Artykuł metodologiczny

Mysi model rany kłutej do badania krwotoku i stanu zapalnego w urazowym uszkodzeniu mózgu

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67797

⸱

21 lutego 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Human Life Science, Ochanomizu University, 2Kitasato University School of Frontier Engineering

W tym artykule

Podsumowanie

Uproszczone modele urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) ułatwiły rozwój podejść terapeutycznych. Protokół ten nakreśla tworzenie kory myszy z raną kłutą za pomocą igieł, umożliwiając analizę krwotoku i stanu zapalnego. Model myszy TBI z raną kłutą ma tę zaletę, że można go wykonać bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu.

Streszczenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) wynika z uszkodzeń fizycznych, często spowodowanych wypadkami lub incydentami związanymi ze sportem. Przyczyny TBI są różnorodne, w tym wstrząśnienia mózgu, stłuczenia mózgu, krwiaki i złamania czaszki. Aby odtworzyć te różne przyczyny, opracowano różne modele myszy TBI przy użyciu różnych protokołów. Fizyczne uszkodzenie mózgu prowadzi zarówno do pierwotnych, jak i wtórnych uszkodzeń mózgu, które pogłębiają utratę neuronów. Uraz pierwotny występuje natychmiast po uszkodzeniu, często z powodu krwotoku, a następnie wywołuje urazy wtórne, w tym stan zapalny wokół zmiany. Opracowanie modelu TBI odpowiedniego do oceny wydłużenia krwotoku i nasilenia stanu zapalnego ma zatem kluczowe znaczenie. Protokół ten wprowadza metodę naśladowania penetrującego uszkodzenia mózgu, określaną jako mysi model TBI z raną kłutą, w celu zbadania mechanizmów krwotoku, zapalenia i utraty neuronów związanych z patologią TBI. Model ten powstaje poprzez nakłucie czaszki i mózgu igłami i jest prosty do wykonania bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu eksperymentalnego. Dodatkowo niewielki uraz zadane korze mózgowej myszy za pomocą igły nie wpływa na zachowanie zwierzęcia po operacji. Ta funkcja pozwala naukowcom badać zlokalizowane skutki urazu mózgu bez obaw o szersze konsekwencje behawioralne. Przykładowe dane z kory mózgowej myszy zranionej kłuciem wykazują skuteczność modelu w ocenie przecieku krwi do miąższu, aktywacji gleju i produkcji cytokin zapalnych. Ponadto protokół ten ułatwia ocenę krzepliwych leków i związków przeciwzapalnych, pomagając w opracowywaniu środków terapeutycznych przeciwko TBI.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie mózgu (TBI) jest spowodowane uszkodzeniami fizycznymi, często wynikającymi z wypadków, w tym wypadków drogowych i upadków. TBI dzieli się na dwa typy: penetrujące uszkodzenie mózgu, które występuje, gdy ostry przedmiot przebija czaszkę, a także mózg, oraz zamknięte uszkodzenie mózgu, które jest spowodowane gwałtownym potrząśnięciem mózgiem wewnątrz bez przerwy w czaszce1.

Przyczyny TBI są bardzo różnorodne, w tym wstrząsy mózgu, stłuczenia mózgu, krwiaki i złamania czaszki; dlatego też modele myszy TBI zostały opracowane przy użyciu różnych protokołów, aby odtworzyć te różne przyczyny. Na przykład, powtarzający się model wstrząsu mózgu obejmuje potrząsanie mózgu, w którym myszy są blokowane kilka razy za pomocą elektromagnetycznie sterowanego gumowego impaktora2. Dodatkowo, w modelu TBI z obniżeniem wagi, silna siła zewnętrzna jest wywierana na głowę przez znormalizowane urządzenie do zmniejszania ciężaru, powodując ogniskowy uraz z nienaruszoną czaszką3. Ponadto model TBI z raną kłutą jest przygotowywany poprzez nakłucie czaszki i mózgu za pomocą igły4 (Rysunek 1A). Ponieważ opracowano kilka modeli TBI, ważne jest, aby wybrać model w oparciu o konkretną patologię, którą należy obserwować.

Uszkodzenie mózgu spowodowane uszkodzeniem fizycznym prowadzi do pierwotnych i wtórnych urazów mózgu, które dodatkowo pogłębiają utratę neuronów. Uraz pierwotny występuje natychmiast po uszkodzeniu, wynikającym z pęknięcia bariery krew-mózg (BBB), krwotoku i krwiaka. Dlatego kluczowe znaczenie ma zminimalizowanie krwotoku i rozszerzania się krwiaka, ponieważ czynniki te mogą nasilać nasilenie objawów TBI. Wtórny uraz jest wywoływany przez śródmiąższowe składniki krwi, które następnie prowadzą do stanu zapalnego wokół zmiany chorobowej5. Rokowanie po urazie mózgu zależy od dynamiki stanu zapalnego; Dlatego tak ważne jest, aby szybko złagodzić zarówno pierwotne, jak i wtórne urazy, aby uzyskać korzystne rokowanie6,7,8.

BBB składa się z perycytów, ścisłych połączeń między komórkami śródbłonka i końcami astrocytów, które współpracują ze sobą, aby ograniczyć wyciek substancji z naczyń krwionośnych w zdrowych mózgach9. W prezentowanym systemie ran kłutych dochodzi do fizycznego przerwania bariery krew-mózg. Typowe metody oceny integralności BBB obejmują barwienie immunoglobuliny G (IgG) i ocenę nieszczelności znaczników fluorescencyjnych, takich jak Evans blue i dextran10,11. Barwienie IgG oznacza składniki krwi, które wyciekają z miejsca zmiany chorobowej i osadzają się w mózgu. W miarę regeneracji bariery krew-mózg zmniejsza się wyciek składników krwi do mózgu, a złogi te są stopniowo degradowane. Dlatego barwienie IgG służy do oceny stopnia regeneracji BBB po urazie mózgu. Dodatkowo poziom wycieku dożylnie podanego znacznika do miąższu mózgu odzwierciedla powrót do zdrowia bariery krew-mózg. Metoda ta zapewnia jaśniejszą ocenę dynamiki bariery krew-mózg, ponieważ wyciek znacznika bezpośrednio wskazuje na przejście składników krwi z krwiobiegu do miąższu mózgu. Co więcej, zminimalizowanie krwotoku prowadzi do łagodniejszego urazu pierwotnego, który jest wspierany przez szybką krzepnięcie krwi i fibrynolizację w odpowiednim czasie. Dlatego ilościowe określenie ekspresji regulatorów krzepnięcia krwi i fibrynolizy jest skutecznym sposobem analizy tego procesu. Jeśli chodzi o mechanizm molekularny leżący u podstaw krzepnięcia, krwotok po uszkodzeniu mózgu jest zatrzymywany przez tworzenie fibryny. Następnie skrzeplina bogata w fibrynę jest degradowana przez tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) i aktywator plazminogenu urokinazy (uPA). W mysim modelu TBI z raną kłutą tworzenie fibryny osiąga szczyt w ciągu 1 dnia po urazie, a następnie zmniejsza się10. W ten sposób poziom regeneracji bariery krew-mózg można przewidzieć, określając ilościowo składniki krwi i wynaczynienie znacznika do miąższu mózgu, a także ekspresję czynników krzepnięcia krwi.

Metody kwantyfikacji stanu zapalnego w procesie wtórnego uszkodzenia obejmują aktywację glejową i ekspresję cytokin zapalnych. Przedłużający się stan zapalny jest wywoływany głównie przez nadmierne nagromadzenie mikrogleju i astrocytów wokół miejsca zmiany. Na przykład w modelu TBI z raną kłutą rany kłute stymulują reaktywację komórek glejowych wokół zmiany w celu usunięcia resztek komórek i składników krwi. Ta reaktywacja glejowa zwykle osiąga szczyt 3 dni po ranie kłutej12,13. Oprócz funkcji fagocytozy, reaktywowane komórki glejowe wydzielają nadmierną ilość cytokin zapalnych, co powoduje utratę neuronów wokół uszkodzenia14. Doniesiono, że osłabienie stanu zapalnego glejowego przyczynia się do korzystnego rokowania po urazie mózgu12,14. Określenie poziomu stanu zapalnego jest przydatne do oceny nasilenia i rokowania. Dlatego konieczne jest opracowanie modelu TBI odpowiedniego do oceny wydłużenia krwotoku i nasilenia stanu zapalnego. Badanie to wprowadza mysi model rany kłutej, który naśladuje penetrujące uszkodzenie mózgu, w celu zbadania mechanizmów krwotoku, stanu zapalnego i utraty neuronów w patologii TBI.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły opieki nad zwierzętami zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Ochanomizu w Japonii i zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustalonymi przez Ministerstwo Edukacji, Nauki i Kultury w Japonii. Użyto sześciotygodniowych dorosłych samic myszy C57BL/6J (20-25 g). Wszystkim myszom zapewniono ad libitum dostęp do pożywienia i wody w czystym środowisku. Szczegółowe informacje na temat stosowanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Operacja rany kłutej kory mózgowej

  1. Przygotowanie odczynników
    UWAGA: Protokół znieczulenia jest podobny do wcześniej opisanego15. Jeśli zakład dla zwierząt zaleca konkretny środek znieczulający, należy postępować zgodnie z jego instrukcjami. Wcześniej potwierdzono, że pentobarbital sodu jest skuteczny w chirurgii ran kłutych w korze mózgowej4,13,16,17.
    1. Złożony środek znieczulający MMB: Rozpuść 1,875 ml 1 mg/ml medetomidyny, 2,0 ml 5 mg/ml midazolamu i 2,5 ml winianu butorfanolu 5 mg/ml w 18,625 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby uzyskać całkowitą objętość 25 ml. Mieszanina ta będzie miała stężenie 75 mg/l medetomidyny, 400 mg/l midazolamu i 500 mg/l winianu butorfanolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 8 tygodni przed użyciem.
    2. Antagonista znieczulenia: Rozpuścić 150 μl chlorowodorku atipamezolu o stężeniu 5 mg/ml w 9,85 ml PBS, aby uzyskać całkowitą objętość 10 ml o stężeniu 75 mg/l chlorowodorku atipamezolu. Przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, do 8 tygodni przed użyciem.
  2. Przebieg zabiegu
    1. Znieczulenie myszy: Tymczasowo znieczulij myszy za pomocą papieru nasączonego roztworem inhalacyjnym izofluranu, aż zasną. Następnie wstrzyknąć 10 μl/g kombinowanego środka znieczulającego MMB dootrzewnowo za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 27 G x 3/4". Po 3-5 minutach potwierdź skuteczność znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i sprawdzając odruch prostowania.
      UWAGA: Należy zwrócić szczególną uwagę, aby nie przedawkować znieczulenia podczas stosowania roztworu do inhalacji z izofluranem.
    2. Umieść mysz na brzusznej stronie w ręczniku papierowym. Po przeniesieniu upewnij się, że mysz jest nadal znieczulona, szczypiąc palec u nogi.
    3. Ogol sierść na skórze w okolicy potylicznej. Wysterylizuj futro z tyłu głowy myszy 70% etanolem za pomocą bawełnianego wacika. Chwyć skórę potyliczną kleszczami i wykonaj nacięcie o szerokości 1,0-1,5 mm, aby odsłonić kość potyliczną bez uszkadzania czaszki lub jakiegokolwiek narządu. Delikatnie i powoli otwórz nacięcie, aby obserwować granicę między korą mózgową a móżdżkiem przez czaszkę (Rysunek 1B).
      UWAGA: Upewnij się, że nie dojdzie do uszkodzenia czaszki lub mózgu w przypadku myszy bez rany.
    4. Kraniotomia myszy: Utwórz mały otwór w prawej półkuli kości potylicznej za pomocą igły 19 G x 1•1/2". Delikatnie obrócić igłę, aby utworzyć punkt wkłucia do igłowania ran kłutych, uważając, aby nie uszkodzić miąższu mózgu. Otwór powinien być umieszczony w środku prawej półkuli linii międzyusznej między lambdą a krawędzią (Rysunek 1B). Otwór ten służy jako prowadnica do wprowadzania igły do ran kłutych w kolejnym kroku.
    5. Rana kłuta: Włóż igłę 27 G x 3/4" z punktu wprowadzenia i dźgnij korę mózgową wzdłuż osi ostrocaudal (Rysunek 1B, C). Igłę wprowadza się, aż zetknie się z przednią częścią czaszki, a następnie delikatnie wycofuje. Odpowiednia głębokość to taka, na której igła może być widoczna przez powierzchnię kory mózgowej. Lewa strona kory mózgowej jest używana jako nieuszkodzona kontrola.
    6. Zszyj nacięcie skóry za pomocą nylonowego szwu 3-0 z okrągłą igłą 1/2.
    7. Podawać dootrzewnowo 10 μl/g antagonisty znieczulenia w postaci złożonego środka znieczulającego MMB. Mysz powinna być w stanie chodzić w ciągu 8-16 godzin po wstrzyknięciu antagonisty znieczulenia.

2. Ocena krwotoku i rekonwalescencji po rozpadzie BBB

  1. Barwienie immunoenzymatyczne rannego kłucie części mózgu pod kątem wycieku IgG u myszy
    UWAGA: W tym przypadku użyto zamrożonych skrawków mózgu montowanych na szkiełku. Swobodnie unoszące się zamrożone sekcje mózgu są również odpowiednie dla tego protokołu.
    1. Znieczulenie myszy: Wywołaj znieczulenie, umieszczając mysz w pobliżu papieru nasączonego roztworem inhalacyjnym izofluranu, aż zaśnie. Następnie natychmiast podać 100 μl/kg znieczulonego MMB dootrzewnowo. Efekt znieczulenia potwierdź uszczypnięciem palca u nogi i odruchem prostującym.
    2. Umieść mysz na plecach i przypnij obie ręce i stopy do deski preparcyjnej.
    3. Torakotomia myszy: Chwyć skórę brzucha za pomocą kleszczy i wykonaj 1,0-1,5 cm nacięcie przez skórę i otrzewną, aby odsłonić klatkę piersiową. Ostrożnie otwórz klatkę piersiową nożyczkami, unikając uszkodzenia serca, aby odsłonić je do perfuzji serca.
    4. Zespolenie perfuzji serca: Przygotuj perystaltyczną pompę perfuzyjną i przymocuj rurkę z igłą 19 G x 1•1/2" na jednym końcu. Napełnij probówkę PBS, włączając pompę przed użyciem. Następnie, podczas pracy pompy, włóż końcówkę igły do lewej komory i zabezpiecz ją kleszczami. Wykonaj nacięcie 0,5-1,0 mm w prawym przedsionku. Wykonuj mysz < sup class="xref">18 z szybkością 4-6 ml / min przez 5 minut z co najmniej 20 ml PBS w celu usunięcia krwi.
    5. Zatrzymać pompę i przenieść probówkę do roztworu 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS. Uruchom ponownie pompę z szybkością 4-6 ml/min przez 5 minut z co najmniej 20 ml 4% PFA w PBS w celu utrwalenia18.
      UWAGA: Jeśli pompa nie jest dostępna, możliwe jest również użycie strzykawki o pojemności 50 ml z igłą 19 G x 1•1/2" do perfuzji.
    6. Rozwarstwienie mózgu: Umieść mysz na jej brzusznej stronie na desce sekcyjnej i odsłoń czaszkę, wykonując nacięcie w linii środkowej skóry od okolicy potylicznej do nosa. Ostrożnie całkowicie odsłaniaj mózg, usuwając czaszkę nożyczkami, uważając, aby nie uszkodzić mózgu. Podnieś mózg za pomocą zakrzywionych kleszczy i przenieś go do 15-mililitrowej probówki wypełnionej 10 ml 4% PFA w PBS.
    7. Wypreparowany mózg należy inkubować przez noc w 4% PFA w PBS w temperaturze 4 °C w celu całkowitego utrwalenia. Następnie inkubuj mózg przez noc w 10 ml 15% sacharozy w PBS i przenieś go do 10 ml 30% sacharozy w PBS na dodatkowy dzień na huśtawce. Ta stopniowa wymiana sacharozy pomaga zapobiegać uszkodzeniom tkanek przez lód, gdy mózg jest później przechowywany w zamrażarce.
    8. Osadzanie mózgu: Osadź mózg koronalnie w podłożu osadzającym w formie do zatapiania tkanek, a następnie zamroź za pomocą 2-metylobutanu z suchym lodem19.
    9. Zamrożone skrawki mózgu: Za pomocą kriostatu zamontuj szeregowe sekcje koronalne (o grubości 20 μm) osadzonego mózgu na dodatnio naładowanym szkiełku szkiełkowym. Sekcje mózgu są całkowicie suszone na powietrzu w temperaturze pokojowej przez noc i przechowywane w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    10. Przygotowanie buforu blokującego: Wymieszaj 10% surowicy cielęcej nowonarodzonego cielęcia, 30 mg/ml albuminy bydlęcej, 10 mg/ml glicyny i 0,4% Triton X-100 w TBS, aby utworzyć bufor blokujący. Przechowywać w temperaturze 4 °C do 2 tygodni przed użyciem.
    11. Barwienie IgG u myszy: Po wysuszeniu uszkodzonych kłucie odcinków kory mózgowej w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, należy je następnie utrwalić za pomocą 500 μl 4% PFA na szkiełko przez 30 minut. Następnie przemyj sekcję PBS (500 μL/szkiełko) przez 5 minut, a następnie dwukrotnie przepłucz solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS, 500 μL/szkiełko) przez 5 minut każde.
      UWAGA: Wykonuj wszystkie procedury w pudełku nawilżającym, aby zapobiec parowaniu.
    12. Stłumić endogenną aktywność enzymatyczną w sekcjach z 10% metanolem i 3% nadtlenkiem wodoru w TBS przez 5 minut, a następnie dwa płukania solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS, 500 μl/szkiełko) przez 5 minut każde.
    13. Blokowanie należy wykonywać za pomocą buforu blokującego (500 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała. Następnie inkubować skrawki z mysim przeciwciałem IgG sprzężonym z biotyną (rozcieńczenie 1:300 z buforem blokującym, 300 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    14. Podczas inkubacji z mysim przeciwciałem IgG przygotować mieszaninę 1 μl odczynnika A i 1 μl odczynnika B z zestawu systemu peroksydazy na bazie awidyny/biotyny w 300 μl buforu blokującego. Przed użyciem inkubować tę mieszaninę przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji mysich przeciwciał IgG należy przemyć skrawki TBS przez 5 minut, trzy razy. Następnie inkubować skrawki z przygotowaną mieszaniną odczynników A i B (300 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    15. Płukać skrawki 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 przez 5 minut, trzy razy, w ciągu 1 godziny. Następnie opracuj kolor za pomocą 0,05% 3,3'-diaminobenzydyny (DAB) w 0,05% nadtlenku wodoru 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μl / szkiełko) przez 5 minut do 1 godziny (Rysunek 2A). Obserwuj pod mikroskopem pod kątem zmiany koloru przed zatrzymaniem reakcji.
    16. Umyj skrawki 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 przez 5 minut trzy razy i wysusz sekcje na powietrzu przez 15 minut. Następnie odwodnić sekcje, zanurzając je dwukrotnie w 95% etanolu na 2 minuty, a następnie w 100% etanolu na 2 minuty dwa razy. Oczyść skrawki z ksylenu przez 5 minut dwukrotnie. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć za pomocą nierozpuszczalnego w wodzie podłoża montażowego i pozostawić do wyschnięcia.
    17. Analiza intensywności barwienia mysich IgG: Uchwyć obrazy przekrojów za pomocą mikroskopu z obiektywem 20x.
    18. Korzystając z oprogramowania ImageJ, określ ilościowo intensywność barwienia, mierząc średnie wartości szarości w pięciu losowo wybranych polach (8 × 8 μm2 dla każdego) z obszarów barwionych immunoenzymatycznie w każdej sekcji. Znormalizuj intensywność barwienia, używając średniej wartości szarości z każdej strony przeciwnej; Nie ma zranionego obszaru jako korekcji tła. Oblicz średnią znormalizowanych średnich wartości szarości z pięciu pól, aby określić średnią wartość szarości barwienia mysich IgG dla każdej sekcji.
  2. Ocena przecieku niebieskiego Evansa do miąższu mózgu
    UWAGA: Niebieski protokół Evansa jest podobny do metody opisanej wcześniej11. Dekstran znakowany izotiocyjanianem fluoresceiny (FITC) działa również w celu regeneracji po rozpadzie BBB10.
    1. Wstrzyknięcie niebieskiego Evansa: Podawać 2% błękitu Evansa w PBS (3 ml / kg) myszy zranionej kłutym przez żyłę ogonową na 1 godzinę przed sekcją.
    2. Świeża ekstrakcja mózgu: 1 godzinę po podaniu błękitu Evansa, perfuzję myszy za pomocą PBS zgodnie z opisem w krokach 2.1.1-2.1.4. Następnie wypreparuj i pokrój świeży mózg koronalnie na sekcje o grubości 1 mm za pomocą krajalnicy do mózgu. Wybierz cztery plasterki i wytnij kawałki mózgu (1 mm2 kwadratowe, każdy), które zawierają obszar rany kłutej lub nienaruszone obszary w korze mózgowej bez rany, zgodnie z papierem milimetrowym (Rysunek 1D).
    3. Kwantyfikacja niebieskiego Evansa: Zbierz cztery części mózgu w probówce o pojemności 1,5 ml i homogenizuj je z 200 μl kwasu trójchlorooctowego za pomocą młynka do tkanek. Odwirować homogenat w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4 °C przez 20 minut. Następnie zebrać sklarowany osad za pomocą pipety i rozcieńczyć go 600 μl etanolu. Przygotuj wzorcową krzywą błękitu Evansa, w zakresie od 0-1,0 ng/ml, aby określić ilościowo jego stężenie. Zmierzyć intensywność fluorescencji przy 680 nm przy długości fali wzbudzenia 620 nm za pomocą czytnika płytek.

3. Ocena poziomu stanu zapalnego w mózgu po ranie kłutej

  1. Barwienie immunoenzymatyczne rannego kłucie wycinka mózgu pod kątem komórek glejowych
    1. Przygotowanie sekcji mózgu: Wykonaj szkiełka do szkieł zamontowanych na sekcjach mózgu, jak opisano w krokach 2.1.1-2.1.9.
    2. Barwienie glejowe: Po wysuszeniu na powietrzu uszkodzonych kłutymi skrawkami kory mózgowej przez 1 godzinę, ponownie utrwalić skrawki za pomocą 4% PFA (500 μL/szkiełko) przez 30 min. Następnie myj sekcje PBS (500 μL/szkiełko) przez 5 minut, a następnie dwa razy myj TBS (500 μL/szkiełko) przez 5 minut każde.
    3. Stłumić endogenną aktywność enzymatyczną w sekcjach z 10% metanolem i 3% nadtlenkiem wodoru w TBS przez 5 minut, a następnie dwa płukania solą fizjologiczną buforowaną Tris (TBS, 500 μl/szkiełko) przez 5 minut każde.
    4. Blokowanie należy wykonywać za pomocą buforu blokującego (500 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała.
    5. Skrawki należy inkubować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym (300 μl/szkiełko). Dla przeciwciała pierwszorzędowego należy użyć następujących rozcieńczeń: rozcieńczenie 1:3 000 dla Iba1 i rozcieńczenie 1:1 000 dla GFAP, rozcieńczone w buforze blokującym.
    6. Umyj sekcję trzykrotnie TBS przez 5 minut każda. Następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym sprzężonym z biotyną (rozcieńczenie 1:300 z buforem blokującym, 300 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    7. Podczas inkubacji z przeciwciałem drugorzędowym przygotować mieszaninę 1 μl odczynnika A i 1 μl odczynnika B z zestawu systemu peroksydazy na bazie awidyny/biotyny w 300 μl buforu blokującego. Następnie inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 30 minut przed użyciem.
    8. Po zakończeniu inkubacji przeciwciał wtórnych przemyć skrawki trzykrotnie TBS przez 5 minut każda, a następnie inkubować skrawki przygotowaną mieszaniną odczynnika A i B (300 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    9. Płukać skrawki 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 przez 5 minut, trzy razy, w ciągu 1 godziny. Następnie opracuj kolor za pomocą 0,05% DAB w 0,05% nadtlenku wodoru 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 (500 μl / szkiełko) przez 30 minut do 3 godzin. Obserwuj pod mikroskopem pod kątem zmiany koloru przed zatrzymaniem reakcji.
    10. Umyj skrawki 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 przez 5 minut trzy razy i wysusz sekcje na powietrzu przez 15 minut. Następnie odwodnić sekcje, zanurzając je dwukrotnie w 95% etanolu na 2 minuty, a następnie w 100% etanolu na 2 minuty, dwa razy. Oczyść skrawki z ksylenu przez 5 minut dwukrotnie. Szkiełko nakrywkowe należy nakryć za pomocą nierozpuszczalnego w wodzie podłoża montażowego i pozostawić do wyschnięcia. Uchwyć obrazy przekrojów za pomocą mikroskopu z obiektywem 20x.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne rannego kłucie wycinka mózgu w poszukiwaniu komórek glejowych
    1. Przygotowanie sekcji mózgu: Wykonaj szkiełka do szkieł zamontowanych na sekcjach mózgu, jak opisano w krokach 2.1.1-2.1.9.
    2. Barwienie glejowe: Po wysuszeniu na powietrzu uszkodzonych kłutymi skrawkami kory mózgowej przez 1 godzinę, ponownie utrwalić skrawki za pomocą 4% PFA (500 μL/szkiełko) przez 30 min. Następnie myj sekcje PBS (500 μL/szkiełko) przez 5 minut, a następnie dwa razy myj TBS (500 μL/szkiełko) przez 5 minut każde. Blokowanie należy wykonywać za pomocą buforu blokującego (500 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciała.
    3. Skrawki należy inkubować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym (300 μl/szkiełko). Dla przeciwciała pierwszorzędowego należy użyć następujących rozcieńczeń: rozcieńczenie 1:3 000 dla Iba1 i rozcieńczenie 1: 1 000 dla GFAP, rozcieńczone w buforze blokującym.
    4. Umyj sekcję trzykrotnie TBS przez 5 minut każda. Następnie inkubować z fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem drugorzędowym (rozcieńczenie 1:300 z buforem blokującym, 300 μl/szkiełko) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyć skrawki trzykrotnie TBS przez 5 minut każda i inkubować skrawki z 0,4 μg/ml roztworu DAPI w TBS (500 μl/szkiełko) przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Płukać sekcje TBS (500 μl/szkiełko) przez 5 minut, a wodą destylowaną (500 μl/szkiełko) przez 5 min. Po wysuszeniu skrawków na powietrzu przez 15 minut, nakryj je medium montażowym na bazie wody i pozostaw do wyschnięcia. Uchwyć obrazy przekrojów za pomocą mikroskopu konfokalnego z obiektywem 20x.
  3. qPCR w czasie rzeczywistym dla markerów komórek glejowych i cytokin zapalnych
    UWAGA: Sekwencje starterów 16,20,21,22 używane w prezentowanym protokole są wymienione w tabeli 1.
    1. Przygotowanie świeżej tkanki mózgowej: Perfuzja myszy za pomocą PBS zgodnie z opisem w krokach 2.1.1-2.1.4. Następnie wyekstrahuj i pokrój świeży mózg koronalnie na sekcje o grubości 1 mm za pomocą krajalnicy do mózgu. Wybierz cztery plasterki i wytnij kawałki mózgu (1 mm2 kwadratowe każdy), które zawierają obszar rany kłutej lub nienaruszone obszary po przeciwnej stronie kory mózgowej, zgodnie z papierem milimetrowym. Określ obszar do wycięcia, który obejmuje zmianę w środku (Rysunek 1D).
    2. Ekstrakcja RNA: Zbierz cztery kawałki mózgu w probówce o pojemności 1,5 ml i homogenizuj je z 1 ml odczynnika TRIzol przez pipetowanie. Inkubować mieszaninę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać 200 μl chloroformu, dobrze odwirować i inkubować przez dodatkowe 2 minuty w temperaturze pokojowej. Odwirować mieszaninę przy 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść górną, przezroczystą warstwę do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, unikając białych osadów, które zawierają DNA i białka.
    3. Dodać 500 μl izopropanolu do zebranej górnej warstwy, dobrze wymieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu przy 12 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, usunąć supernatant i dodać 1 ml 70% etanolu w celu przepłukania osadu RNA. Wirować przy 7 500 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, całkowicie usunąć supernatant i suszyć osad na powietrzu przez 10 minut. Rozpuść osad RNA w 15 μl wody wolnej od RNaz i denaturuj RNA przez 10 minut w temperaturze 55°C.
    4. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego. Natychmiast należy przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
    5. Synteza cDNA: Do syntezy cDNA użyj dostępnego na rynku zestawu do syntezy DNA. Przygotuj łącznie 10 μl buforu reakcyjnego w probówce o pojemności 1,5 μl dla każdej próbki, która zawiera 2 μl 5 x bufor RT, 0,5 μl mieszanki enzymów RT, 0,5 μl mieszanki starterów, 1 μg RNA i wodę wolną od nukleaz. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut w przypadku reakcji odwrotnej transkrypcji i w temperaturze 98 °C przez 5 minut w przypadku reakcji inaktywacji enzymu. Następnie dodaj 90 μl wody wolnej od nukleaz do buforu i dobrze wymieszaj. Roztwór cDNA należy przechowywać w temperaturze -20°C.
    6. Kwantyfikacja ekspresji RNA: Do analizy qPCR w czasie rzeczywistym należy użyć dostępnego na rynku zestawu do mieszania qPCR master. Przygotuj roztwór mieszany dla każdej próbki, łącząc 5 μl KOD SYBR qPCR Mix, 0,4 μl 5 μM startera do przodu, 0,4 μl 5 μM startera odwrotnego i 0,2 μL 50 x ROX w 2 μl wody wolnej od nukleaz.
    7. Przygotuj mieszaninę 2 μl roztworu cDNA i 8 μl roztworu mieszającego w probówce z 8 paskami, dobrze wymieszaj i odwiruj.
    8. Rozpocznij reakcję PCR w następujących warunkach cyklicznych: 98 °C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli 98 °C przez 10 s, 60 °C przez 10 s i 68 °C przez 30 s. Wykonaj etap analizy krzywej topnienia/dysocjacji za pomocą maszyny qPCR w czasie rzeczywistym.
    9. Analiza ekspresji mRNA: Analizuj poziom ekspresji mRNA za pomocą metody 2-Delta-Delta-Ct, która jest przeprowadzana przez normalizację za pomocą genu porządkowego, Gapdh, a następnie za pomocą genu strony przeciwnej23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby przeanalizować powrót do zdrowia po rozpadzie BBB, poziom krwotoku w korze mózgowej zranionej kłuciem został oceniony poprzez pomiar poziomu wynaczynienia IgG w surowicy po 1, 3, 5 i 7 dniach od uszkodzenia mózgu. Obrazy barwienia IgG u myszy ujawniły wyciek krwi i odkładanie się w korze mózgowej po urazie mózgu. Zmniejszyło się to po ponad 7 dniach, gdy bariera krew-mózg odzyskała sprawność, a białko IgG uległo degradacji (Figura 2B). Poziomy wynaczynienia IgG określono ilościowo, mierząc intensy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj wprowadzono protokół tworzenia modelu myszy TBI za pomocą igieł. Protokół ten pozwala na ilościową ocenę powrotu do zdrowia po rozpadzie bariery krew-mózg i stanie zapalnym po urazie mózgu przy użyciu podejść histologicznych i biologii molekularnej. Alternatywne protokoły, takie jak model TBI z powtarzającym się wstrząsem mózgu i model TBI ze spadkiem masy, mogą być również wykorzystywane do analizy rozpadu BBB i stanu zapalnego. Modele te replikują patologię TBI w kontrolowanych warunkach, w tym określone parametr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Ayanie Hamano, Minori Yamashita, Misaki Endo, Hirono Kobayashi i Nito Nakahirze za pomoc w immunohistochemii i qPCR w czasie rzeczywistym. Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI 19K16122, Fundację Naukową Takeda, Fundację Astellas na rzecz Badań nad Zaburzeniami Metabolicznymi, Fundację Mitsubishi, Fundację Nauki o Mózgu oraz Fundację Pamięci Uehara dla K.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
19 G x 1• Igła 1/2"TERUMONN-1938R 
Igła 27 G x 3/4"TERUMONN-2719S przeciwciało
anty-GFAPSigma-AldrichG9269
przeciwciało anty-Iba1Wako019-19741
Chlorowodorek atypamezoluNippon Zenyaku KogyoNazwa produktu:
Mysie przeciwciało IgG sprzężone z biotynąAntysedan Vector LaboratoriesBA-9200
Przeciwciało IgG królika sprzężone z biotynąVector LaboratoriesBA-1000
Albumina bydlęcaNacalai tesque01860-07
Krajalnica do mózguVisikolBSLM-2
Winian butorfanoluMeiji ZdrowieNazwa produktu: Vetorphale 5 mg
Mikroskop konfokalnyZeissLSM700
Kriostat LeicaCM1520
DABSigma-AldrichD5637-1G
DAPIRoche10236276001
Evans niebieskiWako056-04061
Fluorescencyjne przeciwciało IgG królika sprzężoneInvitrogenA-21206
Fluoromount-GInvitrogen4958-02Podłoże
Roztwór do inhalacji izofluranuViatrisv002139
KOD SYBR qPCR MixTOYOBOQKD-201qPCR master mix kit
MedetomidineNippon Zenyaku KogyoNazwa produktu: Mikroskop Domitor
OlympusFSX100
Spektrofotometr mikroobjętościowyThermoFisher ScientificNanoDrop One
Midazolam 10 mg/2 mlSandoz1124401A1060
MONTAŻ SZYBKIDaido SangyoDM01Nierozpuszczalne w wodzie podłoże montażowe
Surowica cielęca noworodkaGibco16010159
Związek O.C.T.Sakura Finetek Japan45833Podłoże do zatapiania
Peel-A-Way, ścięte 22 mm Kwadrat TopTed Pella27118Forma do zatapiania tkanek
Pompa perfuzyjna perystaltycznaATTOSJ-1211
Czytnik płytekFisher ScientificCytation 3
Maszyna qPCR w czasie rzeczywistymThermoFisher ScientificStepOne Plus
ReverTra Ace qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Zestaw do syntezy cDNA
Superfrost Plus Slide GlassFisher Scientific12-550-15Dodatnio naładowany szew szklany
z igłą Odczynnik trizolowy AlfresaHT2003NA75-KF2
Invitrogen15596026
VECTASTAIN ABC Standardowy zestawVector LaboratoriesPK-4000Zestaw systemu peroksydazy na bazie awidyny/biotyny
zwierząt montażowe na bazie wody

Bibliografia

  1. Narayan, R. K., et al. Clinical trials in head injury. J Neurotrauma. 19 (5), 503-557 (2002).
  2. Shitaka, Y., et al. Repetitive closed-skull traumatic brain injury in mice causes persistent multifocal axonal injury and microglial reactivity. J Neuropathol Exp Neurol. 70 (7), 551-567 (2011).
  3. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  4. Ikeshima-Kataoka, H., Shen, J. S., Eto, Y., Saito, S., Yuasa, S. Alteration of inflammatory cytokine production in the injured central nervous system of tenascin-deficient mice. In Vivo. 22 (4), 409-413 (2008).
  5. Zhou, Y., Wang, Y., Wang, J., Anne Stetler, R., Yang, Q. W. Inflammation in intracerebral hemorrhage: From mechanisms to clinical translation. Prog Neurobiol. 115, 25-44 (2014).
  6. Hijazi, N., et al. Endogenous plasminogen activators mediate progressive intracerebral hemorrhage after traumatic brain injury in mice. Blood. 125 (16), 2558-2567 (2015).
  7. Kataoka, K., et al. Roles of urokinase-type plasminogen activator in a brain stab-wound. Brain Res. 887 (1), 187-190 (2000).
  8. Wang, Y., et al. Early posttraumatic csf1r inhibition via plx3397 leads to time- and sex-dependent effects on inflammation and neuronal maintenance after traumatic brain injury in mice. Brain Behav Immun. 106, 49-66 (2022).
  9. Kaplan, L., Chow, B. W., Gu, C. Neuronal regulation of the blood-brain barrier and neurovascular coupling. Nat Rev Neurosci. 21 (8), 416-432 (2020).
  10. Endo, M., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid regulates blood coagulation and fibrinolysis system for repair after brain injury. Brain Res. 1818, 148511(2023).
  11. Goldim, M. P. S., Della Giustina, A., Petronilho, F. Using Evans blue dye to determine blood-brain barrier integrity in rodents. Curr Protoc Immunol. 126 (1), e83(2019).
  12. Hashimoto, K., et al. 2-carba cyclic phosphatidic acid suppresses inflammation via regulation of microglial polarization in the stab-wounded mouse cerebral cortex. Sci Rep. 8 (1), 9715(2018).
  13. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Yasui, M. Aquaporin 4-dependent expression of glial fibrillary acidic protein and tenascin-c in activated astrocytes in stab-wound mouse brain and in primary culture. J Neurosci Res. 93 (1), 121-129 (2015).
  14. Nakashima, M., et al. The neuroprotective function of 2-carba-cyclic phosphatidic acid: Implications for tenascin-c via astrocytes in traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 361, 577749(2021).
  15. Kawai, S., Takagi, Y., Kaneko, S., Kurosawa, T. Effect of three types of mixed anesthetic agents alternate to ketamine in mice. Exp Anim. 60 (5), 481-487 (2011).
  16. Ikeshima-Kataoka, H., Abe, Y., Abe, T., Yasui, M. Immunological function of aquaporin-4 in stab-wounded mouse brain in concert with a pro-inflammatory cytokine inducer, osteopontin. Mol Cell Neurosci. 56, 65-75 (2013).
  17. Ikeshima-Kataoka, H., Yasui, M. Correlation between astrocyte activity and recovery from blood-brain barrier breakdown caused by brain injury. Neuroreport. 27 (12), 894-900 (2016).
  18. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), e3564(2012).
  19. Botta, S., Chemiakine, A., Gennarino, V. A. Dual antibody strategy for high-resolution imaging of murine Purkinje cells and their dendrites across multiple layers. STAR Protoc. 3 (2), 101427(2022).
  20. Amin, D. N., et al. Identification of stage biomarkers for human African trypanosomiasis. Am J Trop Med Hyg. 82 (6), 983-990 (2010).
  21. Jiang, J., et al. Therapeutic window for cyclooxygenase-2 related anti-inflammatory therapy after status epilepticus. Neurobiol Dis. 76, 126-136 (2015).
  22. Wei, J., et al. Microglia activation: One of the checkpoints in the CNS inflammation caused by angiostrongylus cantonensis infection in rodent model. Parasitol Res. 114 (9), 3247-3254 (2015).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative pcr and the 2(-delta delta c(t)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  24. Hazy, A., et al. Divergent age-dependent peripheral immune transcriptomic profile following traumatic brain injury. Sci Rep. 9 (1), 8564(2019).
  25. Xia, Y., et al. Osthole confers neuroprotection against cortical stab-wound injury and attenuates secondary brain injury. J Neuroinflammation. 12, 155(2015).
  26. Cieri, M. B., Villarreal, A., Gomez-Cuautle, D. D., Mailing, I., Ramos, A. J. Progression of reactive gliosis and astroglial phenotypic changes following stab-wound-induced traumatic brain injury in mice. J Neurochem. 167 (2), 183-203 (2023).
  27. Barreda-Manso, M. A., Yanguas-Casas, N., Nieto-Sampedro, M., Romero-Ramirez, L. Neuroprotection and blood-brain barrier restoration by salubrinal after a cortical stab injury. J Cell Physiol. 232 (6), 1501-1510 (2017).
  28. Rapp, P. E., et al. Patient characterization protocols for psychophysiological studies of traumatic brain injury and post-TBI psychiatric disorders. Front Neurol. 4, 91(2013).
  29. Brody, D. L., Benetatos, J., Bennett, R. E., Klemenhagen, K. C., Mac Donald, C. L. The pathophysiology of repetitive concussive traumatic brain injury in experimental models; new developments and open questions. Mol Cell Neurosci. 66 (Pt B), 91-98 (2015).
  30. Meehan, W. P., Zhang, J., Mannix, R., Whalen, M. J. Increasing recovery time between injuries improves cognitive outcome after repetitive mild concussive brain injuries in mice. Neurosurgery. 71 (4), 885-891 (2012).
  31. Chen, C., et al. A novel simple traumatic brain injury mouse model. Chin Neurosurg J. 8 (1), 8(2022).
  32. Machado, C. A., et al. Weight-drop model as a valuable tool to study potential neurobiological processes underlying behavioral and cognitive changes secondary to mild traumatic brain injury. J Neuroimmunol. 385, 578242(2023).
  33. Hashimoto, K., Ikeda, N., Nakashima, M., Ikeshima-Kataoka, H., Miyamoto, Y. Vitronectin regulates the fibrinolytic system during the repair of cerebral cortex in stab-wounded mice. J Neurotrauma. 34 (22), 3183-3191 (2017).
  34. Unterberg, A. W., Stover, J., Kress, B., Kiening, K. L. Edema and brain trauma. Neuroscience. 129 (4), 1021-1029 (2004).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model rany k utejmodel TBI u myszyocena krwawieniaanaliza stanu zapalnegouszkodzenie kory m zguaktywacja glejuodpowied mikroglejuekspresja cytokinmi sz m zgu

Powiązane artykuły