Artykuł metodologiczny

Opracowanie i ocena wewnątrzkomórkowych modeli zakażeń Staphylococcus aureus

DOI:

10.3791/67834

⸱

17 stycznia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Research Institute, Southwest University, 2National Engineering Research Center of Immunological Products, Third Military Medical University, 3School of Pharmacy, University of South China

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Staphylococcus aureus (S. aureus) ma zdolność rozprzestrzeniania się po całym ciele, powodując uporczywe i nawracające infekcje. Aby lepiej zrozumieć te procesy, w badaniu tym ustanowiono wewnątrzkomórkowy model infekcji S. aureus. Model ten będzie stanowił kluczową podstawę do badania mechanizmów stojących za infekcjami wewnątrzkomórkowymi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus może atakować i utrzymywać się w komórkach gospodarza, w tym w komórkach odpornościowych, co pozwala mu uniknąć wykrycia i usunięcia immunologicznego. Ta trwałość wewnątrzkomórkowa przyczynia się do przewlekłych i nawracających infekcji, komplikując leczenie i przedłużając chorobę. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia wewnątrzkomórkowego modelu infekcji, aby lepiej zrozumieć, zapobiegać i leczyć infekcje wywołane przez S. aureus. Badanie to wykazało, że antybiotyki skutecznie eliminują bakterie zewnątrzkomórkowe, ale nie są w stanie wyeliminować tych, które dostały się do komórek. W ten sposób ustalono stabilną infekcję wewnątrzkomórkową in vitro za pomocą RAW264.7 zakażonego S. aureus i współhodowanego z antybiotykami. Następnie ustalono model infekcji wewnątrzkomórkowej u myszy poprzez wstrzyknięcie makrofagów otrzewnowych zawierających infekcję wewnątrzkomórkową. Wankomycyna skutecznie usuwała obciążenia bakteryjne u myszy zakażonych planktonicznym S. aureus; Był jednak nieskuteczny przeciwko myszom zakażonym równym lub niższym poziomem bakterii wewnątrzkomórkowych w makrofagach otrzewnej. Wskazuje to, że udało się ustalić wewnątrzkomórkowy model infekcji S. aureus, oferujący potencjalne informacje na temat zapobiegania i leczenia zakażeń wewnątrzkomórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus jest wysoce zaraźliwym patogenem, który może powodować szereg infekcji, w tym infekcje skóry i tkanek miękkich, sepsę, zapalenie opon mózgowych, zapalenie płuc i zapalenie wsierdzia1. Kliniczne nadużywanie antybiotyków doprowadziło do zwiększonej oporności S. aureus i pojawienia się opornego na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA), który stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego w wielu krajach2.

Chociaż S. aureus nie jest tradycyjnie klasyfikowany jako patogen wewnątrzkomórkowy, pojawiające się dowody sugerują, że może on uporczywie kolonizować komórki gospodarza po inwazji3. Zdolność S. aureus do przetrwania wewnątrzkomórkowego w fagocytach gospodarza jest coraz częściej uznawana za mechanizm ułatwiający infekcję przerzutową i rozprzestrzenianie się w całym organizmie gospodarza4,5,6. Gronkowiec złocisty wydziela różne czynniki wirulencji, które tworzą środowisko odpornościowe, które sprzyja jego przetrwaniu i komplikuje zdolność gospodarza do jego całkowitego wyeliminowania7. Akcesoryjny regulator genów (agr) i gronkowcowe elementy pomocnicze (Sae) to dwa ważne regulatory wirulencji, które są ściśle związane z przeżywalnością Staphylococcus aureus w fagocytach8,9. System agr jest mechanizmem quorum-sensing, który reguluje ekspresję licznych czynników wirulencji u S. aureus. Kontroluje produkcję toksyn i innych czynników ułatwiających przetrwanie i rozprzestrzenianie się bakterii. Podczas infekcji wewnątrzkomórkowej układ agr odgrywa kluczową rolę w regulacji czynników wirulencji, które są niezbędne dla zdolności bakterii do unikania odpowiedzi immunologicznych gospodarza i przetrwania w komórkach gospodarza. Badania wykazały, że system agr wpływa na zdolność bakterii do ucieczki z fagosomów i utrzymywania się w makrofagach. Brak agr może prowadzić do zmniejszenia przeżywalności bakterii w komórkach gospodarza i zmniejszenia zjadliwości10,11. System Sae jest dwuskładnikowym systemem regulacyjnym, który kontroluje ekspresję kilku czynników wirulencji w S. aureus. Bierze udział w regulacji toksyn i enzymów, które przyczyniają się do zdolności bakterii do inwazji i uszkadzania tkanek gospodarza. System Sae odgrywa również kluczową rolę w przeżyciu wewnątrzkomórkowym S. aureus. Wpływa na zdolność bakterii do opierania się zabijaniu przez fagocyty gospodarza i unikania autofagicznej degradacji12,13.

Gdy patogeny atakują, makrofagi mają funkcje fagocytarne, które mogą pochłaniać i zabijać obce patogeny oraz aktywować adaptacyjną odpowiedź immunologiczną14. Większość atakujących bakterii jest fagocytozowana przez makrofagi, które następnie aktywują różne mechanizmy zabijania, aby je wyeliminować. Jednak niektóre bakterie S. aureus mogą przetrwać w makrofagach, co prowadzi do uporczywego zakażenia gospodarza. Oprócz białek bakteryjnych, gospodarz wpływa również na przeżywalność i proliferację S. aureus w makrofagach poprzez wydzielanie cytokin15,16,17. Niektóre badania wskazują, że S. aureus może unikać degradacji, przebywając w autofagosomach, tworząc wewnątrzkomórkową niszę, która sprzyja rozprzestrzenianiu się18. S. aureus unika degradacji autofagicznej poprzez blokowanie strumienia autofagii (np. LC3-II, p62) i zwiększanie pH w autolizosomach po inwazji makrofagów19. To unikanie odporności osiąga się poprzez regulację czynników wirulencji S. aureus i autofagii, co prowadzi do trwałych, ukrytych infekcji.

Usuwanie wewnątrzkomórkowych infekcji S. aureus jest kluczowe dla leczenia uporczywych i utajonych infekcji w praktyce klinicznej. Obecnie antybiotyki są podstawowym sposobem leczenia zakażeń S. aureus, a wankomycyna służy jako ostatnia linia obrony przed infekcjami MRSA20,21. Jednak liczne badania wykazały, że istniejące antybiotyki są nieskuteczne w eliminowaniu wewnątrzkomórkowego S. aureus, zarówno in vivo, jak i in vitro22,23,24.

Obecnie nie ma ujednoliconego standardu dla różnych modeli infekcji wewnątrzkomórkowych S. aureus25,26,27, ponieważ warunki każdego modelu znacznie się różnią. W związku z tym te same kryteria nie mogą być stosowane do oceny skuteczności tych modeli. W tym badaniu ustaliliśmy uniwersalny wewnątrzkomórkowy model infekcji Staphylococcus aureus, optymalizując warunki eksperymentalne. Model ten oferuje większą wygodę w porównaniu z innymi, ponieważ pozwala na wstępne zakażenie bakterii do komórek in vitro, a następnie dostarczenie tych zainfekowanych komórek do organizmu.

Aby lepiej zrozumieć mechanizmy wewnątrzkomórkowego zakażenia S. aureus i opracować powiązane leki, stworzyliśmy modele zarówno in vitro, jak i in vivo. Stabilny model infekcji wewnątrzkomórkowej został pomyślnie stworzony in vitro poprzez zakażenie RAW264.7 i jednoczesną hodowlę z antybiotykami. Następnie wyekstrahowano makrofagi otrzewnowe i uformowano je w infekcje wewnątrzkomórkowe. Model infekcji wewnątrzkomórkowej u myszy ustalono poprzez wstrzyknięcie tych makrofagów otrzewnowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zwierzęta doświadczalne, 6-8 tygodniowe samice myszy BALB/c wolne od specyficznych patogenów (SPF), zostały zakupione od Beijing HFK Bioscience Co., Ltd (Pekin, Chiny). Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Dobrostanu i Etyki Zwierząt Laboratoryjnych Trzeciego Wojskowego Uniwersytetu Medycznego i zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi politykami i wytycznymi dotyczącymi wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Myszy były trzymane i szczepione w placówkach SPF i miały zapewniony bezpłatny dostęp do sterylnego jedzenia i wody. Zwierzęta zostały losowo podzielone na grupy i zapewniono im czas adaptacji wynoszący co najmniej 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentów.

1. Przygotowanie do S. aureus

  1. Odzyskiwanie szczepu: Zaopatrzyć się w probówkę z zamrożonym MRSA252, kauteryzować i schłodzić pierścień inokulacyjny, aby uzyskać pierścień roztworu bakteryjnego, zaszczepić bakterie na płytkach z agarem sojowym tryptycznym (TSA) (patrz Tabela Materiałów) metodą płytek smugowych28, a następnie hodować przez noc w temperaturze 37 °C.
  2. Aktywacja bakteryjna: Następnego dnia weź jedną kolbę o pojemności 50 ml i dodaj 20 ml pożywki z bulionu sojowego (TSB) (patrz tabela materiałów). Pobrać pojedynczą kolonię za pomocą końcówki do pipety o pojemności 10 μl i dodać ją do shakera. Inkubować kolonie przez noc w temperaturze 220 obr./min, 37 °C.
  3. Aktywacja wtórna: Następnego dnia należy pobrać jedną kolbę o pojemności 50 ml zawierającą 15 ml pożywki TSB. Usunąć 200 μl roztworu bakteryjnego z wytrząsarki zawierającej pierwsze aktywowane bakterie, dodać do nowej kolby zawierającej 20 ml pożywki TSB i inkubować z prędkością 220 obr./min, w temperaturze 37 °C przez 4 godziny.
  4. Zebrać wtórny aktywowany roztwór bakteryjny do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml, odwirować przy 3 000 x g przez 10 minut i wyrzucić supernatant.
  5. Ponownie zawiesić wytrącone bakterie w 10 ml soli fizjologicznej i odwirować przy 3 000 x g przez 10 minut. Powtórz ten krok 2 razy.
  6. Zmierz wartość OD600 w roztworze bakteryjnym i dostosuj ją do 1,0 za pomocą soli fizjologicznej. W tym czasie ilość bakterii MRSA252 w tym eksperymencie wynosiła 1,0 x 109 CFU/mL.
    UWAGA: Roztwór bakteryjny dodaje się do pożywki bez antybiotyków i rozcieńcza do pożądanego stężenia; Wszystkie bakterie użyte w tym eksperymencie zostały przygotowane powyższą metodą.

2. Opracowanie modelu infekcji wewnątrzkomórkowej in vitro

  1. Przygotowanie ogniw RAW264.7
    UWAGA: Linie komórkowe użyte w tym badaniu uzyskano z ATCC. Wszystkie linie komórkowe uzyskały wynik negatywny pod kątem zanieczyszczenia mykoplazmą. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na komórkach w logarytmicznej fazie wzrostu.
    1. Usunąć komórki z ciekłego azotu i rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Umieścić komórki RAW264.7 w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml, dodać 2 ml zmodyfikowanej pożywki orła Dulbecco (DMEM; patrz tabela materiałów) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (patrz tabela materiałów), penicyliną (100 jednostek/ml) i streptomycyną (100 μg/ml; patrz tabela materiałów; kompletna pożywka) w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Wirować przy 300 x g przez 5 min.
    3. Wysiewaj 3 x 106 komórek RAW264.7 w szalkach 100 mm z 10 ml kompletnego podłoża. Przechowywać przez 12 godzin w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , tak aby złożenie komórek mieściło się w przedziale 50%-60%.
  2. Zakażenie wewnątrzkomórkowe in vitro
    1. Weź 10 μl zawiesiny komórek i dodaj ją do licznika komórek, aby obliczyć stężenie komórek. Policz i wysiewaj 2 x 105 komórek RAW264.7 na 24-dołkowej płytce (patrz Tabela materiałów) używając 1 ml kompletnego podłoża do każdej studzienki i trzymaj je w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 10-12 godzin.
    2. Usunąć sklarowany osad i dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej roztwór bakteryjny 2 x 106 jtk (krok 1.6) do każdej studzienki. Umieścić go w inkubatorze do hodowli komórkowych na 2 godziny. Zakażony MRSA252 mnogość infekcji
      (MOI) wynosi 10. (Aby zweryfikować korelację między różnymi wielokrotnościami wartości infekcji (MOI) a fagocytozą bakterii przez komórki, ustaliliśmy grupy eksperymentalne o wartościach MOI 20, 30, 40 i 50.).
      UWAGA: Kompletna pożywka stosowana podczas infekowania komórek nie zawiera penicyliny i streptomycyny.
    3. Usunąć supernatant i przemyć komórki 2x PBS (patrz Tabela Materiałów). Dodać 800 μl na studzienkę DMEM ze 100 μg/ml gentamycyny (patrz tabela materiałów) i umieścić w inkubatorze komórkowym w temperaturze 37 °C w 5% CO2 na 2 godziny.
  3. Ocena wewnątrzkomórkowego modelu zakażenia in vitro
    1. Wewnątrzkomórkowy test zabijania S. aureus
      1. Zebrać komórki RAW264.7 (kroki 2.2.2 i 2.2.3) oddzielnie do probówek wirówkowych. Przemyć komórki 2x PBS, dodać 0,1% roztworu Triton X-100 (patrz tabela materiałów) do każdej probówki przez 5 minut i zebrać lizat w probówkach wirówkowych.
      2. Użyć PBS do seryjnego rozcieńczania lizatu. Pobrać 20 μl lizatu i dodać go do probówki do mikrowirówki zawierającej 180 μl PBS, a następnie dokładnie wymieszać pipetując. Rozcieńczać krok po kroku, postępując zgodnie z tą procedurą. Każde rozcieńczenie lizatu należy umieścić na płytkach TSA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Policz kolonie na płytkach TSA dla lizatu (Rysunek 1A).
        UWAGA: Ponadto zbadaliśmy optymalne warunki eksperymentalne dla wewnątrzkomórkowego zakażenia MRSA252 w makrofagach otrzewnowych. Obciążenie bakteryjne w makrofagach otrzewnowych zakażonych MRSA252 i leczonych różnymi stężeniami gentamycyny pokazano na Rysunek 1B, podczas gdy obciążenie bakteryjne po leczeniu 100 μg/ml gentamycyny przez różne czasy jest pokazane w Rysunek 1C.
      3. Rozcieńczyć supernatant i lizat szeregowo PBS, jak opisano w sekcji 2.3.1.2, i obserwować kolonie na płytkach TSA dla supernatantu i lizatu (Rysunek 2A).
    2. Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy (CLSM)
      1. Rozcieńczyć komórki RAW264.7 (krok 2.2) na 2 x 105 komórek/ml na konfokalnej szalce Petriego (patrz tabela materiałów) i umieścić je w inkubatorze komórek w celu adhezji przez noc w temperaturze 37 °C w 5% CO2 . Dodać 1 ml kompletnej pożywki zawierającej 2 x 106 CFU i 4 x 106 roztworu bakteryjnego (krok 1.6) do każdej konfokalnej szalki Petriego i umieścić ją w inkubatorze komórkowym na 2 godziny, otrzymując MOI odpowiednio 10 i 20.
      2. Usunąć supernatant i przemyć komórki 3x PBS, dodać 100 μg/ml gentamycyny DMEM przez 2 godziny i usunąć bakterie zewnątrzkomórkowe. Następnie usunąć supernatant i przemyć komórki 2x PBS, dodać płyn roboczy DIL (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut w ciemności.
      3. Usunąć płyn roboczy DIL i przemyć 3 razy PBS, a następnie utrwalić 4% roztworem paraformaldehydu (patrz Tabela Materiałów) przez 20 minut.
      4. Usunąć roztwór paraformaldehydu i przemyć 3x PBS, dodać barwnik DAPI (patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 5 minut w ciemności. Usuń roztwór barwnika DAPI i przemyj 5x PBS. Użyj CLSM do obserwacji komórek (Rysunek 2B).
        UWAGA: Ta praca MRSA252 zaprojektowana z wykorzystaniem białka zielonej fluorescencji (GFP), które zostało skonstruowane przy użyciu metody rekombinacji homologicznej29.

3. Opracowanie modelu infekcji wewnątrzkomórkowej in vivo

  1. Akwizycja makrofagów otrzewnowych u myszy
    1. Przygotuj 6% bulionu skrobiowego. Zgodnie ze stosunkiem masowym 3:10:5 (w/w), dodawać kolejno trzy rodzaje substancji pomocniczych (ekstrakt wołowy w proszku, trypton, chlorek sodu; patrz Tabela Materiałów) do szklanego pojemnika. Dodaj 1 l ddH2O do szklanego pojemnika, wymieszaj do stopienia i podgrzej w kuchence mikrofalowej. Dodać skrobię rozpuszczalną w skrobi (patrz tabela materiałów) o stosunku masowym 6, mieszać do stopienia i upewnić się, że szklany pojemnik jest sterylizowany w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 30 minut. Przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C do momentu uzyskania konsystencji pasty.
    2. Zbierz makrofagi otrzewnowe myszy, wykonując czynności opisane poniżej.
      1. Wybierz dwie myszy Balb/c. Użyj lewej ręki, aby chwycić szyję myszy i kontrolować ogon. Odwróć mysz i opuść głowę w dół, a brzuch do góry (Rysunek 3A). Podawać dootrzewnowe wstrzyknięcie 6% bulionu skrobiowego, 3 ml na mysz (Rysunek 3B).
        UWAGA: Ze względu na grawitację narządy w jamie brzusznej opadną do tyłu na klatkę piersiową, zapobiegając uszkodzeniu innych narządów przez strzykawkę.
      2. Po 72 godzinach znieczulij myszy 3% izofluranem, a następnie uśmierc je przez zwichnięcie szyjki macicy. Zdezynfekuj je 75% alkoholem etylowym. Użyj nożyczek okulistycznych, aby rozciąć brzuch myszy, aby całkowicie odsłonić jej otrzewną (Rysunek 4A-C).
      3. Wstrzyknij 10 ml pożywki DMEM myszom, aby przepłukać jamę brzuszną przez wstrzyknięcie dootrzewnowe (Ryc. 4D). Po wstrzyknięciu DMEM do jamy brzusznej myszy, delikatnie pocieraj brzuch myszy przez około 1 minutę, aby dokładniej przepłukać jamę brzuszną. Za pomocą strzykawki zebrać płyn z płukania do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (Rysunek 4E).
      4. Odwirować płyn popłuczynowy o sile 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
      5. Użyj 10 ml DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą, penicyliną (100 jednostek / ml) i streptomycyną (100 μg / ml; kompletne podłoże) do wydmuchiwania i odsysania pobranych komórek, policzenia ich i rozcieńczenia stężenia komórek do 2 x 106 / ml i deski na 6-dołkowych płytkach (patrz Tabela materiałów), 1 ml na dołek.
      6. Umieścić płytkę 6-dołkową w temperaturze 37 °C w 5% CO2 , inkubować przez 4 godziny, a następnie usunąć supernatant. Przemyć komórki 2x sterylnym PBS i posiewać przez noc 1 ml DMEM na studzienkę w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
  2. Przygotowanie bakterii wewnątrzkomórkowych
    1. Inkubować makrofagi otrzewnowe (krok 3.1.2) z MRSA252 przez 2 godziny. Usunąć supernatant i przemyć komórki 2x PBS. Dodać kompletną pożywkę DMEM ze 100 μg/ml gentamycyny (1 ml na studzienkę) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .
    2. Usunąć supernatant i przemyć komórki 3x PBS. Za pomocą skrobaka do komórek zebrać mysie makrofagi otrzewnowe do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml, wirować przy 300 x g przez 5 minut. Wewnątrzkomórkowe bakterie MRSA252 z powodzeniem przygotowano w makrofagach otrzewnowych.
    3. W celu obliczenia obecności bakterii wewnątrzkomórkowych do makrofagów otrzewnowych zakażonych MRSA252 wewnątrzkomórkowych dodać lizozym (10 μg/ml, patrz tabela materiałów) w temperaturze 37 °C przez 10 minut, a następnie przemyć PBS 2x. Następnie dodaj 1 ml PBS, aby ponownie zawiesić komórki. Poddaj komórki lizie, dodając 0,1% Triton X-100 przez 5 minut.
    4. Rozcieńczyć lizę seryjnymi rozcieńczeniami i upuścić ją na płytkę TSA. Hodowla przez noc w temperaturze 37 °C. Obliczyć wewnątrzkomórkową liczbę bakterii MRSA252 w makrofagach otrzewnowych, które wynosiły 1,8 x 106 CFU na mysz, licząc kolonie bakteryjne.
      UWAGA: Gdy skrobak do komórek zbiera komórki, działanie powinno być delikatne. Komórki są zeskrobywane w jednym kierunku, aby uniknąć pęknięcia komórek, co mogłoby wpłynąć na późniejszy eksperyment.
  3. Wewnątrzkomórkowa infekcja bakteryjna u myszy
    1. Losowo podziel 20 myszy Balb/c na cztery grupy (n = 5, Rysunek 5A).
    2. W przypadku grupy I wstrzyknąć 3 x 106 CFU MRSA252 planktonowego na mysz we wstrzyknięciu dożylnym. W przypadku grupy II wstrzyknąć 3 x 106 CFU planktonowe MRSA252 i wankomycynę (110 mg/kg; patrz tabela materiałów) na mysz we wstrzyknięciu dożylnym. W przypadku grupy III należy wstrzyknąć bakterie wewnątrzkomórkowe (przygotowane w kroku 3.2) we wstrzyknięciu dożylnym. W przypadku grupy IV należy wstrzyknąć bakterie wewnątrzkomórkowe (przygotowane w kroku 3.2) i wankomycynę (110 mg/kg) na mysz we wstrzyknięciu dożylnym.
    3. Umieść myszy pod lampą do fizjoterapii na podczerwień, aż ich żyły ogonowe ulegną rozszerzeniu.
    4. Wstrzyknąć dożylnie 3 x 106 CFU planktonowe MRSA252 na mysz z grupy I i grupy II. Wstrzyknąć dożylnie bakterie wewnątrzkomórkowe (przygotowane w kroku 3.2) na mysz z grupy III i grupy IV.
      UWAGA: W przypadku używania strzykawki do zbierania płynu zawierającego bakterie wewnątrzkomórkowe zaleca się najpierw delikatnie wymieszać płyn równomiernie pipetą, aby zapewnić stały poziom infekcji u wszystkich myszy.
    5. Po 30 minutach należy wstrzyknąć wankomycynę dożylnie grupie II i grupie IV na mysz.
  4. Ocena wewnątrzkomórkowego modelu infekcji in vivo
    1. Oceń model infekcji wewnątrzkomórkowej myszy, licząc kolonizację bakterii w nerkach. Po 24 godzinach od wstrzyknięcia znieczulij myszy 3% izofluranem i poświęć je przez zwichnięcie szyjki macicy. Zdezynfekuj je w 75% alkoholu etylowym.
    2. Unieruchomij myszy, jedną ręką podnieś skórę brzucha pęsetą, drugą ręką przetnij skórę brzucha myszy nożyczkami okulistycznymi, znajdź nerki w jamie brzusznej i całkowicie usuń nerki. Umieść je w PBS.
    3. Dodaj 1 ml PBS do probówki do mielenia tkanek. Przenieś nerki z każdej myszy do oddzielnych probówek do mielenia i mielej, aż nie pozostanie żadna tkanka stała. Wlej homogenizowaną tkankę do pojedynczych probówek EP i oznacz każdą probówkę odpowiednim identyfikatorem myszy.
    4. Użyj PBS do seryjnego rozcieńczenia homogenatu tkankowego. Umieścić każde rozcieńczenie na oddzielnych płytkach TSA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Policz kolonie i przeanalizuj dane (Rysunek 5B).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wewnątrzkomórkowe modele infekcji S. aureus zostały pomyślnie stworzone zarówno in vitro, jak i in vivo. Optymalizując warunki eksperymentalne dla fagocytozy i wydłużając zarówno stężenie, jak i czas trwania antybiotykoterapii, niektóre S. aureus przetrwały w makrofagach (Ryc. 1). Aby dokładniej ocenić oporność S. aureus na antybiotyki, makrofagi zakażone MRSA252 leczono antybiotykami przez 2 godziny, aż supernatant komórkow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

S. aureus, jako fakultatywny patogen wewnątrzkomórkowy, może atakować i przetrwać w różnych typach komórek, wykorzystując tę zdolność do unikania antybiotyków i odpowiedzi immunologicznej podczas infekcji30. W ramach tego badania stworzono wewnątrzkomórkowy model infekcji S. aureusin vivo , aby zapewnić podstawę do zbadania wewnątrzkomórkowych mechanizmów infekcji patogenu. Badając wpływ różnych wartości MOI na fagocytozę makrofagów S. aureus, a także skuteczność różnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC, Grant No.32300779, NO.32270989), Natural Science Foundation of Chongqing (CSTB2022NSCQ-MSX0156), Science and Technology Research Project of Chongqing Education Commission (KJQN202312802) oraz China Postdoctoral Science Foundation (2024M754250).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Płytka 24-dołkowaCorning Incorporated, USA3524
4 % roztwór paraformaldehyduBBI, Wielka BrytaniaE672002-0500
Płytka 6-dołkowaCorning Incorporated, USA3516
Ekstrakt z wołowiny w proszkuBBI, Wielka BrytaniaA600114-0500
Sprzęt zabezpieczający przed zagrożeniami biologicznymiHeal force, ChinyVS-1300L-u
Inkubator komórekESCO, SingapurCCL-170B-8
Skrobak do komórekGniazdo710001
Wirówka M1416RRWD, ChinyM1416R
Probówka wirówkowaGuanghou Labselect, ChinyCT-002-50A
mikroskop skaningowy (CLSM)Zeiss, Niemcy880
Konfokalna szalkaPetriegoBiosharp, ChinyBS-20-GJM
DAPIbarwnik Shanghai Beyotime, Chiny C1006
DIL płyn roboczyShanghai Beyotime, Chiny C1991S
Dulbecco' s Zmodyfikowany Eagle MediumThermo Gibco, USAC11995500BT
Hyklon płodowej surowicy bydlęcejSV30208.02
GentamycynaShanghai Sangon, ChinyB540724-0010
InkubatorShanghai Hengzi, ChinyHDPF-150
LizozymPekin Solarbio, ChinyL9070
MRSA252Trzecie wojsko Uniwersytet Medyczny, Chinynull
MRSA252(GPF)Trzeci Wojskowy Uniwersytet Medyczny, Chinyzero
penicyliny i streptomycynyShanghai Beyotime, Chiny C0222
Roztwór buforu fosforanowegoSzanghaj Beyotime, Chiny ST476
SalineSichuan Kelun, Chinyzero
Chlorek soduShanghai Macklin, ChinyS805275
Rozpuszczalny w skrobiShanghai Sangon, ChinyA500904-0500
Triton X-100Shanghai Beyotime, Chiny P0096-100ml
Tryptyczny agar sojowy (TSA)Talerze Pekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chiny02-130
Tryptyczny bulion sojowy (TSB) średniPekin AOBOX Biotechnology Co., LTD, Chiny02-102K
TryptonOXOID, Wielka BrytaniaLP0042B
VancomycinShanghai Beyotime, Chiny ST2807-250mg
RAW264.7 komórkaUSA, ATCCnull
Konfokalny laserowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sutton, J. A. F., et al. Staphylococcus aureus cell wall structure and dynamics during host-pathogen interaction. PLoS Pathog. 17 (3), e1009468(2021).
  2. Yang, H., et al. Lateral flow assay of methicillin-resistant Staphylococcus aureus using bacteriophage cellular wall-binding domain as recognition agent. Biosens Bioelectron. 182, 113189(2021).
  3. Howden, B. P., et al. Staphylococcus aureus host interactions and adaptation. Nat Rev Microbiol. 21 (6), 380-395 (2023).
  4. Guo, H., et al. Biofilm and small colony variants-an update on Staphylococcus aureus strategies toward drug resistance. Int J Mol Sci. 23 (3), 1241(2022).
  5. Huitema, L., et al. Intracellular escape strategies of Staphylococcus aureus in persistent cutaneous infections. Exp Dermatol. 30 (10), 1428-1439 (2021).
  6. Pidwill, G. R., et al. Clonal population expansion of Staphylococcus aureus occurs due to escape from a finite number of intraphagocyte niches. Sci Rep. 13 (1), 1188(2023).
  7. Wang, M., et al. Autophagy in Staphylococcus aureus infection. Front Cell Infect Microbiol. 11, 750222(2021).
  8. Arya, R., et al. Identification of an antivirulence agent targeting the master regulator of virulence genes in Staphylococcus aureus. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1268044(2023).
  9. Münzenmayer, L., et al. Influence of sae-regulated and agr-regulated factors on the escape of Staphylococcus aureus from human macrophages. Cell Microbiol. 18 (8), 1172-1183 (2016).
  10. Chin, D., et al. Staphylococcus lugdunensis uses the agr regulatory system to resist killing by host innate immune effectors. Infect Immun. 90 (10), e0009922(2022).
  11. Podkowik, M., et al. Quorum-sensing agr system of Staphylococcus aureus primes gene expression for protection from lethal oxidative stress. Elife. 12, RP89098(2024).
  12. Purves, J., et al. Air pollution induces Staphylococcus aureus usa300 respiratory tract colonization mediated by specific bacterial genetic responses involving the global virulence gene regulators agr and sae. Environ Microbiol. 24 (9), 4449-4465 (2022).
  13. Wittekind, M. A., et al. The novel protein scra acts through the saers two-component system to regulate virulence gene expression in Staphylococcus aureus. Mol Microbiol. 117 (5), 1196-1212 (2022).
  14. Pidwill, G. R., et al. The role of macrophages in Staphylococcus aureus infection. Front Immunol. 11, 620339(2020).
  15. Lang, J. C., et al. A photoconvertible reporter system for bacterial metabolic activity reveals that Staphylococcus aureus enters a dormant-like state to persist within macrophages. mBio. 13 (5), e0231622(2022).
  16. Li, M., et al. Interactions between macrophages and biofilm during Staphylococcus aureus-associated implant infection: Difficulties and solutions. J Innate Immun. 15 (1), 499-515 (2023).
  17. Sun, L., et al. Staphylococcal virulence factor hlgb targets the endoplasmic-reticulum-resident e3 ubiquitin ligase amfr to promote pneumonia. Nat Microbiol. 8 (1), 107-120 (2023).
  18. Mulcahy, M. E., et al. Manipulation of autophagy and apoptosis facilitates intracellular survival of Staphylococcus aureus in human neutrophils. Front Immunol. 11, 565545(2020).
  19. Cai, J., et al. Staphylococcus aureus facilitates its survival in bovine macrophages by blocking autophagic flux. J Cell Mol Med. 24 (6), 3460-3468 (2020).
  20. Ahmad-Mansour, N., et al. Staphylococcus aureus toxins: An update on their pathogenic properties and potential treatments. Toxins. 13 (10), 677(2021).
  21. Davis, J. S., et al. How I manage a patient with MRSA bacteremia. Clin Microbiol Infect. 28 (2), 190-194 (2022).
  22. Fait, A., et al. Staphylococcus aureus response and adaptation to vancomycin. Adv Microb Physiol. 85, 201-258 (2024).
  23. Kelly, J. J., et al. Measurement of accumulation of antibiotics to Staphylococcus aureus in phagosomes of live macrophages. Angew Chem Int Ed Engl. 63 (3), e202313870(2024).
  24. Rowe, S. E., et al. Recalcitrant Staphylococcus aureus infections: Obstacles and solutions. Infect Immun. 89 (4), e00694-e00720 (2021).
  25. Lehar, S. M., et al. Novel antibody-antibiotic conjugate eliminates intracellular S. aureus. Nature. 527 (7578), 323-328 (2015).
  26. Peyrusson, F., et al. Intracellular Staphylococcus aureus persisters upon antibiotic exposure. Nat Commun. 11 (1), 2200(2020).
  27. Pollitt, E. J. G., et al. Staphylococcus aureus infection dynamics. PLoS Pathog. 14 (6), e1007112(2018).
  28. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. 11 (63), e3064(2012).
  29. Qin, L., et al. Antibody-antibiotic conjugate targeted therapy for orthopedic implant-associated intracellular S. aureus infections. J Adv Res. 65, 239-255 (2024).
  30. Andie, S. L., et al. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Nat Rev Dis Primers. 31 (4), 18034(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Model infekcji wewn trzkom rkowejmakrofagi otrzewnoweleczenie antybiotykamiinfekcja MRSA 252hodowla kom rkowamysi model infekcjipersistencja bakteryjnatest fagocytozyliczenie kolonii

Powiązane artykuły