Artykuł metodologiczny

Nowatorska i skuteczna metoda barwienia fluorescencyjnego serca Drosophila z kriosekcją

DOI:

10.3791/67827

⸱

28 marca 2025

 ,  , 
1Department of Pathology, Division of Molecular and Cellular Pathology, Heersink School of Medicine, The University of Alabama at Birmingham, 2UAB Nathan Shock Center, The University of Alabama at Birmingham

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół sekcji serca i obrazowania fluorescencyjnego Drosophila upraszcza badanie struktury i patologii serca. Podejście to obejmuje proste cięcie, barwienie i obrazowanie, z pominięciem wiedzy technicznej potrzebnej do tradycyjnej sekcji. Zwiększa to dostępność, dzięki czemu Drosophila jest modelem szerzej wykorzystywanym do badań związanych z sercem w szerszej społeczności naukowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modele serca Drosophila są szeroko stosowane w badaniu starzenia się serca i modelowaniu chorób serca u ludzi. Jednak sekcja serc Drosophila przed obrazowaniem jest skrupulatnym, czasochłonnym procesem, który wymaga zaawansowanego treningu i umiejętności motorycznych. Aby sprostać tym wyzwaniom, przedstawiamy innowacyjny protokół, który wykorzystuje kriosekcję do obrazowania fluorescencyjnego tkanki serca Drosophila. Protokół ten został zademonstrowany w obrazowaniu serca dorosłego Drosophila, ale może być dostosowany do etapów rozwojowych. Metoda ta zwiększa zarówno skuteczność, jak i dostępność barwienia fluorescencyjnego przy jednoczesnym zachowaniu integralności tkanki. Protokół ten upraszcza proces bez uszczerbku dla jakości obrazowania, zmniejszając w ten sposób zależność od techników z wysoko rozwiniętym przeszkoleniem i umiejętnościami motorycznymi. W szczególności zastępujemy złożone techniki, takie jak kapilarne odsysanie próżniowe, prostszymi metodami, takimi jak osadzanie tkanek. Takie podejście pozwala na wizualizację struktur serca z większą łatwością i powtarzalnością. Wykazujemy użyteczność tego protokołu, skutecznie wykrywając kluczowe markery serca i uzyskując obrazowanie fluorescencyjne i immunologiczne o wysokiej rozdzielczości, które ujawnia skomplikowane szczegóły morfologii serca i organizacji komórek. Metoda ta stanowi solidne i dostępne narzędzie dla naukowców badających biologię serca Drosophila, ułatwiając szczegółowe analizy rozwoju, funkcji i modeli chorób.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby układu krążenia (CVD) są główną przyczyną zgonów na całym świecie, odpowiadają za około 17,9 miliona zgonów rocznie, co stanowi prawie 1/3 wszystkich zgonów na świecie. Drosophila melanogaster (powszechnie znana jako muszka owocowa) jest szeroko stosowana jako organizm modelowy do badania genetycznych, komórkowych i molekularnych podstaw rozwoju serca, fizjologii, metabolizmu, starzenia się i kardiomiopatii1,2,3,4,5,6,7,8,9. Modele Drosophila zostały również wykorzystane do zbadania roli mięśnia sercowego w ogólnoustrojowej regulacji otyłości10, głównego czynnika ryzyka zachorowalności i śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych. Badania nad sekwencjonowaniem genomu Drosophila11 wykazały znaczną ochronę genów u ludzi, w tym tych związanych z rozwojem różnych narządów, w tym serca. Wśród tych wysoce konserwatywnych genów, niektóre są zaangażowane w dysfunkcję serca, takie jak kardiomiopatie lub kanałopatie3. Niedawny rozwój skutecznych technik badania wydolności serca rozszerzył zastosowania modelu o badanie długoterminowych zmian w fizjologii serca u dorosłych spowodowanych takimi czynnikami, jak ćwiczenia, dieta i starzenie się8. Jednak wyzwania techniczne i logistyczne często utrudniają korzystanie z tego modelowego systemu. Jednym z wyzwań związanych z wykorzystaniem Drosophila w badaniach kardiologicznych jest precyzyjna sekcja serca w sposób, który zachowuje cytoarchitekturę i elementy mięśnia sercowego.

Serce Drosophila lub naczynie grzbietowe składa się z rurkowatej struktury składającej się z pojedynczej warstwy kardiomiocytów, komórek osierdzia umieszczonych wzdłuż ściany serca, wspieranych przez mięśnie alaryczne, a u dorosłych z warstwą brzusznej podłużnej komórki mięśniowej12. Dokładna sekcja w celu uzyskania dostępu do tych delikatnych struktur jest procesem czasochłonnym i pracochłonnym. Obecny standard obejmuje technicznie wymagającą sekcję i kapilarne odsysanie próżniowe, co wymaga zaawansowanego treningu i umiejętności motorycznych13,14,15,16. Zazwyczaj sekcja rozpoczyna się od nacięcia brzusznej ściany ciała, a wyzwania pojawiają się szybko ze względu na drobiazgową anatomię serca, jego delikatną strukturę i trudno dostępne położenie grzbietowe. To w połączeniu z tradycyjnymi technikami preparacyjnymi pozwala na precyzyjną analizę struktury i funkcji serca, zapewniając ulepszone narzędzie do badania chorób sercowo-naczyniowych w Drosophila13. Na przykład, korzystając z tego, Alayari i in. opracowali protokół fluorescencyjnego znakowania struktur serca Drosophila, ułatwiając wizualizację morfologii i struktury serca. Pomimo tych wysiłków, tradycyjne preparowanie i barwienie serca napotyka kilka wyzwań, w tym trudności w utrzymaniu integralności tkanek i specjalistyczne szkolenie wymagane do skutecznego barwienia serca.

Metoda oferuje innowacyjne rozwiązanie tego problemu, zastępując całą procedurę prostszym protokołem, który wykorzystuje krioembed klatki piersiowej i brzucha Drosophila, a następnie barwienie immunologiczne i obrazowanie fluorescencyjne. To łatwe do opanowania podejście zapewnia szybszą i prostszą wizualizację struktur serca z większą odtwarzalnością. Dodatkowo opisujemy prostą metodę z użyciem suchego lodu, która zapewnia równomierne ułożenie naskórka brzusznego Drosophila na tej samej płaszczyźnie z, usprawniając etap kriosekcji w dół rzeki. Wykazujemy skuteczność tego protokołu w wykrywaniu ważnych markerów serca, morfologii serca i organizacji komórkowej za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i konfokalnej. Łatwość i wysoka skuteczność tego podejścia jest szczególnie pomocna w przypadku wysokoprzepustowych badań kardiologicznych opartych na Drosophila.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie sprzętu

  1. Upewnij się, że kriostat jest włączony i ustawiony na -20 °C. Poczekaj, aż upłynie odpowiedni czas, aby temperatura osiągnęła ten punkt. Jeśli maszyna ma temperaturę otoczenia, schłodzenie do optymalnej temperatury cięcia może zająć około 5 godzin.
  2. Włącz podgrzewacz do szkiełkek lub inkubator, upewniając się, że jest ustawiony na 37 °C. Upewnij się, że szkiełka mają wystarczająco dużo czasu, aby osiągnąć żądaną temperaturę.
    UWAGA: Na tym etapie oznakowane preparaty można umieścić na podgrzewaczu lub inkubatorze i pozostawić na czas nieokreślony do momentu pokrojenia.
  3. Upewnij się, że suchy lód jest gotowy do użycia. Lód można usunąć z magazynu w temperaturze – 80 °C po osiągnięciu kroku 5.

2. Przygotowanie roztworów

  1. Przygotuj 50 ml PBS. Przygotować 10 ml 10 ml kwasu tetraoctowego glikolu etelinowego w PBS. Przygotować roztwór 4% paraformaldehydu w PBS, w którym końcowa objętość jest równa 100 μl razy liczba grup doświadczalnych.
  2. Przygotuj roztwór czyszczący składający się z 70% etanolu w wodzie w butelce z rozpylaczem. Przygotuj wszystkie fluorescencyjne roztwory barwiące.
    UWAGA: Ten protokół szczegółowo opisuje, jak wykonać proste barwienie przy użyciu prostych barwników fluorescencyjnych lub barwników. W tym przypadku opiszemy zastosowanie 1x Phalloidin 594 w stosunku 1:250 w PBS. Stężenia barwników fluorescencyjnych będą się różnić w zależności od odczynnika i celów eksperymentalnych. Należy przeprowadzić wstępne badania w celu ustalenia odpowiedniego stężenia. Barwienie przeciwciał nie będzie tutaj szczegółowo opisane, ale powinno być stosowane przy użyciu konwencjonalnych metod barwienia.

3. Pobieranie tkanek

  1. Znieczulij 5-10 much za pomocą maty przeciw owadom CO2 i ustaw muchy w polu widzenia pod mikroskopem w powiększeniu 1x-2x. Regulator CO2 powinien rejestrować od 1 do 5 kPa do CO2 mat.
    UWAGA: Dostępne są inne metody znieczulania (np. FlyNap2), które nie wpływają znacząco na wyniki.
  2. Za pomocą nożyczek sprężynowych odetnij głowę, przytnij skrzydła i usuń nogi od 5 do 10 much. To, co pozostaje, to klatka piersiowa i brzuch, razem będą określane jako ciało.
    UWAGA: Aby odpowiednio wyrównać ciała muchy w kroku 5, wszelkie pozostałe długości skrzydeł lub nóg nie mogą kolidować z płaskim wyrównaniem wzdłuż dna formy. Osiągnij to, przycinając skrzydła i nogi jak najbliżej klatki piersiowej.
  3. Za pomocą pędzla delikatnie umieść ciała w oznaczonych probówkach o pojemności 1,5 ml na lodzie, aż wszystkie grupy eksperymentalne zostaną zebrane.

4. Utrwalenie całej tkanki

  1. Po wyjęciu probówek z lodu dodaj 100 μl 10 mM EGTA, pH 8 do każdej probówki, aby rozluźnić tkankę serca w jamie brzusznej. Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone na 10 minut i umieszczone na wytrząsarce orbitalnej. Aby ułatwić zanurzenie ciał, można użyć wirówki stołowej.
  2. Wyjąć i wyrzucić roztwór z probówki. Odpipetować 100 μl PBS do każdej probówki, aby przemywać tkankę przez 10 minut, umieszczając na wytrząsarce orbitalnej. Usuń i wyrzuć po upływie czasu.
  3. Odpipetować 100 μl 4% paraformaldehydu w roztworze PBS do każdej probówki. Upewnij się, że wszystkie ciała są zanurzone w roztworze.
  4. Umieść na wytrząsarce orbitalnej na 15 minut, ustawiając prędkość na około 100 jednostek. Upewnij się, że ustawienie nie powoduje poruszenia tkanek w kontakcie z roztworem.
  5. Po upływie tego czasu wyrzuć PFA i zastąp go 1x PBS na 10 minut, ponownie upewniając się, że wszystkie ciała mają kontakt z roztworem. Umieść probówki z powrotem w wytrząsarce orbitalnej z podobną prędkością, jak w kroku 4.4 dla każdego pozostałego prania.
  6. Za każdym razem odrzucając poprzedni roztwór, przemyj chusteczkę PBS 2x przez 10 minut każde, w sumie 3 prania.
  7. Po odrzuceniu końcowego płukania przenieś ciała do 10% roztworu sacharozy w PBS, upewniając się, że stykają się z roztworem w probówce. Aby uzyskać optymalne nasycenie, pozostaw je na noc lub na tyle długo, aby ciała opadły na dno.
    UWAGA: Preferowana jest krioprotekcja przez noc, ale jeśli konieczne jest obrazowanie tego samego dnia, należy odczekać jak najdłużej krioprotektant na infiltrację tkanki.

5. Przygotowanie formy

  1. W tym momencie wyjmij suchy lód z magazynu i wybierz kilka kawałków do umieszczenia na małej metalowej lub plastikowej tacy. Wymiary tacki powinny być takie, aby można było włożyć formę, umieszczając ją bezpośrednio na pojedynczym, dużym i najlepiej płaskim kawałku suchego lodu.
  2. Napełnij oznakowaną formę w około 50% związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT). Staraj się ograniczyć wprowadzanie pęcherzyków, pozwalając związkowi powoli przepływać.
  3. Za pomocą pędzla ostrożnie umieść ciała na powierzchni OCT w formie. Na tym etapie należy wyraźnie rozdzielić wiele grup eksperymentalnych.
    UWAGA: Ważne jest, aby zapobiec rozcieńczeniu związku OCT poprzez zanieczyszczenie roztworem sacharozy przez szczotkę. Ponadto umieszczenie głęboko w OCT za pomocą szczotki może spowodować powstanie wielu pęcherzyków powietrza. Unikaj tych błędów, aby zapobiec późniejszym problemom z sekcjami.
  4. Za pomocą kleszczy popchnij każde ciało na dno formy grzbietową ścianą klatki piersiowej i brzucha, zwykle wzdłuż dna. Następnie wyreguluj ciało tak, aby brzuch był priorytetowo traktowany jako płaski wzdłuż dna formy. Wyrównaj wszystkie obiekty w wymiarach X, Y i Z w taki sposób, aby każda sekcja zawierała wszystkie obiekty jednocześnie.
  5. Może wystąpić skrzywienie brzucha, szczególnie u samców; spłaszcz je najlepiej jak potrafi technik. Jest to niezbędne, aby dłuższe odcinki mogły być zbierane w płaszczyźnie koronalnej. Podczas tego procesu unikaj przebijania lub zgniatania ciał o dno formy. Pracuj metodycznie, aby prawidłowo wyrównać każdy temat.
  6. Gdy wszystkie przedmioty znajdą się na miejscu, weź formę i połóż spód bezpośrednio na kawałku suchego lodu. Sprawdź, czy OCT zaczyna się zamarzać po kilku chwilach po kontakcie. Pozwól temu trwać, aż wszystkie obiekty zostaną otoczone zamrożoną częścią formy.
  7. Po osiągnięciu tego etapu przenieś formę do -20 °C, aby zamrozić ją w całości. Napełnij pozostałą część formy, gdy pierwsza porcja jest całkowicie zamrożona. Formy można następnie przechowywać w temperaturze -80 °C do późniejszego wykorzystania, owijając je folią aluminiową lub natychmiast pociąć.
    UWAGA: Unikaj otwartej ekspozycji na powietrze w temperaturze -20 °C i -80 °C między dwoma etapami zamrażania. Może to spowodować rozwój wilgoci między warstwami.

6. Kriosekcja form

UWAGA: Generalnie zaleca się przygotowanie i wycięcie pustej formy przed cięciem eksperymentalnych form grupowych. Dzięki temu możemy zapewnić prawidłową funkcjonalność koła, ostrza i szkła anty-roll-roll bezpośrednio przed przecięciem tkanki. Ponadto pozwól, aby wszelkie pleśnie pochodzące z chłodniejszego przechowywania zaaklimatyzowały się w kriostacie przez 30 minut.

  1. Przymocuj wiertło do formy, nakładając dużą ilość OCT na blok i umieszczając wiertło na górze, dociskając je płasko. Pozostaw to do całkowitego zamrożenia w kriostacie, zwykle w ciągu 5 minut.
  2. Zwolnij wiertło i blok OCT z formy i umieść je w uchwycie, upewniając się, że blok pozostaje prawidłowo zorientowany od góry do dołu. Dokręć klucz do uchwytu wiertarskiego, aż wiertło będzie bezpieczne.
  3. Dopasuj blok do ostrza za pomocą pokręteł regulacyjnych i regulatorów głębokości uchwytu. Ustaw szerokość przekroju na 20 μM lub mniej.
    UWAGA: Cieńsze sekcje są bardziej pożądane, aby zwiększyć liczbę możliwych zebranych sekcji. Pierwsze 2-6 sekcji każdego tematu powinno zawierać pożądane, niezakłócone części serca, które są funkcją orientacji i szerokości sekcji. Należy spróbować uzyskać odpowiednią orientację uchwytu przed przecięciem ważnych 2-6 sekcji.
  4. Pokrój każdy plasterek powolnym, ale konsekwentnym ruchem, pozwalając szkłu zapobiegającemu przetaczaniu się uchwycić każdy plasterek. Zbieraj sekcje za pomocą rozgrzanych szkiełek. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez co najmniej 30 minut, ale nie dłużej niż 1 godzinę przed pierwszą rundą prania.

7. Barwienie fluorescencyjne

  1. Bezpośrednio po okresie suszenia usuń nadmiar OCT otaczającego sekcje za pomocą żyletki. Uważaj, aby na tym etapie nie natknąć się na tkankę. Jeśli szkiełko ma być zabarwione w późniejszym czasie, należy je przechowywać w temperaturze -80 °C.
  2. Obrysuj tę granicę na każdym slajdzie za pomocą markera hydrofobowego. To obramowanie posłuży do utrzymania roztworów do mycia i barwienia na tkance.
    UWAGA: Protokół ten określa, jak wykonywać barwienie i mycie metodą pipet, można również używać przesuwnych wiader i stojaków. Wystarczy zastąpić pipetowanie roztworów na wierzchu szkiełek zanurzeniem szkiełek w każdym ze świeżych roztworów. Tak jak zrobiliśmy to ostatnio dla obrazowania mózgu17, procedura barwienia immunologicznego może być również zastosowana do barwienia serca.
  3. Myć wszystkie szkiełka podstawowe 3 razy po 5 minut za pomocą PBS, delikatnie pipetując na wierzchu szkiełka, unikając pipetowania bezpośrednio na chusteczkę, jeśli to możliwe. Zrób to za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i dołączonych końcówek. Staraj się nie wstrzykiwać roztworu w pośpiechu, ponieważ może to spowodować uwolnienie tkanek z powierzchni szkiełka.
  4. Wyrzuć końcowe płukanie i odpipetuj roztwór barwnika fluorescencyjnego (1:250, 1x falloidyna) na tkanki. Pozostaw do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.
  5. Po tym momencie badani są wrażliwi na światło. Wszystkie kolejne kroki wykonuj w ciemności lub zakrywając szkiełka. Wyrzuć barwnik fluorescencyjny i za pomocą pipety o pojemności 1000 μl przemyj 3x przez 5 minut PBS.

8. Montaż i przygotowanie do obrazowania

  1. Wyrzuć końcowe płukanie, pozostawiając niewielką ilość PBS na szkiełku. Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl należy nanieść 3-5 kropli podłoża montażowego na szkiełko, unikając bezpośredniego rozprowadzania na tkankę.
  2. Umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku w taki sposób, aby zminimalizować wytwarzanie pęcherzyków powietrza. Dla ułatwienia użyj kleszczyków, aby umieścić szkiełko nakrywkowe na jednej krawędzi i stopniowo opuszczaj drugą stronę, aż zrówna się ze szkiełkiem. Ze świeżo zamontowanymi prowadnicami należy obchodzić się ostrożnie i przechowywać je w pozycji złożonej na płasko przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  3. Uszczelnij prowadnice za pomocą lakieru do paznokci lub, jeśli media montażowe twardnieją, unikaj tego. Nie należy używać lakieru do paznokci zawierającego neon lub brokat. W zależności od barwienia fluorescencyjnego należy natychmiast wykonać obrazowanie lub przechowywać preparaty do późniejszego uchwycenia.

9. Obrazowanie

UWAGA: Mikroskop Olympus BX 63 z obiektywami 10x, 40x i 60x był używany do przechwytywania obrazu. Zastosowano również odpowiednie filtry dla DAPI, Lipid Spot 488 i Phalloidin 594.

  1. Przed obrazowaniem sprawdź szkiełka i wyczyść je chusteczką chusteczkową i 70% etanolem w roztworze wodnym. Jeśli slajdy są obrazowane bezpośrednio po zamontowaniu, należy zachować szczególną ostrożność podczas czyszczenia, aby nie naruszyć szkiełka nakrywkowego.
  2. Wybierz odpowiednie czasy ekspozycji dla każdego kanału w oparciu o najjaśniejsze fluorescencyjne obiekty w całym eksperymencie. Unikaj przesycenia, generując jak najjaśniejszy obraz i zmniejszając tło. Szybko przeprowadź ankietę wśród każdej grupy eksperymentalnej za pomocą podglądu na żywo każdego kanału, aby upewnić się, że ekspozycje są odpowiednio ustawione.
  3. Skoncentruj się na każdym obiekcie, używając tego samego kanału dla wszystkich obiektów, aby zachować spójność. Następnie uchwyć każdy obiekt. Uchwyć wszystkie grupy eksperymentalne użyte do porównania w tym samym dniu, aby uniknąć różnic w rozpadzie fluorescencyjnym między porównywanymi grupami.
  4. Po zobrazowaniu przechowuj slajdy w ciemności w temperaturze 4 °C w celu późniejszego uchwycenia obrazu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda opisana powyżej ułatwia badanie serca Drosophila za pomocą obrazowania fluorescencyjnego bez żmudnej sekcji. Jest to główna zaleta tej metody, ponieważ konwencjonalna metoda sekcji serca wymaga rozwoju złożonych zdolności motorycznych. Zilustrowana w Rysunek 1, metoda jest bardziej przystępna niż sekcja serca dla nowych badaczy i pozwala na elastyczność eksperymentu. Alternatywnie, przy użyciu przechowywania w temperaturze -80 °C na etapie pleśni OCT, próbki można przechowywa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy skuteczny protokół przygotowania rurki kardiologicznej Drosophila do wizualizacji za pomocą obrazowania fluorescencyjnego lub konfokalnego. Jest to poprzedzone omówieniem powszechnie stosowanej, ale czasochłonnej i pracochłonnej metody uzyskiwania dostępu i monitorowania integralności cytologicznej serca Drosophila. Nasza innowacyjna i wydajna metoda stanowi zwięzłą i skuteczną alternatywę dla tradycyjnych podejść poprzez wykorzystanie bezpośredniego osadzania kriogenicznego, które zachowu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy członkom laboratorium Melkani za pomoc w postaci cennych informacji zwrotnych dotyczących rozwoju protokołu. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) AG065992 i RF1NS133378 dla GCM. Prace te są również wspierane przez fundusze UAB Startup 3123226 i 3123227 G.C.M.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1000 &mikro; L PipetaEppendorf3123000063
1000 µ L Końcówki do pipetOlympus Plastics23-165R
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)FisherJ62036.K7ph=7,4
200 Proof EthanolDecon Laboratories64-17-5
20X Tris Buffered SalineThermo ScientificJ60877. K2pH = 7,4
Szkło antyrolkoweIMEBAR-14047742497
Albumina surowicy bydlęcejFisher9048-46-8
Probówki wirówkowe 1,5 mlFisher05-408-129
Naładowane szkiełkaGlobe Scientific1415-15
Formy do kriosekcjiFisher2363553
KriostatLeicaCM 3050 S
Ostrza kriostatuCL SturkeyDT554N50
Suchy lód
Drobne kleszczeNarzędzia precyzyjne11254-20
Fly PadTritech ResearchMINJ-DROS-FP
Hartowanie podłoża montażowego z DapiVectashieldH-1800
KimwipesKimtech34120
MikroskopOlympusSZ61
Optymalna temperatura cięciaZwiązek Fisher4585
Paraformaldehyd 20%Mikroskopia elektronowa Nauki15713
Falloidyna 594AbnovaU0292
ŻyletkiGravey#40475
NożyczkisprężynoweNarzędzia do nauki o nakładzie15000-10
SacharozaFisherS5-500
pięknym

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, K. D., Thummel, C. S. Diabetic larvae and obese flies-emerging studies of metabolism in Drosophila. Cell Metab. 6 (4), 257-266 (2007).
  2. Bhide, S., et al. Increasing autophagy and blocking Nrf2 suppress laminopathy-induced age-dependent cardiac dysfunction and shortened lifespan. Aging Cell. 17 (3), e12747(2018).
  3. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  4. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
  5. Gill, S., Le, H. D., Melkani, G. C., Panda, S. Time-restricted feeding attenuates age-related cardiac decline in Drosophila. Science. 347 (6227), 1265-1269 (2015).
  6. Melkani, Y., Pant, A., Guo, Y., Melkani, G. C. Automated assessment of cardiac dynamics in aging and dilated cardiomyopathy Drosophila models using machine learning. Commun Biol. 7 (1), 702(2024).
  7. Ocorr, K., et al. KCNQ potassium channel mutations cause cardiac arrhythmias in Drosophila that mimic the effects of aging. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (10), 3943-3948 (2007).
  8. Piazza, N., Wessells, R. J. Drosophila models of cardiac disease. Prog Mol Biol Transl Sci. 100, 155-210 (2011).
  9. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circ Res. 109 (7), 794-806 (2011).
  10. Lee, J. H., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Heart-and muscle-derived signaling system dependent on MED13 and Wingless controls obesity in Drosophila. Proc Natl Acad Sci. 111 (26), 9491-9496 (2014).
  11. Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
  12. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (2), 15(2016).
  13. Alayari, N. N., et al. Fluorescent labeling of Drosophila heart structures. J Vis Exp. (32), e1423(2009).
  14. Guo, Y., Abou Daya, F., Le, H. D., Panda, S., Melkani, G. C. Diurnal expression of Dgat2 induced by time‐restricted feeding maintains cardiac health in the Drosophila model of circadian disruption. Aging Cell. 23 (7), e14169(2024).
  15. Melkani, G. C., et al. Huntington's disease-induced cardiac amyloidosis is reversed by modulating protein folding and oxidative stress pathways in the Drosophila heart. PLoS Genet. 9 (12), e1004024(2013).
  16. Hartley, P. S., Coward, R. J. Modeling podocyte biology using Drosophila nephrocytes. Methods Mol Biol. 2067, 11-24 (2020).
  17. Watson, J. R., Roth, J., Melkani, G. C. Direct cryosectioning of Drosophila heads for enhanced Brain Fluorescence Staining and Immunostaining. J. Vis. Exp. , Press e67791(2025).
  18. Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein‐trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nuc Acids Res. 32 (suppl_1), D418-D420 (2004).
  19. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
  20. Mery, A., et al. The Drosophila muscle LIM protein, Mlp84B, is essential for cardiac function. J Exp Biol. 211 (1), 15-23 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Barwienie serca DrosophilaProtok kriosiekaniaObrazowanie fluorescencyjneMarkery bia ek sercowychKonserwacja tkanekImmunohistochemiaMorfologia sercaBarwienie falloidynModele chor b sercaObrazowanie o wysokiej rozdzielczo ci

Powiązane artykuły