Method Article

Identyfikacja i klasyfikacja specyficznych dla pozycji wariantów missense podjednostki receptora GABAA pod kątem ich roli w neuronach piramidowych hipokampa

DOI:

10.3791/67833

⸱

June 6th, 2025

 , 
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Engineering and Natural Sciences, Üsküdar University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to wprowadza wieloskalowe ramy, obejmujące od DNA po funkcję białek i zachowanie neuronalne. Przedstawiono w nim nowatorskie podejście do badania przewidywanych mutacji patogennych w podjednostce receptora GABAA , stawiając hipotezę, że mutacje padaczkowe i mutacje proksymalne, przewidywane jako patogenne, mogą mieć podobny wpływ na model neuronu piramidowego CA1.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie wpływu nieznanych funkcjonalnie wariantów na geny związane z padaczką ma kluczowe znaczenie dla wyjaśnienia patofizjologii choroby i opracowania spersonalizowanych metod leczenia. Dzięki wieloskalowym ramom, obejmującym sekwencję DNA po funkcję białka i zachowanie neuronalne, opisujemy nowatorskie podejście do przewidywania i badania mutacji patogennych, stawiając hipotezę, że mutacje padaczkowe w podjednostce receptora GABAA i pobliskie przewidywane mutacje mogą mieć podobny wpływ na model neuronu piramidowego CA1. Badając charakterystyczne zależności między przewidywanymi mutacjami patogennymi a proksymalnymi mutacjami padaczkowymi, badanie ma na celu oszacowanie skutków przewidywanych mutacji w oparciu o wpływ mutacji padaczkowych na symulacje neuronów piramidowych hipokampa.

Metodologia rozpoczyna się od zebrania danych genetycznych podjednostki receptora GABAA γ2, a następnie czyszczenia i formatowania danych w R za pomocą niestandardowego skryptu. Następnie zostaną zastosowane predyktory zespołowe w celu identyfikacji i priorytetyzacji patogennych wariantów missense podjednostki γ2 . Zilustrowane zostanie mapowanie specyficznego wariantu patogennego (przewidywanego) do podjednostkowych domen strukturalnych wspólnych dla mutacji padaczkowych, któremu towarzyszyć będzie modelowanie molekularne ich skutków i uwzględnienie ochrony ewolucyjnej. Następnie zostanie przeprowadzona metaanaliza specyficzna dla wariantu i normalizacja parametrów, a następnie analiza korelacji w celu zidentyfikowania wszelkich istotnych zależności między przewidywanymi mutacjami a proksymalnymi mutacjami padaczkowymi. Za pomocą symulatora neuronalnego opartego na języku Python opisany zostanie wieloprzedziałowy model neuronów oparty na przewodnictwie, odzwierciedlający wpływ mutantów typu dzikiego i epileptogennego. Symulacja odpowiedzi neuronalnych generowanych przez podtyp padaczkowego receptoraGABA A zostanie uwzględniona w celu przybliżonego oszacowania wpływu przewidywanych wariantów patogennych na odpowiedź neuronalną. Według naszej wiedzy jest to pierwszy protokół badający wieloskalowe ramy do oszacowania wpływu wariantów receptora GABAA na zachowanie neuronów, co ma kluczowe znaczenie dla badań nad padaczką. Protokół ten może służyć jako podstawa do poprawy przewidywań fenotypów komórkowych spowodowanych przez potencjalnie patogenne warianty receptorów GABAA związane z padaczką.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W przypadku prawie wszystkich chorób człowieka zmienność genetyczna odgrywa znaczącą rolę w indywidualnej podatności. W związku z tym zrozumienie, w jaki sposób zmiany sekwencji odnoszą się do ryzyka choroby, stanowi cenny sposób na odkrycie kluczowych procesów związanych z rozwojem choroby i zidentyfikowanie nowych podejść do zapobiegania i leczenia1. Dotyczy to również zaburzeń neurorozwojowych, które należą do najczęstszych przewlekłych schorzeń w podstawowej opiece zdrowotnej u dzieci2. Stany takie jak zaburzenia ze spektrum autyzmu, niepełnosprawność intelektualna i padaczka ilustrują, w jaki sposób zmienność genetyczna znacząco wpływa na indywidualną podatność podczas rozwoju3.

Rozwijający się mózg jest bardziej podatny na napady padaczkowe niż mózg dorosłego z powodu genetycznie zaprogramowanego niedopasowania neurorozwojowego w krytycznej równowadze między pobudzeniem a hamowaniem4. Ponieważ GABA (kwas gamma-aminomasłowy), główny neuroprzekaźnik hamujący w dorosłym mózgu, jest pobudzający podczas rozwoju embrionalnego i wczesnego rozwoju pourodzeniowego, nie jest to korzystne dla stabilności potrzebnej do zapobiegania napadom w młodych mózgach. Ten tymczasowy stan, spowodowany brakiem wystarczającej ekspresji kotransporterów K-Cl5, może przyczyniać się do zwiększonego ryzyka aktywności napadowej w obecności dysfunkcyjnych receptorów GABAA . Receptory GABA A pośredniczą w pobudzającym i hamującym działaniu GABA, w zależności od wewnątrzkomórkowego stężenia jonu Cl- 6. Tak więc, w miarę dojrzewania mózgu, mutacje w genach kodujących receptor GABAA , a także w innych kanałach jonowych, zniekształcają pobudliwość, a mutacje w genach zaangażowanych w metabolizm neuronalny, sygnalizację komórkową i tworzenie synaps7 mogą powodować stany takie jak padaczka w dzieciństwie8.

Interwencje kliniczne w coraz większym stopniu wykorzystują analizę genetyczną w celu poprawy precyzji w leczeniu zaburzeń neurorozwojowych2. Badania genetyczne w padaczce dziecięcej stanowią potencjalne cele dla podejść medycyny precyzyjnej9, podkreślając znaczenie wariantów genetycznych w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia. Ponadto ~25% pacjentów z padaczką z mutacjami de novo otrzymuje diagnozy genetyczne, które identyfikują potencjalne cele dla medycyny precyzyjnej, co podkreśla istotną wartość wariantów genetycznych w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia10. Było to napędzane przez postępy w technologiach sekwencjonowania nowej generacji, takich jak celowane panele genowe, sekwencjonowanie całego eksomu i sekwencjonowanie całego genomu, które znacznie przyspieszyły odkrycia genetyczne11. Jednak rosnąca liczba nowych odkryć genów wiąże się z wyzwaniem, gdy wyniki dają wariant o nieznanym znaczeniu (VUS), klasyfikację, która odzwierciedla sprzeczne dowody lub niewystarczające informacje dotyczące molekularnej roli wariantu w patogenezie choroby. Warianty sklasyfikowane jako VUS odpowiadają jednej kategorii w ramach pięciopoziomowego systemu klasyfikacji wariantów zaproponowanego przez American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) i Association for Molecular Pathology (AMP)12.

Sprostanie wyzwaniu, jakim są funkcjonalnie nieznane warianty genetyczne, wymaga wysiłków w dwóch kluczowych wymiarach: praktyki klinicznej i badań. Z klinicznego punktu widzenia niepewność związana z VUS może komplikować postępowanie z pacjentem i podejmowanie decyzji13. Z perspektywy badań naukowych kluczowe znaczenie ma identyfikacja wariantów patogennych wśród rosnącej liczby wariantów o niepewnym znaczeniu oraz określenie ich roli w patofizjologii choroby i skutkach fenotypowych1. Jeden z idealnych scenariuszy obejmowałby dokładne przewidywanie molekularnych, neuronalnych i sieciowych skutków wszystkich funkcjonalnie niescharakteryzowanych wariantów, minimalizując w ten sposób zasoby, czas i wysiłek wymagany do badań laboratoryjnych. Aspekty te podkreślają znaczenie dokładnej klasyfikacji wariantów genetycznych, aby umożliwić precyzyjną diagnozę padaczki genetycznej, wspierać spersonalizowane leczenie i ułatwiać odkrywanie potencjalnych celów farmakologicznych. Obecne narzędzia predykcyjne 14,15,16,17 są stosunkowo dokładne, ale zazwyczaj dostarczają tylko binarnych klasyfikacji (patogenny vs. łagodny) i brakuje specyficznego dla choroby wglądu w patofizjologię molekularną, konsekwencje fenotypowe i mechanizmy leżące u podstaw. Koncentrując się na nieznanych wariantach missense wybranych genów kodujących podjednostki receptora GABAA, w artykule przedstawiono ramy mające na celu ulepszenie wytycznych badawczych poprzez włączenie czynników kontekstowych wariantów, takich jak aspekty molekularne, ewolucyjne i strukturalne, a także symulacje patologii neuronalnej pochodzące z danych biofizycznych in vitro mutacji związanych z padaczką. Nasza metodologia dotyczy identyfikacji nieznanych wariantów patogennych podjednostki γ2 receptora GABAA, kluczowej podjednostki zaangażowanej w patofizjologię padaczki 18,19,20. Następnie prowadzone są badania nad dopasowaniem tych przewidywanych wariantów w zależności od pozycji z mutacjami związanymi z padaczką, charakteryzującymi się danymi strukturalnymi i elektrofizjologicznymi. Dane te są następnie wykorzystywane do oszacowania wpływu wariantu na model neuronu piramidowego hipokampa wyrażającego podtyp receptora GABAA, złożony z podjednostek γ2, α1 i β3 (receptory γ2-GABAA), odpowiedzialnych za szybkie hamowanie synaptyczne6. Ważne jest, aby pamiętać, że receptory GABAA składają się z dużej puli podjednostek (α1-α6, β1-β3, γ1-γ3, δ, Ε, θ, π i ρ1-ρ3) i w zależności od składu podjednostek, receptoryGABA A różnią się modulacją, cechami biofizycznymi, a także regionalnymi, komórkowymi, i subkomórkowe wzorce ekspresji sprzężone ze specyficznymi funkcjami 6,21,22,23,24,25. W związku z tym niniejsze badanie koncentruje się tylko na receptorach γ2-GABAA lub tylko na receptorach GABAA zawierających γ2.

Podjednostki receptora GABAA składają się z charakterystycznych cech strukturalnych - długiej N-końcowej domeny zewnątrzkomórkowej (ECD), czterech transbłonowych domen rozpiętych (TM1 do TM4), łącznika wewnątrzkomórkowego łączącego TM1 i TM2, łącznika zewnątrzkomórkowego łączącego TM2 i TM3, dużej pętli wewnątrzkomórkowej między TM3 i TM4 (pętla TM3-TM4) oraz krótkiego zewnątrzkomórkowego końca C 6,26, Lokal mieszkalny 27. Sugeruje się, że receptor GABAA funkcjonuje poprzez złożony mechanizm "lock and pull", w którym wiązanie GABA blokuje podjednostki β i α, powodując ich ciągnięcie za domeny zewnątrzkomórkowe (ECD) podjednostek, obracając je w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara27. Ruch ten wygina domeny transbłonowe (TMD), otwierając w ten sposób kanał jonowy27. Tak więc aktywność kanału wydaje się być skoordynowana z kasetami strukturalnymi w obrębie receptorów GABAA. Okazuje się, że mutacje padaczki powodują dysfunkcję aktywności kanałów poprzez zniekształcenie tych kaset strukturalnych28. W związku z tym nasze badanie opiera się na założeniu, że przewidywane warianty patogenne w pobliżu funkcjonalnie zidentyfikowanych mutacji padaczkowych w specyficznych kasetach strukturalnych podjednostek receptoraGABA A mogą wykazywać podobne wzorce elektrofizjologicznych lub biofizycznych zakłóceń funkcji kanałów, jak obserwowano w przypadkach tych mutacji padaczkowych. Podczas gdy obecność epileptogennych kaset strukturalnych w podjednostkach receptora GABAA 28 pośrednio wspiera to pogląd, nasze badanie pokazuje złożoność i wyzwanie korelacji parametrów biofizycznych mutacji padaczkowych z parametrami przewidywanych mutacji patogennych. Aby zdemaskować te złożone relacje, nasze ramy są istotne, ponieważ podkreślają wieloskalowe podejście, od DNA po funkcję białek i zachowania neuronalne, które mają kluczowe znaczenie dla badań nad padaczką. Podejście to integruje genetykę obliczeniową z modelowaniem molekularnym i symulacjami neuronalnymi, jednocześnie podkreślając znaczenie metod uzupełniających, takich jak uczenie maszynowe trenowane na dużych zbiorach danych, które mogą uchwycić wpływ mutacji na strukturę kanału, aktywność i pobudliwość neuronalną. Ponadto symulacja aktywności padaczkowego receptora γ2-GABAA na modelu neuronu piramidowego hipokampa pozwala na replikację fenotypu komórkowego in vitro związanego z kanałopatią receptora GABAA i wykazanie zmienionych odpowiedzi pojedynczego neuronu w centrum dysfunkcji sieci.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przewidywanie in silico wariantów patogennych

  1. Gromadzenie danych o wariantach
    1. Korzystając z bazy danych ClinVar29, wyszukaj warianty o niepewnym znaczeniu (VUS) w regionie kodującym interesujący nas gen za pośrednictwem strony internetowej: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/. Wpisz symbol genu (np. GABRG2) w pasku wyszukiwania i przefiltruj wyniki, aby uwzględnić tylko żądane typy wariantów, takie jak warianty pojedynczego nukleotydu, warianty missense o niepewnym znaczeniu. Pobierz i zapisz dane w formacie data.xlxs (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S1). Zapisz datę pobrania danych.
      UWAGA: W niniejszym protokole analizowana będzie ludzka podjednostka γ2 receptora GABAA , w szczególności podjednostka receptora gamma-aminomasłowego typu A Homo sapiens gamma2 (GABRG2), wariant transkryptu 1, mRNA (NCBI Ref. seq.: NM_198904.4), znany również jako γ2L. Ważne jest, aby zapisać referencyjny transkrypt genu będącego przedmiotem zainteresowania, jak również inne odpowiadające mu identyfikatory w różnych bazach danych (UniProt, ENSEMBL, PDB), ponieważ różne metody obliczeniowe mogą wymagać różnych identyfikatorów (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S2). W przypadku, gdy baza danych lub narzędzie obliczeniowe nie rozpoznaje numerów wersji identyfikatorów sekwencji, wypróbuj zarówno identyfikator z numerem wersji (NM_198904.4), jak i bez numeru wersji (NM_198904).
    2. Podstawowe informacje o białku referencyjnym
      1. W https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ bazy danych NCBI wybierz opcję Nukleotyd w opcjach wyszukiwania i wprowadź NCBI Ref. seq. ID interesującego genu (NM_198904.4). Następnie, przewijając w dół w prawej kolumnie, kliknij Białko w kategorii Informacje pokrewne , aby znaleźć białko (NP_944494.1) zakodowane przez transkrypt NM_198904.4. Korzystając z informacji podanych dla białka NP_944494.1, zapisać pozycje sekwencji określonych regionów w formie tabeli (plik uzupełniający 4: tabela uzupełniająca S3).
        UWAGA: Ważne jest, aby określić wstępne znane informacje dotyczące pozycji sekwencji funkcjonalnie i strukturalnie krytycznych regionów, motywów lub reszt, takich jak domeny białkowe, miejsca fosforylacji, miejsca wiązania ligandów i interfejsy interakcji molekularnych. Można to osiągnąć poprzez połączenie baz danych (NCBI, ENSEMBL, UniProt...) i przeszukiwania literatury.
  2. Wariantowa organizacja danych
    1. Uporządkuj dane tak, aby spełniały wymagania wejściowe dla wybranych predyktorów. Upewnij się, że format pobieranych danych jest zorganizowany tak, aby odpowiadał wymaganiom serwera dbNSFP http://database.liulab.science/dbNSFP. W tym celu należy usunąć niepotrzebne kolumny z pliku data.xlsx (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S1 z kroku 1.1.1), zachowując tylko następujące kolumny w określonej kolejności:
      "Chromosom GRCh38", "GRCh38Lokalizacja", "Nazwa", "Zmiana białka".
    2. Zapisz plik pod nową nazwą: "data1.xlsx" (tabela uzupełniająca S4). Sformatuj plik data1.xlsx w języku R, uruchamiając kod (Plik uzupełniający 1: Data_GABAA. R), który zapisze sformatowane dane jako data1_output.xlsx (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S5) w katalogu roboczym odpowiednim dla projektu R.
      UWAGA: Różne metody obliczeniowe wymagają różnych typów i formatów danych. Zbieranie i porządkowanie danych według określonych wymagań formatu, nawet dla kilkunastu wariantów, może być podatne na błędy i czasochłonne, dlatego ten krok jest ważny, chyba że pula wariantów składa się tylko z kilku wariantów. Wtedy możliwa może być ręczna organizacja danych.
  3. Przewidywanie chorobotwórczości
    1. Przenieś zawartość pliku data1_output.xlsx do wersji akademickiej serwera dbNSFP30,31, do której dostęp uzyskuje się za pośrednictwem http://database.liulab.science/dbNSFP. Aby to zrobić, skopiuj/wklej lub bezpośrednio prześlij plik w .txt formacie.
    2. Przed przesłaniem upewnij się, że następujące opcje są wstępnie wybrane i potwierdzone na serwerze: HG38 (kompilacja genomu), ClinPred32 i BayesDEL33 . W ciągu kilku minut serwer wygeneruje wyniki.
      UWAGA: W niniejszym protokole wybrano dwa predyktory zespołowe, a mianowicie BayesDEL33 i ClinPred32, ze względu na wysoką dokładność34 i praktyczność. Można jednak również wybrać inne predyktory, takie jak AlphaMissense, który jest dostępny w bazie danych dbNSFP30,31. Wybór narzędzi in silico zależy od kilku czynników, w tym od wygenerowania wystarczającej liczby wielu linii dowodów obliczeniowych dla potężnej prognozy12. Temu celowi mogą służyć predyktory zespołowe integrujące analizę wielu algorytmów predykcyjnych.
    3. Pobierz plik wyjściowy (w formacie .txt) i zapisz go jako data2.xlsx (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S6).
    4. Ustaw filtry w data2.xlsx (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S6), klikając opcję filtra w menu i określając warianty konsensusu w obu kolumnach, filtrując pod kątem D. W ten sposób uzyskamy listę najbardziej patogennych wariantów; zapisz go (patrz zakładka Konsensus w Tabeli Uzupełniającej S6 [ Plik Uzupełniający 4]).
  4. Wybór wariantu
    1. Wśród zgodnych prognoz patogennych należy określić warianty w pobliżu mutacji padaczkowych uzyskane z literatury. Upewnij się, że te ostatnie mają parametry strukturalne i biofizyczne odpowiednie do modelowania neuronów.
      UWAGA: Ten etap ma charakter eksploracyjny i jest również związany z badaniem interesującego białka pod kątem jego parametrów strukturalnych, fizykochemicznych i biofizycznych. W niniejszym badaniu dane te uzyskano od Brüngera i wsp.35 oraz Guo i wsp.36, a także z badania mutacji związanych z padaczką. Poza tym, jako opcję, dostęp do wyników AlphaMissense37 uzyskano z bazy danych dbNSFP30,31 powtarzając krok 1.3 (Plik uzupełniający 4: Tabela uzupełniająca S7). Więcej szczegółów podano w sekcjach protokołu 2.1.1 i 2.1.2 oraz w wynikach (patrz "Warianty grupowania parametrów strukturalnych i biofizycznych").
    2. Do podstawowej wizualizacji użyj serwerów Protter38 ((https://wlab.ethz.ch/protter/start/) i HOPE39 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/) do zbadania wariantów w poprzednim kroku w kontekście wybranych mutacji genu GABRG2 : P302L40 i K328M (lub K289M41, przy wyłączeniu peptydu sygnałowego z 39 resztami).
      UWAGA: Ze względu na ogromną złożoność, ocena strukturalna efektów wariantowych powinna być przeprowadzana na wielu poziomach analizy. Narzędzia takie jak Protter38 pozwolą na przejrzystą wizualizację wariantów w kontekście cech topologicznych białka, a przyjazne dla użytkownika serwery, takie jak HOPE39 , zapewnią wgląd w efekt wariantu poprzez modelowanie molekularne. Ponadto kompleksowy przegląd literatury na temat białka będącego przedmiotem zainteresowania ma kluczowe znaczenie dla zidentyfikowania i zintegrowania informacji na temat mutacji związanych z padaczką.
    3. Analiza ewolucyjnego zachowania i wglądu strukturalnego
      1. Otwórz Jalview 42,43,44, program typu open source do edycji, wizualizacji i analizy białek.
      2. Importuj sekwencje w celu wyrównania. Kliknij Plik w górnym menu | Pobieranie sekwencji; wybierz bazę danych w oknie dialogowym (na przykład UniProt); kliknij kartę Pobierz identyfikatory; i zgodnie z opisem w oknie dialogowym wprowadź identyfikatory akcesji UniProt genu zainteresowania (GABRG2) od ludzi i innych gatunków kręgowców: P18507, P22723, Q6PW52, A0A2I3TKX0, F1RR72, A0A8I3MDZ2, A0A8M1P4D6. Kliknij przycisk OK.
        UWAGA: Numery akcesyjne UniProt białek kodowanych przez GABRG2 są następujące: P18507 (P18507-2) dla Homo sapiens, P22723 dla Mus musculus, A0A2I3TKX0 dla Pan troglodytes, F1RR72 dla Sus scrofa, A0A8I3MDZ2 dla Canis familiaris i A0A8M1P4D6 dla Danio rerio.
      3. W zależności od interesującego genu, niektóre sekwencje mogą nie być oznaczone adnotacjami; dlatego przeprowadź wyszukiwanie BLAST, aby zidentyfikować odpowiednie informacje i potencjalne homologi w celu lepszego zrozumienia kontekstowego. W takim przypadku prześlij sekwencje białek w formacie FASTA za pomocą opcji Dodaj sekwencje/Z pola tekstowego w menu Plik , aby utworzyć wiele wyrównań sekwencji żądanych sekwencji.
      4. Po załadowaniu wyrównania obserwuj wyświetlane sekwencje w celu porównania wielu sekwencji. Każdy wiersz reprezentuje sekwencję, a każda kolumna reprezentuje pozycję w wyrównaniu. Aby określić najlepszą metodę wyrównania, użyj różnych podejść; Na przykład kliknij Usługi internetowe w menu Sekwencja i wybierz opcję Uruchom T-Coffee z ustawieniami wstępnymi , która umożliwia optymalne wyrównanie.
      5. Kliknij prawym przyciskiem myszy sekwencję P18507 Homo sapiens (sekwencję referencyjną w niniejszym badaniu) i ustaw ją jako sekwencję referencyjną. Wybierz Format w górnym menu i kliknij Zawijaj , aby wyświetlić wizualizację pełnego wyrównania na ekranie. W tym samym menu Format kliknij powyższą skalę , aby poprawić wizualizację określonych liczb pozostałości. Aby jeszcze bardziej ulepszyć wizualizację, dostosuj schematy kolorów, przechodząc do opcji Kolor i wybierając różne opcje (np. Kolor klonalny, Właściwość chemiczna); W razie potrzeby zmodyfikuj rozmiar czcionki.
      6. Kliknij Oblicz na pasku menu i wybierz opcję Automatycznie oblicz konsensus, aby podświetlić konserwatywne regiony.
      7. Skoncentruj się na pozycji wariantów będących przedmiotem zainteresowania zidentyfikowanych na etapie predykcji in-silico i zbadaj konkretne pozycje wariantów. Dodaj adnotacje do określonych pozostałości, klikając je prawym przyciskiem myszy i wybierając opcję Dodaj adnotację. Napisz etykietę (np. ID wariantu) z odpowiednim kodem kolorystycznym i zapisz.
        UWAGA: W niniejszej analizie wybrano P302L (fioletowy) i A303T (czerwony) w celu wizualizacji ich w wyrównaniu wielu sekwencji wraz z danymi konstrukcyjnymi (patrz następna sekcja).
    4. Trójwymiarowa rekonstrukcja pełnego białka pokazująca wybrane konserwatywne reszty
      1. W pliku uzyskanym z poprzedniego kroku należy kliknąć prawym przyciskiem myszy na sekwencję referencyjną (człowiek GABRG2 ) i wybrać Dane konstrukcji 3D.
      2. Zidentyfikuj odpowiednie dane konstrukcyjne (7QNE, Łańcuch C)26 z menu rozwijanego i wybierz Otwórz nowy widok struktury za pomocą Jmol.
        UWAGA: Umożliwi to włączenie pozostałości wybranych w wyrównaniu wielu sekwencji do danych strukturalnych przez Jmol, przeglądarkę struktur chemicznych 3D opartą na Javie o otwartym kodzie źródłowym.

2. Dobór parametrów i modelowanie biofizyczne

  1. Metaanaliza specyficzna dla wariantu i normalizacja parametrów
    1. Przegląd aktualnej literatury w celu zebrania zidentyfikowanych wariantów podjednostek z elektrofizjologiczną przewodnością kanału danych (gGABAA), czasem dezaktywacji (dezaktywacja τ), czasem narastania (τwzrostem) i maksymalną amplitudą prądu (Imax). Podaj składy podjednostek, typ komórki i pomiary typu dzikiego dla każdego przypadku. Należy odpowiednio oznaczyć warianty i ich kontrole (np. znane dla wariantów o zidentyfikowanych cechach biofizycznych i znane dla kontroli dla pomiarów typu dzikiego dla każdego wariantu).
    2. Uzyskaj oceny patogenności AlphaMissense dla wariantów o zidentyfikowanych cechach biofizycznych.
      UWAGA: Więcej informacji można znaleźć w sekcji 1.3 protokołu.
    3. Utwórz ramkę danych z pozycją podjednostek i aminokwasów dla każdego wariantu, oryginalnymi i zmienionymi aminokwasami, oceną patogenności i parametrami biofizycznymi uzyskanymi z literatury. Aby uniknąć rozbieżności eksperymentalnych, znormalizuj parametry biofizyczne dla zidentyfikowanych wariantów jako zmiany x-krotne w pomiarach typu dzikiego.
  2. Porównawcza analiza wariantów według cech strukturalnych i funkcjonalnych
    1. Organizowanie przewidywanych wariantów w ramce danych; odpowiednio oznaczyć (np. przewidywane dla wariantów, dla których nie jest dostępna literatura na temat ich cech biofizycznych).
    2. Sklasyfikuj warianty według ich lokalizacji w sekwencji aminokwasów i strukturze trzeciorzędowej. Dodaj strukturalne parametry klasyfikacyjne (np. lokalizację w helisach alfa, cewkach, arkuszach beta, domenach zewnątrzkomórkowych, wewnątrzkomórkowych lub transbłonowych, wyściółkowaniu porów, wiązaniu agonistów, interakcjach białko-białko) w ramce danych i podaj informacje dla każdego wariantu w odniesieniu do ich pozycji aminokwasowej.
    3. Sklasyfikuj warianty według ich odległości od środka błony i osi porów. Dodaj odległość do osi porów i odległość do parametrów środka membrany w ramce danych.
    4. Przeanalizuj korelację między parametrami strukturalnymi i biofizycznymi w porównaniu ze znanymi wariantami. Jeśli to możliwe, oceń przewidywane warianty w odniesieniu do uzyskanych korelacji.
  3. Budowa modelu synaps i neuronów
    1. Użyj Brian245, symulatora neuronowego o otwartym kodzie źródłowym opracowanego w Pythonie do modelowania i symulacji impulsowych sieci neuronowych, aby zbudować wieloprzedziałowy biofizyczny model synapsy GABA-ergicznej na wieloprzedziałowym neuronie piramidowym opartym na przewodnictwie hipokampa.
    2. Zaprojektuj model oparty na przewodności, definiując kinetykę bramkowania kanałów jonowych, parametry pasywne i aktywne oraz przewodnictwa postsynaptyczne. Zdefiniuj model oparty na przewodności, jak podano w pliku uzupełniającym 2, który opisuje równania użyte w modelu.
      1. Ustaw pojemność membrany(CM) na 1 μF/cm2 , a rezystancję wewnątrzkomórkową (Ra) na 200 Ω.cm.
      2. Użyj zmodyfikowanych przewodności typu Hodgkina-Huxleya dla neuronów piramidowych hipokampa39 o gL = 0,0003 S / cm2, gK = 0,036 S / cm2, EL = -76,5 mV, ENa = 50 mV i EK = -90 mV.
      3. Dostosuj rozkład gęstości kanałów NaV przez gNa jako 0,05 S/cm2 dla somy, 0,5 S/cm2 dla początkowego segmentu aksonu (AIS) i węzła Ranviera (NR) oraz 0,005 S/cm2 dla dendrytów. Ustaw gK i gNa jako 0 w segmentach mielinowych.
      4. Zbuduj kinetykę bramkowania kanałów jonowych dla NaV i KV zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 2.
      5. Wprowadź prądy synaptyczne (Isyn) jako sumę wszystkich synaps glutaminergicznych i GABA-ergicznych w kompartmencie. Uwzględnij zarówno szybki prąd za pośrednictwem receptora AMPA (IAMPPA), jak i wolny prąd za pośrednictwem receptora NMDA (INMDA) w prądzie glutaminergicznym (Iglu). Uwzględnij tylko szybki prąd za pośrednictwemreceptora GABA A w prądzie GABA-ergicznym (IGABA). Załóżmy, że stała ilość glutaminianu jest uwalniana do synapsy dla każdego skoku presynaptycznego; w związku z tym aktywacja receptorów jest zależna od czasu skoku (sAMPA i sNMDA), a całkowite przewodnictwa receptorów (gAMPA i gNMDA) odzwierciedlają ilość glutaminianu, która jest uwalniana przez każde zdarzenie.
      6. Użyj modelu synaptycznego zgodnie z opisem w pliku uzupełniającym 2.
        UWAGA: Szczegółowe wyjaśnienie równań znajduje się w pliku uzupełniającym 2 opisującym równania używane w modelu.
    3. Uzyskaj eksperymentalnie zmierzoną średnicę dla somy i neurytów oraz długość każdego przedziału neurytu i wzorce rozgałęzień z poprzedniej literatury46,47. Zmniejsz rzeczywistą morfologię neuronów do modelu wieloprzedziałowego, dzieląc komórkę na wiele przedziałów, który dokładnie zachowuje główną strukturę rozgałęzień i utrzymuje dwustronną symetrię.
    4. Ustawić morfologię (długość i średnica segmentu, tj. d_soma: 30 μm; l_AH: 5 μm; d_AH_i: 1,5 μm; d_AH_f: 1,3 μm; l_AIS: 40 μm; d_axon: 1 μm; l_myseg: 100 μm; l_NR: 2 μm; l_AxTer: 4 μm; d_AxTer: 2 μm; l_approx: 100 μm; l_apmed: 100 μm; l_apdis: 200 μm; d_approx_i: 4 μm; d_approx_f: 3 μm; d_apmed : 2 μm; d_apdis: 2 μm; l_apLM: 70 μm; d_apLM: 2 μm; l_nAcDbasal: 400 μm; d_nAcDbasal: 1,4 μm; l_nAcDbasal_stem: 20 μm; d_nAcDbasal_stem: 1,5 μm) i parametry biofizyczne (podane w sekcji 2.3.2) dla każdego przedziału modelu neuronu piramidowego46,47, jak również szczegółowo opisano w skrypcie Pythona (plik uzupełniający 3: GABAAvar.py).
    5. Określ parametry biofizyczne dla modelu synapsy GABA-ergicznej, oceniając pomiary kontrolne typu dzikiego uzyskane w kroku 2.1.1.
  4. Zaprojektuj topologię modelu neuronu i przypisz parametry morfologiczne i biofizyczne, co obejmuje określenie układu przestrzennego i wzajemnych połączeń przedziałów, na podstawie wcześniej uzyskanych informacji morfologicznych i rozgałęzionych. Przypisać odpowiednie parametry morfologiczne (np. długość i średnicę segmentu) i biofizyczne (sekcja 2.3.2) do każdego przedziału modelu, jak opisano w pliku uzupełniającym 3: GABAAvar.py.
  5. Budowa synaps i wstrzykiwanie prądu
    1. Utwórz aktywność presynaptyczną za pomocą SpikeGeneratorGroup (klasa z biblioteki Brian2), jak podano w "GABAAvar.py" (Plik uzupełniający 3). Podłącz generator impulsów do docelowego przedziału neuronu modelowego za pomocą klasy Synapses w celu modelowania połączeń synaptycznych.
    2. Ustaw stały prąd (Iinj) na 0,85 nA i umieść w somie, aby naśladować aktywność podprogową napędzaną przez podstawowe obciążenie prądem jonowym w danym momencie, jak opisano w pliku uzupełniającym 3: GABAAvar.py.
  6. Aby zbudować monitory rejestrujące, rejestruj ślady napięcia z przedziałów docelowych za pomocą StateMonitor.
  7. Zbuduj i uruchom sieć.
    1. Zbuduj sieć za pomocą modelu neuronu, połączeń i monitorów przy użyciu sieci.
    2. Ustaw krok czasowy symulacji według defaultclock.dt (np. 0.01 ms).
    3. Uruchom symulację w sieci za pomocą network.run(T*ms), gdzie T jest ustawiona na 1 000 ms w przykładzie.
  8. Testowanie wpływu mutacji missense receptora GABAA
    1. Zdefiniuj wpływ każdej mutacji typu missense na kinetykę kanału za pomocą parametrów biofizycznych zebranych w kroku 2.1.1.
    2. Uruchom stymulację, zmieniając te parametry i wykreśl wyniki za pomocą "matplotlib.pyplot", jak podano w "GABAAvar.py" (plik uzupełniający 3).
  9. Testuj kombinacje parametrów, aby przeanalizować zmiany we wzorcach i szybkościach wypalania. Wykreśl wyniki do porównań.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W badaniu tym wykorzystano wieloskalowe podejście do przewidywania i charakteryzowania wariantów patogennych w podjednostce γ2 receptora GABAA , kluczowego składnika patofizjologii padaczki. Dzięki zastosowaniu modeli predykcyjnych, modelowania molekularnego, konserwacji ewolucyjnej, badań strukturalnych, analizy korelacji i symulacji neuronowych, podejście to wzbogaca klasyfikację wariantów, co ma istotne znaczenie dla badań nad padaczką i być może do zastosowań klinicznych. O...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki zastosowaniu kombinacji genetyki obliczeniowej, modelowania molekularnego i symulacji neuronalnych, podejście przedstawione w tym artykule może poprawić klasyfikację wariantów receptora GABAA, oferując cenne informacje zarówno dla badań nad padaczką, jak i zastosowań klinicznych. Przedstawiono kompleksową analizę mającą na celu identyfikację i priorytetyzację przewidywanych mutacji patogennych i rozszerzono ją na ramy, które potencjalnie wypełniają lukę między wpływem wariantów na białko i fenotyp komór...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konfliktu interesów związanego z tą pracą.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Çağli Koca za pomoc w budowie modelowego neuronu.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Brian2 Sorbonne Université, INSERM, CNRS, Institut de la Vision, Francja; Imperial College London, Wielka Brytania2.8.0.4Stimberg i wsp., 2019 (https://pypi.org/project/Brian2/ )
Serwer dbNSFP   Genos Bioinformatics LLC, Stany ZjednoczoneWersja 3.0Liu i in., 2020 (http://database.liulab.science/dbNSFP) (https://sites.google.com/site/jpopgen/dbNSFP)
NADZIEJA   Centrum Informatyki Molekularnej i Biomolekularnej CMBI, Uniwersytet Radboud, Holandia 1.1.1Venselaar i wsp., 2010 (https://www3.cmbi.umcn.nl/hope/)
Jalview   Uniwersytet w Dundee, Wielka BrytaniaJV2Waterhouse i wsp., 2009 (https://www.jalview.org/)
Notes JupyterProjekt Jupyter, Stany Zjednoczonehttps://jupyter.org/install 
Phyton (Phyton)Python Software Foundation, Stany Zjednoczone3.13https://www.python.org/downloads/
Protter   ETH Zurych, SzwajcariaWersja 1.0Omasits, et al., 2014 (https://wlab.ethz.ch/protter/start/)
R R Foundation for Statistical Computing, Stany ZjednoczoneR wersja 4.3.2   https://www.r-project.org/ 
RStudioOprogramowanie Posit, PBC, Stany ZjednoczoneWydanie RStudio 2023.12.1+402 "Ocean Storm"https://posit.co/downloads/

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Claussnitzer, M., et al. A brief history of human disease genetics. Nature. 577 (7789), 179-189 (2020).
  2. Savatt, J. M., Myers, S. M. Genetic testing in neurodevelopmental disorders. Front Pediatr. 9, 526779(2021).
  3. Hoischen, A., Krumm, N., Eichler, E. Prioritization of neurodevelopmental disease genes by discovery of new mutations. Nat Neurosci. 17, 764-772 (2014).
  4. Holmes, G., Ben-Ari, Y. The neurobiology and consequences of epilepsy in the developing brain. Pediatr Res. 49, 320-325 (2001).
  5. Rivera, C., Voipio, J., Kaila, K. Developmental switches in GABAergic signalling: the K+-Cl- cotransporter KCC2 and carbonic anhydrase CAVII. J Physiol. 562, 27-36 (2005).
  6. Goetz, T., et al. GABA(A) receptors: structure and function in the basal ganglia. Prog Brain Res. 160, 21-41 (2007).
  7. Guerrini, R., et al. Monogenic epilepsies: disease mechanisms, clinical phenotypes, and targeted therapies. Neurology. 97 (17), 817-831 (2021).
  8. Matricardi, S., et al. Current advances in childhood absence epilepsy. Pediatr Neurol. 50 (3), 205-212 (2014).
  9. Sands, T. T., Choi, H. Genetic testing in pediatric epilepsy. Curr Neurol Neurosci Rep. 17 (5), 45(2017).
  10. Møller, R. S., et al. The contribution of next generation sequencing to epilepsy genetics. Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1531-1538 (2015).
  11. Møller, R. S., et al. From next-generation sequencing to targeted treatment of non-acquired epilepsies. Expert Rev Mol Diagn. 19 (3), 217-228 (2019).
  12. Richards, S., et al. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genet Med. 17 (5), 405-424 (2015).
  13. Rehm, H. L., et al. The landscape of reported VUS in multi-gene panel and genomic testing: time for a change. Genet Med. 25 (12), 100947(2023).
  14. Katsonis, P., et al. Genome interpretation using in silico predictors of variant impact. Hum Genet. 141 (10), 1549-1577 (2022).
  15. Arslan, A. Pathogenic variants of human GABRA1 gene associated with epilepsy: a computational approach. Heliyon. 9 (9), e20218(2023).
  16. Abdullah, N. K., Arslan, A. Integrated bioinformatic approach for precision medicine: prediction of human GABRG2 gene pathogenic variants, characterized with cellular pathology and epilepsy phenotype severity. SDU J Nat Appl Sci. 28 (33), 300-315 (2024).
  17. Arslan, A. Algorithmic assessment reveals functional implications of GABRD gene variants linked to idiopathic generalized epilepsy. Int J Neurosci. 135 (5), 533-543 (2025).
  18. Kang, J. Q., Macdonald, R. L. Molecular pathogenic basis for GABRG2 mutations associated with a spectrum of epilepsy syndromes, from generalized absence epilepsy to Dravet syndrome. JAMA Neurol. 73 (8), 1009-1016 (2016).
  19. Komulainen-Ebrahim, J., et al. Novel variants and phenotypes widen the phenotypic spectrum of GABRG2-related disorders. Seizure. 69, 99-104 (2019).
  20. Lorenz-Guertin, J. M., et al. γ2 GABA(A)R trafficking and the consequences of human genetic variation. Front Cell Neurosci. 12, 265(2018).
  21. Korpi, E. R., Gründer, G., Luddens, H. Drug interactions at GABA(A) receptors. Prog Neurobiol. 67 (2), 113-159 (2002).
  22. Rudolph, U., Möhler, H. GABA-based therapeutic approaches: GABAA receptor subtype functions. Curr Opin Pharmacol. 6, 18-23 (2006).
  23. Whiting, P. J. GABAA receptors: a viable target for novel anxiolytics. Curr Opin Pharmacol. 6, 24-29 (2006).
  24. Arslan, A. Extrasynaptic δ-subunit containing GABAA receptors. J Integr Neurosci. 20 (1), 173-184 (2021).
  25. Arslan, A. Distinct roles of gamma-aminobutyric acid type A receptor subtypes: a focus on phasic and tonic inhibition. J Neurobehav Sci. 2, 72-76 (2015).
  26. Sente, A., et al. Differential assembly diversifies GABAA receptor structures and signalling. Nature. 604 (7904), 190-194 (2022).
  27. Masiulis, S., et al. GABAA receptor signalling mechanisms revealed by structural pharmacology. Nature. 565 (7740), 454-459 (2019).
  28. Hernandez, C. C., Macdonald, R. L. A structural look at GABAA receptor mutations linked to epilepsy syndromes. Brain Res. 1714, 234-247 (2019).
  29. Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Res. 46 (D1), 1062-1067 (2018).
  30. Liu, X., Jian, X., Boerwinkle, E. dbNSFP: a lightweight database of human non-synonymous SNPs and their functional predictions. Hum Mutat. 32 (8), 894-899 (2011).
  31. Liu, X., et al. dbNSFP v4: a comprehensive database of transcript-specific functional predictions and annotations for human nonsynonymous and splice-site SNVs. Genome Med. 12 (1), 103(2020).
  32. Alirezaie, N., et al. ClinPred: prediction tool to identify disease-relevant nonsynonymous single-nucleotide variants. Am J Hum Genet. 103 (4), 474-483 (2018).
  33. Feng, B. J. PERCH: a unified framework for disease gene prioritization. Hum Mutat. 38 (3), 243-251 (2017).
  34. Tian, Y., et al. REVEL and BayesDel outperform other in silico meta-predictors for clinical variant classification. Sci Rep. 9 (1), 2204(2019).
  35. Brünger, T., et al. Conserved patterns across ion channels correlate with variant pathogenicity and clinical phenotypes. Brain. 146 (3), 923-934 (2023).
  36. Guo, F., et al. Identifying protein-protein interface via a novel multi-scale local sequence and structural representation. BMC Bioinformatics. 20 (Suppl 15), 483(2019).
  37. Cheng, J., et al. Accurate proteome-wide missense variant effect prediction with AlphaMissense. Science. 381 (6664), eadg7492(2023).
  38. Omasits, U., et al. Protter: interactive protein feature visualization and integration with experimental proteomic data. Bioinformatics. 30 (6), 884-886 (2014).
  39. Venselaar, H., et al. Protein structure analysis of mutations causing inheritable diseases: an e-Science approach with life scientist friendly interfaces. BMC Bioinformatics. 11 (548), 548(2010).
  40. Hernandez, C. C., et al. Altered channel conductance states and gating of GABAA receptors by a pore mutation linked to Dravet syndrome. eNeuro. 4 (1), (2017).
  41. Baulac, S., Huberfeld, G., Gourfinkel-An, I. First genetic evidence of GABA(A) receptor dysfunction in epilepsy: a mutation in the γ2-subunit gene. Nat Genet. 28 (1), 46-48 (2001).
  42. Waterhouse, A. M., et al. Jalview version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25 (9), 1189-1191 (2009).
  43. Troshin, P. V., et al. Java bioinformatics analysis web services for multiple sequence alignment-JABAWS:MSA. Bioinformatics. 27 (14), 2001-2002 (2011).
  44. Troshin, P. V., et al. JABAWS 2.2 distributed web services for bioinformatics: protein disorder, conservation and RNA secondary structure. Bioinformatics. 34 (11), 1939-1940 (2018).
  45. Stimberg, M., Brette, R., Goodman, D. F. M. Brian 2, an intuitive and efficient neural simulator. eLife. 8, e47314(2019).
  46. Traub, R. D., et al. A model of a CA3 hippocampal pyramidal neuron incorporating voltage-clamp data on intrinsic conductances. J Neurophysiol. 66 (2), 635-650 (1991).
  47. Hodapp, A., et al. Dendritic axon origin enables information gating by perisomatic inhibition in pyramidal neurons. Science. 377 (6613), 1448-1452 (2022).
  48. Abdulzahir, A., et al. Changes in memory, sedation, and receptor kinetics imparted by the β2-N265M and β3-N265M GABAA receptor point mutations. Int J Mol Sci. 24 (6), 5637(2023).
  49. Fisher, J. L. A mutation in the GABAA receptor alpha1 subunit linked to human epilepsy affects channel gating properties. Neuropharmacology. 46 (5), 629-637 (2004).
  50. Gallagher, M. J., et al. The juvenile myoclonic epilepsy GABAA receptor alpha1 subunit mutation A322D produces asymmetrical, subunit position-dependent reduction of heterozygous receptor currents and α1 subunit protein expression. J Neurosci. 24 (24), 5570-5578 (2004).
  51. Hernandez, C. C., et al. Dravet syndrome-associated mutations in GABRA1, GABRB2 and GABRG2 define the genetic landscape of defects of GABAA receptors. Brain Commun. 3 (2), fcab033(2021).
  52. Lin, S. X. N., et al. Correlations of receptor desensitization of gain-of-function GABRB3 variants with clinical severity. Brain. 147 (1), 224-239 (2024).
  53. Krampfl, K., et al. Molecular analysis of the A322D mutation in the GABA receptor α-subunit causing juvenile myoclonic epilepsy. Eur J Neurosci. 22 (1), 10-20 (2005).
  54. Shen, D., et al. De novo GABRG2 mutations associated with epileptic encephalopathies. Brain. 140 (1), 49-67 (2017).
  55. Janve, V. S., et al. Epileptic encephalopathy de novo GABRB mutations impair γ-aminobutyric acid type A receptor function. Ann Neurol. 79 (5), 806-825 (2016).
  56. Scheller, M., Forman, S. A. Coupled and uncoupled gating and desensitization effects by pore domain mutations in GABAA receptors. J Neurosci. 22 (19), 8411-8421 (2002).
  57. Hernandez, C. C., et al. GABAA receptor coupling junction and pore GABRB3 mutations are linked to early-onset epileptic encephalopathy. Sci Rep. 7 (1), 15903(2017).
  58. Homanics, G. E., et al. A gain-of-function mutation in the GABA receptor produces synaptic and behavioral abnormalities in the mouse. Genes Brain Behav. 4 (1), 10-19 (2005).
  59. Jatczak-Śliwa, M., et al. GABAA receptor β2E155 residue located at the agonist-binding site is involved in the receptor gating. Front Cell Neurosci. 14 (2), 2(2020).
  60. Đurišić, N., et al. SAHA (vorinostat) corrects inhibitory synaptic deficits caused by missense epilepsy mutations to the GABAA receptor γ2 subunit. Front Mol Neurosci. 11, 89(2018).
  61. Bai, Y. F., et al. Pathophysiology of and therapeutic options for a GABRA1 variant linked to epileptic encephalopathy. Mol Brain. 12 (1), 92(2019).
  62. Macdonald, R. L., et al. Mutations linked to generalized epilepsy in humans reduce GABA(A) receptor current. Exp Neurol. 184 (Suppl 1), S58-S67 (2003).
  63. Buhr, A., et al. Functional characterization of the new human GABA(A) receptor mutation β3(R192H). Hum Genet. 111 (2), 154-160 (2002).
  64. Jumper, J. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  65. Sperk, G., et al. GABA(A) receptor subunits in the rat hippocampus I: immunocytochemical distribution of 13 subunits. Neuroscience. 80 (4), 987-1000 (1997).
  66. Connor, J. X., et al. A GABAA receptor α1 subunit tagged with green fluorescent protein requires a β subunit for functional surface expression. J Biol Chem. 273 (44), 28906-28911 (1998).
  67. Kittler, J. T., et al. Analysis of GABAA receptor assembly in mammalian cell lines and hippocampal neurons using γ2 subunit green fluorescent protein chimeras. Mol Cell Neurosci. 16 (4), 440-452 (2000).
  68. Oflaz, F. E., Son, ÇD., Arslan, A. Oligomerization and cell surface expression of recombinant GABAA receptors tagged in the δ subunit. J Integr Neurosci. 18 (4), 341-350 (2019).
  69. Arslan, A., et al. Cytoplasmic domain of δ subunit is important for the extra-synaptic targeting of GABAA receptor subtypes. J Integr Neurosci. 13, 617-631 (2014).
  70. Lombardi, J. P., et al. Visualizing GABAA receptor trafficking dynamics with fluorogenic protein labeling. Curr Protoc Neurosci. 92 (1), 97(2020).
  71. Gadhia, A., et al. Functional analysis of epilepsy-associated GABAA receptor mutations using Caenorhabditis elegans. Epilepsia Open. 9 (4), 1458-1466 (2024).
  72. Ritter, D. M., et al. In silico predictions of KCNQ variant pathogenicity in epilepsy. Pediatr Neurol. 118, 48-54 (2021).
  73. Holland, K. D., et al. Comparison and optimization of in silico algorithms for predicting the pathogenicity of sodium channel variants in epilepsy. Epilepsia. 58 (7), 1190-1198 (2017).
  74. Leong, I. U., et al. Assessment of the predictive accuracy of five in silico prediction tools, alone or in combination, and two metaservers to classify long QT syndrome gene mutations. BMC Med Genet. 16, 34(2015).
  75. Tang, B. Optimization of in silico tools for predicting genetic variants: individualizing for genes with molecular sub-regional stratification. Brief Bioinform. 21 (5), 1776-1786 (2020).
  76. Dong, C., et al. Comparison and integration of deleteriousness prediction methods for nonsynonymous SNVs in whole exome sequencing studies. Hum Mol Genet. 24 (8), 2125-2137 (2015).
  77. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nat Genet. 46 (3), 310-315 (2014).
  78. Anderson, D., Lassmann, T. An expanded phenotype centric benchmark of variant prioritisation tools. Hum Mutat. 43 (5), 539-546 (2022).
  79. Roy, R., Al-Hashimi, H. M. AlphaFold3 takes a step toward decoding molecular behavior and biological computation. Nat Struct Mol Biol. 31, 997-1000 (2024).
  80. Hollingsworth, S. A., Dror, R. O. Molecular dynamics simulation for all. Neuron. 99 (6), 1129-1143 (2018).
  81. Imrie, F., et al. AutoPrognosis 2.0: democratizing diagnostic and prognostic modeling in healthcare with automated machine learning. PLOS Digit Health. 2 (6), e0000276(2023).
  82. Zhu, S., et al. Structure of a human synaptic GABAA receptor. Nature. 559 (7712), 67-72 (2018).
  83. Sun, C., Zhu, H., Clark, S. Cryo-EM structures reveal native GABAA receptor assemblies and pharmacology. Nature. 622, 195-201 (2023).
  84. Scott, S., Aricescu, A. R. A structural perspective on GABAA receptor pharmacology. Curr Opin Struct Biol. 54, 189-197 (2019).
  85. Kim, J. J., et al. Shared structural mechanisms of general anaesthetics and benzodiazepines. Nature. 585 (7824), 303-308 (2020).
  86. Stimberg, M., et al. Equation-oriented specification of neural models for simulations. Front Neuroinform. 8, 6(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

GABAa Receptor VariantsMissense VariantsEpileptogenic MutationsHippocampal Pyramidal NeuronsPathogenic Mutation PredictionMolecular ModelingNeural SimulationEnsemble PredictorsEvolutionary ConservationConductance Based Model

Related Articles