2. Przed użyciem szczelnie zakryć i umieścić kolbę w inkubatorze na noc, aby ogrzała się do temperatury 37 °C. Pożywka ta służy do przenoszenia tkanki jajnikowej i pęcherzyków jajnikowych poza inkubatorem i nie wymaga CO2 do utrzymania pH od 7,2 do 7,4
      UWAGA: Nie wystawiaj naczyń na działanie gazu CO2 , ponieważ podłoże stanie się kwaśne.
  2. Pożywka do trawienia kolagenazy
    1. Rano w dniu zbioru mieszków włosowych dodać 1 mg kolagenazy typu I (295 U/mg) do probówki z 2,2 ml wstępnie podgrzanej pożywki OT. Końcowe pożądane stężenie kolagenazy to 134 U/ml Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Szczelnie zakryj i umieść w bloku rozgrzewającym.
  3. Pożywka do hodowli mieszków włosowych i olej
    1. Przygotować 30 ml minimalnej niezbędnej pożywki alfa uzupełnionej 5% płodową surowicą bydlęcą w kolbie T-50. Suplement zawiera 100 mIU/ml FSH, 10 mIU/ml LH, 10 μg/ml insuliny, 5 μg/ml transferyny i 5 ng/m selenu.
    2. Przed użyciem wstępnie zrównoważyć FCM w temperaturze 37 °C z 6% CO2 i powietrzem przez noc w inkubatorze.
    3. Umieścić 50 ml oleju mineralnego w kolbie, luźno zakręcić i zrównoważyć przez noc w inkubatorze.
  4. Pożywki do witryfikacji FL i FL-Clusters
    1. Podstawowym podłożem dla wszystkich roztworów jest Global-Hepes uzupełniony 20% syntetycznym substytutem białka. Przygotować 20 ml roztworu VS1 z 7,5% glikolem etylenowym (EG) i 7,5% dimetylosulfotlenkiem (DMSO) w podłożu podstawowym.
    2. Przygotuj 20 ml VS2 z 15% EG, 15% DMSO i 0,5 M sacharozy w podłożu podstawowym. Wysterylizuj wszystkie roztwory za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Roztwory można stosować do 4 tygodni.
  5. Pożywki rozgrzewające dla pęcherzyków zeszklonych i klastrów FL
    1. Podstawowym podłożem dla wszystkich roztworów jest Global-Hepes uzupełniony 20% syntetycznym substytutem białka. Przygotować 20 ml podłoża podstawowego z 0,25 M sacharozy. Oznacz jako WS1.
    2. Przygotować 20 ml podłoża podstawowego z 0,125 M sacharozą i oznaczyć jako WS2. Filtr sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 μm. Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do 4 tygodni.

2. Zbiór jajników

  1. Eutanazja 10-14-dniowych szczeniąt B6D2F1 przez zwichnięcie szyjki macicy (bez znieczulenia). Użyj 3-4 szczeniąt, aby uzyskać 250-300 nienaruszonych pęcherzyków przedantralnych do eksperymentów.
  2. Połóż zwierzę na plecach i przetrzyj brzuch 70% alkoholem izopropylowym. Wykonaj małe poziome cięcie na linii środkowej za pomocą czystych nożyczek. Chwyć skórę powyżej i poniżej, przeciętą cienkimi kleszczami i pociągnij w obu kierunkach (w kierunku głowy i stóp), aby odsłonić brzuch.
  3. Używając drugiego zestawu czystych nożyczek i cienkich kleszczy, przetnij ścianę brzucha. Podnieś cewki jelitowe. Zlokalizuj rogi macicy, jajowody i jajniki. Wyciąć jajniki i umieścić w środkowym naczyniu studzienkowym zawierającym 1 ml pożywki OT podgrzanej do temperatury 37 °C.
  4. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego odetnij tłuszcz i tkankę jajowodową. Przeciąć jajniki na pół.

3. Izolacja pęcherzyków i klastra FL- (FL-C)

  1. Do izolacji mieszków włosowych i obsługi należy użyć okapu z przepływem laminarnym z powierzchnią podgrzewaną w temperaturze 37 °C. Pracuj asepcyjnie w okapie. Uważaj na miskę FCM. Użyj bełkotki, aby naczynie było gazowane 5% CO2 podczas pracy w okapie z przepływem laminarnym.
    UWAGA: Wszystkie roztwory muszą być wstępnie podgrzane do temperatury 37 °C. Pożywka FCM, jak również olej mineralny, muszą być wstępnie zrównoważone przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 6% CO2 przed użyciem. pH podłoża zmienia się, gdy znajduje się poza inkubatorem przez ponad 10 minut.
  2. Odmierzyć pipetą 6 ml wstępnie zbalansowanego FCM do dwóch szalek o średnicy 60 mm i nałożyć na olej mineralny. Umieścić z powrotem w inkubatorze.
  3. Odmierzyć pipetą 1 ml kolagenazy w naczyniu ze studzienką środkową i 3 ml pożywki OT w ściankę zewnętrzną. Przenieść jajniki do roztworu kolagenazy za pomocą szklanej mikropipety (1000 μm). Inkubować naczynie przez 30-40 minut na rozgrzanej powierzchni okapu z przepływem laminarnym.
  4. Pod koniec inkubacji kolagenazy odpipetować 6 ml pożywki OT do dwóch 60-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych oznaczonych 1 i 2. Umieść na ciepłej powierzchni okapu.
  5. Za pomocą mikropipety przenieś jajniki poddane kolagenazie do zewnętrznej studzienki, aby wypłukać je z kolagenazy. Wymień mikropipety, a następnie przenieś jajniki do szalki OT 1.
  6. Pobrać pęcherzyki z każdego jajnika za pomocą pipetora P200. Uwolnić pęcherzyki przez wielokrotne zasysanie i wydalenie jajnika poddanego działaniu enzymu przez końcówkę pipety przyciętą do różnych rozmiarów. Mechaniczne rozdzielanie tkanki na fragmenty za pomocą dwóch igieł 27G przed pipetowaniem jest również pomocne w uwalnianiu pojedynczych mieszków włosowych. Każde szczenię myszy powinno dać 60-75 nienaruszonych mieszków włosowych o pożądanej wielkości.
  7. Jeśli to konieczne, włóż niezdysocjowane kawałki jajnika z powrotem do kolagenazy na kolejne 5-10 minut, spłucz i powtórz pipetowanie, aby uwolnić więcej mieszków włosowych.
    UWAGA: Nadmierna ekspozycja na kolagenazę spowoduje przerwanie warstw komórek ziarnistych otaczających oocyt. Nie próbuj rozbijać całego jajnika. Zatrzymaj się po zebraniu 250-300 mieszków włosowych.
  8. Zbadaj uwolnione mieszki włosowe za pomocą mikroskopu preparacyjnego przy 40-krotnym powiększeniu. Zidentyfikuj wtórne pęcherzyki przedantralne (średnica ~120 -140 μm) z centralnie położonym oocytem zamkniętym w nienaruszonej błonie podstawnej (blaszka podstawna). Pęcherzyk tej wielkości będzie zazwyczaj zawierał 2-4 warstwy komórek ziarnistych otaczających komórkę jajową (patrz ryc. 1).
    UWAGA: Porównaj pęcherzyki z otwarciem końcówki mikropipety 175 μm, aby w przybliżeniu określić rozmiar pęcherzyka. Pęcherzyk powinien mieć rozmiar około 3/4 średnicy pipety. Jest to najszybsza metoda selekcji mieszków włosowych o pożądanej wielkości.
  9. Za pomocą mikropipety o średnicy 175 μm przenieś wybrane mieszki włosowe do naczynia OT2. Po zakończeniu pobierania wypłucz wszystkie mieszki włosowe w naczyniu FCM1, aby usunąć wszelkie ślady pożywki OT. Następnie przenieś do naczynia FCM2.
  10. Umieść naczynie w inkubatorze na 60 minut przed rozpoczęciem procesu zatapiania.
  11. W celu izolacji klastra mieszków włosowych wykonaj kroki od 3.1 do 3.5. Za pomocą dwóch strzykawek tuberkulinowych (27 G) rozdzielić jajnik na fragmenty, a następnie na małe skupiska po 6-10 pęcherzyków.
    UWAGA: Hodowla klastrów mieszków włosowych (FL-C) jest alternatywą dla hodowli pojedynczych mieszków włosowych. Metoda ta zachowuje natywną architekturę pęcherzyków wraz ze składnikami zrębu. Wielkość pęcherzyka w FL-C nie jest jednolita. Pęcherzyki zachowują swoją konfigurację in vivo , przy czym obecne są pęcherzyki pierwotne, pierwotne i wtórne.
  12. Zebrać te klastry mieszków włosowych (FL-C) za pomocą mikropipety 200 μm do naczynia OT2. Po zakończeniu zbierania wypłucz cały FL-C i przenieś do FCM2, aby poczekać na osadzenie.

4. Osadzanie mieszków włosowych i klastrów mieszków włosowych

  1. Przygotować 10 mg/ml roztwór podstawowy aktywowanego hydrożelu hialuronowego (HA) połączonego z tyraminą. Nawodnić 250 mg hialuronianu sodu w proszku z podstawieniem tyraminy z 25 ml enzymu peroksydazy chrzanowej (HRP; 10 j.m./ml) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami. Po rozpuszczeniu należy przechowywać 500 μl porcji tego aktywowanego materiału hialuronowego w temperaturze -4 °C do przyszłych eksperymentów.
  2. W przypadku eksperymentów z pęcherzykami należy rozmrozić roztwór podstawowy HA i rozcieńczyć go do stężenia 3 mg/ml w pożywce globalnej ogrzanej do 37 °C. Wszystkie etapy osadzania należy wykonać w okapie z przepływem laminarnym z powierzchnią stołu podgrzaną do temperatury 37 °C. Użyć naczynia o średnicy 60 mm z ośmioma studzienkami o pojemności 100 μl do osadzania i późniejszej hodowli mieszków włosowych.
  3. Przenieś mieszki włosowe lub klastry FL, które mają być osadzone, z naczynia FCM do kropli żelu HA, aby spłukać z pożywki hodowlanej. Nośnik śledzący będzie przeszkadzał w tworzeniu żelu. Umieść naczynie FCM z powrotem pod bełkotką, aby zagazować.
    UWAGA: Izolowane pęcherzyki mogą być osadzane, pojedynczo lub w grupach, w zależności od eksperymentu. Generalnie wolimy wysiewać 2-4 mieszki włosowe na koralik.
  4. Umieścić 1 μl 0,03% nadtlenku wodoru (H2O2) na szalce Petriego. Dodać 25 μl żelu HA o stężeniu 3 mg/ml do kropli nadtlenku wodoru i wymieszać pipetując w celu zainicjowania sieciowania (patrz rysunek 2).
  5. Za pomocą pipetora P20 pobrać mieszaninę HA-H2O2 i odpipetować jedną kroplę (~ 8-10 μl) do dwóch oddzielnych dołków 8-dołkowej płytki hodowlanej. Unikaj robienia bąbelków.
  6. Za pomocą mikropipety o wielkości 200 μm szybko przenieś mieszki włosowe lub FL-C do środka każdej kropli (ryc. 3). Szybkość jest ważna, ponieważ po wystawieniu HA na działanie katalizatora (nadtlenku) zacznie żelować w ciągu 1-2 minut. Uważaj, aby nie wprowadzić bąbelków podczas siewu.
    UWAGA: Aby śledzić wzrost poszczególnych mieszków włosowych, umieść mieszki włosowe w pewnej odległości od siebie. Nie należy umieszczać mieszków włosowych zbyt blisko dna żelu, ponieważ podczas IVC mogą one opadać na tyle, aby się przyczepić.
  7. Odczekaj ~ 3 minuty na zakończenie procesu żelowania, a następnie dodaj 100 μl wstępnie zbalansowanego FCM do każdego dołka. Powtórz ten proces i załaduj mieszki włosowe do wszystkich ośmiu studzienek. Pokryj ciepłym, wstępnie zrównoważonym olejem mineralnym i umieść naczynie w inkubatorze.

5. Witryfikacja mieszków włosowych i klastrów FL

UWAGA: Witryfikację można przeprowadzić przy użyciu otwartego nośnika (Cryoloop; CL), umożliwiający bezpośredni kontakt z ciekłym azotem lub zamkniętym nośnikiem (Rapid I; RI), w którym próbka jest szczelnie zamknięta w zewnętrznej słomce i dlatego nigdy nie wchodzi w kontakt z ciekłym azotem. Rysunek 4 przedstawia urządzenia i kontrasty dwóch systemów witryfikacji. Wykazano, że witryfikacja na obu urządzeniach jest skuteczna w kriokonserwacji zarodków35.

  1. Witryfikacja RI z zamkniętym nośnikiem
    1. Podgrzej wstępnie 2 ml porcji roztworów VS do temperatury 37 °C w podgrzewanym bloku. Wykonaj wszystkie etapy witryfikacji na rozgrzanej powierzchni okapu z przepływem laminarnym za pomocą mikroskopu preparacyjnego, aby uwidocznić pęcherzyk i nośnik.
    2. Napełnij izolowaną krioskrzynkę ciekłym azotem (LN2). Umieść zewnętrzną słomkę urządzenia w szczelinie w pudełku, tak aby była częściowo zanurzona w ciekłym azocie. Połóż wewnętrzny plastikowy patyczek z małym otworem w poprzek pokrywki szalki Petriego, przygotowując się do załadunku.
    3. Umieść dwie krople VS1 obok siebie na szalce Petriego w pobliżu góry. Użyj mikropipety 200 μm, aby umieścić dwa mieszki włosowe w pierwszej kropli. Spłucz i szybko przejdź do drugiej kropli VS1. Inkubować przez 5 minut. W przypadku zeszklenia klastrów FL należy przetwarzać pojedynczą grupę na raz.
    4. Umieść trzy krople VS2 obok siebie na tej samej szalce, gdy pierwsza inkubacja jest prawie zakończona. Następnie szybko przenieś mieszki włosowe sekwencyjnie przez trzy krople VS2 w ciągu 60 s i załaduj na nośnik. Uważaj, aby pobrać minimalną ilość płynu z mieszkami włosowymi, aby uniknąć śledzenia pożywki z jednej kropli do drugiej.
    5. Aby załadować nośnik, podnieś dwa mieszki włosowe i umieść minimalną ilość płynu w małym otworze w plastikowym patyczku. Końcowa objętość płynu w otworze jest niewielka < 0,5 μl. Unikaj przepełnienia, które powoduje wylanie płynu z otworu na plastikowy patyczek.
    6. Wrzuć patyczek do wstępnie schłodzonej słomki zewnętrznej. Użyj zgrzewarki ultradźwiękowej, aby zamknąć i uszczelnić słomkę. Umieść słomkę w kielichu przymocowanym do kriokanu. W tym samym kielichu można umieścić do 4 słomek.
    7. Przykryj trzcinę plastikową osłoną ochronną. Zanurz trzcinę w zbiorniku na ciekły azot (LN2).
  2. Witryfikacja CL otwartego nośnika
    1. Wstępnie podgrzej roztwory VS do temperatury 37 °C. Wszystkie etapy witryfikacji należy wykonać na rozgrzanej powierzchni okapu z przepływem laminarnym. Przygotuj wcześniej potrzebną liczbę otwartych nośników CL. Włóż metalowy trzpień CL do namagnesowanej nasadki fiolki, upewniając się, że mocno się trzyma (w razie potrzeby użyj odrobiny kleju).
    2. Napełnij izolowany kriobox ciekłym azotem (LN2). Umieść stojak w kriopudełku, aby utrzymać kriowiale tak, aby LN2 znajdował się poniżej górnej części fiolki.
    3. Napełnij specjalną namagnesowaną i odpowietrzoną fiolkę LN2. Umieść go na stojaku. Wykonać etapy witryfikacji zgodnie z opisem w krokach 6.1.3 do 6.1.5. Jedyna różnica polega na tym, że zazwyczaj przetwarzamy pięć mieszków włosowych na raz. Po raz kolejny należy uważać, aby zminimalizować przepływ płynu śledzącego z kropli na kroplę.
    4. Aby załadować mieszki włosowe, chwyć otwarty nośnik CL za dołączoną nasadkę magnetyczną za pomocą metalowej różdżki. Zanurz otwarty nośnik CL w osobnej kropli VS2, aby utworzyć film krioprotektantu.
    5. Za pomocą mikropipety zbierz wszystkie mieszki włosowe lub FL-Cluster i umieść je na folii z minimalną ilością płynu. Pracuj szybko, ponieważ mieszki włosowe muszą zostać załadowane, zanim folia zacznie wysychać.
    6. Natychmiast zanurzyć CL w kriowiale wypełnionym LN2 w celu zeszklenia próbki. Zakręć i umieść fiolkę na kriokanie. Przykryj plastikowym rękawem. Zanurz trzcinę w zbiorniku na ciekły azot.

6. Ocieplenie zeszklonych pęcherzyków i klastrów FL

  1. Ogrzewanie zamkniętego nośnika RI
    1. Przygotuj naczynie ze studzienką środkową z 3 ml wstępnie zbalansowanego FCM w studzience zewnętrznej i 1 ml w studzience środkowej. Pokryj olejem i umieść w inkubatorze.
    2. Umieść 0,5 ml wstępnie podgrzanych WS1 i WS2 w dwóch oznaczonych naczyniach środkowych. Przenieś laski z próbkami ze zbiornika magazynowego do krioboxa wypełnionego LN2.
    3. Zdejmij plastikową osłonę trzciny. Wyjmij słomkę z kielicha, trzymając ją zanurzoną, i wsuń ją do szczeliny przytrzymującej w pudełku kriogenicznym.
    4. Za pomocą cienkich nożyczek odetnij zewnętrzną słomkę tuż nad czarną kropką wskazującą górną część wewnętrznego nośnika RI z pęcherzykami.
    5. Za pomocą cienkich kleszczy lekko wyjmij wewnętrzny plastikowy patyczek z zewnętrznej słomki. Chwyć urządzenie i szybko zanurz patyczek w WS1, delikatnie obracając, aby rozładować mieszki włosowe. Szybkość ma kluczowe znaczenie. Mieszki włosowe muszą zostać rozładowane do WS1 w ciągu 10 sekund.
    6. Użyj mikroskopu preparacyjnego, aby uwidocznić mieszki włosowe i upewnić się, że wszystkie zostały usunięte z nośnika. Po 2 minutach w WS1 użyj mikropipety, aby przenieść wszystkie pęcherzyki (lub FL-Cluster) do WS2, uważając, aby nie śledzić pożywki.
    7. Po 3 minutach wypłucz mieszki włosowe w zewnętrznej studzience naczynia FCM, a następnie przejdź do dołka środkowego. Umieść z powrotem w inkubatorze na 1-2 godziny przed osadzeniem.
  2. CL Otwarte ogrzewanie nośnego
    1. Przygotuj potrawy FCM i WS zgodnie z powyższym opisem. Przenieś trzcinę z mieszkami włosowymi ze zbiornika magazynowego do krioskrzynki wypełnionej LN2. Zdejmij plastikową osłonę trzciny.
    2. Użyj różdżki magnetycznej, aby podnieść nasadkę kriowialną, aż metalowy trzpień CL będzie widoczny.
    3. Za pomocą kleszczy chwyć metalowy trzpień. Wyjąć CL z fiolki i bardzo szybko zanurzyć w WS 1, delikatnie obracając, aby usunąć mieszki włosowe. Rozładować do WS1 w ciągu 10 sekund. Za pomocą lunety preparacyjnej sprawdź, czy wszystkie mieszki włosowe zostały usunięte
    4. Wszystkie pozostałe kroki ogrzewania są takie same, jak w przypadku stopni zamkniętego nośnika RI, począwszy od kroku 7.1.6.

7. Obrazowanie pęcherzyków i klastrów FL oraz zmiana pożywki

  1. Monitoruj pęcherzyki i klastry FL w studzienkach podczas 10-12-dniowego odstępu między hodowlami za pomocą mikroskopu światła odwróconego z optyką modulacji kontrastu Hoffmana i wyposażonego w kamerę o wysokiej rozdzielczości. Użyj oprogramowania do obrazowania, aby rejestrować obrazy w powiększeniu 40x i 100x lub 200x, w zależności od rozmiaru.
  2. Obrazowanie i ocena mieszków włosowych
    1. W pierwszym dniu hodowli, po osadzeniu, zobrazuj wszystkie studzienki hodowlane w powiększeniu 40x i 200x za pomocą odwróconego mikroskopu, aby ustalić podstawową morfologię i rozmiar. Włóż naczynie z powrotem do inkubatora.
    2. Przeglądaj obrazy i rejestruj liczbę całkowicie osadzonych mieszków włosowych w każdym kulku żelu. W przypadku FL-C należy oszacować liczbę pęcherzyków na początku hodowli.
    3. Za pomocą oprogramowania do obrazowania zmierz średnicę pęcherzyka wzdłuż płaszczyzn pionowych i poziomych od krawędzi błony podstawnej. Zmierz wielkość oocytów podobnie od zewnętrznej krawędzi strefy. Rekordowe wartości średnie. Wykonaj pionową i poziomą miarę średnicy klastra.
    4. Kontynuuj obrazowanie kultur co 2-3 dni. Zmierz średnice mieszków włosowych, które nie stykają się ze sobą. W przypadku FL-C klastry zwijają się w kule podczas IVC, dzięki czemu cały plik udojowy może być mierzony w płaszczyźnie pionowej i poziomej.
      UWAGA: W przypadku pęcherzyków zgrupowanych blisko siebie, poszczególne granice mieszków włosowych mogą nie być widoczne po 4 dniu hodowli, więc pomiary nie są wykonywane.
    5. Klasyfikuj pęcherzyki, które stają się ciemne lub apoptotyczne, a także te, w których oocyt nie jest już otoczony komórkami ziarnistymi lub został wytłoczony jako niezdolne do życia. Śledź wszelkie mieszki włosowe lub FL-C, które przyczepiły się do powierzchni naczynia (patrz rysunek 5).
    6. Uważnie obserwuj mieszki włosowe pod kątem tworzenia się antrum od 8 dnia. Mieszki włosowe z antrumami będą wyglądały tak, jakby miały w sobie czystą lub jaśniejszą przestrzeń (ryc. 6).
    7. Wykonywać połowiczną zmianę pożywki co 2 dni. Użyj pipetora P200 o pojemności 50 μl. Włóż końcówkę do studzienki pod nakładką olejową i z dala od kulki żelu. Powoli pobrać 50 μl pożywki hodowlanej. Wymień pożywkę, powoli pipetując 50 μl świeżego FCM pod nakładkę olejową. Unikaj robienia bąbelków.

8. Dojrzewanie oocytów w pęcherzykach otoczkowanych

UWAGA: Końcowy etap dojrzewania jest zwykle inicjowany, gdy tworzenie się antrum wśród wszystkich wysianych (i żywotnych) mieszków włosowych osiąga ponad 40%. Jednak w przypadku, gdy tworzenie się antrum jest niskie lub nie jest widoczne, zalecamy wywołanie do 12 dnia hodowli. Nie zaobserwowaliśmy żadnych korzyści z dalszego czekania. W przypadku kultur FL-C dojrzewanie jest zwykle wywoływane, gdy antrum obserwuje się w 40% studzienek lub najpóźniej do 12 dnia.

  1. Przygotować pożywkę do dojrzewania in vitro (IVM), uzupełniając FCM 1,5 j.m./ml ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej (hCG) i 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF).
  2. Wywołać dojrzewanie, zastępując FCM w każdym dołku 100 μl pożywki IVM około godziny 17. Po nocnym dojrzewaniu (16-18 godzin po wyzwoleniu) użyj mikroskopu preparacyjnego przy 40-krotnym powiększeniu, aby dobrze zbadać każdą kulturę pod kątem kompleksów wzgórko-oocytów (COC), które uległy owulacji z kulki żelu HA. COC zwykle znajdują się tuż nad kulką żelową lub w bliskiej odległości.
  3. Zebrać owulowane COC do środkowego naczynia studzienkowego z 1 ml wstępnie zbalansowanego FCM pokrytego olejem i umieścić naczynie z powrotem w inkubatorze.
  4. Pobrać oocyty z pęcherzyków, które są nadal osadzone, delikatnie pipetując kulkę HA za pomocą pipetora P200 w celu uwolnienia nieowulacyjnych COC. Zbierz je w osobnym naczyniu z FCM.
  5. Przygotować naczynie ze studzienką środkową z 1 ml hialuronidazy (10 j.m./ml) i 3 ml pożywki FCM w ścianie zewnętrznej.
  6. Przenieś owulowane COC do roztworu hialuronidazy i krótko wystawij na działanie enzymu (30-45 s) w celu pozbawienia oocytu komórek ziarnistych w celu wizualizacji statusu jądra oocytu. Opłucz oocyty, aby usunąć enzym przed umieszczeniem w 5 μl kropli świeżej pożywki pod olejem w celu szczegółowej oceny. Umieść naczynie w inkubatorze. Powtórz ten proces dla nieowulacyjnych COC.
  7. Zapisz całkowitą liczbę odzyskanych jaj owulowanych i nieowulacyjnych. Sfotografować i ocenić stan jądrowy (GV, metafaza I lub metafaza II) każdego odzyskanego oocytu. Zmierz i zapisz średnicę.
  8. Oblicz wskaźnik przeżywalności IVC na podstawie całkowitej liczby żywotnych pęcherzyków (tych, które dożyły dnia wyzwalacza hCG) i całkowitej liczby odzyskanych komórek jajowych. Obliczyć procent oocytów metafazy II z owulowanych COC. Powtórz to dla wszystkich oocytów odzyskanych z nieowulacyjnych COC.
  9. Określić szybkość dojrzewania do metafazy II w ten sam sposób dla FL-C.

Wyniki

W artykule szczegółowo opisano metodologię stosowania nowego żelu hialuronowego związanego z tyraminą do hodowli in vitro pęcherzyków preantralnych myszy36,37. Rycina 6 ilustruje różnice między wzrostem pęcherzyków przedantralnych po umieszczeniu w konwencjonalnym systemie hodowli 2D a pojedynczym pęcherzykiem zamkniętym w żelu HA do hodowli 3D. Natywna architektura mieszków włosowych jest utrzymywana przez 12 dni hodowli z antrum wyraźnie widocznym w ostatnim dniu wzrostu.

Żel HA jest bardzo wszechstronny, umożliwiając wzrost izolowanych pęcherzyków pojedynczo lub w grupach, a także tkanka jajnika jest mechanicznie rozbijana na małe skupiska mieszków włosowych. Żel jest przezroczysty, dzięki czemu możliwe jest uwidocznienie mieszków włosowych, nawet jeśli znajdują się na różnych głębokościach. Zamknięte pęcherzyki i FL-C wykazują promienistą ekspansję w wyniku ciągłej proliferacji komórek ziarnistych (ryc. 7). Początkowe średnice pęcherzyków wynoszą średnio 139,8 ± 28 μm, a średnica oocytów GV wynosi 63,5 ± 4,6 μm. W pojedynczo hodowanych pęcherzykach końcowe średnice wynoszą około 385,6 ± 36,7 μm, co stanowi około 3-krotny wzrost wielkości. Owulowane oocyty metafazy II mierzą około 84,8 ± 3,8 μm. W obrębie hodowanych klastrów FL wielkość pęcherzyków jest dość zróżnicowana (ryc. 5, ryc. 7). Owulowane oocyty po wyzwoleniu hCG znajdują się w pobliżu pęcherzyka (ryc. 8). Większość oocytów metafazy II zostanie pobrana z owulowanych COC. Pęcherzyki nadal osadzone po wyzwoleniu zwykle zawierają oocyty GV i metafazy I.

Tabela 1 porównuje tempo dojrzewania między izolowanymi pęcherzykami a klastrami FL ze świeżych lub mrożonych jajników. FL-C z kriokonserwowanych jajników miał znacznie niższe tempo dojrzewania. Obserwacje mikroskopowe wykazały, że często mają złamaną blaszkę podstawną, co czyni je dość podatnymi na przedwczesną ekstruzję oocytów. Delikatna natura skupisk mieszków włosowych została w pewnym stopniu zniwelowana przez enkapsulację. Unikano leczenia krioprezerwowanych jajników kolagenazą, ponieważ było ono szczególnie szkodliwe przy niskiej przeżywalności i niskiej wydajności nienaruszonych pęcherzyków.

Kriokonserwacja izolowanych pęcherzyków jest znacznie skuteczniejsza niż konserwacja całych jajników. Wysokie tempo dojrzewania można osiągnąć przy użyciu obu badanych metod witryfikacji (tabela 2). Pomimo dużych różnic w szybkości chłodzenia, dojrzewanie oocytów po IVC nie różniło się. Otwarte nośniki CL pozwalają na większą wydajność, ponieważ na jednym otwartym nośniku CL można załadować do dziesięciu mieszków włosowych. Skraca to również całkowity czas odzyskiwania wielu kriokonserwowanych mieszków włosowych. Jednak w przypadku ewentualnego klinicznego zastosowania witryfikacji mieszków włosowych u ludzi preferowany może być zamknięty, zamknięty system.

Ułożenie chromatyny wokół jąderka oocytu GV można wykorzystać do identyfikacji oocytów, które najprawdopodobniej zapłodnią się po owulacji i rozwiną się w blastocysty38. Rycina 9 ilustruje barwienie oocytów na żywo w celu wizualizacji wzorca dystrybucji chromatyny.

figure-results-1
Rycina 1: Schemat wzrostu pęcherzyków. Ten diagram ilustruje różne etapy rozwoju pęcherzyka od pęcherzyka pierwotnego do drugorzędowego stadium przedantralnego i wreszcie do w pełni dojrzałego pęcherzyka trzeciorzędowego gotowego do owulacji. Pokazany jest również obraz mikroskopowy typowego pęcherzyka przedantralnego z jego różnymi cechami morfologicznymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat metody enkapsulacji HA. Struktura żelu hialuronowego i różne etapy osadzania mieszków włosowych są zilustrowane na tym schemacie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Izolacja i enkapsulacja pęcherzyków. (A, B) Pęcherzyk przedantralny wybrany do osadzenia w powiększeniu 40x i 200x. (C) Pęcherzyk apoptotyczny jest pokazany ze zdrowym pęcherzykiem przedantralnym z oocytem nie do końca centralnym. (D) Obraz kulki żelu HA wysianej pęcherzykami i (E) z dwoma FL-C. Zdjęcia wykonane mikroskopem stereoskopowym, aby pokazać całą kulkę żelu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Urządzenia do kriokonserwacji izolowanych pęcherzyków. W przypadku urządzenia CL z otwartym nośnikiem etap witryfikacji odbywa się poprzez bezpośrednie zanurzenie mieszków włosowych w ciekłym azocie. Szybkość chłodzenia jest zatem niezwykle wysoka i wynosi ponad -20 000 °C/min. W przeciwieństwie do tego, w przypadku zamkniętego nośnika RI, mieszki włosowe są ładowane na wewnętrzny plastikowy patyczek i wrzucane do zewnętrznej słomki zanurzonej w ciekłym azocie. Ta zamknięta metoda witryfikacji pozwala uniknąć bezpośredniego kontaktu z ciekłym azotem. Jednak szybkość chłodzenia jest znacznie niższa i wynosi -1220 °C/min. Ładowanie i odzyskiwanie mieszków włosowych z dowolnego nośnika jest łatwe. Otwarta nośna CL mogła pomieścić do dziesięciu mieszków włosowych na urządzenie, w porównaniu do zaledwie dwóch w przypadku zamkniętego nośnika RI. Liczba ta została zmodyfikowana z35. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywne obrazy napotkanych problemów. (A) Klaster pęcherzyków z wytłaczanym oocytem. (B) Izolowane pęcherzyki z pękniętą błoną blaszki podstawnej i jeden z wytłoczonym oocytem. (C) Pęcherzyk osadzony pod pęcherzykiem w żelu. (D) Skupisko mieszków włosowych, które pozostało w żelu (po lewej) w porównaniu z klastrem osadzonym zbyt głęboko, który ostatecznie przyczepił się do naczynia. Szeroki zakres rozmiarów mieszków włosowych w FL-C jest wyraźnie widoczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Porównanie wzrostu pęcherzyków w hodowli 2-D i 3-D w HA. Przy wzroście 2D spłaszczenie pęcherzyka i przyłączenie komórek ziarnistych do naczynia do hodowli tkankowej zaobserwowano do 4 dnia, pozostawiając oocyt podatny na migrację komórek ziarnistych, przerwanie połączeń szczelinowych i przedwczesną ekstruzję oocytów. Pęcherzyk otoczony HA pozostał nieprzyczepiony przez cały okres hodowli. Ekspansja komórek ziarnistych zachodziła we wszystkich kierunkach, otaczając oocyt i zachowując architekturę 3D. Liczba ta została zmodyfikowana z36. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Reprezentatywne obrazy pęcherzyków zamkniętych w żelu hialuronowym połączonym z tyraminą. (A) Pęcherzyk przedantralny pobrany po trawieniu kolagenazą świeżego jajnika w dniu 1. (B) Kropla żelu z czterema pęcherzykami przedantralnymi zobrazowanymi w dniu 1 i (C) dniu 4 hodowli, (D) skupisku pęcherzyków ze świeżego jajnika w dniu 2 (E) w dniu 6 i (F) w dniu 9 hodowli. (G) Skupisko pęcherzyków mechanicznie wypreparowane z zeszklonego całego jajnika pokazane w 2. dniu i (H) w 6. dniu hodowli. (I) Pęcherzyk z tworzeniem się antrum jest wyraźnie widoczny w 9 dniu hodowli. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Owulacja oocytów. (A, B) Owulowany kompleks wzgórko-oocytowy (COC) pokazany obok kulki HA-żelu. (C) Oocyty zobrazowano po enzymatycznym traktowaniu COC hialuronidazą w celu usunięcia otaczających komórek wzgórka. Liczne oocyty metafazy II. (D) Oocyt metafazy II z wydatnym ciałem polarnym. Powiększenie 400x. (E) Obrazowanie na żywo oocytu metafazy II przy użyciu światła spolaryzowanego i systemu obrazowania do wizualizacji wrzeciona mejotycznego i oceny organizacji, wykonane zgodnie z opisem w37. Powiększenie 400x. Widoczne normalne wrzeciono dwójłomne. (F) Oocyt metafazy II utrwalony i wybarwiony anty-alfa / beta-tubuliną i jodkiem propidyny w celu uwidocznienia organizacji wrzeciona mejozycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rycina 9: Reorganizacja chromatyny w oocytach GV. Układ chromatyny w oocytach GV po utworzeniu antrum badano poprzez barwienie DNA preparatem Hoechst 33342 (50 ng/ml). Reprezentatywne pęcherzyki pobrano z kulek HA za pomocą delikatnego pipetowania. Komórki ziarniste usunięto za pomocą hialuronidazy. Oocyty GV były następnie barwione przez 15 minut (patrz protokół Monti i wsp.38). Zdjęcia zostały wykonane w 40-krotnym powiększeniu. (A) oocyt GV pokazany w dniu 1 podczas inicjacji hodowli, wykazujący wzór barwienia chromatyną bez otoczenia (NSN). (B) Oocyt GV z rosnącego pęcherzyka z antrum widocznym w dniu wyzwolenia hCG. Chromatyna skondensowała się i utworzyła pierścień okołojądrowy wokół jąderka. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

ParametrŚwieży jajnikZamrożony jajnik
Izolowany FLKlaster FLKlaster FL
Pęcherzyki zaobserwowane podczas IVC13015469
Owulacja po HCG (%)71%66%93%
 (92/130) (101/154)(64/69)
Dopuszczalna wartość brutto (%)30%28%52%
 (28/92) (28/101)(33/64)
Tworzenie komórek jajowych MII (%)59%55%*34%
(54//92)(56/101)(22/64)

Tabela 1: Wyniki z pęcherzykami osadzonymi w HA ze świeżych i zeszklonych jajników. Pęcherzyki jajnikowe i FL-C ze świeżych jajników dojrzewały in vitro po enkapsulacji w żelu HA. Żel HA testowano również na pęcherzykach z jajników zeszklonych przy użyciu protokołu EG/DMSO39. W przypadku świeżych jajników po strawieniu kolagenazy pobrano zarówno pojedyncze pęcherzyki (FL), jak i klastry pęcherzyków (FL-C). W przypadku zeszklonych jajników narażenie na kolagenazę było w rzeczywistości szkodliwe dla pęcherzyków. Najlepszym podejściem w przypadku kriokonserwowanych jajników było wyizolowanie klastrów FL, a nie pojedynczych pęcherzyków i zastosowanie wyłącznie mechanicznego rozwarstwienia za pomocą igieł. Tabela porównuje wyniki między kulkami HA zasianymi z pęcherzykami w grupach 4-6 w porównaniu z kulkami z pojedynczym FL-C zawierającym 6-10 pęcherzyków. *Tempo dojrzewania FL-C z kriokonserwowanych jajników było istotnie niższe (p = 0,008; Analiza chi-kwadrat w celu sprawdzenia istotności).

PrzewoźnikRICL
(Zamknięte)(Otwórz)
Przeżycie (%)100% (24/24)100% (41/41)
Tworzenie Antrum* (%)25.0% (6/24)75.6% (31/41)*
Częstość owulacji (%)66.7% (16/24)87.8% (36/41)
Wskaźnik dojrzewania (% MIIs)81.3% (13/16)69.4% (25/36)

Tabela 2: Wyniki po kriokonserwacji izolowanych pęcherzyków na dwóch różnych urządzeniach do witryfikacji. Wysokie tempo dojrzewania osiągnięto zarówno przy użyciu otwartego urządzenia CL, jak i zamkniętego nośnika RI, przy niższym współczynniku chłodzenia. Tworzenie się Antrum było jedyną miarą wyniku, którą zaobserwowano jako istotną, ale nie wpływała na ogólne tempo dojrzewania (p < 0,05; Analiza chi-kwadrat w celu sprawdzenia istotności).

Dyskusja

Możliwość kontrolowania właściwości mechanicznych i biodegradowalności hydrożelu HA związanego z tyraminą oferuje wiele korzyści w zastosowaniach inżynierii tkankowej. Nasze laboratorium jest pierwszym, które stosuje ten specyficzny żel HA do wzrostu pęcherzyków jajnikowych. Ten opatentowany żel hialuronianu sodu podstawiony tyraminą (TS-NAHY) to nowatorski system hydrożelowy na bazie kwasu hialuronowego opracowany w Cleveland Clinic. Sieciowanie żelu odbywa się poprzez wystawienie peroksydazy w aktywowanej mieszaninie żelu na działanie środka utleniającego. Można to zrobić zarówno in vitro , jak i in vivo. Uformowane hydrożele TS-NAHY wykazują szerokie spektrum właściwości od słabego żelu, pasty do kruchego ciała stałego, w zależności od stężenia żelu40.

Rozczarowujący postęp w zakresie posiewu pęcherzyków jajnikowych podkreśla potrzebę opracowania nowych modeli hodowli. Bardziej korzystnym podejściem może być stworzenie systemu hodowli opartego wyłącznie na natywnych składnikach macierzy zewnątrzkomórkowej. Opisany model hodowli HA jest łatwy w użyciu w sposób fizjologiczny i nie wymaga stosowania dodatkowych komponentów ECM. Żel jest przezroczysty, co pozwala na szczegółową wizualizację mieszków włosowych. Lepkosprężyste właściwości żelu HA ułatwiają regulację sztywności, a także podatności na formowanie. Ta cecha zwiększa wszechstronność tej biomatrycy. Sztywność biomatrycy może wpływać na proliferację komórek ziarnistych i tworzenie antrum 30,41,42. Doniesiono, że pęcherzyki pochodzące ze środowisk hodowlanych sprzyjających tworzeniu antrum mają inne profile ekspresji genów niż te w niewspierającym systemie hodowli43. Wydaje się, że pęcherzyki naczelnych wymagają sztywniejszej macierzy44. Dostosowanie biomatrycy do wymagań różnych gatunków zwierząt, w tym ludzi, będzie prawdopodobnie ważne dla pomyślnego dojrzewania in vitro.

W przypadku wzrostu pęcherzyków przedantralnych myszy przetestowaliśmy stężenia żelu w zakresie 2-5 mg/ml36. Tempo dojrzewania oocytów wahało się od 44% do 58%. Wyższe stężenia żelu HA pozwoliły na większą podatność na formowanie i zachowanie struktury 3D, ale miało to wpływ na ekspansję mieszków włosowych. Niższe stężenia kwasu hialuronowego pozwalały na bardziej promieniową ekspansję pęcherzyka, ale zwiększały ryzyko spontanicznego wytłaczania pęcherzyka przed końcem IVC. Stężenie 3-3,5 mg/ml HA działało najlepiej w przypadku mysich pęcherzyków przedantralnych. Utrzymanie małej kropli żelu było niezbędne do tworzenia kulek żelu HA o wystarczającej głębokości, aby utrzymać mieszki włosowe w konfiguracji 3D przez cały IVC. Większe krople spłaszczają się, co skutkuje opadaniem mieszków włosowych przez żel i przyczepianiem się do powierzchni płytki. Jednym z ograniczeń stosowania tego biomateriału do zatapiania jest niezwykle szybki czas żelowania. Utrudnia to wysiew więcej niż dwóch kulek żelowych HA na raz. Zwiększenie efektywności wysiewu mieszków włosowych do żelu HA to jeden z obszarów, w którym staramy się poprawić.

Hodowla klastrów mieszków włosowych w środowisku 3D z wykorzystaniem HA ma ogromny potencjał. Normalna architektura jajników jest zachowana, z pęcherzykami o różnej wielkości stykającymi się ze sobą i podścieliskiem. LH może pomóc we wzroście mniejszych pęcherzyków przedantralnych w FL-C poprzez indukowanie zmian we wczesnych różnicujących się komórkach oponowych, dlatego został włączony do pożywki FCM45. Kontynuowanie hodowli FL-C przez ostatnie 12 dni, aby sprawdzić, czy nowa fala wzrostu może zostać zainicjowana w którymkolwiek z mniejszych pęcherzyków nadal osadzonych po wyzwalaczu hCG, wymaga dalszych badań. Dalsza optymalizacja środowiska hodowlanego może być warunkiem wstępnym hodowli pęcherzyków o różnych zakresach wielkości we fragmencie tkanki. Zaletą tego 3-D modelu hodowli HA z FL-C jest to, że umożliwia on dokładne naśladowanie układu pęcherzyków i interakcji in vivo . Inną ważną cechą jest to, że w przeciwieństwie do alginianu wapnia i innych systemów polimerowych, owulacja i dojrzewanie mogą być indukowane bez fizycznego usuwania pęcherzyków z tkanki lub matrycy żelowej.

Czas potrzebny na hodowlę pęcherzyków in vitro i uzyskanie dojrzałych oocytów do zamrożenia jest długi, zwłaszcza u dużych ssaków. Zdolność do kriokonserwacji pobranych mieszków włosowych lub skupisk mieszków włosowych stanowi sposób na opóźnienie tego kroku na późniejszy i prawdopodobnie bardziej korzystny czas. Jeśli taka technologia będzie mogła pewnego dnia zostać zastosowana do ludzkich pęcherzyków podczas pobierania jajników, może to być korzystne. Kriokonserwacja całych jajników w celu zachowania płodności jest obecnie jedyną opcją dla pacjentek. Ale czy jest to rzeczywiście najlepsza metoda, pozostaje do ustalenia. W tym artykule przedstawiamy metodologię witryfikacji kriokonserwacji pęcherzyków przedantralnych, która zapewnia doskonałe wskaźniki przeżycia i dojrzewania po ociepleniu po hodowli 3D.

Podsumowując, opisaliśmy nowy model hodowli 3D z wykorzystaniem hialuronianu, składnika natywnego ECM. Technika enkapsulacji kwasu hialuronowego pozwala na zatrzymanie czynników troficznych w bliskiej odległości od rozwijających się pęcherzyków. Metodologia enkapsulacji w biomatrycy jest prosta i może pomieścić izolowane pęcherzyki, a także klastry mieszków włosowych. To ostatnie może otworzyć nowe ścieżki badań i zapewnić wgląd w podstawową biologię folikulogenezy i jej regulacji. Wykazano, że oocyty z pęcherzyków otoczonych HA są funkcjonalnie kompetentne37. Oocyty te mogą być zapładniane, tworzyć blastocysty in vitro i zagnieżdżać się po przeniesieniu do myszy w pseudociąży. Dane te potwierdzają słuszność stosowania kwasu hialuronowego sprzężonego z tyraminą jako biomatrycy do hodowli pęcherzyków 3D i dojrzewania oocytów in vitro. Protokół ten może być potencjalnie zastosowany do hodowli pęcherzyków jajnikowych w innych modelach zwierzęcych, w tym u ludzi. Innymi możliwymi zastosowaniami tego systemu żelu 3-D HA mogą być ciało zarodkowe i hodowla organoidów.

Oświadczenia

Brak konfliktów interesów i ujawniania informacji.

Podziękowania

Pragniemy podziękować całemu zespołowi embriologicznemu w Cleveland Clinic za ich pomoc, a także działowi REI, a w szczególności dr Falcone za wsparcie. Projekt ten został sfinansowany z funduszu badawczego w Cleveland Clinic.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Oznakowane anty-alfa tubuliną-FITCSigma-AldrichF2168 powiedział:
Z oznaczeniem anty-beta tubuliny-FITCSigma-AldrichZobacz materiał F2043
BZ-X700Klucz
Środkowa studnia miskaFisher Naukowy08-772-12
Kolagenaza typu IKorporacja Biochemiczna WorthingtonLS004196
Fiolka z odpowietrzeniem CrycapBadania HamptonHR4-904 powiedział:
KriopętlaBadania HamptonHR4-974 powiedział:
Kryształowa nakrętkaBadania HamptonPrzekaźnik HR4-733
Naczynie hodowlane 60mmFisher Naukowy 08-772B
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichZobacz materiał D2650
Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)R & Systemy D236-EG
Glikol etylenowy (EG)Sigma-Aldrich293237
Płodowa surowica bydlęca inaktywowana termicznieThermoFisher Naukowy10082-147
Hormon folikulotropowy (FSH)Sigma-AldrichZobacz materiał F4021
Global-Hepes  ŚredniBednarz ChirurgicznyLGGH-100 powiedział:
Hoechst 33342 powiedział:Sigma-AldrichZobacz materiał B2261
Ludzka gonadotropina kosmówkowa (hCG)Sigma-AldrichCG10 powiedział:
Albumina surowicy ludzkiejBednarz ChirurgicznyGHSA-125 powiedział:
HialuronidazyBednarz ChirurgicznyART-4007-A
Nadtlenek wodoruCVS Apteka Inc.372441
Insulina-transferyna-selen (ITS)ThermoFisher Naukowy41400-045
Leibovitz medium (L-15)ThermoFisher Naukowy11415-064
Hormon luteinizującySigma-AldrichL9773
Różdżka magnetycznaBadania HamptonHR4-729
Mikropipety (1000 i mikro; m)Minitube19025/0050
Mikropipety (175 , 200 i 275 i mikro; m)Bednarz ChirurgicznyMXL3-175, MXL3-200, MXL3-275
Millex GV filtr 0,22 &mikro; mMiliporySLGU033RS
Olej mineralnyBednarz ChirurgicznyLGOL-500 powiedział:
Minimalna niezbędna pożywka alfa (MEM)ThermoFisher Naukowy32561-037
System obrazowania oocytów-SpindleviewHamiltona Thorne'a
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)ThermoFisher Naukowy10010-023
Jodek propidynySigma-AldrichZobacz materiał P4170
Szybki iŻycie in vitro14406
Skrzynka SmartBoxŻycie in vitro14423
Syntetyczny substytut białka (SPS)Bednarz ChirurgicznyART-3011
Zestaw biohydrożelu hialuronowego połączonego z tyraminą Rdzeń życiaPOL-00151
Zgrzewarka ultradźwiękowaŻycie in vitro14415
Uniwersalna miska do hodowli GPS 8x 100 &mikro; l studnieBednarz ChirurgicznyUGPS-010 powiedział:

Bibliografia

  1. Telfer, E. E., Andersen, C. Y. In vitro growth and maturation of primordial follicles and immature oocytes. Fertil Steril. 115 (5), 1116-1125 (2021).
  2. Telfer, E. E., McLaughlin, M. Natural history of the mammalian oocyte. Reprod Biomed Online. 15 (3), 288-295 (2007).
  3. Xiao, S., et al. In vitro follicle growth supports human oocyte meiotic maturation. Sci Rep. 5, 17323(2015).
  4. Carabatsos, M. J., Sellitto, C., Goodenough, D. A., Albertini, D. F. Oocyte-granulosa cell heterologous gap junctions are required for the coordination of nuclear and cytoplasmic meiotic competence. Dev Biol. 226 (2), 167-179 (2000).
  5. Diaz, F. J., Wigglesworth, K., Eppig, J. J. Oocytes are required for the preantral granulosa cell to cumulus cell transition in mice. Dev Biol. 305 (1), 300-311 (2007).
  6. Eppig, J. J., Pendola, F. L., Wigglesworth, K., Pendola, J. K. Mouse oocytes regulate metabolic cooperativity between granulosa cells and oocytes: amino acid transport. Biol Reprod. 73 (2), 351-357 (2005).
  7. Dadashzadeh, A., Moghassemi, S., Shavandi, A., Amorim, C. A. A review on biomaterials for ovarian tissue engineering. Acta Biomater. 135, 48-63 (2021).
  8. Simon, L. E., Kumar, T. R., Duncan, F. E. In vitro ovarian follicle growth: a comprehensive analysis of key protocol variablesdagger. Biol Reprod. 103 (3), 455-470 (2020).
  9. Belli, M., et al. Towards a 3D culture of mouse ovarian follicles. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 931-937 (2012).
  10. Berkholtz, C. B., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Extracellular matrix functions in follicle maturation. Semin Reprod Med. 24 (4), 262-269 (2006).
  11. Desai, N., et al. Three-dimensional in vitro follicle growth: overview of culture models, biomaterials, design parameters and future directions. Reprod Biol Endocrinol. 8, 119(2010).
  12. Shea, L. D., Woodruff, T. K., Shikanov, A. Bioengineering the ovarian follicle microenvironment. Annu Rev Biomed Eng. 16, 29-52 (2014).
  13. Paulini, F., et al. Survival and growth of human preantral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicle isolation and short-term xenografting. Reprod Biomed Online. 33 (3), 425-432 (2016).
  14. West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28 (30), 4439-4448 (2007).
  15. Joo, S., et al. The effect of collagen hydrogel on 3D culture of ovarian follicles. Biomed Mater. 11 (6), 065009(2016).
  16. Telfer, E., Torrance, C., Gosden, R. G. Morphological study of cultured preantral ovarian follicles of mice after transplantation under the kidney capsule. J Reprod Fertil. 89 (2), 565-571 (1990).
  17. Torrance, C., Telfer, E., Gosden, R. G. Quantitative study of the development of isolated mouse pre-antral follicles in collagen gel culture. J Reprod Fertil. 87 (1), 367-374 (1989).
  18. Dong, C., Yonggang, L. V. Application of collagen scaffold in tissue engineering: recent advances and new perspectives. Polymers. 8 (2), 42(2016).
  19. Le, B. A. M., et al. Agarose-based 3D culture improved the developmental competence of oocyte-granulosa complex isolated from porcine preantral follicle. Theriogenology. 223, 11-21 (2024).
  20. Park, J. E., et al. In vitro maturation on an agarose matrix improves the developmental competence of porcine oocytes. Theriogenology. 157, 7-17 (2020).
  21. Zaniker, E. J., et al. Three-dimensionally printed agarose Micromold supports scaffold-free mouse ex vivo follicle growth, ovulation, and luteinization. Bioengineering. 11 (7), 719(2024).
  22. Pangas, S. A., Saudye, H., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell-oocyte complexes. Tissue Eng. 9 (5), 1013-1021 (2003).
  23. West, E. R., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Engineering the follicle microenvironment. Semin Reprod Med. 25 (4), 287-299 (2007).
  24. Xu, J., et al. Survival, growth, and maturation of secondary follicles from prepubertal, young, and older adult rhesus monkeys during encapsulated three-dimensional culture: effects of gonadotropins and insulin. Reproduction. 140 (5), 685-697 (2010).
  25. Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12 (10), 2739-2746 (2006).
  26. Amorim, C. A., Van Langendonckt, A., David, A., Dolmans, M. M., Donnez, J. Survival of human pre-antral follicles after cryopreservation of ovarian tissue, follicular isolation and in vitro culture in a calcium alginate matrix. Hum Reprod. 24 (1), 92-99 (2009).
  27. Converse, A., Zaniker, E. J., Amargant, F., Duncan, F. E. Recapitulating folliculogenesis and oogenesis outside the body: encapsulated in vitro follicle growth dagger. Biol Reprod. 108 (1), 5-22 (2023).
  28. Mainigi, M. A., Ord, T., Schultz, R. M. Meiotic and developmental competence in mice are compromised following follicle development in vitro using an alginate-based culture system. Biol Reprod. 85 (2), 269-276 (2011).
  29. Kreeger, P. K., Deck, J. W., Woodruff, T. K., Shea, L. D. The in vitro regulation of ovarian follicle development using alginate-extracellular matrix gels. Biomaterials. 27 (5), 714-723 (2006).
  30. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Interpenetrating fibrin-alginate matrices for in vitro ovarian follicle development. Biomaterials. 30 (29), 5476-5485 (2009).
  31. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 211-224 (2006).
  32. Irving-Rodgers, H. F., Rodgers, R. J. Extracellular matrix of the developing ovarian follicle. Semin Reprod Med. 24 (4), 195-203 (2006).
  33. Salustri, A., Camaioni, A., Di Giacomo, M., Fulop, C., Hascall, V. Hyaluronan and proteoglycans in ovarian follicles. Hum Reprod Update. 5, 293(1999).
  34. Rashki Ghaleno, L., Cristian, P. P., Shahverdi, A., Dardmeh, F., Alipour, H., Valojerd, M. R. Exploring the role of hyaluronic acid in reproductive biology and beyond: Applications in assisted reproduction and tissue engineering. Adv. Biology. 8 (6), e202300621(2024).
  35. Desai, N. N., Goldberg, J. M., Austin, C., Falcone, T. The new Rapid-i carrier is an effective system for human embryo vitrification at both the blastocyst and cleavage stage. Reprod Biol Endocrinol. 11, 41(2013).
  36. Desai, N., Abdelhafez, F., Calabro, A., Falcone, T. Three dimensional culture of fresh and vitrified mouse pre-antral follicles in a hyaluronan-based hydrogel: a preliminary investigation of a novel biomaterial for in vitro follicle maturation. Reprod Biol Endocrinol. 10 (1), 29(2012).
  37. Desai, N., Spangler, M., Nanavaty, V., Gishto, A., Brown, A. New hyaluronan-based biomatrix for 3-D follicle culture yields functionally competent oocytes. Reprod Biol Endocrinol. 20 (1), 148(2022).
  38. Monti, M., Redi, C. A. Isolation and characterization of mouse antral oocytes based on nucleolar chromatin organization. J Vis Exp. (107), e53616(2016).
  39. Huang, L., et al. Cryopreservation of human ovarian tissue by solid-surface vitrification. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 139 (2), 193-198 (2008).
  40. Chan, J., Darr, A., Alam, D., Calabro, A. Investigation of a novel cross-linked hyaluronan hydrogel for use as a soft-tissue filler. Am J Cosmetic Sur. 22, 105-108 (2005).
  41. Shikanov, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. A method for ovarian follicle encapsulation and culture in a proteolytically degradable 3-dimensional system. J Vis Exp. (49), e2695(2011).
  42. Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development. Biol Reprod. 75 (6), 916-923 (2006).
  43. West-Farrell, E. R., et al. The mouse follicle microenvironment regulates antrum formation and steroid production: alterations in gene expression profiles. Biol Reprod. 80 (3), 432-439 (2009).
  44. Xu, M., et al. Encapsulated three-dimensional culture supports development of nonhuman primate secondary follicles. Biol Reprod. 81 (3), 587-594 (2009).
  45. Wu, J., Nayudu, P. L., Kiesel, P. S., Michelmann, H. W. Luteinizing hormone has a stage-limited effect on preantral follicle development in vitro. Biol Reprod. 63 (1), 320-327 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kultura tr jwymiarowawitryfikacja p cherzyk wdojrzewanie oocyt wwzrost p cherzyk w przedantralnychmacierz zewn trzkom rkowap cherzyki jajnikowe myszyfilm krioprotekcyjny
Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.