Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

Luke Stanley; Jesús  F. Peña

doi:10.3791/67790

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Krzyżówki płciowe z Mucoromycete Phycomyces blakesleeanus

834 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67790

⸱

6 czerwca 2025

Luke Stanley¹ , Jesús F. Peña¹

¹Organismal Biology and Ecology Department, Colorado College

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy podstawowy protokół indukcji krycia P. blakesleeanus.

Streszczenie

Phycomyces blakesleeanus, nitkowaty grzyb z gromady Mucoromycota, wyróżnia się niezwykłą zdolnością do percepcji otoczenia i reakcji adaptacyjnych. Podczas gdy wcześniejsze prace wykazały, że bodźce środowiskowe, w tym grawitacja, światło, wilgoć i dostępność składników odżywczych, wpływają na dynamikę wzrostu i strategie reprodukcyjne, mechanizmy leżące u ich podstaw pozostają głównym obszarem badań. Sygnały środowiskowe wyzwalają rozmnażanie płciowe lub bezpłciowe. Rozmnażanie płciowe rozpoczyna się od sygnalizacji feromonowej, która wyzwala chemoprzyciąganie strzępek, ostatecznie prowadząc do seryjnych przemian morfologicznych zakończonych powstaniem zygospory.

W warunkach laboratoryjnych, krzyżówki P. blakesleeanus skutkują komplementarną grzybnią przechodzącą cykl płciowy na różnych etapach. Nasza praca ma na celu sprawdzenie, czy sygnały środowiskowe mogą wywołać krycie w grzybni P. blakesleeanus. Krzyżówki P. blakesleeanuuprawiane na pożywkach o ograniczonej zawartości składników odżywczych zostaną poddane działaniu agaru o ograniczonej zawartości składników odżywczych w celu wywołania reakcji płciowej zgodnie z niedoborem składników odżywczych. Pomyślne wywołanie krycia u P. blakesleeanus ułatwi przyszłe badania, które wymagają dużej ilości grzybni rozmnażającej się płciowo w określonych stadiach. Wyniki tych badań jeszcze bardziej pogłębią naszą wiedzę na temat wpływu czynników środowiskowych na mechanizmy rozrodcze P. blakesleeanus, przyczyniając się do poszerzenia bazy wiedzy na temat rozmnażania płciowego grzybów strzępkowych.

Wprowadzenie

Indukcja krycia w systemach grzybowych w warunkach laboratoryjnych pogłębiła zrozumienie genetyki eukariotycznej, biologii komórki, biologii ewolucyjnej i biotechnologii. Grzyby dikarian, w szczególności Ascomycota, charakteryzują się najobszerniejszą wiedzą na temat indukcji krycia w warunkach laboratoryjnych¹. Co ciekawe, pierwszy grzyb, u którego zaproponowano rozmnażanie płciowe, Syzygites megalocarpus, nie jest członkiem Ascomycota, ale raczej członkiem gromady Mucoromycota². Gromada Mucoromycota to wcześnie rozchodząca się grupa, wcześniej klasyfikowana jako "Zygomycota", ale obecnie uważana za siostrzaną dla linii Dikaryan ³^,⁴. Mucoromycota, wraz z Zoopagomycota, są ewolucyjnie znaczące, ponieważ te typy reprezentują przejście grzybów do ekosystemów lądowych⁴^,⁵. Podobnie jak inne grzyby, Mucoromycetes używają bezpłciowych i płciowych strategii reprodukcyjnych w odpowiedzi na swoje środowisko³^,⁶. W warunkach ograniczonej ilości składników odżywczych mucoromycetes rozpoczną cykl płciowy⁶. Mucoromycetes wykazują zarówno homotaliczne, jak i heterotalliczne mechanizmy kojarzenia, gdzie zgodność jest określana przez geny typu kojarzeniowego sexM i sexP, oznaczone odpowiednio jako (-) i (+)⁷^,⁸^,⁹.

Blakeslee¹⁰ podkreślił wrażliwość cyklu płciowego mucoromycete na warunki zewnętrzne, zauważając, że wilgoć jest krytyczna dla ich powstawania i że dostępność składników odżywczych w podłożu odgrywa znaczącą rolę. Komplementarne typy kojarzenia rozpoczynają cykl płciowy poprzez kooperatywną syntezę kwasów trisporowych (TA) przy użyciu beta-karotenu jako prekursora¹¹^,¹²^,¹³. Po wykryciu TA reagujące strzępki wegetatywne gęstnieją i stają się silnie rozgałęzionymi zygoforami¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. Zygofory kontynuują produkcję TA i wzajemnie chemoprzyciągają. U P. blakesleeanus zygofory różnicują się w podłożu i nie są łatwo widoczne na stałych podłożach agarowych¹⁷. Po nawiązaniu kontaktu zygofory przeplatają się i stają się zygoforami powietrznymi.

W miarę trwania cyklu płciowego, końcówki zygoforów przyczepiają się, a środek komórek wypycha się, tworząc strukturę podobną do pierścienia z koralowym obrzękiem u podstawy, kończąc przejście do progametangium. Końcówki komórek tworzących progametangium zaczynają się łączyć i przekształcać w gametangium. Na etapie gametangii zygofory wykazują ornamentykę przypominającą kolce. Ściana komórkowa na końcach rozpuszcza się i pojawiają się przegrody przybyszowe, wyznaczające obszar, w którym utworzy się zygospora, a zygofory działają jak szczypce przypominające suspensory¹⁸. Zygospora zostanie zabarwiona, gdy jej ściana komórkowa pogrubi się i uzyska dodatkową ozdobę przypominającą ciernie¹⁷^,¹⁸. Po uformowaniu zygospora wejdzie w okres spoczynku przed ponownym rozpoczęciem cyklu wzrostu.

Phycomyces blakesleeanus to heterotaliczny mucoromycete wyróżniający się dużymi komórkami i reagującymi na środowisko sporangioforami⁶^,⁸^,¹⁸. Organizm ten jest łatwy do wyhodowania w laboratorium, a części cyklu płciowego prowadzące do powstania zygospor można zaobserwować w ciągu 8-10 dni. Jako model, P. blakesleeanus został przebadany pod kątem jego zdolności do wykrywania światła w swoim otoczeniu¹⁷^,¹⁹. Łatwość uprawy i zdolność do wywoływania krycia sprawiły, że był to idealny model do badania mechanizmu stojącego za jego zdolnością do postrzegania światła²⁰; Odkrycia te zwróciły również uwagę na ewolucyjne zachowanie mechanizmów wykrywania światła u grzybów. Wykazano, że u P. blakesleeanus światło hamuje rozmnażanie płciowe poprzez te konserwatywne białka wyczuwające światło²¹. Ostatnie ewolucyjne badania rozwojowe miały na celu zrozumienie, jakie geny przyczyniają się do różnicowania komórek podczas cyklu płciowego P. blakesleeanus⁶. Korelacja morfogenezy z określonymi genami wymagałaby wyizolowania wystarczającej ilości tkanek o tych samych typach komórek do przeprowadzenia badań ekspresji genów.

Chociaż protokoły indukowania krycia P. blakesleeanus w warunkach laboratoryjnych zostały już wcześniej opisane, niektóre wspominają tylko o rodzaju pożywki do użycia i odpowiednich szczepach¹⁸. Niektóre opisy protokołów nie zawierają konkretnych formuł pożywki, ale opisują, gdzie umieścić przypuszczalne komplementarne typy kojarzenia na płycie¹⁰. Nowsze protokoły pozwalają na zwiększoną produkcję zygospor poprzez mieszanie zarodników każdego typu kojarzenia i zaszczepianie mieszaną zawiesiną zarodników²¹ lub umieszczanie typów kojarzących w pewnej odległości od siebie i pozostawianie kultury do inkubacji przez 20 dni²². Podejścia te są przydatne do generowania amp zróżnicowanych komórek, w szczególności zygospor, ale mogą nie być odpowiednie do obserwacji przebiegu rozwoju w czasie lub selekcji struktur płciowych, które tworzą się przed zygosporami do transkryptomiki pojedynczej komórki. Inne prace zajęły się tym problemem, umieszczając komplementarne typy kojarzenia w pewnej odległości od siebie na pożywkach stałych, aby umożliwić obserwację szeregowych przejść morfologicznych w miarę rozpoczynania się cyklu płciowego⁶^,²²^,²³. Podobnie jak w przypadku innych grzybów, grzybnia P. blakesleeanus rozszerza się promieniście²⁴^,²⁵. Dlatego, gdy komplementarne typy krycia są uprawiane na tej samej szali, różne części ich grzybni będą się stykać w różnym czasie. Ponieważ kontakt między grzybnią jest jednym z pierwszych kroków w cyklu płciowym P. blakesleeanus, oznacza to, że różne części grzybni oddziałującej na siebie będą na różnych etapach cyklu płciowego. Ta asynchroniczność może mieć wpływ na wynik badania ekspresji genów, tak że jeśli zróżnicowane typy komórek są mieszane i mają różne programy ekspresji genów, trudno byłoby przypisać rolę genu jednej konkretnej strukturze.

Oprócz wartości P. blakesleeanus jako modelu do badania genów zaangażowanych w morfogenezę podczas cyklu płciowego, jego energiczny wzrost i zdolność do różnicowania się w ciągu kilku dni sprawiają, że jest to idealny grzyb do szkolenia studentów zainteresowanych wczesnymi rozchodzącymi się grzybami strzępkowymi oraz do wykorzystania w klasie licencjackiej, aby dowiedzieć się o różnorodności grzybów i ich procesach rozwojowych. Przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje trzy stężenia dwóch różnych typów pożywek w celu zademonstrowania wpływu dostępności składników odżywczych na pojawienie się grzybni, indukcję krycia i wzbogacenie dla określonych struktur płciowych, zarówno do oceny ilościowej, obserwacji, jak i potencjalnej transkryptomiki pojedynczej komórki.