Ten raport opisuje metodę pomiaru czasu do powalenia dorosłej Drosophila melanogaster za pomocą Monitora Aktywności Drosophila (DAM2) w odpowiedzi na stresor cieplny przewodnictwa powietrza w komorze inkubatora. DAM2 mierzy aktywność, rejestrując ruchy poszczególnych much, gdy przecinają one wiązkę podczerwieni. Analizę danych ułatwia stworzony przez autorów nowatorski plik wykonywalny.
Artykuł metodologiczny
Testy tolerancji ciepła przy użyciu systemu monitorowania aktywności Drosophila: przewodnik po wykonywalnej aplikacji do analizy danych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Badanie tolerancji na ciepło u Drosophila melanogaster było szczególnie interesujące dla badaczy od dziesięcioleci, a powszechnym podejściem do oceny tolerancji na ciepło jest monitorowanie czasu do powalenia (TKD) po ekspozycji na podwyższoną temperaturę. Klasycznie muchy są umieszczane w pojedynczych fiolkach i umieszczane w podgrzewanej łaźni wodnej. TKD jest następnie monitorowane ręcznie przez badaczy. Chociaż są one bardzo dobrze ugruntowane, nadal istnieją problemy z subiektywizmem i konsekwentnym stosowaniem namacalnej definicji ustania wszystkich ruchów, w tym skurczów mięśni, podczas wdrażania tych ręcznych testów. Opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę automatyzacji testów tolerancji ciepła przy użyciu monitorów aktywności TriKinetics Drosophila (DAM2). Do systemu DAM2 napisaliśmy program i stworzyliśmy łatwy w użyciu plik wykonywalny, który automatycznie odczytuje czas ostatniego ruchu z wygenerowanych danych dotyczących aktywności. Ten skrypt następnie zapisuje w pliku .csv czas do paraliżu cieplnego (TKD) dla każdej muchy. Nasze dane pokazują, że ta zautomatyzowana metoda DAM2 jest spójna i niezawodna. Tymczasem interesujące są profile aktywności utworzone na podstawie danych o liczbie aktywności. Te profile aktywności mogą być kompilowane i mają potencjał do rozszerzenia testów tolerancji na ciepło o stosunkowo niezbadane behawioralne składniki tolerancji ciepła. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak korzystać z systemu DAM2 i HoTDAM! oprogramowanie do szacowania tolerancji na ciepło u D. melanogaster.
Wprowadzenie
Ektotermy zazwyczaj reagują na stres cieplny zwiększoną aktywnością lokomotoryczną. Zjawisko to jest widoczne dla badaczy od dziesięcioleci, z charakterystyczną reakcją behawioralną opisaną przez Cowlesa i Bogerta w 19441. Opisali, w jaki sposób organizm poddany stresowi cieplnemu najpierw wykazuje wzmożony ruch lokomotoryczny. W miarę narastania stresu cieplnego krótkie okresy aktywności przeplatają się z okresami bezczynności. Temperatura, w której organizm nie może już wykazywać skoordynowanych ruchów, jest krytycznym maksimum termicznym (CTmax). Następuje spam mięśniowy, a ostatecznie organizm się załamuje1,2. Upadek ten jest trudny do zdefiniowania i reprezentuje coś w rodzaju "rygoru cieplnego, śpiączki lub śmierci"2. Tutaj użyjemy terminu zapadnięcie fizjologiczne, aby teoretycznie odnieść się do tego niewyraźnego punktu końcowego stresu cieplnego.
Drosophila melanogaster i inne małe owady były cennymi modelami do badania stresu cieplnego. Aby oszacować przynajmniej część złożonego zbioru cech, które składają się na tolerancję na ciepło, wielu badaczy ręcznie obserwowało czas i temperaturę, w której następuje zapadanie fizjologiczne, reprezentujące odpowiednio czas do powalenia (TKD) i CTmax. Chociaż te ręczne metody oznaczania są bardzo dobrze ugruntowane, mają pewne wady. Operacyjna definicja zapaści fizjologicznej może być trudna do ustalenia i odpowiedniego zastosowania do wszystkich przypadków, zwłaszcza gdy obserwatorzy są mniej doświadczeni. Na przykład, w którym momencie organizm przechodzi od skurczów mięśni do zapaści? Wzorzec skurczów mięśni i aktywności napadowej przed upadkiem może być nieprzewidywalny i może komplikować dokładną obserwację2,3, zagrażając dokładności i precyzji. Tymczasem trudność w obserwacji ogranicza również liczbę organizmów, które można oznaczyć w tym samym czasie, co ogranicza skalowalność.
Ponieważ wzrost aktywności jest konsekwentną reakcją na ciepło, a TKD i CTmax są ostatecznie punktem, w którym aktywność ustaje, staraliśmy się wykorzystać Monitory Aktywności Drosophila (DAM2) firmy TriKinetics do automatyzacji testów tolerancji ciepła. Niedawno opublikowaliśmy metodę automatycznego testu, wraz z łatwym w użyciu oprogramowaniem, przy użyciu systemu DAM2 4. Test został zwalidowany poprzez porównanie miar tolerancji ciepła pod względem TKD z klasycznym ręcznym testem TKD opartym na obserwacji w odniesieniu do kilku czynników. Zbadaliśmy również składnik aktywności lokomotorycznej w testach TKD, aby dokładniej scharakteryzować indukowalny fenotyp termotolerancji. Test i towarzyszące mu oprogramowanie nazwaliśmy HoTDAM! (Testy tolerancji ciepła przy użyciu Systemu Monitorowania Aktywności Drosophila). Poniżej przedstawiamy szczegółowy opis metody automatycznego oznaczania tolerancji ciepła przy użyciu systemu DAM2 i HoTDAM! oprogramowanie. Test jest łatwy w użyciu i łatwo skalowalny, aby umożliwić pomiar wielu organizmów jednocześnie.
W tym manuskrypcie przeprowadziliśmy testy TKD na termosensorycznie zmutowanych muszkach (przejściowy potencjał receptora ankyryna 1; TRPA1) i ich kontrola genetyczna (biały1118; w1118). Organizmy te zostały wybrane w celu podkreślenia znaczenia charakterystycznej zwiększonej aktywności obserwowanej podczas stresu cieplnego dla testu. Mianowicie, organizmy TRPA1 nie wykazują tego zachowania ucieczki, co ilustruje wewnętrzny związek między konserwatywnymi reakcjami behawioralnymi a szacunkami tolerancji na ciepło, takimi jak TKD. Przeprowadziliśmy test zarówno dla samic, jak i samców, wraz z wdrożeniem obróbki wstępnej utwardzania termicznego. Przedstawione tutaj reprezentatywne wyniki są danymi z całkowicie nowych testów niż te, które zostały wykorzystane w pierwotnie opublikowanych testach walidacyjnych.
Protokół
1. Hodowla much
- Wybierz odpowiednią linię/szczep muszek do badania.
UWAGA: Aby zilustrować test, wykorzystano szczep z nokautem potencjału przejściowego TRPA1 oraz jego kontrolę genetyczną, szczep w1118. - Utrzymuj szczepy muszek w stałych, odpowiednich warunkach. W celu realizacji niniejszego protokołu, hoduj szczepy w temperaturze 25 ˚C w cyklu dobowym 12:12 na standardowej pożywce (mąka kukurydziana, melasa i drożdże torula).
- Rozdziel samce i samice przy użyciu lekkiej anestezji.
UWAGA: W zależności od eksperymentu można użyć muszek dziewiczych lub kopulowanych.- Pozostaw dorosłe samce i samice (osobno dla obu szczepów) w celu kopulacji i składania jaj przez 5 dni. Usuń dorosłe osobniki z butelek.
- Gdy kilka dni później zaczną wykluwać się dorosłe osobniki, ponownie oczyść butelki. Po 2 dniach rozdziel samce i samice, stosując lekką anestezję eterową, i pozwól im dojrzewać oddzielnie w zagęszczeniu 25 muszek na fiolkę.
2. Obróbka wstępna
- Zastosuj wstępną obróbkę lub zmienną niezależną, która zdefiniuje grupy eksperymentalne (genetyczną, środowiskową, farmakologiczną lub inną).
- Aby postępować zgodnie z niniejszym protokołem, oddziel osobniki dorosłe według płci, a po 5 dniach poddaj połowę z nich wstępnej obróbce poprzez zanurzenie szczelnie zamkniętej fiolki z organizmami w łaźni wodnej w temperaturze 37 ˚C przez 1 h. Grupę kontrolną przechowuj w inkubatorze w temperaturze 25 ˚C. Przed przeprowadzeniem testu tolerancji cieplnej pozwól muchom na regenerację przez 24 h po wstępnej obróbce.
3. Konfiguracja systemu DAM2
- Przenieś muchy do probówek monitora DAM2 i zakorkuj oba końce probówek watą. Jeśli muchy mają zostać poddane ocenie tolerancji cieplnej natychmiast, nie stosuj żadnej anestezji podczas przenoszenia organizmów do probówek monitora, aby uniknąć potencjalnych efektów zakłócających związanych z ekspozycją na środek znieczulający. Zamiast tego, odsysaj pojedyncze muchy z fiolek hodowlanych do probówek monitora.
- Umieść probówki testowe w monitorach aktywności, odnotowując numery slotów, do których wprowadzono poszczególne grupy.
UWAGA: W zależności od eksperymentu rozmieszczenie może być randomizowane, jeśli lokalizacja wewnątrz monitora mogłaby zostać uznana za zmienną zakłócającą. - Oprogramowanie do akwizycji danych DAM2
UWAGA: System i oprogramowanie DAM2 są szczegółowo opisane w arkuszu danych DAMSystem3 Software Data Sheet dostępnym na stronie internetowej firmy (patrz Tabela materiałów). W celu rozwiązania konkretnych problemów oraz zapoznania się z ogólną funkcjonalnością należy odnieść się do instrukcji DAM2. Poniżej przedstawiamy wskazówki dotyczące korzystania z systemu w kontekście naszego testu tolerancji cieplnej.- System DAM2 monitoruje liczbę razy, gdy pojedyncza mucha w każdej probówce przecina wiązkę podczerwieni. Oprogramowanie do akwizycji danych indeksuje i resetuje to zliczenie w każdym zdefiniowanym odstępie czasu. W sekcji preferences (preferencje) wybierz reading interval (interwał odczytu), który zostanie zastosowany w teście. Ustaliliśmy, że interwał odczytu wynoszący 15 s zapewnia dobrą równowagę między rozdzielczością a błędami odczytu.
UWAGA: Zaleca się, aby interwał odczytu w sekundach nie był krótszy niż liczba używanych monitorów. Krótszy interwał odczytu zapewni lepszą rozdzielczość czasową testu, ale potencjalnie zwiększy również liczbę błędów odczytu. Oprogramowanie może nie nadążać z indeksowaniem odczytów. Ponadto nowszy, szybszy komputer w znacznym stopniu pomaga zapobiegać błędom odczytu. - Biorąc pod uwagę błędy odczytu, upewnij się, że komputer używany do uruchamiania oprogramowania do akwizycji danych DAM2 jest ustawiony tak, aby nigdy nie przechodził w tryb uśpienia ani hibernacji, aby nie przerwać testu. Ponadto upewnij się, że auto-updates (automatyczne aktualizacje, w tym wszelkie aktualizacje sieciowe kontrolowane przez instytucję) są wyłączone podczas gromadzenia danych.
- Sprawdź, czy wszystkie monitory są podłączone i komunikują się z oprogramowaniem. Potwierdź, że status każdego monitora jest zielony w zakładce current data (bieżące dane).
UWAGA: Szczegóły dotyczące tego, jakie problemy oznaczają poszczególne kody kolorów, znajdują się w arkuszu danych DAMSystem3 Software Datasheet. - Oprogramowanie do akwizycji danych automatycznie zapisze wyniki aktywności w plikach tekstowych w folderze Data w plikach systemowych. Aby ułatwić analizę danych, usuń wszelkie pliki tekstowe z tego folderu Data przed uruchomieniem oprogramowania do akwizycji danych dla każdego testu.
UWAGA: Pliki tekstowe zostaną utworzone automatycznie, więc dopuszczalne jest usunięcie ich z tego folderu w celu wyczyszczenia starych danych bez utrudniania pracy programu.
- System DAM2 monitoruje liczbę razy, gdy pojedyncza mucha w każdej probówce przecina wiązkę podczerwieni. Oprogramowanie do akwizycji danych indeksuje i resetuje to zliczenie w każdym zdefiniowanym odstępie czasu. W sekcji preferences (preferencje) wybierz reading interval (interwał odczytu), który zostanie zastosowany w teście. Ustaliliśmy, że interwał odczytu wynoszący 15 s zapewnia dobrą równowagę między rozdzielczością a błędami odczytu.
4. Test tolerancji na wysoką temperaturę
- Umieść monitory w inkubatorze do analizy.
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji i pozwól mu indeksować przez określony czas (np. 40 indeksów lub 10 min, jeśli odstęp odczytu jest ustawiony na 15 s) przed zastosowaniem stresu cieplnego.
UWAGA: Pozwala to na aklimatyzację w probówkach i regenerację po przemieszczaniu monitorów podczas ich ustawiania. Szczególnie w przypadku analizy aktywności podczas testu, czas ten pozwoli na ustalenie bazowej aktywności przed indukcją stresu cieplnego. W zależności od specyfiki wykonywanej analizy, fazę aklimatyzacji można pominąć, umieszczając monitory bezpośrednio w inkubatorze już w temperaturze stresowej. - W przypadku przeprowadzania statycznego testu (TKD), ustaw inkubator tak, aby temperatura rosła tak szybko, jak to możliwe, do wyznaczonej temperatury szkodliwej po okresie aklimatyzacji. Zmienną odpowiedzią będzie ostatni zarejestrowany czas ruchu (tj. ostatni niezerowy indeks) w celu oszacowania TKD.
- W przypadku przeprowadzania testu dynamicznego, określ tempo wzrostu temperatury po okresie aklimatyzacji. W tym przypadku zmienną odpowiedzią jest ponownie czas. Moment zarejestrowania ostatniego ruchu będzie odpowiadał konkretnej temperaturze (CTmax), w zależności od tempa wzrostu temperatury.
- Monitoruj liczbę aktywności w czasie rzeczywistym na wyświetlaczu systemu DAM w oprogramowaniu do akwizycji lub bezpośrednio analizuj pliki tekstowe w folderze danych w plikach programu DAMSystem3. Kopiuj pliki tekstowe i otwieraj kopię, a nie plik oryginalny w folderze danych, aby uniknąć problemów z zapisywaniem danych na żywo.
- Po kilku minutach braku ruchu u wszystkich much zatrzymaj oprogramowanie do akwizycji.
UWAGA: W naszych analizach stwierdziliśmy, że od kilku do kilkunastu minut braku aktywności świadczy o załamaniu fizjologicznym spowodowanym stresem cieplnym, podobnym do tego obserwowanego w klasycznych ręcznych testach TKD. Jest to jednak zależne od spontanicznych zachowań ucieczkowych. W związku z tym należy wziąć pod uwagę możliwe zmienne zakłócające, jeśli konkretna metoda traktowania w badaniu może zmienić tę reakcję behawioralną. Ponadto długość testu będzie oczywiście różnić się w zależności od konkretnych parametrów analizy (np. temperatury, traktowania).
5. Organizacja i analiza danych
UWAGA: Zobacz Supplemental Video S1, aby zapoznać się z instrukcją pobierania aplikacji wykonywalnej z serwisu GitHub, a także z podstawowymi funkcjami oprogramowania.
- Po pozyskaniu danych, przeskanuj pliki tekstowe w poszukiwaniu błędów za pomocą referowanego oprogramowania (patrz Tabela materiałów) i wybierz konkretne punkty początkowe i końcowe dla binowania danych o aktywności. Jeśli zastosowano 10 min interwał aklimatyzacji, rozpocznij binowanie w 10 min nagrania aktywności. Szczegóły dotyczące binowania znajdują się w dyskusji.
- Otwórz oprogramowanie analityczne HoTDAM! i zaimportuj przeskanowane pliki danych z monitora, klikając File | load monitor data.
UWAGA: Oprogramowanie i aplikacja wykonywalna są dostępne w serwisie GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) lub na stronie internetowej firmy w sekcji Analysis Software. Należy pamiętać, że aplikacja wykonywalna jest obecnie kompatybilna wyłącznie z systemami operacyjnymi Windows. - Dodaj oznaczenia grup, aby wskazać, które grupy badawcze odpowiadają którym komórkom w monitorach DAM2.
UWAGA: Układ interfejsu oprogramowania odpowiada układowi monitorów. - Kliknij Start Multi-Group Definition, aby wyświetlić okno dialogowe służące do dodawania oznaczenia grupy, które zostanie zastosowane do wielu komórek. Po zaakceptowaniu oznaczenia grupy, klikaj w komórki, aby przypisać im to oznaczenie, a następnie kliknij Stop Multi-Group Designation.
UWAGA: Oprogramowanie organizuje i eksportuje dane z DAMSystem3 do plików .csv w celu ich analizy w programach statystycznych. - Wyeksportuj TKD (tj. ostatni niezerowy indeks) dla każdej muchy w monitorach do pliku .csv, klikając File | Export Knockdown Data | Export All Monitors or Export Selected Monitors. TKD dla każdej muchy zostanie zorganizowane w pliku wyjściowym według oznaczenia grupy.
- Wyeksportuj dane o aktywności dla każdej muchy, klikając File | Export Activity Data | Export All Monitors or Export Selected Monitors do pliku .csv, zachowując jedynie znacznik czasu i dane o liczbie zdarzeń, co ułatwi pracę z plikiem danych, jednocześnie przypisując wyznaczone etykiety grup dla każdej muchy.
UWAGA: Pierwsze kilka kolumn w plikach danych DAMSystem3 odpowiada wewnętrznym danym monitorów (np. monitorowanie światła lub komunikaty o błędach) podczas akwizycji. Dane o liczbie zdarzeń znajdują się w kolumnach 11-42 (szczegóły w arkuszu danych DamSystem3). Eksport danych o aktywności za pomocą oprogramowania analitycznego usunie wszystkie kolumny poza znacznikiem czasu i kolumnami z danymi o liczbie zdarzeń. - W przypadku przeprowadzania eksperymentu CTmax, użyj TKD do wyznaczenia CTmax, wykorzystując tempo wzrostu temperatury.
UWAGA: Oprogramowanie analityczne zostało napisane w sposób obiektowy w języku C# (kod źródłowy dostępny na GitHub; https://github.com/MatthewR47/HoTDAM), dzięki czemu elementy programu można łatwo modyfikować, aby dostosować je do konkretnych celów.
6. Statystyka
UWAGA: W zależności od specyfiki układu eksperymentalnego do analizy danych TKD można zastosować wiele różnych testów.
- Zastosuj analizę przeżycia (np. regresję Coxa, metodę Kaplana-Meiera), aby zdefiniować knockdown jako zdarzenie, którego doświadczy każda mucha w ramach testu.
UWAGA: Szczegółowy przegląd zagadnienia znajduje się w serii czterech prac Bradburna i Clarka omawiających analizę przeżycia i jej implementację5,6,7,8. - Użyj analizy ANOVA do oceny różnic między grupami i porównania modalności, szczególnie podczas walidacji zautomatyzowanego testu dla określonych warunków.
- Przeanalizuj dane TKD za pomocą analizy przeżycia Kaplana-Meiera. Podziel plik według linii hodowlanych tak, aby analiza była przeprowadzona oddzielnie (np. dla linii TRPA1 i w1118). Wybierz zmienną czasową jako TKD (w min), knockdown jako zdarzenie, pretreatment jako czynnik oraz płeć jako stratyfikację.
- Przeprowadź testy log-rank, Breslowa i Tarone-Ware'a, aby porównać pretreatment dla każdej warstwy (tj. płci), w celu zilustrowania kilku metod.
- Stwórz wykresy przeżycia.
Wyniki
Analizy dla linii TRPA1 oraz w1118 przeprowadzono oddzielnie. Percentyle czasów TKD oraz inne statystyki opisowe znajdują się w Tabeli 1.
| Percentylea | ||||||||
| Płeć | Zabieg | 25,00% | 50,00% | 75,00% | ||||
| N | Szacunek | Błąd std. | Szacunek | Błąd std. | Szacunek | Błąd std. | ||
| W1118 | ||||||||
| Samica | Kontrola | 16 | 42,50 | 0,43 | 40,75 | 2,00 | 38,75 | 0,43 |
| Utwardzone | 16 | 48,75 | 4,55 | 43,25 | 2,50 | 38,50 | 1,95 | |
| Samiec | Kontrola | 16 | 43,25 | 1,88 | 39,75 | 0,25 | 37,00 | 2,38 |
| Utwardzone | 16 | 46,50 | 5,63 | 35,50 | 2,00 | 30,75 | 3,03 | |
| TRPA1 | ||||||||
| Samica | Kontrola | 16 | 34,25 | 2,17 | 29,25 | 7,50 | 21,50 | 0,72 |
| Utwardzone | 15 | 37,25 | 4,84 | 28,75 | 1,77 | 25,75 | 0,86 | |
| Samiec | Kontrola | 15 | 38,25 | 3,29 | 32,00 | 1,29 | 24,50 | 7,92 |
| Utwardzone | 16 | 27,50 | 0,72 | 25,75 | 1,00 | 22,75 | 6,06 | |
Tabela 1: Statystyki opisowe dla analiz przeżycia Kaplana-Meiera much w1118 i TRPA1. Wartości percentylowe TKD podano w minutach. Termin „hartowane” (hardened) odnosi się do wstępnej obróbki termicznej w 37 ˚C, po której nastąpiła 24-godzinna regeneracja przed szokiem cieplnym w 39 ˚C. Grupy kontrolne były utrzymywane w temperaturze 25 ˚C przez cały czas trwania wstępnej obróbki. UWAGA: W analizach przeżycia 75th percentyl to najpóźniejszy czas, w którym 75% próby nadal wykazuje aktywność.
W przypadku much w1118 test log-rank wykazał istotną różnicę w prawdopodobieństwie utraty równowagi (knockdown) między samicami hartowanymi a kontrolnymi (p = 0,026), tak że samice hartowane miały niższe prawdopodobieństwo utraty równowagi pod wpływem stresora termicznego w trakcie trwania testu. Tymczasem test log-rank nie wykazał istotnej różnicy w prawdopodobieństwie utraty równowagi między hartowanymi a kontrolnymi samcami w1118 (p = 0,798). Dla samic TRPA1 za pomocą testu log-rank nie stwierdzono istotnej różnicy w prawdopodobieństwie utraty równowagi między organizmami hartowanymi a kontrolnymi (p = 0,547). Wreszcie, w przypadku samców TRPA1 test log-rank wykazał istotną różnicę w prawdopodobieństwie utraty równowagi między organizmami hartowanymi a kontrolnymi (p = 0,014), przy czym organizmy kontrolne miały niższe prawdopodobieństwo utraty równowagi pod wpływem stresora termicznego. Wszystkie wyniki analiz przeżywalności (w tym uogólnione testy Wilcoxona i Tarone-Ware) przedstawiono w Tabeli 2, a krzywe przeżywalności na Rysunku 1.
| Płeć | χ2 | df | pwartość p | |
| W1118 | ||||
| Kobieta | Test log-rank (Mantel-Cox) | 4.96 | 1 | 0.026 |
| Breslow (uogólniony test Wilcoxona) | 1.72 | 1 | 0.190 | |
| Tarone-Ware | 3.07 | 1 | 0.080 | |
| Samiec | Test Log-Rank (Mantela-Coxa) | 0.07 | 1 | 0.798 |
| Breslow (uogólniony test Wilcoxona) | 0.86 | 1 | 0.353 | |
| Tarone-Ware | 0.32 | 1 | 0.572 | |
| TRPA1 | ||||
| Kobieta | Test Log-Rank (Mantela-Coxa) | 0.36 | 1 | 0.547 |
| Breslow (uogólniony test Wilcoxona) | 0.45 | 1 | 0.503 | |
| Tarone-Ware | 0.36 | 1 | 0.549 | |
| Samiec | Test log-rank (Mantela-Coxa) | 6.01 | 1 | 0.014 |
| Breslow (uogólniony test Wilcoxona) | 4.19 | 1 | 0.041 | |
| Tarone-Ware | 5.20 | 1 | 0.023 |
Tabela 2: Testy istotności porównujące prawdopodobieństwo pozostania w stanie aktywności między grupami poddanymi wstępnej obróbce a grupami kontrolnymi u samic i samców much w1118 oraz TRPA1. Termin „zahartowane” odnosi się do wstępnej obróbki w temperaturze 37 ˚C, po której nastąpiła 24-godzinna regeneracja przed szokiem termicznym w temperaturze 39 ˚C. Organizmy kontrolne były utrzymywane w temperaturze 25 ˚C przez cały czas trwania wstępnej obróbki.
Rycina 1: Krzywe przeżycia przedstawiające proporcję organizmów z zachowaną aktywnością w czasie trwania testu TKD dla muszek w1118 i TRPA1. Hartowanie odnosi się do wstępnej obróbki w 37 ˚C, po której następowała 24 h regeneracja przed szokiem termicznym w 39 ˚C. Organizmy kontrolne były utrzymywane w 25 ˚C przez cały czas trwania wstępnej obróbki. TKD jest podawane w minutach od momentu wprowadzenia stresora termicznego w 39 ˚C. Skróty: TKD = time to knockdown; TRPA1 = transient receptor potential ankyrin 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Średnią aktywność w funkcji czasu przedstawiono na Ryc. 2 dla zahartowanych i kontrolnych samców oraz samic TRPA1 i w1118.
Rycina 2: Średnia aktywność w funkcji czasu dla much w1118 oraz TRPA1 podczas trwania testu TKD. Skróty: TKD = czas do powalenia (time to knockdown); TRPA1 = transient receptor potential ankyrin 1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Prawdopodobnie istnieje wiele nowych sposobów analizy danych dotyczących aktywności, zwłaszcza przy uwzględnieniu efektów grupowych oraz włączeniu TKD. Ponieważ analiza aktywności podczas tolerancji na ciepło jest stosunkowo słabo zbadana, nie eksplorowaliśmy potencjalnie nowych podejść statystycznych do analizy tych danych. Takie testy statystyczne wymagałyby znacznie szerszego przeglądu literatury i dyskusji, niż jest to tutaj stosowne. Zamiast tego po prostu przedstawiliśmy na wykresie średnią aktywność dla każdej grupy (grupy z pretreatmentem lub kontrolnej) w funkcji czasu, ponieważ wcześniej opublikowaliśmy tę metodę ilustrowania aktywności wraz z odpowiednim przeglądem literatury.
Wideo uzupełniające S1: Instrukcja pobierania aplikacji wykonywalnej z serwisu GitHub oraz podstawowe funkcje oprogramowania. Najnowszą wersję (obecnie kompatybilną tylko z systemem Windows) można znaleźć w odnośniku do serwisu GitHub (https://github.com/MatthewR47/HoTDAM) lub poprzez link indeksowany w sekcji Analysis Software na stronie internetowej firmy. Po pobraniu wersji należy rozpakować pliki, a następnie można uruchomić aplikację HoTDAM!. Oprogramowanie antywirusowe może uniemożliwić uruchomienie aplikacji; konieczne może być nadanie odpowiednich uprawnień dla aplikacji. Po uruchomieniu interfejsu można przesłać zeskanowane pliki DAM2 (oprogramowanie do skanowania plików) (File | Load Monitor Data). Interfejs Group Designation odzwierciedla układ monitora aktywności i pozwala użytkownikowi przypisywać grupy traktowane do probówek pojedynczo lub wiele jednocześnie za pomocą funkcji Multi-Select Group Definition. Wszystkie monitory są wzajemnie wykluczające się w odniesieniu do funkcjonalności Group Designation i muszą być definiowane osobno. Dane TKD i dane o aktywności można następnie wyeksportować do plików .csv (File | Export Knockdown Data lub File | Export Activity Data) dla wybranego monitora indywidualnie lub dla wszystkich monitorów jednocześnie. Jeśli wszystkie monitory zostaną wyeksportowane jednocześnie, dane TKD lub aktywności zostaną wyeksportowane do jednego pliku .csv, ale dane dla każdego monitora będą wewnątrz pliku rozdzielone. Wyeksportowane pliki TKD pogrupują muchy w grupy wyświetlające ostatni niezerowy indeks aktywności dla każdej probówki. Pliki aktywności utrzymają wszystkie probówki osobno, ale powiążą je z oznaczeniami grup i usuną z plików wszystkie informacje poza znacznikiem czasu i danymi o liczbie dla każdej probówki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda testu tolerancji cieplnej jest wszechstronna i skalowalna. Wcześniej opublikowaliśmy badanie walidacyjne, w którym porównaliśmy metodę HoTDAM! z klasycznym testem TKD opartym na obserwacji i stwierdziliśmy, że test zautomatyzowany wykazuje ten sam ogólny trend w odniesieniu do kilku czynników4 (Rysunek 3). Innymi słowy, podobnie jak w przypadku klasycznego ręcznego testu TKD, zautomatyzowany test DAM2 był w stanie zróżnicować organizmy ze względu na płeć, temperaturę testu, wstępne hartowanie oraz czas regeneracji po hartowaniu przed przystąpieniem do badania. Choć zakłada się, że test zautomatyzowany jest bardziej obiektywny, ponieważ TKD nie opiera się na obserwacjach badacza, nasze dane nie sugerują, aby czyniło to test DAM2 znacząco lepszym od testu ręcznego pod kątem wykrywania efektu. Stwierdziliśmy, że testy są bardzo podobne pod względem precyzji, a jeśli cokolwiek, to wielkości efektów w teście zautomatyzowanym są nieco mniejsze (szczegółowe dane statystyki opisowej i wyniki analizy ANOVA dla obu testów – zautomatyzowanego DAM2 oraz ręcznego opartego na obserwacji – z naszych badań walidacyjnych znajdują się w materiałach uzupełniających publikacji Rokusek et al.4). Przyczyną tego jest prawdopodobnie immanentna różnica w tym, co oba testy mierzą w odniesieniu do TKD, co zostanie szczegółowo omówione poniżej.
Rycina 3: Porównanie zautomatyzowanego testu DAM2 z klasycznym testem TKD opartym na obserwacji. Wykresy przedstawiają średnie TKD w minutach, a słupki błędów oznaczają błąd standardowy średniej. Porównane niezależne czynniki to (A) płeć w zależności od temperatury testu, (B) hartowanie w zależności od temperatury testu, (C) płeć w zależności od czasu rekonwalescencji, (D) hartowanie w zależności od płci, (E) temperatura testu w zależności od czasu rekonwalescencji oraz (F) hartowanie w zależności od czasu rekonwalescencji. Bezwzględne TKD ma tendencję do być dłuższe w teście zautomatyzowanym, jednak ogólne trendy dla poszczególnych czynników są spójne między testami. Rycina ta pochodzi z pracy Rokusek et al. 4. Skrót: TKD = czas do powalenia (time to knockdown). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Przedstawione tutaj dane ilustracyjne pochodzą z eksperymentów całkowicie odrębnych od naszych pierwotnych prób weryfikacyjnych, w których wykorzystano również inne linie much. Test (TKD i aktywność) był wrażliwy na efekty wstępnego hartowania w szczepie w1118 (w oryginalnych eksperymentach użyliśmy szczepu dzikiego Canton S), co stanowi potwierdzenie, że podstawowa funkcjonalność testu jest stabilna w zmiennych warunkach, mimo że do tej pory przetestowano tylko kilka linii. Test jest wszechstronny, ponieważ nie ogranicza się jedynie do pomiaru TKD. Ponieważ TKD w naszym teście jest definiowane jako zaprzestanie aktywności lokomocyjnej, można wyznaczyć CTmax, jeśli znana jest szybkość wzrostu temperatury. Wreszcie, test jest w pełni zautomatyzowany i można go łatwo rozszerzyć poprzez dodanie większej liczby monitorów aktywności, co pozwala na zastosowanie znacznie większych prób niż byłoby to możliwe przy użyciu metody obserwacji manualnej.
Poniżej przedstawiono kluczowe punkty, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania testu i analizy. Należy używać inkubatora, który szybko osiąga zadaną temperaturę, tak aby monitory można było umieścić w inkubatorze w temperaturze hodowli i pozostawić w spokoju do aklimatyzacji w nowym środowisku przed zastosowaniem stresora termicznego. Jeśli temperatura wzrasta zbyt powoli, test zaczyna bardziej przypominać dynamiczny test CTmax niż statyczny test TKD. Na przykład, jeśli oprogramowanie zaindeksowało 40x przed indukcją stresu termicznego w celu ustalenia wartości bazowej, może ono wygenerować plik danych zaczynający się od indeksu 40 do wyznaczenia TKD i analizy danych. Punkt startowy jest określony przez znacznik czasu zarejestrowany przez oprogramowanie, dlatego należy zwrócić uwagę na interwał indeksowania (np. 40 indeksów to 10 min, jeśli interwał indeksowania wynosi 15 s).
Oprogramowanie File Scan może być również wykorzystywane do „grupowania” (binning) indeksów, przy czym możliwe jest sumowanie lub wyciąganie średniej z zliczeń. Na przykład podczas przedstawiania danych o aktywności na wykresie (patrz poniżej) pogrupowano co cztery indeksy, sumując zliczenia (tzn. wyeksportowano aktywność w interwałach minutowych zamiast co 15 s). Należy zauważyć, że w przypadku grupowania oprogramowanie File Scan nie dopuszcza znaczników czasu rozpoczynających się w niepełnych minutach. Przykładowo, jeśli pierwszy indeks wystąpił o 12:10:15 przy ustawionym interwale indeksowania 15 s, to grupowanie w interwałach 1 min rozpocznie się od najbliższej pełnej minuty (np. 12:11:00). W związku z tym, jeśli do analizy mają zostać wykorzystane przyrosty minutowe aktywności, ale pożądana jest rozdzielczość interwałów 15 s dla TKD, należy uruchomić oprogramowanie do akwizycji w ciągu 15 s przed najbliższą pełną minutą (np. po 12:09:45, a przed 12:10:00). To utrudnienie wynika z faktu, że oprogramowanie do akwizycji danych wykorzystuje zegar systemowy komputera jako znacznik czasu, ponieważ DAMSystem3 został prawdopodobnie zaprojektowany z myślą o badaniach snu.
W odniesieniu do podejść statystycznych do porównywania TKD, uważamy, że analiza przeżycia dostarcza więcej informacji niż proste porównywanie średniego lub medianowego czasu nokdaunu między grupami. Krzywe przeżycia mogą zapewnić wizualny wgląd w przebieg czasowy nokdaunu dla populacji podczas testu. Podobnie, testy statystyczne mogą być dostosowane do konkretnego pytania badawczego postawionego w badaniu. Na przykład, uogólnione testy Wilcoxona przypisują większą wagę zdarzeniom wczesnym, podczas gdy testy log-rank przypisują równą wagę wszystkim punktom czasowym i są bardziej czułe na różnice w późniejszych punktach czasowych. Jeśli współczynniki hazardu nie są proporcjonalne (tj. krzywe przeżycia przecinają się), test Tarone-Ware jest bardziej rygorystyczny. Ponieważ nie powinno dojść do cenzurowania danych, gdyż wszystkie organizmy doświadczą zdarzenia (nokdaunu), można argumentować za zastosowaniem nieparametrycznych testów opartych na rangach, takich jak test U Manna-Whitneya i test Kruskala-Wallisa, wraz z krzywymi przeżycia Kaplana-Meiera9. Jeśli badanie koncentruje się na nokdaunie po określonym czasie, a nie na TKD po znokdaunowaniu wszystkich organizmów, zastosowanie analizy przeżycia oraz testów log-rank lub uogólnionych testów Wilcoxona byłoby odporne na dane ocenzurowane (tj. scenariusz, w którym nie wszystkie organizmy przestałyby się poruszać lub upadły do końca testu). W Tabeli 2 przedstawiliśmy wyniki testów log-rank, uogólnionego testu Wilcoxona oraz testu Tarone-Ware w celu zilustrowania tych zależności.
Podczas stresu cieplnego i przed osiągnięciem CTmax, zmiany behawioralne (np. zachowania ucieczkowe) służą jako mechanizmy radzenia sobie. Te wrodzone strategie behawioralne są zachowane w całym królestwie zwierząt, ale są szczególnie ważne dla ektermów ze względu na ich niższą zdolność do metabolicznej termoregulacji10,11. Ewidentnie zachowanie jest istotnym aspektem fenotypu stresu cieplnego u ektermów, jednak stosunkowo niewiele badań analizowało te behawioralne aspekty tolerancji cieplnej. Biorąc pod uwagę, że opisany przez nas test opiera się na charakterystycznym wzroście aktywności lokomotorycznej w odpowiedzi na stres cieplny, jest on dobrze dostosowany do badania lokomotorycznych aspektów odpowiedzi na stres cieplny. Jednocześnie ta zależność od aktywności spontanicznej niesie ze sobą pewne ograniczenia. Należy pamiętać, zwłaszcza podczas badania komponentów odpowiedzi lokomotorycznej na stres cieplny, że zarówno TKD, jak i aktywność są ze sobą ściśle powiązane. Aby zademonstrować sytuację, w której byłoby to ograniczające dla naszego testu, przedstawiliśmy tutaj dane z organizmów TRPA1 z niedoborem termorecepcji. Gdy organizmy wykazują niedobór receptora TRPA1, muchy nie wykazują charakterystycznej odpowiedzi lokomotorycznej na ciepło12. Na przedstawionych tutaj reprezentatywnych danych odpowiedź aktywności w organizmach TRPA1 jest stłumiona. Pomiary TKD nie byłyby łatwo porównywalne z organizmami typu dzikiego, ponieważ pomiar ten reprezentuje inną odpowiedź lokomotoryczną.
Potencjalnym ograniczeniem jest również możliwość uogólnienia oraz bezpośrednie porównanie wyników, szczególnie z klasycznymi testami tolerancji cieplnej (Rysunek 3). Często testy oparte na obserwacji obejmują bodziec mechaniczny lub inny, aby upewnić się, że nieruchomy organizm faktycznie doświadcza załamania fizjologicznego, a nie wykazuje jedynie brak spontanicznej aktywności3,13. Ponieważ nasz test opiera się na spontanicznej aktywności, istnieje immanentna różnica w operacyjnej definicji TKD, która mogłaby skomplikować porównanie. Innymi słowy, zdefiniowaliśmy TKD jako zaprzestanie aktywności lokomotorycznej, podczas gdy klasyczne testy zazwyczaj definiują TKD jako załamanie fizjologiczne. Ponadto automatyczne testy, takie jak opisany przez nas, opierają się na ogrzanym powietrzu, podczas gdy testy manualne zazwyczaj wykorzystują łaźnię wodną, co zapewnia sprawniejszy transfer ciepła. Wszystkie te ograniczenia w porównywaniu modalności testów stanowią wady w zakresie uogólnialności metody automatycznej. Jednocześnie zgłaszano, że metody oparte na obserwacji również obarczone są komplikacjami przy bezpośrednich porównaniach między badaniami2,14,15. Twierdzimy, że pomimo tych ograniczeń, testy automatyczne są wykonalnym sposobem szacowania tolerancji cieplnej w odniesieniu do TKD lub CTmax.
Inne zautomatyzowane testy tolerancji cieplnej dla TKD i CTmax zostały wcześniej wdrożone i opisane w literaturze16,17,18,19, przy czym w niektórych z nich wykorzystano monitory aktywności DAM218,19. Co więcej, w co najmniej kilku badaniach zastosowano metody oparte na analizie wideo16,20,21, a także monitory aktywności DAM220, aby zbadać profile aktywności muszek owocówek w odniesieniu do tolerancji cieplnej w kontekście ostrego stresu termicznego. Zatem automatyzacja testów tolerancji cieplnej, w tym z wykorzystaniem systemu DAM2, nie jest nowym pomysłem. Nowością i wartością naszego testu jest łatwość zarządzania danymi dzięki oprogramowaniu (analitycznemu) HoTDAM!. Praca z danymi o aktywności jest trudna, a wyodrębnienie nawet najprostszych parametrów (np. TKD) z dużych zbiorów danych bez użycia oprogramowania lub skryptów, które muszą być tworzone na zamówienie dla każdego scenariusza, może być czasochłonne i uciążliwe. HoTDAM! jest darmowy i dostępny jako w pełni funkcjonalna aplikacja wykonywalna z prostym i łatwym w obsłudze interfejsem. Nie jest wymagane wcześniejsze doświadczenie w programowaniu. Ponadto oprogramowanie zostało napisane w sposób obiektowy i posiada dokumentację ułatwiającą wprowadzanie modyfikacji. W związku z tym HoTDAM! można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb. Kod źródłowy jest dostępny wraz z aplikacją wykonywalną. Mamy nadzieję, że HoTDAM! pomoże laboratoriom rozpoczynającym pracę z testami tolerancji cieplnej, oferując łatwy sposób pomiaru TKD i CTmax, a także wesprze laboratoria doświadczone w tych badaniach, zapewniając konfigurowalne oprogramowanie ułatwiające zarządzanie danymi.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.
Podziękowania
Opisany projekt był wspierany przez granty Institutional Development Award (IDeA) z National Institute of General Medical Sciences of the National Institutes of Health (5P20GM103427 i 1U54GM115458). Program stypendialny UNK Undergraduate Research Fellows oraz Letni Program Badawczy Studentów Medycyny UNMC.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 14 ml probówki z polistyrenu | Falcon | 352057 | |
| 30 galonów | Wal-mart | ||
| Butelki 8 uncji | Genesee | 32-129F | |
| Komora klimatyczna do testów stabilności | Memmert | HPP750eco | |
| Lab Scientific | FLY801010 | ||
| DAM2 Monitor aktywności Drosophila | TriKinetics | DAM2 | (arkusz danych DAMSystem3) https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| oprogramowanie do akwizycji danych DAMSystem | TriKinetics | do pobrania za darmo | |
| Drosophila agar | Lab Scientific | FLY80201 | |
| etanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Ether | Oprogramowanie Fisher Scientific | E134-4 | |
| FileScan | TriKinetics | do skanowania w poszukiwaniu błędów tekstowych, kategoryzacji danych i wyprowadzania | |
| FlyStuff Flugs do butelek | Genesee | 49-100 | |
| FlyStuff Flugs do fiolek | Genesee | 49-102 | |
| Fiolki FlyStuff | Genesee | 32-113RL | |
| Oprogramowanie HoTDAM | Github lub Trikinetyka | https://github.com/MatthewR47/HoTDAM | |
| Zanurzeniowa grzałka obiegowa | PolyScience | MX-CA11B | |
| melasa | Lab Scientific | FLY80084 | |
| kwas propionowy | Fisher Scientific | A258-500 | |
| Pyrex Rurki szklane 5 x 65 mm do DAM2 | TriKinetics | PGT 5x65 | https://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Price%20List%202024.7.pdf |
| mały pędzel | Wal-mart | ||
| SPSS Statistics | IBM | ||
| tegosept | Lab Scientific | FLY55015 | |
| torula drożdże | MP Biomedicals | 290308505 | |
| TRPA1 mutant stock | Bloomington Stock Center | 26504 | w[1118]; TI{w[+mW.hs]=TI}TrpA1[1] |
| w1118 stock | Bloomington Centrum magazynowe | 3605 |
Bibliografia
- Cowles, R. B., Bogert, C. M. A preliminary study of the thermal requirements of desert reptiles. Bull Am Mus Nat Hist. 83, 261-296 (1944).
- Lutterschmidt, W. I., Hutchison, V. H. The critical thermal maximum: history and critique. Can J Zool. 75, 1561-1574 (1997).
- Jørgensen, L. B., Malte, H., Overgaard, J. How to assess Drosophila heat tolerance: Unifying static and dynamic tolerance assays to predict heat distribution limits. Funct Ecol. 33 (4), 629-642 (2019).
- Rokusek, B., et al. HoTDAM! An easy-to-use automated assay expands the inducible thermotolerance phenotype in Drosophila melanogaster: Heat hardening reduces motility. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 286, 111522(2023).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part III: Multivariate data analysis - Choosing a model and assessing its adequacy and fit. Br J Cancer. 89 (4), 605-611 (2003).
- Bradburn, M. J., Clark, T. G., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part II: Multivariate data analysis- An introduction to concepts and methods. Br J Cancer. 89 (3), 431-436 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part IV: Further concepts and methods in survival analysis. Br J Cancer. 89 (5), 781-786 (2003).
- Clark, T. G., Bradburn, M. J., Love, S. B., Altman, D. G. Survival analysis part I: Basic concepts and first analyses. Br J Cancer. 89 (2), 232-238 (2003).
- Hazra, A., Gogtay, N. Biostatistics series module 9: survival analysis. Indian J Dermatol. 62 (3), 251-257 (2017).
- Stevenson, R. D. The relative importance of behavioral and physiological adjustments controlling body temperature in terrestrial ectotherms. Am Nat. 126 (3), 362-386 (1985).
- Grigg, G. C., Beard, L. A., Augee, M. L. The evolution of endothermy and its diversity in mammals and birds. Physiol Biochem Zool. 77 (6), 982-997 (2004).
- Soto-Padilla, A., et al. Thermosensory perception regulates speed of movement in response to temperature changes in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 221 (10), jeb174151(2018).
- Hoffmann, A. A., Sørensen, J. G., Loeschcke, V. Adaptation of Drosophila to temperature extremes: bringing together quantitative and molecular approaches. J Therm Biol. 28 (3), 175-216 (2003).
- Terblanche, J. S., et al. Ecologically relevant measures of tolerance to potentially lethal temperatures. J Exp Biol. 214 (22), 3713-3725 (2011).
- Rezende, E. L., Castaneda, L. E., Santos, M. Tolerance landscapes in thermal ecology. Funct Ecol. 28 (4), 799-809 (2014).
- MacLean, H. J., Hjort Hansen, J., Sørensen, J. G. Validating the automation of different measures of high temperature tolerance of small terrestrial insects. J Insect Physiol. 137, 104362(2022).
- Gioia, A., Zars, T. Thermotolerance and place memory in adult Drosophila are independent of natural variation at the foraging locus. J Comp Physiol A. 195, 777-782 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. The effect of developmental temperature fluctuation on wing traits and stressed locomotor performance in Drosophila melanogaster, and its dependence on heterozygosity. Evol Ecol Res. 14 (7), 803-819 (2012).
- Bak, N. K., Rohde, P. D., Kristensen, T. N. Strong sex-dependent effects of malnutrition on life- and healthspan in Drosophila melanogaster. Insects. 15 (1), 9(2023).
- Bettencourt, B. R., et al. Natural variation in Drosophila stressed locomotion meets or exceeds variation caused by Hsp70 mutation: analysis of behavior and performance. Behav Genet. 393, 306-320 (2009).
- Kjærsgaard, A., et al. Locomotor activity of Drosophila melanogaster in high temperature environments: plastic and evolutionary responses. Clim Res. 43 (1-2), 127-134 (2010).
Przedruki i uprawnienia
