Generowanie trójwymiarowych sferoidów/organoidów z dwuwymiarowych kultur komórkowych przy użyciu nowatorskiego urządzenia do stemplowania

Summary

To badanie przedstawia opłacalną i efektywną metodologię generowania struktur komórkowych 3D za pomocą systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. System sprzyja tworzeniu się jednolitych sferoidów/organoidów, poprawiając w ten sposób interakcje komórkowe. Takie podejście zmniejsza zmienność eksperymentalną i wspiera zastosowania w testowaniu leków i inżynierii tkankowej.

Abstract

Trójwymiarowe (3D) hodowle komórkowe zapewniają dokładniejsze odwzorowanie mikrośrodowiska in vivo niż konwencjonalne dwuwymiarowe (2D) hodowle, ponieważ promują wzmocnione interakcje między komórkami a macierzą zewnątrzkomórkową. To badanie miało na celu opracowanie wydajnej, opłacalnej i powtarzalnej metodologii generowania struktur komórkowych 3D (sferoidy/organoidy) przy użyciu innowacyjnego systemu opartego na stemplach do tworzenia mikrostudzienek w formach agarozowych. Nowatorski stempel wykorzystano do wyprodukowania 663 mikrodołków na studzienkę na płytkę 6-dołkową, zapewniając idealne środowisko do agregacji komórek. Pierwotne komórki wysp trzustkowych trzustki świni zostały wysiane w tych mikrodołkach, gdzie agregowały się, tworząc sferoidy/organoidy. Kultury inkubowano w temperaturze 37 °C przy 5% CO_{2 ,} a pożywkę wymieniano co 3 dni. Powstawanie sferoid było okresowo monitorowane i pobierano próbki do charakterystyki. Metoda ta z powodzeniem pozwoliła na uzyskanie jednolitych i wysokiej jakości sferoid, zmniejszając zmienność eksperymentalną, minimalizując manipulacje i wzmacniając interakcje międzykomórkowe. Zastosowanie form do mikrowzorów na bazie agarozy zapewniło uproszczone, kontrolowane środowisko dla kultur 3D, oferując ustandaryzowane i opłacalne rozwiązanie. Metodologia ta wspiera aplikacje do testowania leków i inżynierii tkankowej, oferując praktyczną i skalowalną platformę dla modeli 3D hodowli komórkowych, które można łatwo wdrożyć w różnych warunkach laboratoryjnych.

Introduction

W ciągu ostatnich 50 lat, liczne badania biologii komórki wykazały, że dwuwymiarowe (2D) hodowle nie są w stanie dokładnie odtworzyć warunków in vivo obserwowanych w modelach zwierzęcych¹. Strukturalnie hodowle komórkowe 2D nie pozwalają komórkom organizować się trójwymiarowo i replikować sytuacji obserwowanej w systemach in vivo. Co więcej, komórkowe szlaki sygnałowe są zmienione w hodowlach 2D w porównaniu z kulturami trójwymiarowymi (3D), co może prawdopodobnie wyjaśniać, dlaczego niektóre rodzaje badań przesiewowych leków przy użyciu kultur 2D są tak rozbieżne². Znaczący postęp w technikach hodowli komórkowych nastąpił wraz z wprowadzeniem systemów hodowli 3D. Systemy 3D różnią się znacznie pod względem złożoności w zależności od składu komórkowego i cytoarchitektury. Ogólnie rzecz biorąc, generowane są dwa rodzaje struktur, a mianowicie: sferoidy i organoidy. Sferoidy są opisywane jako proste skupiska komórek uzyskanych z tkanek normalnych lub nowotworowych, ciał embrionalnych i linii komórkowych. Na tworzenie struktur 3D wpływają różne czynniki, w tym interakcje komórka-komórka i szlaki sygnałowe, w których pośredniczą składniki macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), które zapewniają wsparcie strukturalne i sygnały biochemiczne. Elementy te regulują interakcje, które przyczyniają się do organizacji i funkcji tkanek³. System hodowli sferoidalnych został po raz pierwszy opisany na początku lat siedemdziesiątych XX wieku, przy użyciu linii komórkowych płuc chomika chińskiego V79 jako modelu raków guzkowych, rosnących w warunkach nieprzylegających i tworzących idealne kule⁴. Organoidy są opisywane jako klastry specyficznych dla narządów typów komórek pochodzących z komórek macierzystych lub progenitorowych, które samoorganizują się poprzez procesy, takie jak sortowanie komórek i specyfikacja linii, w sposób ograniczony przestrzennie, odzwierciedlając in vivo development⁵.

Kilka dostępnych metod i materiałów jest dostępnych do hodowli komórek w warunkach 3D. Główne metody stosowane obecnie do generowania kultur 3D to: 1) wiszące krople; 2) rotacyjna hodowla komórkowa i tworzywa sztuczne o niskim stopniu przylegania; 3) płyty ostrosłupowe zawierające stożkowe studnie; 4) rusztowania makroporowate; 5) koraliki magnetyczne; oraz 6) hydrożele niedostępne na rusztowaniach.

Wiszące krople to metoda używana do uzyskiwania kultur 3D bez rusztowań. Metoda ta wiąże się z pewnymi ograniczeniami, w tym koniecznością intensywnego przenoszenia, niską wydajnością produkcji, geometrią sferyczną i narażeniem na duże siły ścinające. Co więcej, określone procedury, takie jak wymiana pożywki lub dodanie mieszanki, mogą być trudne i mogą skutkować stratami materialnymi. Co więcej, doniesienia literaturowe wskazują, że niektóre linie komórkowe nie wytwarzają ciasno upakowanych sferoid przy zastosowaniu tego podejścia⁶.

Rotacyjne hodowle komórkowe i tworzywa sztuczne o niskim przyleganiu są używane, aby zapobiec przyczepianiu się komórek do podłoża, powodując ich agregację i tworzenie sferoid. Proces ten wymaga specjalnych kolb i/lub mieszania/rotacji. Chociaż jest to jedno z najprostszych podejść do produkcji sferoidów lub organoidów na dużą skalę, nie jest pozbawione wad, takich jak potrzeba specjalnego sprzętu, niska trwałość hodowli, różnice w wielkości sferoid, mechaniczne uszkodzenia komórek i niska wydajność⁶.

Płyty piramidalne zawierające stożkowe studnie są dostępne na rynku, co wpływa na koszty, oprócz faktu, że niektóre manipulacje mogą utrudniać tworzenie sferoidów/organoidów⁷.

Makroporowate rusztowania są również wykorzystywane do hodowli 3D; jednak główną przeszkodą jest osiągnięcie efektywnego zasiewu komórek i równomiernego rozmieszczenia. Ten problem pojawia się, ponieważ rozmiary porów mogą być albo zbyt małe, aby przeniknąć do komórek, albo zbyt duże, aby bezpiecznie zatrzymać komórki. Aby rozwiązać ten problem, zbadano kilka strategii⁸, które mają bezpośredni wpływ na złożoność i koszt tej techniki.

Metodologia kulek magnetycznych generuje niewielką liczbę sferoidów/organoidów, jest kosztowna i może pozostawiać pozostałości nanocząsteczek wewnątrz komórek⁹.

Wśród systemów do hodowli sferoid dostępne są nieadhezyjne hydrożele agarozowe, stanowiące hydrożel bez rusztowań. Takie podejście oferuje znaczące korzyści, takie jak precyzyjna kontrola nad rozmiarem struktur 3D i zdolność do generowania znacznej liczby tych struktur na płytę. W tej metodzie komórki są wprowadzane do hydrożelu z wstępnie uformowanymi studzienkami, w których toną i samoorganizują się w sferoidy 3D¹⁰.

W tym badaniu prezentujemy urządzenie i metodologię generowania mikrostudzienek agarozowych za pomocą formy mikrowzorcowej w prosty, wydajny, powtarzalny i tani sposób.

Użycie tego stempla jako formy do generowania mikrostudzienek w agarozie, wspomaganych grawitacyjnie, ma na celu zwiększenie interakcji komórek w mikrostudzience i organizacji komórkowej, generując struktury 3D (sferoidy/organoidy) in vitro w prosty, wydajny, powtarzalny i tani sposób, oszczędzając w ten sposób czas badań i zasoby laboratoryjne.

Protocol

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji Etyki Badań Naukowych na Ludziach naszej instytucji CEUA-FMUSP: 1699/2021, zatwierdzonym 8 września 2021 r. -"Izolacja i enkapsulacja wysp trzustkowych świni" i jest częścią Projektu Tematycznego naszej Grupy Terapii Komórkowej i Molekularnej NUCEL (www.usp.br/nucel), Grant FAPESP nr 2016/05311-2, zatytułowany: "Medycyna regeneracyjna mająca na celu terapię chorób przewlekło-zwyrodnieniowych (rak i cukrzyca)".

1. Produkcja urządzenia stemplującego

UWAGA: Ten znaczek jest wykonany na zamówienie przez grupę NUCEL (https://w3nucel.webhostusp.sti.usp.br/). Urządzenie do stemplowania zostało opracowane przy użyciu referencyjnego oprogramowania, powszechnie znanego ze swojej precyzji i zaawansowanych możliwości modelowania trójwymiarowego.

1. Upewnij się, że zaprojektowane prototypy zawierają 663 mikropiny rozmieszczone w taki sposób, aby umożliwić wygenerowanie równoważnej liczby trójwymiarowych kultur, takich jak sferoidy lub organoidy. Aby zapewnić stabilność stempla na powierzchniach tacy T6, należy strategicznie ustawić pięć punktów podparcia wzdłuż obwodu urządzenia.
2. Upewnij się, że mikroszpilki mają stożkową konstrukcję z regulowanymi wymiarami, w zakresie od 1 do 3 mm długości. Średnica podstawy stożka waha się od 0,7 do 1,5 mm, a kąt stożka waha się od 5° do 10°.
3. Upewnij się, że struktura "ogranicznika" urządzenia, która określa głębokość mikroszpilek, ma regulowaną długość od 10 do 19 mm i średnicę od 20 do 40 mm, z mikroszpilkami równomiernie rozmieszczonymi na jego powierzchni.
4. Dodatkowo zaprojektuj urządzenie tak, aby miało ergonomiczny uchwyt, odpowiedni do obsługi jedną ręką, aby zwiększyć praktyczność i precyzję podczas użytkowania.
   UWAGA: Aby ułatwić produkcję urządzenia na dużą skalę, dostarczany jest plik cyfrowy w formacie .stl, który jest niezbędny w procesie drukowania 3D.
5. Wystarczy pokroić go w plastry za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wydrukować na kompatybilnej drukarce 3D. Użyj następujących wymiarów wydruku: X - 68 mm; Y - 120 mm; Z - 150 mm, zapewniając idealną równowagę między funkcjonalnością a jakością konstrukcji.
6. Do produkcji urządzenia należy użyć fotoutwardzalnej drukarki 3D, która jest kompatybilna z żywicą polimerową utwardzaną promieniami UV, która musi mieć wysoką rozdzielczość i jednolite wykończenie powierzchni, co jest niezbędne dla optymalnej wydajności urządzenia.
7. Pokrój model cyfrowy do druku za pomocą oprogramowania kompatybilnego z wybraną drukarką 3D.

2. Przygotowanie mikrostudzienek agarozowych

1. Przygotuj roztwór agarozy.
   1. Zważyć czysty proszek agarozy i rozpuścić go w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), aby uzyskać końcowe stężenie 1-2% (w/v).
   2. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej lub łaźni wodnej aż do całkowitego rozpuszczenia, upewniając się, że jest jednorodny i przezroczysty.
      UWAGA: Unikaj przegrzania lub nadmiernego podgrzewania, ponieważ może to spowodować degradację agarozy. Nie należy przygotowywać dużych objętości roztworu podstawowego.
   3. Pozostawić roztwór do ostygnięcia do temperatury ~40 °C, idealnej do pipetowania.
2. Przygotuj pieczątkę na zamówienie.
   1. Umyj stempel gąbką o miękkim włosiu i wodą destylowaną, aby usunąć pozostałości.
   2. Wystawiony na działanie oczyszczonego stempla należy wystawić na działanie promieniowania UV przez 5-10 minut, aby zapewnić sterylność.
3. Uformuj mikrodołki.
   1. Wlać/pipetować ~3 ml roztworu agarozy o temperaturze 40 °C do każdego dołka na płytce 6-dołkowej, zapewniając jednolitą głębokość 2-3 mm.
   2. Umieść wykonany na zamówienie stempel na środku studzienki, gdy agaroza jest jeszcze ciepła.
      UWAGA: Stempel posiada boczne podpory, które zapewniają wyrównanie i stabilność, eliminując potrzebę ręcznego podparcia. Każdy stempel tworzy ~663 mikrodołki (~2 mm wysokości) na studzienkę. Upewnij się, że na mikroszpilkach nie ma pęcherzyków; Jeśli utworzą się bąbelki, delikatnie przesuń stempel, aby je wyeliminować.
   3. Pozostaw agarozę do zestalenia się na 5-10 minut w temperaturze pokojowej bez przesuwania płytki.
      UWAGA: Nie należy naruszać agarozy podczas krzepnięcia, aby uniknąć zmian w strukturze mikrostudzienki.
   4. Usuń stempel delikatnymi ruchami w przód iw tył, aby uwolnić próżnię bez uszkadzania mikrostudzienek.
      UWAGA: Ten ruch ułatwia dopływ powietrza, umożliwiając płynne usuwanie stempla bez deformacji żelu. Mikrostudzienki muszą pozostać nienaruszone.
   5. Umyj mikrostudzienki 3x roztworem PBS, aby usunąć pozostałości.
   6. Wystaw płytkę na działanie światła UV przez 10 minut, aby wyeliminować zanieczyszczenie mikrobiologiczne.
   7. Dodać 3 ml pożywki hodowlanej i inkubować płytkę w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C przez noc.
      UWAGA: Ta inkubacja sprawdza brak zanieczyszczenia przed wysiewem komórek.

3. Umieszczanie komórek w mikrostudzienkach

1. Przygotować zawiesinę komórkową.
   1. Zebrać komórki za pomocą trypsynizacji lub innej metody dysocjacji, aby uzyskać jednorodną zawiesinę.
   2. Policz komórki i dostosuj stężenie zgodnie z żądaną liczbą na mikrostudzienkę.
      UWAGA: Aby wysadzić 5,000 komórek na mikrostudzienkę w 663 mikrostudzienkach, przygotuj zawiesinę zawierającą co najmniej 3,315 × 10⁶ komórek ogółem. Zoptymalizuj stężenie komórek, aby zapobiec centralnej martwicy i zapewnić odpowiednią dyfuzję składników odżywczych i tlenu.
2. Zasiej komórki.
   1. Odpipetować ~3 ml przygotowanej zawiesiny komórek nad mikrodołkami, zapewniając równomierne rozprowadzenie poprzez delikatne obracanie płytki.
   2. Pozwól komórkom osiąść grawitacyjnie (~10-15 min) lub wykonaj delikatne wirowanie przy 100 × g przez 5 min.
      UWAGA: Można zastosować wirowanie, aby zapewnić koncentrację komórek w mikrostudzienkach.
   3. Przenieść płytkę do inkubatora CO₂ w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.

4. Utrzymanie hodowli komórkowych 3D

1. Wymień pożywkę hodowlaną.
   1. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni, usuwając 50% starego podłoża i dodając świeże podłoże.
      UWAGA: Upewnij się, że mikrostudzienki pozostają zanurzone przez cały okres hodowli, aby zapobiec odwodnieniu.
2. Monitoruj tworzenie kultur 3D.
   1. Kontynuuj hodowlę, aż struktury 3D będą w pełni uformowane i zwarte (np. 2-3 dni w przypadku pierwotnych kultur wysp trzustkowych).
      UWAGA: W przypadku kultur wymagających dłuższego czasu formowania należy wykonywać częściowe zmiany podłoża co 2-3 dni.

5. Zbieranie i charakteryzacja struktur 3D

1. Zbierz sferoidy/organoidy.
   1. Usuń stare podłoże i zbierz struktury 3D za pomocą energicznego pipetowania za pomocą końcówki do pipet o dużej średnicy lub naciętej, aby zapobiec ściskaniu lub dezagregacji.
      UWAGA: Energiczne pipetowanie musi być kontrolowane, aby usunąć kruszywa bez ich deformacji.
2. Przygotuj się do analizy.
   1. Zebrane sferoidy/organoidy należy natychmiast wykorzystać lub naprawić je do przyszłej analizy.
      UWAGA: Asocjacja i stabilność sferoid zależą od typu komórki, czasu tworzenia i warunków hodowli. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć dysocjacji.

Results

Hodowla komórkowa użyta w tym badaniu pochodziła z wysp trzustkowych świni. Preparat wysp trzustkowych zastosowany w tym badaniu charakteryzował się czystością 80 ± 5% w oparciu o barwienie ditizonem i >80% żywotnością komórek wysp trzustkowych w oparciu o wykrycie dioctanu fluoresceiny w żywych komórkach lub jodku propidyny w martwych komórkach (metoda fluorescencyjna Live/Dead). Upewnij się, że preparat na wyspę trzustkową świni jest czysty w co najmniej 80% (np. przez barwienie ditizozonem) i >80% żywotny. Po iz...

Discussion

Chociaż w literaturze istnieją różne protokoły hodowli 3D, w badaniu przeprowadzonym przez Wassmer i ^wsp.13 przetestowano kilka metodologii generowania struktur 3D przy użyciu wysp trzustkowych. Autorzy zaobserwowali, że rodzime wysepki i samozagregowane sferoidy wykazywały znaczną niejednorodność pod względem wielkości i kształtu oraz były większe niż te uzyskane innymi metodami. Na podstawie swoich ustaleń doszli do wniosku, że sferoidy mogą być generowane przy użyciu różnych technik, z których ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
31L Kuchenka mikrofalowa	Electrolux	78965840 6699 9	Sprzęt służący do podgrzewania roztworu agarozy, ułatwiający jego rozpuszczenie i zapewniający większą jednorodność. Pozwala to roztworowi osiągnąć idealny stan ciekły do powstania studzienek.
3DFila Szara nieprzezroczysta światłoczuła żywica 3D z żywicy			polimerowej utwardzanej promieniami UV
- Creality Halot One	Creality	N/A	używana do drukowania urządzenia do stemplowania
Agaroza	UNISCIENCE	UNI-R10111	Aby utworzyć żel, rozpuść 1 do 2% w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) lub odpowiednim podłożu.
Autodesk Fusion 360			Modelowanie 3D
BB15 Inkubator CO2	Thermo Fisher	51023121	Sprzęt używany do inkubacji hodowanych komórek w odpowiednim i kontrolowanym środowisku.
Chitubox	Chitubox	N/A	Oprogramowanie służące do krojenia części do druku
Szafa Bezpieczeństwa Biologicznego klasy II	Grupo VECO	N/A	Zapewnia sterylne środowisko do przeprowadzania hodowli komórkowych zgodnie z ustalonymi parametrami i protokołami.
Pożywka	hodowlana USBiological/Life Sciences	C5900-03A	Zawiera dodatki do prawidłowej hodowli komórek.
Płytki hodowlane (P6)	SARSTEDT	1023221	Służy do kształtowania agarozy i hodowli komórek.
Kolba Erlenmeyera (25 mL)	Laborglas	91 216 14	Pojemnik służący do rozpuszczenia 1– 2% agarozy w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub innym odpowiednim podłożu, zwykle podgrzewanym w kuchence mikrofalowej.
Falcon 15 mL Polistyrenowa probówka	Corning	352099	Służy do utrzymywania komórek w zawiesinie i wykonywania ewentualnych rozcieńczeń.
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Vitrocell Embriolife	005/19	Dodatek do pożywki hodowlanej.
Roztwór PBS (bufor fosforanowy soli fizjologicznej)	Lab wykonany	/A	Rozcieńczony 1x ultraczystą wodą MiliQ. Służy do rozpuszczania agarozy od 1 do 2% i do mycia już wyprodukowanych studzienek.
Butelka z odczynnikiem z niebieską nakrętką - Schott	Laborglas	21801545	Służy do przygotowania i przechowywania pożywki hodowlanej.
Stamp device	NUCEL Group	N/A	Link- To łącze zapewnia dostęp do pliku .stl urządzenia stemplowego. Wystarczy pokroić go w plastry za pomocą odpowiedniego oprogramowania i wydrukować na kompatybilnej drukarce 3D. https://drive.google.com/drive/folders/1gTYComnJWzHpN6ZKOyK EChKS3Qns0rOA?usp=udostępnianie
Kolba hodowlana poddana działaniu z filtrem 25 cm²	Corning	430639	Służy do hodowli i utrzymania przylegających komórek.
Trypsyna	Merck	07-07-9002	Do dysocjacji komórek przed siewem.
Światło ultrafioletowe (UV)	NIE	DOTYCZY	Służy do sterylizacji stempla i płytek.