Artykuł metodologiczny

Bezpośrednia kriosekcja głów Drosophila w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67791

⸱

7 lutego 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2Department of Neurobiology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 3UAB Nathan Shock Center

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Streszczenie

Immunologiczne barwienie mózgów Drosophila melanogaster jest niezbędne do zbadania mechanizmów stojących za złożonymi zachowaniami, obwodami neuronalnymi i wzorcami ekspresji białek. Tradycyjne metody często wiążą się z wyzwaniami, takimi jak przeprowadzanie skomplikowanej sekcji, utrzymywanie integralności tkanek i wizualizacja określonych wzorców ekspresji podczas obrazowania w wysokiej rozdzielczości. Przedstawiamy zoptymalizowany protokół, który łączy kriosekcję z barwieniem fluorescencyjnym i barwieniem immunologicznym. Metoda ta poprawia zachowanie tkanek i klarowność sygnału oraz zmniejsza potrzebę pracochłonnej sekcji w celu obrazowania mózgu Drosophila. Metoda obejmuje szybką preparację, optymalne utrwalenie, krioprotekcję i kriosekcję, a następnie barwienie fluorescencyjne i barwienie immunologiczne. Protokół znacznie zmniejsza uszkodzenia tkanek, zwiększa penetrację przeciwciał i daje ostre, dobrze zdefiniowane obrazy. Pokazujemy skuteczność tego podejścia poprzez wizualizację określonych populacji neuronów i białek synaptycznych z wysoką wiernością. Ta wszechstronna metoda pozwala na analizę różnych markerów białkowych w mózgu dorosłego człowieka w wielu płaszczyznach Z i może być dostosowana do innych tkanek i organizmów modelowych. Protokół stanowi niezawodne i skuteczne narzędzie dla badaczy prowadzących wysokiej jakości badania immunohistochemiczne w neurobiologii Drosophila. Szczegółowa wizualizacja tej metody ułatwia kompleksową analizę neuroanatomii, patologii i lokalizacji białek, co czyni ją szczególnie cenną dla badań neurobiologicznych.

Wprowadzenie

Złożone zachowania, począwszy od interakcji społecznych1, percepcja sensoryczna i przetwarzanie2, learning3, do movement4 są napędzane przez mózg. Zaburzenia neurologiczne są również coraz bardziej powszechne i przewiduje się, że będą się nasilać z czasem5,6. Bardzo ważne jest zbadanie, jak działa mózg zarówno w zdrowiu, jak i chorobie. Główny dogmat biologii molekularnej sugeruje, że jedną z najważniejszych funkcji jednostek biologicznych są białka7, a zarówno to, ile i gdzie są one wyrażane, mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia, jak działa mózg.

Drosophila melanogaster, powszechnie znana jako muszka owocowa, jest bardzo cennym modelem do badania funkcji mózgu w warunkach starzenia się i patofizjologicznych8. Dostępność zaawansowanych narzędzi genetycznych u Drosophila umożliwia naukowcom zbadanie funkcji prawie każdego białka9, z obszernymi bibliotekami genetycznymi dla prawie każdego genu łatwo dostępnymi10. W połączeniu z krótką żywotnością i wysokim wskaźnikiem reprodukcji, cechy te sprawiają, że Drosophila jest wyjątkowym modelem do badań nad mózgiem11. Doprowadziło to do znaczących osiągnięć, w tym opracowania kompletnej mapy mózgu fly12, a nawet przyczyniło się do przyznania Nagrody Nobla za wyjaśnienie mechanizmów neuronalnych rytmów okołodobowych i zegarów molekularnych13,14,15. W rezultacie, Drosophila pozostaje potężnym i wszechstronnym systemem, który naprzód nasze zrozumienie funkcji mózgu i dostarcza bezprecedensowego wglądu w procesy neurologiczne.

Immunohistochemia i immunofluorescencja są podstawowymi narzędziami do badania ekspresji białek in situ. W przeciwieństwie do technik takich jak Western Blot, która pozwala tylko na analizę półilościową i jest zwykle przeprowadzana w bulk tissue16, lub skomplikowanych i kosztownych technik, takich jak spektrometria mas do pomiaru poziomu białka17, immunohistochemia jest stosunkowo prosta i pozwala zarówno na ilościowe określenie ekspresji białka, jak i na pomiar lokalizacji białka w tkance lub komórce. Co ważne, immunohistochemia fluorescencyjna może być również multipleksowana w celu pomiaru wielu białek w celu identyfikacji określonych typów komórek i tkanek lub odpowiedzi na wiele pytań w tej samej tkance. Ponadto utrwalenie tkanek może umożliwić porównania w różnych warunkach eksperymentalnych, genotypach, wieku i okołodobowych punktach czasowych. Jednak immunohistochemia fluorescencyjna może być trudna, a na jakość obrazu może wpływać wiele czynników. Ten zoptymalizowany protokół kriosekcji i barwienia immunologicznego dla mózgów Drosophila ma na celu poprawę obrazowania w wysokiej rozdzielczości poprzez poprawę zachowania tkanek, penetracji przeciwciał oraz wizualizacji populacji neuronów i markerów białkowych. Opracowany w celu sprostania wyzwaniom związanym z tradycyjnymi metodami, takim jak złożona sekcja, uszkodzenie tkanek i ograniczona rozdzielczość obrazowania związana z montażami całego mózgu18. Protokół ten łączy kriosekcję z barwieniem fluorescencyjnym, aby zapewnić integralność strukturalną i ostre obrazowanie w wielu płaszczyznach z. W porównaniu z preparatami typu full-mount, metoda ta minimalizuje zniekształcenia, ułatwia głębszą dyfuzję przeciwciał i zapewnia przejrzyste analizy lokalizacji neuroanatomicznej i białkowej18. Jego wszechstronność pozwala na adaptację do innych tkanek i organizmów modelowych, oferując niezawodne i wydajne narzędzie do badań neurobiologicznych19,20. Można go dostosować do prawie każdego białka i zastosować do badania dowolnego stanu, choroby lub modelu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie sprzętu

  1. Upewnij się, że kriostat jest włączony i ustawiony na -20 °C. Włącz podgrzewacz do szkiełek lub mały inkubator, upewniając się, że jest ustawiony na 37 °C.
    UWAGA: Na tym etapie oznakowane preparaty można umieścić na podgrzewaczu lub inkubatorze i pozostawić na czas nieokreślony do momentu pokrojenia.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 50 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), pH 7,4, z 10x bulionu PBS. Przygotować roztwór 4% paraformaldehydu w PBS o końcowej objętości 10 ml.
  2. Przygotuj roztwór czyszczący składający się z 70% etanolu w wodzie w butelce z rozpylaczem. Przygotuj roztwór blokujący (3% albumina surowicy bydlęcej (BSA) w soli fizjologicznej buforowanej Tris z 20x bulionu). Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała (rozcieńczenie zależy od eksperymentu). W tym przypadku stosuje się rozcieńczenie 1:250 mysiego przeciwciała ApoE w 3% BSA w TBS.
  3. Przygotować drugorzędowy roztwór przeciwciał (rozcieńczenie zależy od doświadczenia). W tym przypadku stosuje się rozcieńczenie 1:500 mąki Alexa Flour 750 A21037 Goat Anti-Mouse Secondary w 3% BSA w TBS.
  4. Przygotuj fluorescencyjny roztwór bejcy (rozcieńczenie zależy od eksperymentu). Tutaj przygotowuje się 5 μg/ml roztworu czerwieni nilowej w PBS.
    UWAGA: Wszystkie roztwory, w szczególności fluorescencyjne, należy przechowywać w lodówce i przechowywać w ciemnym pojemniku chłodniczym. Powinny być również doprowadzone do temperatury pokojowej tuż przed użyciem.

3. Pobieranie tkanek

  1. Po uzyskaniu much w fiolkach do leżakowania, otwórz zawór na macie CO2 i szybko zrzuć muchy na matę, aby uniknąć ucieczki. Poczekaj, aż muchy staną się w większości nieprzytomne, przestając się poruszać. Pozycja odbywa się pod mikroskopem SZ61, przesuwając matę pod soczewką obiektywu. Dostosuj powiększenie i ostrość tak, aby muchy były wyraźnie widoczne i wygodne do ścięcia.
    UWAGA: Muchy użyte w tym przykładzie to ELAV/+ i ELAV>ApoE4
  2. Włóż nożyczki sprężynowe między klatkę piersiową a głowę, mocno ściśnij i odetnij głowę od 5 do 10 głów much na grupę eksperymentalną. Niewykorzystane muchy należy umieścić z powrotem w leżakującej fiolce.
    UWAGA: Jeśli istnieje obawa dotycząca penetracji utrwalacza, można wykonać małe nacięcie z tyłu głowy, aby umożliwić zwiększoną penetrację środka utrwalającego w kroku 4.1.
  3. Za pomocą pędzla delikatnie umieść głowice w oznakowanych probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie, aż do zebrania grup ELAV/+ i ELAV>ApoE4.

4. Utrwalenie całej tkanki

  1. Wyjmij probówki z lodu i odpipetuj 100 μl 4% roztworu paraformaldehydu w PBS do każdej probówki, upewniając się, że wszystkie głowice są zanurzone w roztworze. Jeśli główki przylegają do ścianek rurki i unikają kontaktu z roztworem, użyj szczotki, aby delikatnie popchnąć je w dół lub lekko postukaj w poziomą powierzchnię, aby zapewnić odpowiedni kontakt.
  2. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej przy użyciu średniego ustawienia na 15 minut. Po 15 minutach wyrzuć roztwór paraformaldehydu i zastąp go 1x PBS na 10 minut, upewniając się, że wszystkie głowice są zanurzone w roztworze.
  3. Za każdym razem odrzucając poprzedni roztwór, przemyj chusteczkę PBS 2x przez 10 minut każde, w sumie 3 prania.
  4. Po ostatnim umyciu przenieś głowice do 10% roztworu sacharozy w PBS, upewniając się, że głowice są zanurzone w probówce. Pozostaw je na noc, aby uzyskać optymalne nasycenie.
    UWAGA: Jeśli pożądane jest obrazowanie tego samego dnia, napar sacharozy można zmniejszyć; Jednak efekty krioprotekcji również zostaną proporcjonalnie zmniejszone.

5. Przygotowanie formy

  1. Napełnij oznakowaną formę w około 50% związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), umożliwiając mu rozprzestrzenienie się na wszystkie 4 rogi formy.
  2. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść głowice na powierzchni OCT w formie. Umieszczając wiele grup eksperymentalnych w tej samej formie, upewnij się, że grupy te są oddzielone w formie, aby zapobiec pomyłkom.
    UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec rozcieńczeniu związku OCT poprzez zanieczyszczenie wcześniejszym roztworem sacharozy za pomocą szczotki. Ponadto umieszczenie głęboko w OCT za pomocą pędzla może spowodować powstanie wielu pęcherzyków wokół głów. Unikaj tych błędów, aby zapobiec późniejszym problemom z sekcjami.
  3. Za pomocą końcówki kleszczy powoli dociśnij każdą głowę do dna formy z oczami skierowanymi do dołu. Ta orientacja jest wybierana dla cięcia przez płaszczyznę koronalną.
  4. Podczas tego procesu unikaj nakłuwania lub zgniatania główek o dno formy. Wyrównaj wszystkie głowice w wymiarach X, Y i Z tak, aby każda sekcja zawierała jednocześnie wszystkie obiekty. Zapewnij powolne zanurzenie, aby zmniejszyć tworzenie się pęcherzyków powietrza.
  5. Gdy wszystkie głowice są prawidłowo wyrównane, ostrożnie umieść formy bezpośrednio w temperaturze -20 °C, aby zamrozić.
    UWAGA: Jeśli okaże się, że wyrównanie główek jest znacznie przesunięte podczas cięcia, rozważ użycie suchego lodu lub ciekłego azotu do początkowego natychmiastowego zamrażania formy.
  6. Gdy forma w większości zamarznie, napełnij pozostałą część OCT i pozwól jej zamarznąć przed długotrwałym przechowywaniem w temperaturze - 80 °C.

6. Kriosekcja form

UWAGA: Generalnie zaleca się przygotowanie i wycięcie pustej formy przed cięciem eksperymentalnych form grupowych. Pozwala to na zapewnienie prawidłowej funkcjonalności koła, ostrza i szkła stabilizującego bezpośrednio przed przecięciem tkanki.

  1. Przymocuj wiertło uchwytu do formy, nakładając dużą ilość OCT na formę i umieszczając wiertło na górze, dociskając je płasko. Pozostaw to do całkowitego zamrożenia w kriostacie, zwykle w ciągu 5 minut.
  2. Wyjmij wiertło i blok OCT z formy i umieść je w uchwycie, upewniając się, że forma pozostaje prawidłowo zorientowana od góry do dołu. Dokręć klucz do uchwytu wiertarskiego, aż wiertło będzie bezpieczne.
  3. Dopasuj blok do ostrza za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu.
  4. Ustaw szerokość przekroju na 20 μm. Pokrój każdy plasterek powolnym, ale konsekwentnym ruchem, pozwalając szkłu zabezpieczającemu przechwycić każdy plasterek. Uchwyć sekcje za pomocą rozgrzanych slajdów, dotykając zjeżdżalni bliższą krawędzią sekcji i pozwalając sekcji wznieść się na slajd. Na prowadnicy o standardowym rozmiarze (25 mm x 75 mm x 1 mm) można zmieścić do ośmiu sekcji, jeśli są one odpowiednio rozmieszczone.
    UWAGA: Przy wyborze sekcji do zebrania należy dokonać wyboru. W wyniku orientacji osadzania wcześniejsze sekcje będą pochodzić z przodu, a późniejsze z tylnych części głowy. W związku z tym, jeśli zainteresowanie leży w jednym konkretnym obszarze bardziej niż w innym, wybór sekcji można odpowiednio dostosować. Alternatywnie, wszystkie skrawki można zebrać na wielu szkiełkach, aż nie pozostanie żadna tkanka.
  5. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę.

7. Barwienie i IHC

UWAGA: Dla tego protokołu, metoda szczegółowo opisze IHC przy użyciu niesprzężonego przeciwciała pierwszorzędowego. Przeciwciała sprzężone z fluorochromem lub inne barwienia fluorescencyjne, które można wykonać w jednym etapie, powinny być stosowane razem z przeciwciałem drugorzędowym, jeśli oba mają być stosowane razem.

  1. Bezpośrednio po okresie schnięcia usuń OCT z krawędzi szkiełka za pomocą żyletki, pozostawiając miejsce na hydrofobową obwódkę. Narysuj hydrofobową obwódkę na każdym slajdzie za pomocą markera. Pozostaw do wyschnięcia na 5 minut.
  2. Umyj wszystkie szkiełka 3 razy po 5 minut za pomocą PBS, delikatnie pipetując na wierzchu szkiełka, unikając pipetowania bezpośrednio na chusteczkę, jeśli to możliwe.
    UWAGA: Najbardziej przydatna jest tutaj pipeta o pojemności 1000 μl. Szkiełko o standardowej wielkości z chusteczką powinno być całkowicie pokryte 750 μl dowolnego roztworu. Można również stosować stojaki ślizgowe i kubełka.
  3. Po umyciu szkiełek należy nałożyć na szkiełka pipetą 3% BSA w roztworze blokującym TBS. Pozostawić do inkubacji na 30 minut.
  4. Odrzucić roztwór blokujący i odpipetować pierwotny roztwór przeciwciała na szkiełka. W tym przypadku należy rozcieńczyć SC-13521 ApoE w stosunku 1:250 w 3% BSA w TBS. Pozostawić przeciwciało do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Używaj wilgotnych chusteczek higienicznych lub ręczników papierowych, aby zapobiec wysychaniu roztworu przez noc.
  5. Wyrzuć przeciwciało pierwotne i za pomocą pipety przemyj 3 razy przez 5 minut każdy PBS.
  6. Dodać drugorzędowy roztwór przeciwciała. W tym przypadku należy rozcieńczyć AF 750 Goat Anti-Mouse w stosunku 1:500 w połączeniu ze stężeniem 5 μg/ml czerwieni nilowej, a wszystko to w 3% BSA w TBS. Pozostawić do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Jednocześnie inkubujemy barwienie fluorescencyjne i przeciwciało drugorzędowe w tym samym buforze, 3% BSA w TBS. Jest to preferowane, o ile nie ma znanych konfliktów między tymi dwoma odczynnikami. Jeśli występują konflikty, inkubuj oddzielnie i wykonaj dodatkowe 3 płukania między inkubacjami.
  7. Umyj szkiełka 3 razy PBS przez 5 minut każda. Po ostatnim umyciu pozostaw niewielką ilość PBS na szkiełku.

8. Montaż i przygotowanie do obrazowania

  1. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl równomiernie rozprowadź 3-5 kropli utwardzającego podłoża montażowego zawierającego DAPI (0,9 μg/ml), unikając bezpośredniego upuszczania na tkankę.
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku podstawowym, unikając tworzenia się pęcherzyków powietrza.
    UWAGA: Użycie kleszczy może w tym pomóc, pozwalając szkiełku nakrywkowemu przesunąć się blisko powierzchni szkiełka przed ostatecznym zwolnieniem.
  3. Ze świeżo zamontowanymi prowadnicami należy obchodzić się ostrożnie i przechowywać je płasko do całkowitego wyschnięcia. Uszczelnij szkiełka za pomocą lakieru do paznokci, jeśli przewiduje się długotrwałe przechowywanie.
  4. Rób zdjęcia tak szybko, jak to możliwe, aby uniknąć zaniku fluorescencyjnego.

9. Akwizycja obrazu

UWAGA: Do przechwytywania obrazów, użycie oprogramowania Olympus Cell Sense Dimensions będzie szczegółowo opisane.

  1. Przed obrazowaniem sprawdź szkiełka i przetrzyj je 70% etanolem w roztworze wodnym. Jeśli slajdy są obrazowane bezpośrednio po zamontowaniu, należy zachować szczególną ostrożność podczas czyszczenia, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego. Pozostaw powierzchnie szkiełka i szkiełka nakrywkowego do wyschnięcia na 5 minut przed obrazowaniem.
  2. Wybierz każdy żądany kanał do przechwytywania, w tym przypadku kanały dla DAPI, Nile Red i AF 750.
    1. Wybierz żądane powiększenie zgodnie z poniższym opisem. Wybór powiększenia zależy od eksperymentu; Tutaj użyj 10-krotnego powiększenia.
      UWAGA: Wszystkie powiększenia są użyteczne, w tym soczewki olejne. W razie potrzeby nałóż olejek immersyjny na powierzchnię szkiełka.
    2. Dla każdego kanału skalibruj odpowiednie czasy ekspozycji na podstawie najjaśniejszych fluoryzujących obiektów w eksperymencie. Unikaj prześwietlenia, generując jak najjaśniejszy obraz.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, dwoma głównymi czynnikami wpływającymi na słabe uchwycenie procesu są prześwietlenie, powodujące utratę definicji, oraz zbyt duża ilość sygnału tła, który jest trudny do oddzielenia od prawdziwego sygnału. Ponadto ekspozycje muszą być ustawiane niezależnie dla każdego używanego unikalnego powiększenia.
    3. Wybierz folder, w którym chcesz zapisać i nazwij scalone obrazy w menu. Po przechwyceniu wszystkie obrazy będą znajdować się w tym folderze i będą nosiły zdefiniowaną tutaj nazwę.
    4. Rób zdjęcia, najpierw ustawiając ostrość na obiekcie w kanale, który pozwala na uzyskanie najlepszego punktu ogniskowego, a następnie rozpocznij zbieranie. Utrzymuj procedurę skupiania się na każdym obiekcie w tym samym kanale, aby zachować spójność w całym eksperymencie.
    5. Uchwyć wszystkie grupy eksperymentalne użyte do późniejszych porównań tego samego dnia, aby uniknąć rozpadu fluorescencji między porównywanymi grupami.

10. Kwantyfikacja

UWAGA: Kwantyfikacja może być przeprowadzona za pomocą różnych programów. W tym miejscu odniesiono się do zastosowania Olympus CellSense Dimensions.

  1. Po zakończeniu kolekcji przejrzyj obrazy. Usuń sekcje, które mają imperfekcje lub artefakty sekcji, z folderu kwantyfikacji. Wybierz obrazy, które odzwierciedlają cel kwantyfikacji. Przykładami niedoskonałości są pęcherzyki, rozdarte skrawki, nakładające się na siebie tkanki oraz kurz lub zanieczyszczenia.
    1. Aby wybrać odpowiednie obrazy, upewnij się, że wszystkie obrazy przedstawiające tkankę mózgową są używane do oceny ilościowej, aby odzwierciedlić ogólną ekspresję w mózgu. Alternatywnie, użyj obrazów odzwierciedlających tylko przednią, środkową lub tylną część mózgu, aby uzyskać wgląd w różnice w ekspresji w tych obszarach.
  2. W menu zliczania i mierzenia określ parametry zainteresowania i ich granice dla kwantyfikacji obrazów.
    1. W celu ilościowego określenia wyrażenia ApoE przez porównanie średnich wartości intensywności należy wybrać wartości progowe tak, aby wszystkie piksele dla tego kanału były brane pod uwagę (0-nieskończoność). Ponadto obrysuj obszary zainteresowania za pomocą dostępnych narzędzi do rysowania.
  3. Uruchom liczenie i pomiar w partii dla wszystkich plików lub indywidualnie dla każdego obrazu.
    1. W przypadku przetwarzania wsadowego zapisz ustawienia i wykonanie kwantyfikacji, a następnie wybierz folder, w którym chcesz przeprowadzić kwantyfikację. Przetwarzanie w partii jest dostępne za pośrednictwem karty menedżera makr i znacznie przyspiesza przepływ pracy.
  4. Wyeksportuj tabelę danych do arkusza kalkulacyjnego w celu wykreślenia. Aby to zrobić, użyj menu wyników zliczania i mierzenia podczas automatycznego otwierania lub eksportowania do tabeli podczas wykonywania w partii. Te tabele danych będą zawierać wszystkie wybrane parametry wybrane w kroku 10.2.
  5. W przypadku analizy statystycznej i sporządzania wykresów należy wykreślać dane za pomocą arkusza kalkulacyjnego bezpośrednio lub za pomocą innego oprogramowania. Znajomość wybranego oprogramowania jest kluczem do wygenerowania dokładnej reprezentacji wyników eksperymentu. W tym przypadku bezwzględne wartości intensywności ekspresji ApoE w mózgu mutanta zostały znormalizowane do kontroli, a następnie wykreślone za pomocą pryzmatu GraphPad.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opisana powyżej metoda umożliwia niezawodny obrazowanie fluorescencyjne mózgów dorosłych much bez konieczności przeprowadzania żmudnej sekcji. Metoda ta, przedstawiona w prosty sposób na Rysunku 1, jest przejrzysta i może być szybko wykonana, jeśli wszystkie okazy, sprzęt i materiały są łatwo dostępne. Alternatywnie, dzięki przechowywaniu w temperaturze -80 °C na etapie formowania w OCT, okazy mogą być zachowane do użytku przez wiele tygodni. Badacze nie wyma...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy protokół precyzyjnego obrazowania fluorescencyjnego głów Drosophila poddanych kriosekcji. Jest to proste podejście, które ma kilka ważnych pozytywów. Mianowicie, metody są na tyle proste, że każdy, kto ma podstawowe przeszkolenie w zakresie bezpieczeństwa laboratoryjnego, może je ukończyć, są one w stanie dostosować się do pomiaru ekspresji dowolnego białka, dla którego istnieją wysokiej jakości przeciwciała, i pozwalają na precyzyjny pomiar zarówno tego, jak bardzo wyrażane jest biał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy członkom laboratorium Melkani za pomoc w postaci cennych informacji zwrotnych dotyczących rozwoju protokołu. Muchy Elav-Gal4 (BL#458) i UAS-ApoE4 (BL#76607) zostały pozyskane z Bloomington Drosophila Stock Center (Bloomington, IN, USA). Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) AG065992 i RF1NS133378 dla GCM. Prace te są również wspierane przez fundusze UAB Startup 3123226 i 3123227 G.C.M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Pipeta 1000 uLEppendorf3123000063
1000 uL Końcówki do pipetOlympus Plastics23-165R
10X sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)FisherJ62036.K7ph=7,4
200-procentowy etanolDecon Laboratories64-17-5
20X Buforowana sól fizjologiczna TrisThermo ScientificJ60877.K2pH = 7,4
AF750 Kozie przeciwciało wtórne przeciw myszomAlexa FluorA21037
Szkło antyrolkoweIMEBAR-14047742497
Pierwszorzędowe przeciwciało pierwotne myszy ApoESanta CruzSC13521
Albumina surowicy bydlęcejFisher9048-46-8
Probówki wirówkowe 1,5 mlFisher05-408-129
Naładowane szkiełkaGlobe Scientific1415-15
Formy do kriosekcjiFisher2363553
CryostatLeicaCM 3050 S
Cryostat BladesCL SturkeyDT554N50
Woda
Suchy lód??????
Cienkie kleszczeFine Science Tools11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
Hartowanie podłoża montażowego z DapiVectashieldH-1800
Kimwipes Kimtech34120
Mikroskop OlympusSZ61
Nil Czerwony SigmaN3013
Optymalna temperatura cięcia ZwiązekFisher4585
Wytrząsarka orbitalnaOHAUSSHLD0415DG
Paraformaldehyd 20%Mikroskopia elektronowa Sciences15713
ŻyletkiGravey#40475
Nożyczki sprężynoweFine Science Tools15000-10
SacharozaFisherS5-500
destylowana

Bibliografia

  1. Fabbri-Destro, M., Rizzolatti, G. Mirror neurons and mirror systems in monkeys and humans. Physiology. 23, 171-179 (2008).
  2. Faust, T. E., Gunner, G., Schafer, D. P. Mechanisms governing activity-dependent synaptic pruning in the developing mammalian CNS. Nat Rev Neurosci. 22, 657-673 (2021).
  3. Roozendaal, B., McEwen, B. S., Chattarji, S. Stress, memory and the amygdala. Nat Rev Neurosci. 10, 423-433 (2009).
  4. Arber, S., Costa, R. M. Networking brainstem and basal ganglia circuits for movement. Nat Rev Neurosci. 23, 342-360 (2022).
  5. GBD 2019 Dementia Forecasting Collaborators. Estimation of the global prevalence of dementia in 2019 and forecasted prevalence in 2050: an analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet Public Health. 7, e105-e125 (2022).
  6. Huang, Y., Li, Y., Pan, H., Han, L. Global, regional, and national burden of neurological disorders in 204 countries and territories worldwide. J Glob Health. 13, 04160(2023).
  7. Crick, F. Central dogma of molecular biology. Nature. 227, 561-563 (1970).
  8. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Dis Model Mech. 9, 235-244 (2016).
  9. Hales, K. G., Korey, C. A., Larracuente, A. M., Roberts, D. M. Genetics on the Fly: A primer on the Drosophila model system. Genetics. 201, 815-842 (2015).
  10. Larkin, A., et al. FlyBase: updates to the Drosophila melanogaster knowledge base. Nucleic Acids Res. 49, D899-D907 (2021).
  11. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. Int J Mol Sci. 10, 407-440 (2009).
  12. Winding, M., et al. The connectome of an insect brain. Science. 379, eadd9330(2023).
  13. Bargiello, T. A., Jackson, F. R., Young, M. W. Restoration of circadian behavioural rhythms by gene transfer in Drosophila. Nature. 312, 752-754 (1984).
  14. Zehring, W. A., et al. P-element transformation with period locus DNA restores rhythmicity to mutant, arrhythmic Drosophila melanogaster. Cell. 39, 369-376 (1984).
  15. Huang, R. C. The discoveries of molecular mechanisms for the circadian rhythm: The 2017 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Biomed J. 41, 5-8 (2018).
  16. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4, 429-434 (2012).
  17. Ong, S. E., Foster, L. J., Mann, M. Mass spectrometric-based approaches in quantitative proteomics. Methods. 29, 124-130 (2003).
  18. Behnke, J. A., Ye, C., Moberg, K. H., Zheng, J. Q. A protocol to detect neurodegeneration in Drosophila melanogaster whole-brain mounts using advanced microscopy. STAR Protoc. 2, 100689(2021).
  19. Moraes, R. C. M., et al. Apolipoprotein E induces lipid accumulation through Dgat2 that is prevented with time-restricted feeding in Drosophila. Genes. 15 (11), 1376(2024).
  20. Roth, J. R., et al. Rapamycin reduces neuronal mutant huntingtin aggregation and ameliorates locomotor performance in Drosophila. Front Aging Neurosci. 15, 1223911(2023).
  21. Currier, T. A., Pang, M. M., Clandinin, T. R. Visual processing in the fly, from photoreceptors to behavior. Genetics. 224, (2023).
  22. McKellar, C. E., Siwanowicz, I., Dickson, B. J., Simpson, J. H. Controlling motor neurons of every muscle for fly proboscis reaching. Elife. 9, (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Immunobarwienie m zgu Drosophilaprotok kriosekcjonowaniakonserwacja tkanki m zgowejobrazowanie obwod w neuronalnychlokalizacja bia ekpenetracja przeciwciazatapianie w OCTobrazowanie konfokalneanaliza neuroanatomiczna

Powiązane artykuły