Artykuł metodologiczny

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67802

⸱

25 kwietnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 2Department of Chemistry and Chemical Biology, TU Dortmund University, 3Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas, Universidad de Chile

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Opisujemy protokół przeprowadzania anizotropii fluorescencji rozdzielczej w czasie na poziomie pojedynczej cząsteczki za pomocą mikroskopii konfokalnej w celu zbadania lokalnej elastyczności i dynamiki domeny FKH czynnika transkrypcyjnego FoxP1 wiążącej kwas dezoksyrybonukleinowy (DNA). FoxP1 dimeryzuje poprzez trójwymiarowy mechanizm zamiany domen (3D-DS), tworząc nieuporządkowany produkt pośredni z DNA lub bez. Ponieważ 3D-DS obejmuje wewnętrznie nieuporządkowany region, zrozumienie jego zachowania ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia strukturalnych i funkcjonalnych właściwości FoxP1. Korzystając z FoxP1 znakowanego pojedynczą cysteiną, przeprowadziliśmy eksperymenty anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFA), stosując dynamiczną analizę rozkładu anizotropii fotonów (daPDA) i analizę wariancji impulsu anizotropii w czasie (traBVA) w celu zbadania lokalnej elastyczności i dynamiki. Protokół ten zawiera szczegółowy przewodnik krok po kroku dotyczący pomiarów smFA, kładąc nacisk na analizy czasowo-rozdzielcze, wariancję i techniki rozkładu prawdopodobieństwa w celu uchwycenia dynamiki strukturalnej w różnych skalach czasowych. Podejście to umożliwiło nam powiązanie dynamiki i heterogeniczności z dimeryzacją FoxP1 i wiązaniem DNA, podkreślając złożony mechanizm działania, który charakteryzuje ten czynnik transkrypcyjny.

Wprowadzenie

Aktywność funkcjonalna biomolekuł zależy od ich elastyczności molekularnej i dynamiki strukturalnej1,2,3. Naturalnie, biomolekuły doświadczają ciągłych wahań termicznych, od gwałtownych ruchów po długotrwałe zmiany konformacyjne wpływające na ich funkcję (Rysunek 1)4. W biomolekułach lokalne ruchy kręgosłupa przyczyniają się do globalnych ruchów na większą skalę, w tym zginania zawiasów u enzymów i znaczących zmian konformacyjnych w białkach motorycznych. Metody określania struktury, takie jak magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)5, krystalografia rentgenowska6 i kriogeniczna mikroskopia elektronowa (cryo-EM)7 ujawniły wiele konformacji w różnych biomolekułach. Niemniej jednak powiązanie lokalnych fluktuacji z dużą dynamiką konformacyjną biomolekuł i ich rolą w funkcji jest w większości niezbadane. Powiązanie dynamiki i struktury może być trudne, szczególnie w przypadku białek wewnętrznie nieuporządkowanych (IDPs)8,9,10. W przeciwieństwie do białek strukturalnych, IDP nie utrzymują stabilnej struktury trzeciorzędowej. Zamiast tego przechodzą rozległe zmiany konformacyjne o podobnych poziomach energii swobodnej, umożliwiając szeroki zakres aktywności biologicznej11,12.

Zastosowano kilka podejść eksperymentalnych do zbadania dynamiki konformacyjnej białek poprzez badanie ich elastyczności molekularnej1,13,14,15,16. Wśród nich NMR wyróżnia się zdolnością do zapewniania rozdzielczości na poziomie atomowym w różnych skalach czasowych, od dziesiątek pikosekund do kilku godzin12. Jednak określenie elastyczności makromolekularnej pozostaje wyzwaniem ze względu na wysokie stopnie swobody i w przypadku białek o dużych rozmiarach; w związku z tym NMR często ogranicza się do badania biomolekuł o masie około 100 kDa17.

Biorąc pod uwagę złożoność strukturalną wysoce dynamicznych białek, takich jak IDP, opracowano dodatkowe postępy metodologiczne w celu zbadania lokalnej i długoterminowej przestrzeni konformacyjnej w celu zrozumienia ich funkcji11. Wieloparametrowa spektroskopia fluorescencyjna jednocząsteczkowa (smMFS)18,19,20,21,22 oferuje obszerne informacje na temat biomolekuł, dostarczając kluczowych informacji na temat ich funkcji, dynamiki konformacji, stanów wiązania i stechiometrii. Jednak interpretacja ogromnej ilości danych strukturalnych uzyskanych z biomolekuł jest trudna, a czynniki takie jak dynamika molekularna, zachowanie fluoroforów i złożone zachowanie cząsteczek mogą jeszcze bardziej skomplikować analizę danych23,24,25,26,27,28.

Używamy anizotropii fluorescencji pojedynczej cząsteczki (smFA) jako solidnej metody oceny lokalnej i globalnej dynamiki wzdłuż szkieletu biomolekuł (Rysunek 1A). Anizotropia fluorescencji, po raz pierwszy opisana przez Perrin29 i wprowadzona przez Weber30,31 jako narzędzie bioanalityczne32, została później zaadaptowana do badań pojedynczych cząsteczek wraz z pojawieniem się technik fluorescencji czasowo-rozdzielczej i zwiększeniem czułości detektorów33,34,35,36,37. smFA obejmuje szeroki zakres skal czasowych - od pikosekund do kilku godzin - i uzupełnia dane uzyskane z eksperymentów z transferem energii rezonansu Förstera (smFRET) na pojedynczej cząsteczce38.

smFA może być wizualizowane w różnych formatach, aby wydobyć kluczowe informacje o dynamice biomolekularnej (Rysunek 1B). Czasowo-rozdzielcze rozpady anizotropii fluorescencji to jednowymiarowe histogramy, które rejestrują dynamikę w skali od pikosekundy do nanosekundy39,40. Dwuwymiarowe histogramy pojedynczych cząsteczek, które korelują czas życia fluorescencji z anizotropią dla poszczególnych cząsteczek, mogą ujawnić niejednorodność stanu anizotropii i zapewnić wizualny wgląd w potencjalną dynamikę w czasie obserwacji w eksperymentach konfokalnych (~ms)41,42. Do badania dynamiki submilisekundowej można wykorzystać analizę dynamicznego rozkładu fotonów anizotropii (daPDA), podczas gdy analiza wariancji impulsu anizotropii w czasie (traBVA) oferuje solidną metodę potwierdzania określonej dynamiki wokół milisekund43 (Rysunek 1B).

Te metody uzupełniają bardziej tradycyjne narzędzia, takie jak spektroskopia korelacji fluorescencji z rozdzielczością polaryzacji (pFCS), która ma szersze spektrum44,45,46,47. Ogólnie rzecz biorąc, wiele narzędzi do analizy danych dla smFA ułatwia identyfikację lokalnych i globalnych zmian konformacyjnych, pod warunkiem, że weźmie się pod uwagę odpowiednią kalibrację.

Tutaj stosujemy smFA do badania wiązania DNA ludzkiego czynnika transkrypcyjnego FoxP148,49,50,51. Białko to przyjmuje dimer zamieniony domeną ze względu na wewnętrznie nieuporządkowany charakter jego łańcucha polipeptydowego, który jest wyraźnie dotknięty w zależności od czwartorzędowego stanu białka i obecności DNA. Wygenerowaliśmy różne mutanty pojedynczej cysteiny do znakowania za pomocą BODIPY-FL, przeprowadziliśmy eksperymenty smFA i zastosowaliśmy daPDA i trBVAa. Takie podejście pozwoliło nam powiązać dynamikę i heterogeniczność z dimeryzacją FoxP1 i wiązaniem DNA, podkreślając złożony mechanizm działania, który charakteryzuje ten czynnik transkrypcyjny.

Protokół

UWAGA: Wybór odpowiedniego fluoroforu jest niezbędny do eksperymentów z smFA. Biomolekuły mogą być znakowane w pozycjach specyficznych dla danego miejsca poprzez modyfikację aminokwasów w białkach lub zasad nukleotydowych w kwasach nukleinowych za pomocą markerów fluorescencyjnych, w zależności od dostępnych grup reaktywnych. Wśród barwników organicznych52, rodziny Alexa Fluor, Cy, BODIPY i Janelia Farms są najpopularniejszym wyborem dla smFA, dzięki ich długiemu okresowi życia fluorescencji, fotostabilności i wysokiej wydajności kwantowej. BODIPY-FL jest często preferowany ze względu na wydłużoną żywotność fluorescencji, doskonałą wydajność kwantową i krótki łącznik łączący. Dodatkowo, alternatywne fluorofory są powszechnie stosowane w badaniach przesiewowych leków, gdzie preferowane są techniki masowe53. Chimeryczne białka fluorescencyjne mogą być również wykorzystywane do eksperymentów z anizotropią żywych komórek i obrazowania, chociaż istnieje ograniczenie w postaci niższego zakresu dynamiki.

1. Przygotowanie bufora

UWAGA: Noś rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny podczas przeprowadzania eksperymentów laboratoryjnych.

  1. Bufor wzorcowy (20 mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy [HEPES], pH 7,8, 150 mM NaCl): Rozpuścić 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,8 i uzupełnić końcową objętość do 500 ml.
  2. Bufor do lizy (20 mM HEPES, pH 7,8, 150 mM NaCl, 0,1 mM fluorku fenylometylosulfonylu [PMSF], 10 μg/ml DNAzy): Rozpuścić 2,38 g HEPES, 4,38 g NaCl i 8,71 mg PMSF i końcowe stężenie 10 μg/ml DNAzy w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,8 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.
  3. Bufor równowagowy (50 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS], 150 mM NaCl i 10 mM Imidazolu; pH 7,4): Rozpuścić 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 0,34 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,4 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.
  4. Bufor płuczący (50 mM PBS, 150 mM NaCl i 30 mM Imidazol; pH 7,4): Rozpuść 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 1,02 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij końcową objętość do 500 ml.
  5. Bufor elucyjny (50 mM PBS, 150 mM NaCl i 250 mM Imidazol; pH 7,4): Rozpuścić 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4, 4,38 g NaCl i 8,5 g Imidazolu w 400 ml ultraczystej wody, dostosować pH do 7,4 i doprowadzić końcową objętość do 500 ml.
  6. Bufor PBS (50 mM soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu, 150 mM NaCl, pH 7,4). Rozpuść 5,05 g Na2HPO4, 0,85 g NaH2PO4 i 4,38 g NaCl w 400 ml ultraczystej wody, dostosuj pH do 7,4 i uzupełnij końcową objętość do 500 ml.
  7. Wysterylizuj wszystkie, filtrując roztwór za pomocą filtrów o wielkości porów 0,22 μm i przechowuj w temperaturze pokojowej (RT).
  8. Przefiltruj standardowy bufor za pomocą filtra węglowego do akwizycji pojedynczych cząsteczek.

2. Sondy fluorescencyjne

  1. BODIPY-FL: Rozpuścić fiolkę 5 mg zawierającą BODIPY-FL, dodając końcową objętość 1,29 ml świeżo otwartego sulfotlenku dimetylu (DMSO), aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM BODIPY-FL.
  2. Rodamina 110: Rozpuść 3,67 mg Rhodamine 110, dodając końcową objętość 1 ml świeżo otwartego DMSO, aby uzyskać końcowe stężenie 10 mM Rhodamine 110,
    UWAGA: Należy unikać sond fluorescencyjnych wystawionych na działanie światła. Zawsze używaj światłoczułej tubki (kolor bursztynowy) i owiń ją folią aluminiową. Jeśli DMSO jest już otwarty, musi być przechowywany w eksykatorze, aby wydłużyć jego okres przydatności do spożycia.
  3. Przygotować porcje o małej objętości przygotowanej sondy fluorescencyjnej i przechowywać je w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia.
    UWAGA: Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania, aby poprawić wydajność etykietowania.

3. Pomiary kalibracyjne

  1. Wykonuj eksperymenty z wieloparametrową detekcją fluorescencji (MFD) na domowej konfiguracji z rozdzielczością polaryzacji z 4 kanałami detekcji i 2 laserami impulsowymi (niebieski 485 nm i czerwony 640 nm)54. Jednak do pomiarów anizotropii należy użyć niebieskiego lasera i dwóch kanałów detektora.
  2. Włącz kanały detektora (równoległe i prostopadłe) oraz moc niebieskiego lasera.
  3. Upewnij się, że moc lasera jest ustawiona na 60 μW i otwórz panel sterowania zliczania pojedynczych fotonów skorelowanych czasowo (TCSPC)36.
  4. Zmieszać 1 μl 100 nM Rhodamine 110 i 49 μL wody destylowanej, aby uzyskać końcowe stężenie 2 nM Rhodamine 110. Dodaj 50 μl 2 nM Rhodamine 110 do środka szkła nakrywkowego w celu przeprowadzenia pomiarów kalibracyjnych.
  5. Następnie dodaj kroplę płynu immersyjnego (oleju lub wody, ale uważając, aby mieć ten sam współczynnik załamania światła) na wierzch soczewki obiektywu mikroskopu, aby zwiększyć zdolność rozdzielczą mikroskopu.
  6. Umieść szkiełko nakrywkowe na soczewce obiektywu i upewnij się, że kropla wody znajduje się w środku obiektywu mikroskopu.
  7. Dostosuj płaszczyznę obrazu tak, aby znajdowała się wewnątrz roztworu i nad powierzchnią szkła.
  8. Wyreguluj pokrętło, aby znaleźć drugi jasny punkt ogniskowy i obróć do półtora punktu. Skoncentruj laser na granicy faz szkła i cieczy.
  9. Zmaksymalizuj liczbę wykrywanych fotonów, dostosowując pozycję otworka (70 μm) przy jednoczesnym monitorowaniu szybkości zliczania fotonów.
  10. Otwórz oprogramowanie w panelu trybu TTTR lub T3 (TTTR lub T3) z oznaczeniem czasowym i kliknij przycisk Start. Zapisz szybkość zliczania przez 120 s i zapisz format pliku Rhodamine 110.ptu za pomocą oprogramowania do akwizycji. Ten czas akwizycji powinien wystarczyć, biorąc pod uwagę stężenie (2 nM).
  11. W celu pomiaru tła dodaj 50 μl wody destylowanej do środka szkła nakrywkowego i powtórz kroki 3.5-3.10. Należy jednak zapisać szybkość zliczania fotonów przez 300 s i zapisać plik water.ptu.
  12. W przypadku innych pomiarów tła dodać 50 μl buforu wzorcowego na środek szkła nakrywkowego i powtórzyć kroki 3.5-3.10. Zapisuj szybkość zliczania fotonów przez 300 s i zapisz standardowy plik buffer.ptu. Następnie przeanalizuj dane za pomocą oprogramowania do analizy czasu życia fluorescencji z integracją impulsów (BIFL).

4. Kalibracja i analiza danych

  1. Otwórz oprogramowanie BIFL i kliknij potwierdź konfigurację w oknie automatycznym. Następnie kliknij pobierz parametry z pliku, a następnie OK.
  2. Aby przeanalizować pomiar, kliknij tablicę ścieżek danych i wybierz ją.
  3. Następnie załaduj plik water.ptu do pomiaru wody dla tablic takich jak zielone rozproszenie. Podobnie wybierz standardowy plik buffer.ptu dla Zielone tło. W polu Zielony gruby wybierz Rhodamine 110.ptu.
  4. Pod parametrami wyboru pojedynczej cząsteczki kliknij przycisk Dalej, a następnie Dostosuj, aby wyświetlić nowe okno podręczne. Kliknij próg, aby zmienić czas nadejścia międzyfotonu i wybierz czas zdarzenia pojedynczej cząsteczki jako średni czas przybycia między fotonami (dt). Następnie kliknij min. #, aby wybrać minimalną liczbę fotonów na zdarzenie pojedynczej cząsteczki, a następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Return. Następnie kliknij przycisk OK.
  5. Następnie kliknij opcję Parametry dopasowania koloru, aby dostosować początkowy czas życia fluorescencji dla koloru zielonego, kolorów generowanych z parametrami zaniku fluorescencji. Dostosuj wartości monitu i opóźnienia, modyfikując wartości Od i Do. Następnie zamknij wyskakujące okienko, klikając Powrót. Następnie kliknij przycisk OK.
  6. Kliknij przycisk Zapisz, aby przetworzyć pliki ASCII i zapisać je w wybranym folderze. Następnie przetwórz dane pod kątem czasowo-rozdzielczego zaniku anizotropii fluorescencji za pomocą ChiSurf22, Photon Distribution Analysis55,56, or Burst Variance Analysis57,58.
    UWAGA: Przykładowe dane i opisy krok po kroku dotyczące korzystania z ChiSurf, PDA i BVA są dostępne odpowiednio w github.com/Fluorescence-Tools/chisurf, github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib, www.mpc.hhu.de/en/software/mfd-fcs-and-mfis i github.com/SMB-Lab/feda_tools. Dane eksperymentalne są dostępne na stronie Zenodo (10.5281/zenodo.13371503).

5. Preparat białka FoxP1

  1. Rekombinowana nadekspresja bakterii FoxP1
    1. Przeprowadź transformację w komórki bakteryjne E. coli C41 po szybkiej zmianie mutagenezy łańcuchowej polimerazy skierowanej do miejsca (PCR).
    2. Przygotuj podłoże LB i autoklaw, aby je wysterylizować.
    3. Wstępnie zaszczepić pojedynczą kolonię E. coli C41, dodając do 5 ml pożywki LB zawierającej 5 μl (100 μg/ml) ampicyliny. Pozostawić na noc do inkubacji w temperaturze 37 °C na wytrząsarce inkubatora.
    4. Następnego dnia zaszczepij kulturę bakteryjną na dużą skalę, dodając pre-inokulum na noc do 500 ml pożywki LB z dodatkiem wstępnie dodanego antybiotyku w stosunku 1:500.
    5. Monitorować wzrost kultury, mierząc absorbancję kultury przy 600 nm.
    6. Gdy gęstość optyczna osiągnie zakres ~0,5-0,7, indukuj ekspresję białka, dodając końcowe stężenie 0,5 mM izopropylo-β-d-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i utrzymuj kulturę w temperaturze 15 °C na wytrząsarce inkubatora przez noc.
    7. Po osiągnięciu gęstości optycznej (600 nm) w zakresie 1,4-1,6, zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie w stężeniu 3000 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i przechowywać osad w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  2. Oczyszczanie rekombinowanego FoxP1
    1. Lizuj komórki E. coli C41, dodając bufor do lizy przy użyciu dowolnych metod lizy, takich jak sonikacja, homogenizacja cieczy, prasa francuska itp.
    2. Odwirować lizat w temperaturze 14000 g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. W przypadku białek znakowanychprzez niego 6 należy przemyć kolumnę powinowactwa Ni2 + -NTA i zrównoważyć z NiSO4 za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC).
    4. Załaduj białko FoxP1 znakowane przez His 6 do zrównoważonej kolumny powinowactwa Ni2 + -NTA.
    5. Eluować białko FoxP1 z kolumny Ni2+-NTA przy użyciu liniowego gradientu buforu elucyjnego.
    6. Po wymyciu białka należy przeprowadzić dializę w celu wymiany buforu. Dodać białko do buforu równowagowego bez imidazolu i dializować przez noc za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Jeśli białko jest oczyszczane inną metodą, należy odpowiednio przeprowadzić wymianę buforu.
    7. Aby usunąć znacznik He6, dodaj proteazę wirusa wytrawiania tytoniu (TEV) (stosunek TEV:FoxP1 1:100) do dializy przez noc.
      UWAGA: Jego 6-znacznikowe trawienie można również przeprowadzić, dodając trawienie proteazy TEV na kolumnie. Ten krok poprawiłby wydajność białka będącego przedmiotem zainteresowania.
    8. Następnego dnia powtórz kroki z 5.2.3-5.2.5. Jednak tym razem należy wymyć białko w buforze do płukania, a nie w buforze elucyjnym.
    9. Zagęścić białko do odpowiedniej objętości przez dodanie buforu PBS i określić ilościowo białko, stosując absorbancję przy długości fali 280 nm, biorąc pod uwagę współczynnik ekstynkcji białka.
  3. Znakowanie rekombinowanego FoxP1
    1. Inkubować 50-100 μM białka FoxP1 z 10-krotnym nadmiarem molowym ditiotreitolu (DTT) lub tris(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP) z końcową objętością 500 μl w temperaturze pokojowej przez 30 min.
    2. Przeprowadzić wymianę buforu za pomocą kolumn odsalających PD 10. Umieść kolumnę PD10 w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml za pomocą adaptera kolumny.
    3. Zrównoważyć kolumnę PD10, dodając 5 ml buforu PBS i odwirować przy 1000 × g przez 2 minuty. Powtórzyć ten krok 3 razy.
    4. Umieść kolumnę PD10 w świeżej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 2 ml buforu PBS do kolumny. Następnie dodaj 500 μl białka FoxP1 z kroku 1 do kolumny. Rozpuść białko przez odwirowanie 1000 × g przez 2 minuty i zbierz białko.
    5. Zagęścić białko, dodając je do ultra filtrów odśrodkowych (10 kDa MWCO), odwirować przy 7500 × g przez 10 minut i zebrać elucję.
    6. Zmierzyć stężenie białka, dodać BODIPY z 30% równowartościowym stężeniem cysteiny w białku i umieścić na rotatorze na 2 godziny w temperaturze 4 °C.
    7. Przeprowadzić wymianę buforu i zagęścić białko zgodnie z opisem w krokach 5.3.2-5.3.5.
    8. Sprawdzić stężenie białka za pomocą spektrofotometru lub testu kolorymetrycznego, takiego jak metoda Bradforda lub Lowry'ego, oraz stężenie barwnika przez absorbancję przy 500 nm.
    9. Zmierz stopień oznakowania za pomocą następującego wzoru:
      (Barwnik A/ε barwnik)/(masa cząsteczkowa białka/miligram białka na mililitr) = mole barwnika/mole białka
      GdzieBarwnik A iε Barwnik są odpowiednio wartością absorbancji barwnika i molowym współczynnikiem ekstynkcji barwnika przy maksymalnej długości fali absorbancji59. Przy pomiarze przy długości fali 280 nm rzeczywistą absorbancję białka należy skorygować za pomocą następującego wzoru:
      Białko A = A280-(Barwnik A·CF280)
      Gdzie CF280 jest współczynnikiem korygującym dla określonego barwnika, biorąc pod uwagę jego wewnętrzną absorbancję przy 280 nm59.
      UWAGA: Podczas gdy skupiamy się na ekspresji i oczyszczaniu białka modyfikowanego cysteiną, należy dokładnie rozważyć strategiczne wprowadzenie reszt cysteiny do białka.

6. Przygotowanie komory na próbki mikroskopu

  1. Dodaj 495 μl ultraczystej wody i 5 μl (0,01% v/v stężenie końcowe) Tween-20 (niejonowy środek powierzchniowo czynny) do studzienki szkiełka komorowego i wymieszaj. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  2. Delikatnie umyj komorę dwukrotnie ultra czystą wodą i wysusz ją.
    UWAGA: Komora jest gotowa do użycia na potrzeby eksperymentu.

7. Eksperyment z anizotropią fluorescencji pojedynczej cząsteczki

  1. Najpierw skalibruj przyrząd smFA. Określić funkcję odpowiedzi przyrządu, albo poprzez pomiar światła rozproszonego Ramana, albo przez pomiar fluorescencji barwnika o krótkim czasie życia i odpowiednim widmie emisyjnym (np. Erytrozyna lub zieleń malachitowa) dodatkowo stłumionego nasyconym roztworem jodku potasu, KI.
  2. Aby skorygować fluorescencję tła, należy wykonać pomiary roztworu buforowego. Skalibruj względną czułość detektorów równoległych i prostopadłych (współczynnik G), pozyskując dane z szybko rotującego barwnika. W tym przypadku do kalibracji detektorów użyto 2 nM Rhodamine 11060.
  3. W przypadku eksperymentów smFA na monomerycznym FoxP1 dodaj 100 pM FoxP1 znakowanego BODIPY i 100 nM nieznakowanego FoxP1 do 500 μl standardowego buforu (20 mM HEPES, 20 mM NaCl, pH 7,8) w szkiełku komorowym.
  4. Do testu miareczkowania z DNA i monomerycznym FoxP1 dodać 400 nM DNA do 100 pM znakowanej BODIPY/100 nM mieszanki białek nieznakowanych i inkubować w RT przez 10 minut.
  5. W przypadku eksperymentów smFA na dimerycznym FoxP1 dodaj 500 nM nieznakowanego FoxP1 do 100 pM FoxP1 znakowanego BODIPY w standardowym buforze. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Do testu miareczkowania z DNA i dimerycznym FoxP1 dodać 2000 nM DNA do 100 pM mieszanki białek znakowanych BODIPY/500 nM nieznakowanych i inkubować w RT przez 10 minut.
  7. Rozpocznij pomiary i sprawdź w oprogramowaniu BIFL, czy liczba impulsów w rekordzie 30 s mieści się w przedziale 60-90. Jeżeli próbka jest bardziej skoncentrowana, należy ją rozcieńczyć, aż osiągnie tę wartość. Ten krok zapewnia warunki jednocząsteczkowe.
  8. Rozpocznij smFA każdy pomiar dla monomerycznego FoxP1 lub dimerycznego FoxP1 w przypadku braku lub obecności DNA przez co najmniej 4 godziny.
  9. Przeanalizuj pomiary smFA zgodnie z opisem w sekcji 4.

Wyniki

Anizotropia fluorescencji wynika z względnej orientacji momentów dipolowych absorpcji i emisji fluoroforu. Gdy fluorofory są poddawane działaniu światła spolaryzowanego, preferencyjnie pobudzane są te, których momenty przejścia absorpcyjnego są wyrównane z wektorem pola elektrycznego padającego światła (fotoselekcja). W rezultacie populacja stanu wzbudzonego staje się częściowo zorientowana, a znaczna frakcja wzbudzonych cząsteczek posiada momenty przejścia wyrównane z wektorem pola elektrycznego spolaryzowanego światła wzbudzającego61. Fluorofory rotują na skutek ruchu Browna. W konsekwencji rotuje również moment przejścia emisji, co prowadzi do zależności anizotropii fluorescencji od czasu. Efekt ten może być wykorzystany do pomiaru ruchów rotacyjnych cząsteczek fluorescencyjnych, wykrywania zdarzeń wiązania, charakteryzacji otoczenia fluoroforu oraz rejestrowania dynamiki molekularnej.

Eksperymenty z pojedynczymi cząsteczkami dają wyjątkowe możliwości określenia heterogeniczności próbki. Wykorzystanie czułości na poziomie pojedynczych cząsteczek oraz anizotropii fluorescencji dodaje kolejny wymiar do wieloparametrycznej spektroskopii fluorescencyjnej. W typowym konfokalnym mikroskopie do badania pojedynczych cząsteczek (Rycina 2)20,21, anizotropię fluorescencji można określić metodą opartą na intensywności lub metodą z rozdzielczością czasową przy użyciu laserów impulsowych.

Aby uwzględnić efekty depolaryzacyjne obiektywu o wysokiej aperturze numeryczną w mikroskopie konfokalnym62, odpowiednią formę anizotropii rozdzielonej w czasie35,63 określa wzór

Równanie równowagi statycznej, wzór r_xy(t), schemat związany z dynamiką obrotową.     (1)

gdzie Wzór na równowagę statyczną \(F_{xy,\|}(t)\); równanie fizyczne do analizy sił. i Równanie równowagi statycznej \(F_{xy,\perp}(t)\); metoda analizy dynamicznej; wzór matematyczny. intensywności fluorescencji rozdzielone w czasie w y-tym kanale detekcji po wzbudzeniu długością fali Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia., dla polaryzacji równoległej i prostopadłej l1 i l2 or są czynnikami opisującymi mieszanie się sygnałów równoległych i prostopadłych wynikające z zastosowania w tych pomiarach obiektywu o wysokiej aperturze numerycznej (NA)35,62,64Różnice w wydajności detekcji w układzie równoległym, Równania równowagi statycznej, ηV, λemV, schemat optyczny dla badania analizy emisyjnej.or prostopadły kanał detekcji, Współczynnik wydajności optycznej η dla emisji w określonych warunkach; szczegóły formuły., w przypadku barwnika są korygowane stosunkiem sprawności detekcji, Równanie procesu absorpcji i emisji światła; formuła naukowa do analizy spektroskopii optycznej.. The GUV jest również nazywany czynnikiem G.

Anizotropię fluorescencji rozdzieloną w czasie można modelować za pomocą wielowykładniczego zaniku, aby uwzględnić przyłączenie fluoroforu do większej biomolekuły, w następujący sposób:

Równanie wykładniczego zaniku, rxy(t), na schemacie analizy spektroskopii absorpcyjnej przejściowej.,     (2)

gdzie r0 to fundamentalna anizotropia zależna od fluoroforu (zazwyczaj r0 = 0.38), r∞ to anizotropia resztkowa, a ρ1 i ρ2 to odpowiednio szybki (lokalne ruchy fluoroforu) i wolny (globalny ruch makrocząsteczki) czas korelacji rotacyjnej.

W pomiarach anizotropii pojedynczych cząsteczek (Rysunek 2) rejestrowane są czasy dotarcia fotonów w celu zidentyfikowania poszczególnych emitterów przy użyciu analizy zintegrowanego czasu życia fluorescencji w serii (burst-integrated fluorescence lifetime, BIFL)33,35. Czas pośredni dotarcia fotonów (Δt) jest wygładzany za pomocą średniej kroczącej, a następnie nanoszony na wykres w celu ułatwienia wizualizacji. Histogram tych czasów jest dopasowywany do połowy rozkładu Gaussa, aby wyznaczyć średnią i odchylenie standardowe fotonów pochodzących z tła. Arbitralny próg, ustalony jako wielokrotność odchylenia standardowego, jest wykorzystywany do filtrowania pojedynczych zdarzeń przy jednoczesnej identyfikacji pierwszego i ostatniego fotonu w każdej serii. Fotony w obrębie każdej serii są następnie integrowane do dalszej analizy, która obejmuje obliczanie anizotropii fluorescencji rozdzielonej w czasie oraz anizotropii w stanie stacjonarnym opartej na intensywności, przy użyciu równań 1 i 2 lub za pomocą estymatora największej wiarygodności35. Ze względu na ograniczoną liczbę fotonów w zdarzeniach pojedynczych cząsteczek, estymator największej wiarygodności uwzględnia tylko pojedynczą składową wykładniczą i nie będzie dalej omawiany.

Na dwuwymiarowym histogramie zdarzeń pojedynczych cząsteczek średni czas życia fluorescencji (τ) oraz anizotropia (rxy) mogą być powiązane równaniem Perrina29,61 w celu wyznaczenia (ρ) jako średniego czasu rotacji.

Wzór na anizotropię fluorescencji obliczający r_xy, badanie naukowe, zmienne r_0, τ, ρ.      (3)

Konkretne wartości ρ można uzyskać z większą pewnością za pomocą analizy „podzespołu” (se), w której fotony z różnych błysków są integrowane w łączny czasowo rozdzielczy zanik anizotropii fluorescencji, który można analizować poprzez optymalizację parametrów równania 2 względem eksperymentalnego zaniku (seTRFA). Czasowo rozdzielcza anizotropia pozwala rozdzielić heterogeniczność i dynamikę związaną z ruchami rotacyjnymi (lokalnymi i globalnymi) biomolekuł w ramach emisji fluorescencji, która zachodzi w skali nanosekundowej (ns).

Aby wykryć dynamikę w zdarzeniach pojedynczych cząsteczek (w skali submilisekundowej), wprowadziliśmy analizę wariancji serii z rozdzielczością czasową dla anizotropii (traBVA)57. W metodzie traBVA, dla serii fotonów zawierającej Mi następujących po sobie segmentów fotonowych, nadmiarowa wariancja anizotropii (s2) dla serii wynosi

Wzór na wariancję; obraz równania matematycznego; statystyczna analiza danych; do celów edukacyjnych..     (4)

W przypadku pojedynczego stanu anizotropowego wariancja σ2 wynika wyłącznie z szumu śrutowego65 (sn: √N, gdzie N oznacza liczbę fotonów)

Wzór na wariancję, σ² = (rₓᵧ)(1-rₓᵧ)/m, metoda obliczania prawdopodobieństwa.     (5)

gdzie m jest liczbą fotonów w serii. Zatem, aby zidentyfikować dodatkową wariancję anizotropii, możemy zdefiniować nadmiarową wariancję anizotropii (S2) wynikającą z heterogeniczności konformacyjnej jako różnicę między równaniami 4 i 5.

Wzór na wariancję, \(S^2 = s^2 - \sigma^2\), stosowany w statystycznej analizie danych.      (6)

Aby uchwycić dynamikę występującą podczas obserwacji pojedynczych cząsteczek i uwzględnić przybliżenie wariancji, można zastosować dynamiczną analizę rozkładu fotonów anizotropii (daPDA)55,56. W metodzie daPDA natężenie fluorescencji jest modelowane zgodnie z prawdopodobieństwem warunkowym (Równania prawdopodobieństwa P(Fxy𝖨‖, Fxy⟂), analiza statystyczna, formuła matematyczna.) wyrażonym jako rozkład dwumianowy.

Równanie prawdopodobieństwa; P(Fxy,||, Fxy, ⊥|F); analiza statystyczna; wzór; fizyka; badania.     (7)

Razem z szacunkową szybkością zliczeń tła, która podlega rozkładowi Poissona

Równanie prawdopodobieństwa, wzór, rozkład Poissona, koncepcja matematyczna, analiza P(B).     (8)

gdzie Równowaga statyczna; równanie ⟨B⟩; symbol w fizyce; słowo kluczowe edukacyjne; zwięzły opis. to średnia liczba fotonów tła w ustalonym oknie czasowym. Liczby zliczeń tła równoległego i prostopadłego, Wzór równowagi statycznej ΣFx=0, równanie, schemat edukacyjny. oraz Równanie równowagi statycznej ⟨B⊥⟩, wzór do analizy bilansu, schemat badawczy edukacyjny., można zmierzyć, wykorzystując próbki buforu jako odniesienie. Eksperymentalnie wyznaczona anizotropia fluorescencji jest optymalizowana poprzez minimalizację miary dopasowania χ2 przy rozkładzie intensywności fluorescencji na kanał polaryzacji, który może uwzględniać zmiany kinetyczne.

Przedstawione procedury analizy i reprezentacje danych oferują kompleksowe podejście do interpretacji zgromadzonych wyników. Chociaż niniejszy protokół koncentruje się przede wszystkim na pomiarach konfokalnych, które mają ograniczone możliwości rejestracji zmian anizotropii w zakresie od nanosekund do milisekund, możliwe jest zastosowanie mikroskopu z całkowitym wewnętrznym odbiciem w celu monitorowania anizotropii fluorescencji w dłuższych skalach czasowych, co umożliwia analizę szeregów czasowych66. W przypadku konfokalnych pomiarów pojedynczych cząsteczek wskazujemy na zastosowanie histogramów wielowymiarowych, które tworzą unikalny odcisk palca obserwowanego zespołu. Rozkłady zaniku fluorescencji rozdzielone w czasie, zrekonstruowane z wybranych populacji, mogą śledzić ewolucję anizotropii fluorescencji w skali nanosekundowej (Rycina 3). Analiza rozkładu fotonów55,56 oraz analiza wariancji serii impulsów (BVA)57,58 mogą również rejestrować dynamikę w pośrednich skalach czasowych, pomiędzy rozkładami zaników rozdzielonymi w czasie a histogramami wielowymiarowymi. Choć protokół ten nie obejmuje zastosowania polaryzacyjnej spektroskopii korelacyjnej fluorescencji (FCS), z wzbudzeniem impulsowym lub bez67,68, która może wypełnić lukę między skalą nanosekundową a milisekundową, te same dane mogą zostać wykorzystane do obliczenia FCS69, co jednak wykracza poza zakres przedstawionego protokołu. W przypadku przeprowadzenia takich eksperymentów zaleca się dłuższy czas pomiaru próbki.

Podejście to zastosowano w odniesieniu do złożonego systemu, jakim są ludzkie białka FoxP, co pozwoliło uzyskać cenne informacje na temat ruchów zaangażowanych w ich mechanizm działania. Białka FoxP to czynniki transkrypcyjne uczestniczące w wielu aspektach fizjologicznych, takich jak rozwój mózgu i płuc; co istotne, rozpoznano różne mutacje upośledzające funkcję tych białek70,71. Wykorzystując domenę wiążącą DNA białka FoxP1 jako model, wygenerowano różne mutanty jednocysteinowe w celu wprowadzenia barwnika BODIPY-FL jako trackera ruchów (Rycina 4A). W rzeczywistości oceniono wpływ dimeryzacji oraz wiązania DNA jako głównych regulatorów strukturalnych tego białka. Stosując podejście smFA, wygenerowano wykresy 2D-smFA oraz sporządzono traBVA i daPDA dla każdego mutanta w warunkach monomerowych i dimerowych. Przedstawiono przykład jednego z badanych mutantów pojedynczych (Rycina 4). Zachowanie anizotropii jest podobne u wszystkich mutantów pod kątem określania wysokich i niskich czasów korelacji rotacyjnej, a tym samym, prawdopodobnie, zespołów nieuporządkowanych i sfałdowanych. Niemniej jednak jest ono również wysoce heterogeniczne u wszystkich mutantów pod względem frakcji i kinetyki każdego zespołu, co wskazuje na różne zmiany przejścia z porządku w nieporządek pod wpływem dimeryzacji i wiązania DNA, oraz pozwala na wysokorozdzielczy opis dynamiki strukturalnej wzdłuż łańcucha (Rycina 5).

Wykres anizotropii, analiza FA w funkcji czasu oraz 2D-smFA dynamiki molekularnej i zmian strukturalnych.
Rycina 1: Zakres dynamiczny biomolekuł i metody anizotropii fluorescencji. (A) Anizotropia małych fluoroforów przyłączonych w różnych pozycjach wzdłuż szkieletu badanej biomolekuły dostarcza informacji o lokalnej dynamice strukturalnej. (B) Skale czasowe badane za pomocą zaników natężenia fluorescencji (anizotropia fluorescencji w funkcji czasu, FA) oraz histogramy pojedynczych cząsteczek z danych mikroskopu konfokalnego do badania pojedynczych cząsteczek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat układu lasera wzbudzającego, metoda spektroskopii absorpcji przejściowej z wynikami analizy danych.
Rycina 2: Rejestracja i przetwarzanie danych anizotropii fluorescencji pojedynczych cząsteczek. (A) Swobodnie dyfundujące cząsteczki są analizowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu do pojedynczych cząsteczek, wyposażonego w pojedynczy liniowo spolaryzowany laser wzbudzający (w naszym przypadku niebieski). Emisja fluorescencji (w naszym przypadku zielona) jest wykrywana przez dwa detektory po tym, jak polaryzator wiązki rozdziela sygnał na dwie polaryzacje (równoległą, Płytki do cienkowarstwowej chromatografii (TLC) ilustrujące schemat procesu rozdziału., i prostopadłą, Symbol w kształcie litery T, relacja prostopadłości; schemat pojęcia geometrycznego; zasada równowagi statycznej., względem źródła wzbudzenia). (B) Każdy wykryty foton jest charakteryzowany przez trzy parametry: mikroczas, makroczas oraz typ kanału. Dane są zapisywane w formacie Time-Tagged Time-Resolved (TTTR)72. (C) Wybuchy (bursts) poszczególnych cząsteczek są wybierane i przetwarzane w celu wyodrębnienia parametrów fluorescencji, w tym anizotropii fluorescencji dla każdej obserwowanej cząsteczki. (D) Dane są przedstawione na kilka sposobów, w tym za pomocą dwuwymiarowych wykresów anizotropii fluorescencji w funkcji czasu życia fluorescencji oraz rozkładów anizotropii rozdzielonych w czasie. Reprezentacje te umożliwiają wizualne i ilościowe określenie czasów życia fluorescencji, czasów korelacji rotacyjnej oraz heterogeniczności układu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza anizotropii fluorescencji; diagram 2D-smFA, fluorescencja TR, wyniki seTRFA.
Rycina 3: Reprezentatywne dane dla dimeru FoxP1 z zamianą domen. (A) Korelacja anizotropii fluorescencji (rscatter) z średnim czasem życia fluorescencji na cząsteczkę przedstawiona w formie wykresu konturowego. Nałożenie pojedynczego równania Perrina dla dwóch komponentów rotacyjnych jako reprezentanta średniej zespołu cząsteczek, przy założeniu ρ1 i ρ2 wynoszących odpowiednio 0.2 ns i 8.5 ns. (B) Przebiegi zaniku fluorescencji rozdzielonej w czasie dla podzespołów są wykorzystywane do obliczenia anizotropii fluorescencji próbki rozdzielonej w czasie. Dopasowanie za pomocą równania 2 pozwoliło rozdzielić lokalne i globalne komponenty anizotropii fluorescencji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza oddziaływań białkowych; schematy przedstawiają strukturę FoXP1 oraz wyniki 2D-smFA, traBVA i daPDA.
Rycina 4: Dynamika FoxP1 w skali submilisekundowej monitorowana za pomocą anizotropii fluorescencji pojedynczych cząsteczek (smFA). (A) Schematyczna reprezentacja struktury monomeru FoxP1. (B) Dwuwymiarowy histogram ilustrujący heterogeniczność dynamiczną, ujawniający dwa wyraźne czasy korelacji rotacyjnej zidentyfikowane za pomocą anizotropii fluorescencji rozdzielonej w czasie. Analiza wariancji impulsów anizotropii rozdzielonej w czasie (traBVA) ujawnia niewielki podzbiór zdarzeń z nadmiarową wariancją (Eq. 6), które wykazują dużą anizotropię. Ilościowa analiza dynamicznej anizotropii z wykorzystaniem analizy rozkładu fotonów (PDA) pozwala na dalsze wyznaczenie szybkości wymiany w tym procesie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza oddziaływań białkowych: schemat monomeru/dimeru FoxP1, wykres rozproszenia wariancji, wykres słupkowy frakcji.
Rysunek 5: Przesiewanie ruchów lokalnych i globalnych FoxP1 podczas dimeryzacji. (A) Schematyczna reprezentacja porównująca monomer FoxP1 z jego formą dimeryczną. (B) Przedstawiono średnią nadmiarową wariancję w zależności od lokalizacji w warunkach monomeru i dimeru; większa nadmiarowa wariancja wskazuje na istotniejsze zmiany anizotropii. (C) Analiza anizotropii dynamicznej z wykorzystaniem analizy rozkładu fotonów (PDA) pomaga określić frakcje populacyjne (wysoka anizotropia w ciemnych kolorach i niska anizotropia w jasnych kolorach) w obecności (żółty) i braku (zielony) DNA. W tym podejściu oszacowano szybkości (niewykazane) przejść między zachowaniami lokalnymi a globalnymi, co wykazało, że FoxP1 ulega częściowemu rozfałdowaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W przypadku eksperymentów z anizotropią fluorescencji pojedynczych cząsteczek kluczowe jest dokładne rozważenie właściwości fotofizycznych wybranego fluoroforu. Właściwości te obejmują długość fali emisyjnej, która musi być zgodna z systemem detekcji, oraz długość fali wzbudzenia, która powinna być kompatybilna z dostępnymi laserami impulsowymi. Aby zoptymalizować zakres dynamiki, fluorofor powinien mieć długi czas trwania fluorescencji w stosunku do czasu dyfuzji rotacyjnej cząsteczki. Ma to kluczowe znaczenie dla śledzenia dynamiki rotacji i wiązania/orientacji dipola fluoroforu względem biomolekuły będącej przedmiotem zainteresowania. Ponadto jasność, fotostabilność i wydajność kwantowa są niezbędne do wytwarzania silnych sygnałów o stabilnym stosunku sygnału do szumu. Z tych powodów BODIPY-FL został wybrany jako fluorofor w kilku badaniach 39,40,42.

Badania przesiewowe dynamiki szkieletu biomolekuł często wymagają znakowania białek, zwykle osiąganego poprzez znakowanie specyficzne dla miejsca. Zwykle odbywa się to poprzez wprowadzenie pozostałości do ukierunkowanej modyfikacji chemicznej. Najczęstszym podejściem jest wprowadzanie cystein w interesujące ich miejsca, gdzie ich tiolowe łańcuchy boczne mogą być selektywnie modyfikowane za pomocą odczynników, takich jak maleimidy lub jodoacetamidy. Rzadziej halogenki benzylowe i ketony bromometylowe są używane do tworzenia wiązań tioeterowych. Inne łańcuchy boczne aminokwasów również mogą być celowane, ale ich obfitość w białkach jest rzadziej stosowana. Można jednak również stosować alternatywne podejścia, takie jak nienaturalne aminokwasy73. Właściwy wybór miejsca do znakowania ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania ingerencji w badaną biomolekułę i należy wprowadzić odpowiednie kontrole. Na przykład, jeśli znakowana cząsteczka jest używana w testach wiązania, uzupełniające metody bezznacznikowe powinny sprawdzić, czy fluorofory nie wpływają na powinowactwo wiązania.

Po zidentyfikowaniu odpowiedniej próbki i wdrożeniu optymalnej strategii znakowania, następnym krokiem jest upewnienie się, że mikroskop konfokalny jest prawidłowo ustawiony i skalibrowany do eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami. W protokole opisano, w jaki sposób określić wymagany współczynnik do dalszej analizy. Po skalibrowaniu przyrządu następnym krokiem jest zmierzenie próbki i przetworzenie danych w celu wydobycia jak największej ilości informacji z wykrytych fotonów. Kluczowe parametry, takie jak mikroczas, makroczas i typ kanału, jak pokazano na rysunku 2, mogą być wykorzystane do dalszej analizy i wizualizacji przy użyciu typowej elektroniki TCSPC.

Najnowsze osiągnięcia w spektroskopii fluorescencji pojedynczych cząsteczek mogą być szeroko wykorzystywane do badania informacji strukturalnych z heterogenicznych zespołów biomolekuł. Jednak stosunkowo niewiele badań wykorzystuje spostrzeżenia dostarczane przez anizotropię fluorescencji, a do uzyskania dynamiki strukturalnej biomolekuł wymagany jest kompletny model białkowy. W związku z tym rozwikłanie dynamiki interakcji międzydomenowych i białko-białko kilku czynników transkrypcyjnych jest wyzwaniem.

Podsumowując, eksperymenty z anizotropią fluorescencji pojedynczych cząsteczek dostarczają uzupełniających informacji na temat lokalnych i globalnych ruchów szkieletu biomolekularnego, które mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia jego funkcji.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w stosunku do treści tego artykułu.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez FONDECYT przyznaje 11200729 i FONDEQUIP EQM200202 dla E.M., NIH R15CA280699 R01GM151334 i NSF CAREER MCB 1749778 nagrody dla HS. NK podziękował za wsparcie ze strony programu stypendiów podoktoranckich Uniwersytetu Clemson.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Alexa Fluor 488ThermoFisher ScienctificA20100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 10 kDaMWCO Millipore SigmaUFC901008https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010
Sól sodowa ampicylinyMillipore SigmaA0166-5Ghttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166
BODIP FL Maleimid (BODIPY FL N-(2-aminoetylo))Maleimid))ThermoFisher ScienctificB10250https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250
Jednorazowe kolumny odsalające PD 10Millipore SigmaGE17-0851-01https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101
DithiothreitolMillipore Sigma10197777001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro
DMSO, bezwodnyThermoFisher ScienctificD12345
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345 DNAseMillipore Sigma10104159001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001
E. coli Komórki bakteryjne C41 Invitrogen
Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, kolumna 5 mlBio-Rad12004037https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037
HEPESMillipore Sigma7365-45-9https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375
ImidazoleMillipore Sigma288-32-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513
https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758 MCE IPTGMillipore SigmaI6758-1G
, 0,22 μ m Wielkość porówMillipore Sigma GSWP02500https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500
NaClMillipore Sigma7647-14-5https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014
System prowadnic komorowych Nunc Lab-Tek IIThermoFisher Scienctific154534https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534
OverExpress C41(DE3) Chemicznie Kompetentne komórkiMillipore SigmaCMC0017-20X40ULhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017
PMSFMillipore Sigma329-98-6https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830
Rodamina 110ThermoFisher Scienctific419075000https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000
Sód fosforan dwuzasadowyMillipore Sigma7558-79-4https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodnyMilipore Sigma13472-35-0https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505
TCEP, chlorowodorek, odczynnik klasyMillipore Sigma580567-5GMhttps://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567
Animacja 20milipore Sigma11332465001https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001
Filtr membranowy

Bibliografia

  1. Cooper, A. Thermodynamic fluctuations in protein molecules. Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (8), 2740-2741 (1976).
  2. Volozhin, S. I. Inguinal hernia in cryptorchism. Khirurgiia (Mosk). 450 (7), 69-71 (1975).
  3. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838-844 (2007).
  4. Karplus, M., Mccammon, J. A. The internal dynamics of globular-proteins. CRC Crit Rev Biochem. 9 (4), 293-349 (1981).
  5. Ishima, R., Torchia, D. A. Protein dynamics from nmr. Nat Struct Biol. 7 (9), 740-743 (2000).
  6. Fernandez, F. J., Querol-Garcia, J., Navas-Yuste, S., Martino, F., Vega, M. C. X-ray crystallography for macromolecular complexes. Adv Exp Med Biol. 3234, 125-140 (2024).
  7. Bai, X. C., Mcmullan, G., Scheres, S. H. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  8. Wright, P. E., Dyson, H. J. Intrinsically unstructured proteins: Re-assessing the protein structure-function paradigm. J Mol Biol. 293 (2), 321-331 (1999).
  9. Tompa, P. Intrinsically unstructured proteins. Trends Biochem Sci. 27 (10), 527-533 (2002).
  10. Dyson, H. J., Wright, P. E. Intrinsically unstructured proteins and their functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (3), 197-208 (2005).
  11. Csermely, P., Palotai, R., Nussinov, R. Induced fit, conformational selection and independent dynamic segments: An extended view of binding events. Trends Biochem Sci. 35 (10), 539-546 (2010).
  12. Camacho-Zarco, A. R., et al. NMR provides unique insight into the functional dynamics and interactions of intrinsically disordered proteins. Chem Rev. 122 (10), 9331-9356 (2022).
  13. Drenth, J. Principles of Protein X-Ray Crystallography. , Springer, Verlag. New York, NY. (2007).
  14. Loeb, H. Systematic diagnosis of chronic diarrhea in infants and small children. Kinderarztl Prax. 44 (1), 36-41 (1976).
  15. Ellaway, J. I. J., et al. Identifying protein conformational states in the protein data bank: Toward unlocking the potential of integrative dynamics studies. Struct Dyn. 11 (3), 034701(2024).
  16. Berjanskii, M. V., Wishart, D. S. A simple method to predict protein flexibility using secondary chemical shifts. J Am Chem Soc. 127 (43), 14970-14971 (2005).
  17. Puthenveetil, R., Vinogradova, O. Solution NMR: A powerful tool for structural and functional studies of membrane proteins in reconstituted environments. J Biol Chem. 294 (44), 15914-15931 (2019).
  18. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule fret measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  19. Weidtkamp-Peters, S., et al. Multiparameter fluorescence image spectroscopy to study molecular interactions. Photochem Photobiol Sci. 8 (4), 470-480 (2009).
  20. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. M. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  21. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for fret-restrained high-precision structural modeling. Nat Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  22. Peulen, T. O., Opanasyuk, O., Seidel, C. aM. Combining graphical and analytical methods with molecular simulations to analyze time-resolved fret measurements of labeled macromolecules accurately. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241 (2017).
  23. Hamilton, G. L., Sanabria, H. Multiparameter Fluorescence Spectroscopy of Single Molecules. Spectroscopy and Dynamics of Single Molecules. , Elsevier. Cambridge, MA. (2019).
  24. Kolimi, N., et al. Out-of-equilibrium biophysical chemistry: The case for multidimensional, integrated single-molecule approaches. J Phys Chem B. 125 (37), 10404-10418 (2021).
  25. Felekyan, S., Sanabria, H., Kalinin, S., Kuhnemuth, R., Seidel, C. A. Analyzing forster resonance energy transfer with fluctuation algorithms. Methods Enzymol. 519, 39-85 (2013).
  26. Medina, E. D. R. L., Sanabria, H. Unraveling protein's structural dynamics: From configurational dynamics to ensemble switching guides functional mesoscale assemblies. Curr Opin Struct Biol. 66, 129-138 (2021).
  27. Aznauryan, M., et al. Comprehensive structural and dynamical view of an unfolded protein from the combination of single-molecule FRET, NMR, and SAXS. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (37), E5389-E5398 (2016).
  28. Gomes, G. W., et al. Conformational ensembles of an intrinsically disordered protein consistent with NMR, SAXS, and single-molecule fret. J Am Chem Soc. 142 (37), 15697-15710 (2020).
  29. Perrin, F. Polarisation de la lumière de fluorescence. Vie moyenne des molécules dans l'etat excité. J phys radium. 7 (12), 390-401 (1926).
  30. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. I. Theory and experimental method. Biochem J. 51 (2), 145-155 (1952).
  31. Weber, G. Polarization of the fluorescence of macromolecules. II. Fluorescent conjugates of ovalbumin and bovine serum albumin. Biochem J. 51 (2), 155-167 (1952).
  32. Jameson, D. M., Ross, J. A. Fluorescence polarization/anisotropy in diagnostics and imaging. Chem Rev. 110 (5), 2685-2708 (2010).
  33. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Gunther, R., Seidel, C. A. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  34. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. aM. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  35. Schaffer, J., et al. Identification of single molecules in aqueous solution by time-resolved fluorescence anisotropy. Journal of Physical Chemistry A. 103 (3), 331-336 (1999).
  36. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  37. Gradinaru, C. C., Marushchak, D. O., Samim, M., Krull, U. J. Fluorescence anisotropy: From single molecules to live cells. Analyst. 135 (3), 452-459 (2010).
  38. Mazal, H., Haran, G. Single-molecule fret methods to study the dynamics of proteins at work. Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).
  39. Tsytlonok, M., et al. Specific conformational dynamics and expansion underpin a multi-step mechanism for specific binding of p27 with cdk2/cyclin a. J Mol Biol. 432 (9), 2998-3017 (2020).
  40. Tsytlonok, M., et al. Dynamic anticipation by cdk2/cyclin a-bound p27 mediates signal integration in cell cycle regulation. Nat Commun. 10 (1), 1676(2019).
  41. Cruz, P., et al. Domain tethering impacts dimerization and DNA-mediated allostery in the human transcription factor foxp1. J Chem Phys. 158 (19), (2023).
  42. Kolimi, N., et al. DNA controls the dimerization of the human foxp1 forkhead domain. Cell Rep Phys Sci. 5 (3), 101854(2024).
  43. Yanez Orozco, I. S., et al. Identifying weak interdomain interactions that stabilize the supertertiary structure of the n-terminal tandem PDZ domains of PSD-95. Nat Commun. 9 (1), 3724(2018).
  44. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  45. Rigler, R., Elson, E. S. Fluorescence Correlation Spectroscopy: Theory and Applications. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2012).
  46. Aragon, S. R., Pecora, R. Fluorescence correlation spectroscopy as a probe of molecular-dynamics. J Chem Phys. 64 (4), 1791-1803 (1976).
  47. Mockel, C., et al. Integrated NMR, fluorescence, and molecular dynamics benchmark study of protein mechanics and hydrodynamics. J Phys Chem B. 123 (7), 1453-1480 (2019).
  48. Shu, W., Yang, H., Zhang, L., Lu, M. M., Morrisey, E. E. Characterization of a new subfamily of winged-helix/forkhead (Fox) genes that are expressed in the lung and act as transcriptional repressors. J Biol Chem. 276 (29), 27488-27497 (2001).
  49. Co, M., Anderson, A. G., Konopka, G. Foxp transcription factors in vertebrate brain development, function, and disorders. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (5), e375(2020).
  50. Takahashi, H., Takahashi, K., Liu, F. -C. FOXP Genes, Neural Development, Speech and Language Disorders. Forkhead Transcription Factors: Vital Elements in Biology and Medicine. , Springer. New York, NY. (2009).
  51. Wang, B., Lin, D., Li, C., Tucker, P. Multiple domains define the expression and regulatory properties of foxp1 forkhead transcriptional repressors. J Biol Chem. 278 (27), 24259-24268 (2003).
  52. Leake, M. C., Quinn, S. D. A guide to small fluorescent probes for single-molecule biophysics. Chem Phys Rev. 4 (1), 011302(2023).
  53. Zhang, H., Wu, Q., Berezin, M. Y. Fluorescence anisotropy (polarization): From drug screening to precision medicine. Expert Opin Drug Discov. 10 (11), 1145-1161 (2015).
  54. Ma, J., et al. High precision fret at single-molecule level for biomolecule structure determination. J Vis Exp. (123), e55623(2017).
  55. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. J Phys Chem B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  56. Mcgeer, P. L., Mcgeer, E. G. Enzymes associated with the metabolism of catecholamines, acetylcholine and gaba in human controls and patients with parkinson's disease and huntington's chorea. J Neurochem. 26 (1), 65-76 (1976).
  57. Terterov, I., Nettels, D., Makarov, D. E., Hofmann, H. Time-resolved burst variance analysis. Biophys Rep (N Y). 3 (3), 100116(2023).
  58. Torella, J. P., Holden, S. J., Santoso, Y., Hohlbein, J., Kapanidis, A. N. Identifying molecular dynamics in single-molecule fret experiments with burst variance analysis. Biophys J. 100 (6), 1568-1577 (2011).
  59. Haugland, R. P. The Handbook: A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Molecular Probes. , (2005).
  60. Medina, E., et al. Intrinsically disordered regions of the DNA-binding domain of human foxp1 facilitate domain swapping. J Mol Biol. 432 (19), 5411-5429 (2020).
  61. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. New York, NY. (2007).
  62. Koshioka, M., Sasaki, K., Masuhara, H. Time-dependent fluorescence depolarization analysis in three-dimensional microspectroscopy. Appl Spectrosc. 49 (2), 224-228 (1995).
  63. Kudryavtsev, V., et al. Combining mfd and pie for accurate single-pair forster resonance energy transfer measurements. Chemphyschem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  64. Van Zanten, T. S., Greeshma, P. S., Mayor, S. Quantitative fluorescence emission anisotropy microscopy for implementing homo-fluorescence resonance energy transfer measurements in living cells. Mol Biol Cell. 34 (6), tp1(2023).
  65. Laine, R. F., Jacquemet, G., Krull, A. Imaging in focus: An introduction to denoising bioimages in the era of deep learning. Int J Biochem Cell Biol. 140, 106077(2021).
  66. Strohl, F., Wong, H. H. W., Holt, C. E., Kaminski, C. F. Total internal reflection fluorescence anisotropy imaging microscopy: Setup, calibration, and data processing for protein polymerization measurements in living cells. Methods Appl Fluoresc. 6 (1), 014004(2017).
  67. Loman, A., Gregor, I., Stutz, C., Mund, M., Enderlein, J. Measuring rotational diffusion of macromolecules by fluorescence correlation spectroscopy. Photochem Photobiol Sci. 9 (5), 627-636 (2010).
  68. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem Phys Lett. 353 (5-6), 439-445 (2002).
  69. Peulen, T. -O., et al. Tttrlib: Modular software for integrating fluorescence spectroscopy, imaging, and molecular modeling. arXiv. , (2024).
  70. Le Fevre, A. K., et al. Foxp1 mutations cause intellectual disability and a recognizable phenotype. Am J Med Genet A. 161A (12), 3166-3175 (2013).
  71. Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in foxp1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87 (5), 671-678 (2010).
  72. Wahl, M., Orthaus-Müller, S. Time tagged time-resolved fluorescence data collection in life sciences. , https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2014).
  73. Lemke, E. A. Site-specific labeling of proteins for single-molecule fret measurements using genetically encoded ketone functionalities. Methods Mol Biol. 751, 3-15 (2011).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Analiza pojedynczych cz steczekmikroskopia konfokalnadimeryzacja FoxP1dynamika wi zania DNAanaliza wariancji serii sygna wanaliza rozk adu foton wznakowanie bia ekdynamika strukturalnapomiary z rozdzielczo ci czasow
Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.