Protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego dla szczurów

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego u szczurów, umożliwiający dostarczanie leku bezpośrednio do nerwu bez powikłań po wstrzyknięciu. Metoda ta ma zastosowanie w przedklinicznych badaniach neurologicznych obejmujących manipulację autonomicznego układu nerwowego. Może być stosowany do bezpośredniego wstrzykiwania nerwów dla innych nerwów u szczurów i innych gatunków, z niezbędnymi modyfikacjami.

Streszczenie

Istnieje względna obfitość strategii i metodologii ułatwiających dostarczanie leków do ośrodkowego układu nerwowego. Jednak dostarczanie leków bezpośrednio do obwodowego układu nerwowego jest mniej powszechne, a publikacja dotycząca szczegółowych metod jest dostępna, aby pomóc naukowcom. W tym miejscu opisujemy metodę bezpośredniego wstrzykiwania nerwu w celu dostarczania leków do obwodowego układu nerwowego, wykorzystując nerw błędny jako nerw modelowy. Metoda ta może być stosowana w leczeniu zaburzeń autonomicznego układu nerwowego poprzez celowanie w lewy nerw błędny, chociaż tę ogólną metodę iniekcji można ekstrapolować na iniekcję innych nerwów z niewielkimi modyfikacjami. Metoda ta wyjaśnia wszystkie krytyczne etapy związane z procedurą obejmującą mikrochirurgię u znieczulonych dorosłych szczurów pod mikroskopem preparacyjnym. Opisano zastosowanie barwnika śledzącego w celu ułatwienia monitorowania wierności wtrysku w czasie rzeczywistym. Przedstawiono ilustracje udanych i nieudanych wstrzyknięć. Jeśli zostaną przeprowadzone prawidłowo, bezpośrednie zastrzyki z nerwu błędnego mogą być przeprowadzone w bezpieczny sposób, który jest dobrze tolerowany przez szczura, bez komplikacji po porodzie. Na przykład, gdy chirurdzy zostali przeszkoleni w tej metodzie, sześciu z sześciu szczurów udało się wstrzyknąć bez żadnych komplikacji. Ta metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwów w badaniach przedklinicznych na szczurach jest w stanie dostarczyć środki (w tym między innymi terapię genową) do nerwów obwodowych.

Wprowadzenie

Stosowanie prawidłowej metody podawania leków jest jednym z kluczowych czynników w osiąganiu pomyślnych wyników terapeutycznych. Pomimo obfitości metod dostarczania środków terapeutycznych do ośrodkowego układu nerwowego (OUN), opisano tylko kilka metod dostarczania do obwodowego układu nerwowego (PNS) przez bezpośrednie wstrzyknięcie nerwu. Bezpośrednie wstrzyknięcie nerwu, takie jak wstrzyknięcie do zwojów korzenia grzbietowego (DRG) u szczurów, zostało wypróbowane w badaniach przedklinicznych w celu lepszego zrozumienia mechanizmów bólu, toksyczności leków, transferu genów^1,2,3, oraz ogólny rozwój metody^1,4. Dodatkowe doniesienia na temat bezpośredniego wstrzykiwania nerwu obejmują wstrzyknięcie nerwu rdzeniowego⁴, wstrzyknięcie nerwu kulszowego^{1 oraz wstrzyknięcie} nerwu błędnego u szczurów⁵ i myszy⁶. Ostatnio zaproponowano metodę wstrzykiwania nadchondrialnego w celu lepszej dystrybucji leków do głowy nerwu wzrokowego u królików⁷.

DRG jest uważane za idealne miejsce do bezpośredniego wstrzykiwania wektorów obciążonych transgenami, takich jak wirus związany z adenowirusem (AAV), ze względu na funkcję sensoryczną ciał komórkowych w klasie DRG2. Opisano zarówno chirurgiczne, jak i niechirurgiczne metody iniekcji DRG^1,8. Znaleziono jednak kontrowersyjne wnioski dotyczące spójności wyników z niechirurgiczną metodą iniekcji DRG¹. Sugeruje się, że metoda chirurgiczna polegająca na częściowej laminektomii jest w 100% skuteczna w przypadku wstrzyknięcia DRG szczurom bez żadnej zmiany wyników zachowania³, podobnie jak metoda obejmująca częściową osteotomię u myszy⁹. Kilka badań donosi o metodach dostarczania leków do wstrzykiwań DRG, które były stosowane w przedklinicznych badaniach nad terapią genową u szczurów i myszy^1,2,10. Badania nad terapią genową opartą na wektorach, obejmujące miejscowe wstrzyknięcia, mogą przynieść następujące korzyści: zmniejszona ekspresja poza celem, zmniejszenie toksyczności ogólnoustrojowej oraz mniejsze miano wirusa i objętość wstrzyknięć, zmniejszone ryzyko powikłań immunogennych^11,12.

Metoda bezpośredniego wstrzykiwania w nerw kulszowy, najdłuższy nerw ciała, została wypróbowana poprzez odsłonięcie prawego nerwu kulszowego na poziomie połowy uda szczura. W metodzie wykorzystano pipetę z wyciąganego szkła wyposażoną w system iniekcji sterowany przez mikroprocesor w celu wstrzyknięcia całkowitej objętości 10 μl barwnika o natężeniu przepływu 1,2 μl/min¹. Eksperyment ten wykazał brak dystrybucji barwnika do poziomu DRG, a dystrybucja była w większości ograniczona wokół miejsca wstrzyknięcia. Podobnie, inne metody bezpośrednich zastrzyków nerwowych, takie jak zastrzyki z nerwu rdzeniowego, zostały wypróbowane z barwnikiem w celu oceny odpowiedniej objętości wstrzyknięcia i wzorca dystrybucji barwnika u szczurów. Sugeruje się, że 2 μl są optymalne do wstrzyknięcia nerwu rdzeniowego, podczas gdy 3 μl barwnika przez wstrzyknięcie DRG wykazały rozkład zarówno w zwojach korzenia grzbietowego, jak i brzusznego u szczurów¹. Stwierdzono, że objętość do wstrzyknięcia DRG u myszy jest optymalna od 1,0 μl do 1,5 μl w zależności od szczepu i wielkości ciała^2,9.

Metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego została użyta u szczurów⁵ i myszy⁶ do oceny roli uszkodzenia nerwowego lub integralności komórkowej w przenoszeniu ludzkiej α-synukleiny. Te dwa badania, przeprowadzone przez tę samą grupę badaczy, opisują krótką metodę bezpośredniego wstrzykiwania wektorów AAV do lewego nerwu błędnego w okolicy szyjki macicy. U szczurów metoda obejmowała szklaną kapilarnę o średnicy końcówki 60 μm w celu wstrzyknięcia 2 μl wektora przy natężeniu przepływu 0,5 μl/min za pomocą strzykawki Hamilton o pojemności 5 μm. U myszy wstrzyknięto całkowitą objętość roztworu wektorowego o stężeniu 750 nL / min z szybkością przepływu 160 nl / min za pomocą stalowej igły 36 G umieszczonej na strzykawce NanoFil o pojemności 10 μl⁶. Eksperymenty te wykazały, że transgen był dostarczany i wyrażany w aksonach w moście i śródmózgowiu szczurów i myszy. Podobnie grzbietowe jądro ruchowe lewego nerwu błędnego wykazało dodatnią reakcję immunologiczną z transgenem. Te dowody ilustrują, że metoda bezpośredniego wstrzykiwania nerwu błędnego może być niezawodną metodą w terapii genowej, w której transdukcja komórkowa jest przedłużona do kilku miejsc w mózgu, które wysuwają aksony przez nerw błędny. Jednak metody te nie wspominają o użyciu żadnego barwnika do śledzenia wierności wtrysku.

Tutaj opisana jest metoda bezpośredniego wstrzykiwania do lewego nerwu błędnego przy użyciu nietoksycznych barwników śledzących, które są w dużej mierze stosowane przez badaczy w badaniach przedklinicznych. Omówiono potencjalne pułapki, które mogą powodować trudności w dostarczaniu leków oraz sposoby ich pokonania. Sytuacje te są zilustrowane zdjęciami, aby pokazać, co sprawia, że poród się nie udaje i jak sprawić, by zakończyła się sukcesem.

Protokół

Poniższy protokół jest przeprowadzany zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi etycznymi i zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC).

1. Przygotowanie mieszkania

UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony dla dorosłych szczurów w wieku co najmniej 2 miesięcy. Mniejsze zwierzęta (w tym myszy i młodsze szczury) są możliwe, ale nie są zalecane i będą znacznie trudniejsze.

1. Zapewnij wilgotną karmę lub inny miękki pokarm (żel weterynaryjny) przez 48 godzin przed operacją nerwu błędnego. Ponieważ zwierzęta mogą mieć trudności z jedzeniem po zabiegu, należy zapoznać je z tymi przedmiotami przed operacją, aby pomóc im zapoznać się ze smakiem tych produktów i wywołać motywację do jedzenia.
2. Szczury domowe należy trzymać pojedynczo w klatce (lub zgodnie z wytycznymi instytucji) co najmniej 1 tydzień przed operacją, a także 1 tydzień po operacji. Pozwoli im to przyzwyczaić się do stresu związanego z samotnością i zapobiegnie drapaniu ran po operacji przez rodzeństwo z miotu.

2. Przygotowanie przedmiotów chirurgicznych i przestrzeni

1. Sporządź z wyprzedzeniem listę wszystkich niezbędnych przedmiotów i dokładnie sprawdź, czy wszystkie przedmioty są dostępne do operacji.
2. Przed zabiegiem należy wysterylizować wszystkie przedmioty odpowiednimi metodami sterylizacji.
3. Ustaw sterylną przestrzeń chirurgiczną pod mikroskopem preparacyjnym. Umieść poduszkę grzewczą pod mikroskopem, aby utrzymać szczura w cieple podczas operacji.
4. Umieść wszystkie materiały chirurgiczne na stole operacyjnym na sterylnej serwety. Zachowaj wystarczająco dużo miejsca na operację pod mikroskopem preparacyjnym. Upewnij się, że ostrość mikroskopu jest optymalna i obejmuje obszar chirurgiczny, aby uwidocznić nerw.
5. Umieścić pompę strzykawkową w pobliżu etapu chirurgicznego, tak aby długość rurki była wystarczająca, aby dotrzeć do miejsca wstrzyknięcia.
6. Umieść narzędzia chirurgiczne w kierunku boku dominującej ręki chirurga.

3. Przygotowanie mieszaniny leku kandydującego i barwnika śledzącego

1. Upewnij się, że lek kandydujący jest rozcieńczony w celu osiągnięcia wymaganego stężenia w zalecanym rozcieńczalniku, tak aby 5 μl leku zmieszanego z barwnikiem dało wymaganą ilość leku kandydującego do dostarczenia. Zaleca się, aby maksymalna objętość wstrzyknięcia metodą bezpośredniego nerwu błędnego wynosiła 5 μl (łącznie z barwnikiem śledzącym, patrz krok 3.2).
2. Zmieszaj kompatybilny barwnik z kandydującym lekiem, aby umożliwić śledzenie wierności wstrzyknięć w czasie rzeczywistym. Na przykład końcowe stężenie 1% Luxol Fast Blue lub 0,002% fluoresceiny jest kompatybilnymi barwnikami.
   UWAGA: Barwnik należy stosować w optymalnym stężeniu w mieszaninie barwnika i leku kandydującego. Gdy stężenie barwnika w mieszaninie jest zbyt niskie, śledzenie wstrzyknięcia może nie być widoczne. Gdy stężenie barwnika jest zbyt wysokie, może to spowodować, że mieszanina będzie zbyt gęsta i ma wysoką lepkość, co spowoduje zablokowanie igły iniekcyjnej.

4. Ładowanie mieszanki leku i barwnika do rurki

1. Podłączyć szklaną strzykawkę o pojemności 100 μl z wyjętym tłokiem do igły 27 G.
2. Podłącz jeden koniec około 45 cm wysterylizowanej rurki polietylenowej do igły 27 G.
3. Weź plastikową strzykawkę o pojemności 3 ml i wyposaż ją w igłę 27 G. Umieścić w strzykawce około 0,5 ml 0,9% soli fizjologicznej.
4. Napełnij rurkę polietylenową 0,9% soli fizjologicznej od otwartego końca, aby wypełnić całą długość rurki i całą lufę szklanej strzykawki, aż się wyleje.
   UWAGA: Bardzo ważne jest, aby uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza wewnątrz rurki.
5. Wyjąć i wyrzucić strzykawkę i igłę o pojemności 3 ml.
6. Włożyć tłok strzykawki do cylindra szklanej strzykawki i popchnąć go lekko do przodu do środka cylindra.
7. Umieścić szklaną strzykawkę w pompie strzykawkowej.
8. Pociągnąć tłok lekko do tyłu za pomocą pompki strzykawkowej, aby utworzyć przestrzeń powietrzną o długości około 1,5 cm na otwartym końcu rurki.
9. Odpipetować co najmniej 5 μl mieszaniny barwnika i potencjalnego leku za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl i upuścić ją na wysterylizowany kawałek parafilmu.
10. Pobrać proponowaną mieszaninę leku do rurki, odciągając tłok z powrotem za pomocą pompy strzykawkowej. Utrzymuj pęcherzyki powietrza między 0,9% solą fizjologiczną a roztworem do wstrzykiwań, ale poza tym należy unikać uwięzienia pęcherzyków powietrza w roztworze do wstrzykiwań. Oznaczyć poziom mieszaniny iniekcyjnej w drenach markerem.
    UWAGA: Szczelina powietrzna między mieszaniną leku i barwnika a sterylną solą fizjologiczną w rurce ma kluczowe znaczenie dla zapobieżenia mieszaniu się tych dwóch roztworów.
11. Dopasuj igłę 35 G do rurki. Przymocuj igłę do czystej powierzchni etapu chirurgicznego za pomocą taśmy, tak aby igła nie była luźna, nie poruszała się i nie dotykała niczego innego oraz pozostała wysterylizowana.

5. Gruntowanie igły iniekcyjnej

1. Ustawić program pompy strzykawkowej na dozowanie 0.5 μl/min.
2. Pompę strzykawkową należy uruchomić na około 10-15 s, aż roztwór do wstrzykiwań zacznie wypływać z końcówki igły. Niewielka ilość mieszaniny na końcu igły bez nieszczelności na połączeniu rurki i igły do wstrzykiwań (lub w dowolnym innym miejscu na długości strzykawki, rurki lub igły) wskazuje, że konfiguracja jest prawidłowa.
   UWAGA: Jeśli mała kropelka na końcu igły nie jest widoczna, oznacza to zablokowanie igły. Zablokowanie igły może wystąpić z powodu wysokiej lepkości mieszanki leku kandydującego i barwnika, nadmiaru powietrza uwięzionego w systemie, a szklana strzykawka nie jest prawidłowo osadzona w pompie strzykawki. Zobacz Rysunek 1 dla przykładu wycieku na styku igły i rurki. Przygotowanie ma kluczowe znaczenie, ponieważ pomaga określić, czy igła jest drożna, a wstrzyknięcie do wnętrza nerwu przejdzie płynnie.

6. Przygotowanie szczura do operacji

1. Uzyskaj masę ciała szczura, aby obliczyć niezbędną dawkę leków przeciwbólowych. Na przykład karprofen stosuje się podskórnie w dawce 5 mg/kg mc. u szczurów.
   UWAGA: Karprofen zaleca się przechowywać w temperaturze 4 °C przed wstrzyknięciem.
2. Znieczulić szczura parownikiem izofluranowym, stosując natężenie przepływu 3%-4% w celu indukcji znieczulenia przez około 2-3 minuty. Zmniejsz szybkość przepływu izofluranu do około 1,75%-2% w celu utrzymania znieczulenia.
3. Przenieś szczura na osobny stół z zestawem do usuwania włosów i przygotowania miejsca. Upewnij się, że ten stół znajduje się blisko przestrzeni operacyjnej.
4. Nałóż maść na sztuczne łzawienie w oba oczy szczura, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu.
5. Podawaj leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt, aby kontrolować ból, gdy szczur wraca do przytomności.
6. Ogol obszar operacyjny maszynką do strzyżenia włosów po brzusznej stronie szyi w okolicy szyjki macicy. Ogolić się do około 2 cm prostopadłej odległości od linii środkowej po obu stronach, od podbródka do mostka.
7. Wysterylizuj obszar 70% alkoholem etylowym i 10% betadyną, przecierając obszar trzykrotnie na przemian wacikiem nasączonym alkoholem i jodonem powidonu. Wytrzyj od środka obszaru na zewnątrz w okrągły wzór.
8. Przenieś szczura do etapu chirurgicznego pod mikroskopem w pozycji leżącej. Dostosuj ostrość mikroskopu, aby uwidocznić obszar operacji w odcinku szyjnym macicy.

7. Przeprowadzanie operacji na szczurach w celu wstrzyknięcia potencjalnego leku bezpośrednio do lewego nerwu błędnego (Rysunek 2, Rysunek 3, oraz Rysunek 4)

UWAGA: Ta część metody będzie wymagała drugiej osoby do asystowania chirurgowi.

1. Umieść szczura na poduszce grzewczej w pozycji leżącej pod mikroskopem preparacyjnym powiązanym z zamontowanym światłem.
2. Zaczep przednie górne zęby szczęki szczura kawałkiem niewchłanialnego szwu i zamocuj otwarty koniec szwu wewnątrz stożka nosowego tak, aby nozdrze szczura zawsze znajdowało się wewnątrz stożka nosa przez cały czas znieczulenia.
3. Ustaw szczura tak, aby jego głowa leżała po lewej stronie praworęcznego chirurga (lub po prawej stronie leworęcznego chirurga). W tej pozycji przednia strona chirurga jest prostopadła do ciała szczura. Umieść poduszkę ze sterylizowanego miernika pod szyją i wyreguluj kąt odcinka szyjnego szczura tak, aby odcinek szyjny stał się prosty. Ułatwi to zlokalizowanie lewego nerwu błędnego i wykonanie iniekcji.
4. Ułóż całe ciało szczura wysterylizowaną serwetą, pozostawiając otwartą przestrzeń chirurgiczną.
5. Zamocuj cztery kołki zwijacza indywidualnie za pomocą 4 stabilizatorów magnetycznych z elastomerami i umieść stabilizatory w czterech rogach etapu chirurgicznego.
6. Wstrzyknąć miejscowo środki znieczulające naskórkowo w linię środkową odcinka szyjki macicy, w którym wykonuje się nacięcie. Na przykład zwykle stosuje się mieszaninę lidokainy i bupiwakainy.
7. Wykonaj podłużne nacięcie skóry o długości około 2 cm na linii środkowej między podbródkiem a mostkiem za pomocą ostrza skalpela po brzusznej stronie szyi w okolicy szyjki macicy (Ryc. 3A).
8. oddziel odcięte krawędzie skóry za pomocą wysterylizowanych bawełnianych końcówek.
9. Cofnij krawędzie skóry w przeciwnych kierunkach od miejsca nacięcia za pomocą końcówek retraktora.
10. Oddziel deskę rozdzielczą bawełnianymi końcówkami, aby wejść głębiej. Wypchnij gruczoły ślinowe w kierunku bocznej strony.
11. Oddziel mięśnie mostkowo-sutkowe bawełnianymi końcówkami i odsuń je na bok za pomocą szpilek. W miarę jak separacja mięśnia mostkowo-sutkowego postępuje szeroko, tchawica pojawia się pośrodku, pokryta mięśniem mostkowo-gnykowym (Ryc. 3B).
    UWAGA: Uważaj, aby nie wywierać nacisku na tchawicę.
12. Przyspiesz separację tkanek po lewej stronie tchawicy szczura, aż pojawi się osłonka szyjna, która zawiera wspólną tętnicę szyjną biegnącą razem z lewym nerwem błędnym.
13. Ostrożnie wykonaj mały punktowy otwór w pochwce tętnicy szyjnej za pomocą drobnych kleszczy, uważając, aby nie uszkodzić tętnicy szyjnej pod mikroskopem. Oddziel lewy nerw błędny od tętnicy szyjnej wspólnej za pomocą drobnych kleszczy.
    UWAGA: Obszar operacyjny jest anatomicznie krytyczny. Ściana tętnicy szyjnej jest gruba, śliska i niełatwo się uszkadza, ale ostra końcówka cienkich kleszczy może ją zranić i może dojść do krwawienia. Jednocześnie zwróć uwagę, aby nie uszkodzić nerwu.
14. Gdy nerw zostanie oddzielony od tętnicy za pomocą kleszczy, użyj zakrzywionej igły o wadze 25 G dopasowanej do strzykawki o pojemności 1 ml z tego otworu, aby "zaczepić" i przytrzymać nerw ręką niedominującą (Rysunek 4A).
    UWAGA: Końcówka zakrzywionej igły jest, aby nie uszkodzić nerwu i tętnicy. Kąt krzywizny końcówki igły jest dostosowywany do około 90° przy użyciu hemostatu (Rysunek 2).
15. Ręką dominującą przytrzymaj igłę załadowaną mieszanką leku i barwnika i delikatnie nakłuj nerw w tym samym kierunku, w którym biegnie nerw, tak aby skos igły był skierowany do góry.
    1. Aby ułatwić nakłucie, utrzymuj nerw prosto, delikatnie pociągając za pomocą haczyka 25 G. Wbij igłę do nerwu i przesuwaj się do przodu o więcej niż 0,5 cm, trzymając igłę równolegle do nerwu błędnego. Następnie odciągnąć lekko do tyłu, tak aby około 0,4-0,5 cm igły pozostało wewnątrz nerwu.
       UWAGA: Kąt igły powinien być na tyle płytki, aby wniknąć do wnętrza nerwu bez przechodzenia na drugą stronę.
16. Mogą wystąpić sytuacje, w których igła jest drożna na zewnątrz nerwu w momencie gruntowania, ale kandydat na mieszaninę leku i barwnika nie przechodzi gładko wewnątrz nerwu. Aby uniknąć takiej sytuacji, ogranicz liczbę nakłuć nerwów za pomocą jednej igły nie więcej niż 3 razy. Jeśli igła zostanie stępiona, zwiększa się ryzyko zablokowania lub w inny sposób słabego wstrzyknięcia.
17. Upewnij się, że igła znajduje się całkowicie wewnątrz nerwu. Utrzymać pozycję nieruchomą i włączyć pompę strzykawkową.
    UWAGA: Należy dokładnie sprawdzić miejsce wstrzyknięcia, aby upewnić się, że potencjalna mieszanina leku i barwnika nie wypływa wstecznie z nerwu.
18. W trakcie wstrzykiwania należy stale sprawdzać, czy napar pozostaje w nerwie i płynnie płynie. Użyj oznaczenia wykonanego na rurce infuzyjnej, aby monitorować ruch mieszaniny leku i barwnika od punktu początkowego.
    1. Jeśli kandydat na mieszaninę leku i barwnika nie przepływa płynnie, wyciągnąć igłę i powtórzyć etap zalewania (krok 5.2). Następnie ponownie wprowadzić igłę do nerwu i wznowić infuzję.
19. Nerw zaczyna rozwijać kolor barwnika (Ryc. 4B). Kontynuować infuzję w dawce 0,5 μl/min przez 10 minut, aby podać wszystkie 5 μl kandydackiej mieszaniny leku i barwnika.
    UWAGA: W razie potrzeby zaleca się nawodnienie odsłoniętych tkanek niewielką ilością ciepłej 0,9% sterylnej soli fizjologicznej, aby zapobiec nadmiernemu wysuszeniu i uszkodzeniom.
20. Po podaniu w infuzji 5 μl i zatrzymaniu pompy strzykawkowej, należy przytrzymać igłę na miejscu przez dodatkowe 1 minutę, aby umożliwić rozprzestrzenienie się całej kandydackiej mieszaniny leku i barwnika z miejsca wstrzyknięcia. Wyjąć igłę.
21. Wyjąć zakrzywioną igłę 25 G. Użyj sterylnych bawełnianych końcówek, aby delikatnie przesunąć chusteczki z powrotem na ich pierwotne miejsce. Zdejmij końcówki zwijacza.
22. Zamknij ranę szwem niewchłanialnym (można również zastosować szew wchłanialny). W razie potrzeby nałóż niewielką ilość kleju tkankowego między szwy, aby idealnie zamknąć ranę.

8. Opieka pooperacyjna szczura

1. Po zamknięciu rany podać podskórnie około 3 ml 0,9% ciepłej soli fizjologicznej. Pomaga to szczurom w natychmiastowym nawodnieniu.
2. Umieść szczura w źródle ciepła, aż w pełni wyzdrowieje ze znieczulenia do normalnego stanu. Zwróć uwagę na wszystko, co jest nieprawidłowe podczas procesu odzyskiwania.
   UWAGA: czas rekonwalescencji może być dłuższy, jeśli procedura iniekcji nerwu trwa długo.
3. Przenieś szczura do jego domowej klatki z wilgotną karmą na podłodze klatki. Upewnij się, że woda jest dostępna przez cały czas. Obserwuj szczura po operacji przez około 2 godziny, aby upewnić się, że nie jest mu zimno.
   UWAGA: Umieść szczura w źródle ciepła na dodatkowe godziny, jeśli jest mu zimno.
4. Monitoruj szczura po 12 godzinach, 24 godzinach, 36 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach po operacji z pisemnymi notatkami z obserwacji. Powtórz leki przeciwbólowe zgodnie z zatwierdzonym instytucjonalnym protokołem dla zwierząt w celu kontrolowania bólu. Na przykład karprofen podaje się podskórnie w dawce 5 mg/kg dwa razy w odstępie 24 godzin. Skonsultuj się z weterynarzem, jeśli ból utrzymuje się u szczura dłużej niż 48 godzin.
5. Powtórz wstrzyknięcie podskórne około 3 ml 0,9% ciepłej soli fizjologicznej po 24 godzinach, w zależności od warunków szczura.
6. Kontynuuj ocenę rany. Upewnij się, że rana jest sucha i jest w trakcie gojenia.
   UWAGA: Zaczerwienienie, obrzęk i bolesny stan rany z bezczynnością i otępieniem szczura może wskazywać na stan zapalny rany i może wymagać dodatkowej konsultacji z weterynarzem. Szczur z bólem pokaże zgarbione plecy, potarganą sierść, czerwone oczy i nieaktywny stan. Zwykle znajduje się w rogu klatki.
7. Usuń niewchłanialne szwy w ciągu 2 tygodni po zagojeniu się rany.

Wyniki

W niniejszym badaniu wykorzystano sześć dorosłych szczurów (3 samce i 3 samice). Z sześciu, jednemu szczurowi wstrzyknięto wiele razy, aby zademonstrować stan nieudanego wstrzyknięcia, który pokazuje dyfuzję barwnika wokół miejsca wstrzyknięcia Rysunek 5A. Wszystkie inne szczury wykazały gładkie wstrzyknięcie i zabarwienie nerwów, jak pokazano na Rysunek 4B i Rysunek 5B.

Dyskusja

Metodę bezpośredniego wstrzyknięcia do lewego nerwu błędnego można wykonać bezpiecznie i bez powikłań pooperacyjnych u szczurów. Dostarczanie leku do nerwu błędnego może być wykorzystane do celowania w autonomiczny układ nerwowy (ANS). Wiąże się to z pewnymi krytycznymi krokami, które wymagają praktyki i umiarkowanego lub wysokiego stopnia umiejętności chirurgicznych.

Ten zabieg chirurgiczny wymaga zrównoważonego znieczulenia ogólnego u szczurów. Chirurg dąży do zakończenia operacji w krótszym...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 ml BD  Strzykawka tuberkulinowa z odłączaną strzykawką 25 G x 5/8". Igła	Becton, Dickinson and Company	SKU:309626	Służy do łączenia z zakrzywioną igłą w celu pociągnięcia nerwu błędnego i przytrzymania go w momencie wstrzyknięcia.
0,5% chlorowodorek bupiwakainy do wstrzykiwań	Hospira	NDC 0409-1162-19	Znieczulenie miejscowe stosowane do znieczulenia miejscowej tkanki.
100 ml 0,9% Chlorek sodu Nawadnianie USP	Stericare Solutions	Pozycja #6240	Sól fizjologiczna zwykła, używana do nawadniania szczurów i tkanek.
20 końcówek retraktora, 7,5 mm	Kent Scientific Corporation	Surgi 5018	Służy do rozsuwania i przytrzymywania tkanek podczas operacji.
Strzykawka 3 ml BD-Luer-Lok, sterylna, jednorazowego użytku	Becton, Dickinson and Company	SKU # 309657	Służy do wstrzykiwania soli fizjologicznej szczurom i napełniania soli fizjologicznej rurkami polietylenowymi.
AK-Fluor10%	Akorn	NDC 17478-253-10	Barwnik fluoresceinowy widoczny w obrębie nerwu. Służy do śledzenia wierności wtrysku.
Waga do ważenia zwierząt	Kent Scientific Corporation	SCL 4000	Służy do pomiaru masy ciała szczura.
Rękawice chirurgiczne Ansell ENCORE Perry Style 42 PF	Ansell	ASTM D3577	Sterilie, jest używana podczas operacji przez chirurga.
Maść na sztuczne łzy 3,5g	Pivetal	NDC 46066-753-55	Stosowana w celu zapobiegania nadmiernej suchości oczu.
Hemostat Baby-Myxter	Fine Science Tools	13013-14	Służy do tamowania krwawienia w nagłych wypadkach. Służy również do zginania igły 25 G x 5/8".
Rurki BD Intramedic PE	Becton, Dickinson and Company	14-170-12A	Używane w systemie konfiguracji wtrysku do łączenia z igłą Hamilton i igłami NanoFil. Mieści również mieszaninę iniekcyjną.
Igła BD Precison Glide, 25 G x 5/8"	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Służy do wstrzykiwania soli fizjologicznej szczurom i do wytwarzania zakrzywionej igły.
Igła do ślizgu BD Precison Glide, 27 G x & frac12; "	Becton, Dickinson and Company	REF#301629	Służy do napełniania sterylnego roztworu soli fizjologicznej do rurki BD Intradermic.
Benchmark Accuris " NastępnyPette" Zestaw startowy mikropipet o zmiennej objętości zawiera 4 pipety: 10/20/200/1000 μ L, plus podstawka	MilliporeSigma	BMSP7700S1	Służy do pipetowania sterylnego roztworu.
Betadine, Povidine Jod 10%	Honestmed	67618015017	Służy do dezynfekcji pola operacyjnego.
Karprofen Roztwór do wstrzykiwań 50 mg / ml	Dostarczany przez Covtrus (6451506845)	SKU 591149	W naszym przypadku użyliśmy rozcieńczonego karprofenu w dawce 5 mg / kg dostarczonej przez Animal Resource Center of University of Texas Southwestern Medical Center.
Zakrzywiona igła (wykonana na zamówienie)	Becton, Dickinson and Company	REF#305122	Igła BD PrecisionGlide 25 G x 5/8" jest zakrzywiona do 90 stopni za pomocą hemostatu. Końcówka igły jest. Przed użyciem należy go wysterylizować. Służy do zaczepienia nerwu błędnego i przytrzymania go w momencie separacji i wstrzyknięcia.
Mikroskop preparacyjny	Motic	SMZ-171-BLED (lornetka ze światłami)	Służy do powiększania kryficznego obszaru anatomicznego w momencie separacji nerwu błędnego, injecitonu oraz do sprawdzania wycieku wstrzyknięcia.
Arkusz zasłony	Dynarex	Reorder#8122	Używany jako serweta po sterylizacji.
Dukal Cotton Tip Applicators, niesterylne	Dukal	Item 9003	Służy do oddzielania tkanek, przed użyciem należy je wysterylizować.
Dumont #7 - Cienkie kleszcze	Fine Science Tools	11274-20	Służy do oddzielania lewego nerwu błędnego od tętnicy szyjnej wspólnej. Jest zakrzywiony, więc łatwy w użyciu.
Ethicon PDS II Niebarwiony szew monofilamentowy - SZEW, 4/0 18 PDS II CLR MONO PS	Ethicon	VA - Z682G	Stosowany do szycia ran.
Ethilon Nylon Suture Black Monofilament	Ethicon	1856G	Stosowany do szycia rany, jeśli stosowany jest szew niewchłanialny. Służy również do zaczepiania zęba szczura, aby zamocować nos wewnątrz stożka nosowego.
Cienkie kleszcze - Lustrzane wykończenie	Fine Science Tools	11412-11	Używany w momencie oddzielenia nerwu błędnego od wspólnej tętnicy szyjnej. To jest proste.
Cienkie nożyczki - Ostre	narzędzia do nauki	14060-09	Służy do cięcia tkanki.
Roztwór czyszczący	Hamilton	HT18311	Służy do czyszczenia Hamiltona po użyciu.
Igła Hamilton, 27G, Mała Piasta RN Igła, 2", PT3, 6/PK	Hamilton	7762-01	Służy do podłączenia BD Intramedic™ Rurki PE.
Strzykawka Hamiltona , 710RN	Hamilton	7638-01	Służy do przechowywania leku w czasie wstrzyknięcia nerwu błędnego.
Strzykawka insulinowa	EXEL INT, punkt komfortu	REF 26027	Służy do wstrzykiwania karprofenu i środków znieczulających miejscowo.
Lidokaina 2% Injection	Covetrus	Reorder#002468	Służy do mieszania z bupiwakainą i wstrzykiwania w miejsce nacięcia.
Luxol Fast Blue MBSN	Acros Organics	212170250	Barwnik widoczny w obrębie nerwu, stosowany do mieszania z lekiem, tak aby widoczna była mieszanina iniekcyjna.
Sterylizator mikrokulek ze szklanymi koralikami	Fine Science Tools	Nr artykułu 18090-46	Służy do sterylizacji narzędzi chirurgicznych między operacjami na szczurach.
Igły NanoFil-NF35BV-2	World Precision Instrument	NC9708956	Służy do wstrzykiwania mieszaniny narkotyków i barwników do nerwu błędnego.
Uchwyty igieł Olsen-Hegar z obcinakami do szwów	Fine Science Tools	12002-12	Stosowany do szycia ran.
Laboratoryjna folia do pakowania Parafilm M, 4 cale x 125 stóp, 1 rolka w pudełku, 12 sztuk	Honestmed	PM#996	Służy do przechowywania 5 μl mieszaniny leku i barwnika, tak aby ładowanie mieszaniny leku i barwnika do rurki śródskórnej BDTM było dokładne.
PDI Alcohol Prep Pads	Honestmed	NDC 10819-3914-2	Służy do dezynfekcji pola operacyjnego.
Sterylne gąbki z gazy typu VII Premium Care, 8-warstwowe, 2" x 2"	Dukal	Pozycja C5119	Używana jako cushon pod szyją szczura w czasie operacji.
Naciśnij przycisk n Folia spożywcza Seal	Glad		Służy do przykrywania szczura w czasie operacji jak zasłona.
Zestaw zwijaczy szczurów	Kent Scientific Corporation	Surgi 5002	Służy do utrzymywania otwartego nacięcia, dzięki czemu łatwo jest oddzielić nerw błędny od tętnicy szyjnej.
RightTemp Jr.	Kent Scientific Corporation		20,3 cm szer. x 25,4 cm dł. (8 cali szer. x 10 cali dł.), służy do utrzymywania szczurów w cieple.
S& Kleszcze T - Końcówki SuperGrip	Fine Science Tools	00632-11	Używane w czasie szycia do utrzymywania tkanki bez uszkodzeń.
S& T Kleszcze do wiązania szwów	Fine Science Tools	00272-13	Służy do zaciskania szwu.
Ostrze skalpela #15	Fine Science Tools	10015-00	Służy do wykonywania nacięcia w skórze po brzusznej stronie szyi.
Rękojeść skalpela-#7	Fine Science Tools	10007-12	Służy do przytrzymywania ostrza skalpela.
Pompa strzykawkowa	KD Scientific	78-81-8052GL&	nbsp; Serial #D107034, Model#LEGATO-180, to programowalna pompa, która może pompować małą objętość mieszanki w ramach programu.
TipOne Filter Tip Refill Starter Systems	USA Pozycja naukowa	#1120-3510	Służy do pipetowania mieszaniny leku i barwnika.
Waporyzator do izofluranu, wypełniony lejkiem	Kent Scientific Corporation	Vetflow 1231	Służy do znieczulania szczurów.
Kleje do tkanek Vetbond	3M Science Applied to Life	ID B00016067	Służy do uszczelniania tkanek w miejscu przeciętej rany, jeśli szycie nie jest idealne.
Profesjonalny akumulatorowy zestaw do strzyżenia Wahl BravMini+	Kent Scientific Corporation	CL7300-Kit	Służy do strzyżenia sierści szczurów.