Artykuł metodologiczny

Izolacja i hodowla pierwotnych mysich adipocytów od myszy chudych i otyłych

4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67846

⸱

24 stycznia 2025

 ,  , 
1Department of Biochemistry, University of Utah School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Rozmiar i kruchość dojrzałych adipocytów ograniczyły dostępne techniki i narzędzia do ich badania i izolacji. W tym miejscu opisano protokół izolacji dojrzałych mysich adipocytów, który można łatwo dostosować do różnych magazynów tłuszczowych i diety myszy.

Streszczenie

Tkanka tłuszczowa składa się głównie z dojrzałych, bogatych w lipidy adipocytów objętościowo. Te postmitotyczne komórki odgrywają kluczową rolę w magazynowaniu i mobilizacji energii, termoregulacji i wydzielaniu czynników endokrynnych. Ekspansja białej tkanki tłuszczowej na skutek nierównowagi kalorycznej skutkuje zarówno powiększeniem istniejących adipocytów, jak i generowaniem dodatkowych adipocytów z komórek progenitorowych adipocytów. Zmiany w białej tkance tłuszczowej spowodowane otyłością, w tym te dotyczące adipocytów, są związane z licznymi chorobami współistniejącymi, takimi jak cukrzyca typu 2 i 13 rodzajów raka. Istotną przeszkodą w badaniu, w jaki sposób adipocyty przyczyniają się do choroby, jest niezdolność do łatwego wyizolowania i hodowli dojrzałych adipocytów. W tym artykule opisano protokół izolacji mysich, szczupłych i otyłych adipocytów z podskórnych i trzewnych magazynów tłuszczu samców i samic myszy C57BL / 6. Protokół szczegółowo opisuje, w jaki sposób izolowane adipocyty pierwotne mogą być hodowane w systemie agregacji adipocytów błonowych przez okres do 2 tygodni, ułatwiając ich analizę funkcjonalną w eksperymentach z kokulturą, testach lipolizy lub poprzez zbieranie kondycjonowanych pożywek zawierających czynniki wydzielane przez adipocyty. Ponadto w protokole przedstawiono metody hodowli eksplantatów tkanki tłuszczowej w kopułach macierzy błony podstawnej oraz obrazowania pierwotnych izolowanych adipocytów. Co ważne, podejście to można zintegrować z istniejącymi protokołami izolacji komórek progenitorowych adipocytów znajdujących się w tkance tłuszczowej za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS). Razem protokoły te zapewniają naukowcom narzędzia do funkcjonalnego badania adipocytów, komórek progenitorowych adipocytów i całej tkanki tłuszczowej od szczupłych i otyłych, męskich i żeńskich myszy.

Wprowadzenie

Oczekuje się, że do 2030 roku rozpowszechnienie otyłości wśród dorosłych w Stanach Zjednoczonych osiągnie 50%1, co czyni koniecznym do lepszego zrozumienia komórkowych i fizjologicznych skutków otyłości. Otyłość charakteryzuje się nierównowagą kaloryczną skutkującą ekspansją białej tkanki tłuszczowej na skutek zwiększonego magazynowania energii w postaci tłuszczu. Ekspansja tkanki tłuszczowej może zachodzić zarówno poprzez wytwarzanie nowych adipocytów (hiperplazja), jak i poprzez wzrost wielkości istniejących adipocytów (hipertrofia). Chociaż oba procesy prowadzą do rozrostu tkanki tłuszczowej, ekspansja przerostowa zbiega się z obniżonym zdrowiem metabolicznym i częstszym występowaniem zaburzeń metabolicznych2,3. Lepsze zrozumienie złożoności tkanki tłuszczowej zapewni wgląd w mechanizmy molekularne regulujące zaburzenia metaboliczne i inne choroby współistniejące związane z otyłością, w tym cukrzycę typu 2 i nowotwory.

Tkanka tłuszczowa od dawna jest doceniana za swoją rolę w magazynowaniu energii i termoregulacji. Ostatnio jednak tkanka tłuszczowa stała się ważną metaboliczną tkanką sygnalizacyjną, odpowiedzialną za wydzielanie metabolitów, lipidów i peptydów4,5. Te cząsteczki pochodzące z tkanki tłuszczowej, zwane adipokinami, sygnalizują lokalnie i ogólnoustrojowo oraz mogą regulować homeostazę energetyczną, funkcje odpornościowe, dynamikę naczyń krwionośnych i wiele innych5,6,7. Dojrzałe adipocyty stanowią około 50% komórek w tkance tłuszczowej i reprezentują zdecydowaną większość objętości tkanki tłuszczowej8. Co ważne, badania wykazały, że adipocyty składają się z wielu subpopulacji9,10. W związku z tym komórki progenitorowe adipocytów generują odrębne populacje dojrzałych adipocytów w oparciu o takie czynniki, jak płeć i magazyn tkanki tłuszczowej. Te dojrzałe adipocyty mogą być dodatkowo modulowane przez zmiany w diecie i otyłości, tworząc subpopulacje adipocytów, które są transkrypcyjnie odrębne i wyrażają różne sygnatury parakrynne9,11,12,13,14,15,16. Pomimo ich złożoności i znaczenia fizjologicznego, zdolność do izolowania i hodowli dojrzałych adipocytów pozostaje wyraźną barierą w badaniu tych komórek.

Obecnie dostępne metody izolowania dojrzałych adipocytów wykorzystują różnicowanie od komórek progenitorowych adipocytów (APC), fluorescencyjne sortowanie komórek aktywowanych i techniki oparte na wirowaniu, choć wszystkie te mają swoje wady. Różnicowanie in vitro lub ex vivo APC do dojrzałych adipocytów jest szeroko stosowane do rozwoju dojrzałych adipocytów. Jednak te sztucznie zróżnicowane komórki są wielopłatkowe, zawierają wiele małych kropelek lipidów, a nie jednopunktowy fenotyp dojrzałych adipocytów in vivo, które zawierają jedną dużą kroplę lipidu17. Ponadto badania wykazały, że komórki zróżnicowane in vitro różnią się transkrypcyjnie od izolowanych dojrzałych adipocytów znalezionych in vivo17. Co ważne, różnicowanie in vitro nie jest w stanie uchwycić różnicy między adipocytami szczupłymi i otyłymi. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) jest powszechnie stosowane do izolowania określonych populacji komórek z tkanki; jednak dojrzałe adipocyty mogą łatwo pęknąć w warunkach FACS ze względu na ich duży rozmiar i delikatne błony, co sprawia, że jest to nieefektywna metoda izolacji dojrzałych adipocytów. Inne istniejące protokoły powodują akumulację dużych ilości wolnych lipidów, które z czasem mogą być toksyczne dla dojrzałych adipocytów w hodowli.

Tutaj opisujemy protokół izolacji mysich dojrzałych adipocytów z białej tkanki tłuszczowej. Protokół ten został zaadaptowany z protokołu dla dojrzałych kultur zagregowanych adipocytów pierwotnie ustanowionego przez Harms et al.17; Jednak opisane tutaj podejście oparte na wirowaniu wykorzystuje powszechny sprzęt laboratoryjny i jest w stanie skutecznie izolować adipocyty z niewielkich ilości (~0,5 g) tkanki tłuszczowej. Jest to łatwy do adaptacji system i obejmuje modyfikacje dotyczące izolowania dojrzałych mysich adipocytów od samców i samic myszy, trzewnych i podskórnych magazynów tłuszczu oraz różnych warunków dietetycznych.

Protokół

Wszystkie opisane eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Utah. Protokół ten został zoptymalizowany pod kątem izolacji dojrzałych adipocytów od samców i samic myszy C57BL/6 w wieku 8-16 tygodni, o masie ciała w zakresie 20-45 g. Szczegółowe informacje na temat odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworu

  1. Przygotuj bufor kolagenazy. Dodaj 100 mg kolagenazy w proszku, 1 ml 1 M buforu HEPES, 500 μl 100x P188, 50 μL 1 M CaCl2, 0,05 g BSA i 48,45 ml pożywki 199. Sterylnie przefiltrować roztwór, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Zrób pożywkę do hodowli komórkowych. Połącz 500 ml DMEM, 50 ml FBS, 5 ml penicyliny-streptomycyny i 5 ml suplementu L-glutaminy.

2. Pobieranie składów białej tkanki tłuszczowej od myszy

  1. Przygotuj talerz o wymiarach 1 x 10 cm z 200 μl HBSS dla każdego innego magazynu i kondycjonuj zgodnie z potrzebami, a następnie umieść go na lodzie.
  2. Odzyskaj zwierzęta z pomieszczenia dla zwierząt i poddaj je eutanazji zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania Zwierząt. Tutaj zwierzęta zostały poddane eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w głębokim znieczuleniu.
  3. W razie potrzeby zważ i zapisz wagę każdej myszy.
  4. Wysterylizuj mysz, rozpylając 70% etanolu, aby pokryć zewnętrzną powierzchnię.
  5. Zbierz odpowiednie poduszeczki tłuszczowe z mouse18,19.
    UWAGA: Należy pamiętać o usunięciu węzłów chłonnych z zapasu podskórnego przed umieszczeniem tkanki w naczyniu.
  6. Zważ każdy tłuszcz i zapisz wagę.
  7. Umieść poduszkę tłuszczową w przygotowanym talerzu o długości 10 cm na lodzie.

3. Przygotowanie eksplantatów z białej tkanki tłuszczowej

UWAGA: Ten krok jest opcjonalny.

  1. Co najmniej 12 godzin przed rozpoczęciem sekcji rozmrozić matrycę błony podstawnej (Matrigel) w temperaturze 4 °C na lodzie i schłodzić jedno pudełko sterylnych końcówek do pipet o pojemności 200 μl w temperaturze 4 °C.
  2. Używając schłodzonych końcówek pipet, odpipetuj 80 μl macierzystej matrycy membranowej do środka każdej studzienki 24-dołkowej płytki hodowlanej, aby utworzyć kopułę (Rysunek 1A). Umieścić płytkę w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ) na 30 minut w celu częściowego zestalenia matrycy.
  3. Przygotowanie tkanki: Za pomocą sterylnych nożyczek do rozwarstwiania odważ 0,1 g tkanki z każdej próbki i umieść ją w PBS na lodzie.
  4. Za pomocą sterylnych kleszczy zanurz wstępnie zważoną tkankę w częściowo zestalonej kopule matrycy. Dodaj 30 μl macierzy błony podstawnej na osadzoną tkankę. Umieść płytkę z powrotem w inkubatorze na 30 minut, aby umieścić tkankę w macierzy błony podstawnej.
    UWAGA: Osadzenie tkanki w macierzy błony podstawnej ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia, że tkanka pozostaje w kulturze, a nie unosi się na wodzie. Pozwala to zachować zdrowie i jakość tkanek (Rysunek 1B).
  5. Dodaj 1 ml pożywki wzrostowej (DMEM z 10% FBS) do każdej studzienki i wróć do inkubatora.

4. Leczenie kolagenazą

  1. Oblicz potrzebną ilość roztworu kolagenazy. Patrz tabela 1.
  2. Przygotować roztwór kolagenazy z DNazą. Dodać 0,00017 g DNazy na 1 ml roztworu kolagenazy. Wirować do mieszania.
  3. Za pomocą żyletki zmiel izolowaną tkankę tłuszczową, aż tkanka stanie się jednorodna (Rysunek 2A). Przenieść tkankę mieloną do sterylnej probówki stożkowej o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Nie miażdż zbyt mocno. Mielenie jest zakończone, gdy tkanka wydaje się jednorodna i ma kształt pasty. Niedostatecznie rozdrobniona tkanka wydaje się gruba i niejednorodna, a nadmiernie rozdrobniona tkanka spowoduje uwolnienie wolnych lipidów (Rysunek 2B).
  4. Dodać przygotowany roztwór kolagenazy i DNazy do rozdrobnionej tkanki tłuszczowej, używając objętości obliczonych w kroku 4.1. Wiruj z maksymalną prędkością przez 7-10 s, aby dokładnie się połączyć. Umieścić 50 ml stożkowych probówek poziomo w wytrząsarce ustawionej na 220 obr./min, 37 °C.
  5. Inkubować wstrząsy przez 10 minut, następnie wirować przez 5 s i sprawdzić próbki. W pełni strawione próbki będą wydawały się jednorodne, bez widocznych grudek lub kawałków tkanki. Jeśli próbki nie są w pełni strawione, kontynuuj trawienie w shakerze, sprawdzając co 2 minuty (Rysunek 2C).
    UWAGA: Nie trawić zbyt mocno. Zbyt długi czas w roztworze kolagenazy może spowodować rozpad adipocytów i uwolnienie lipidów.
  6. Za pomocą pipety serologicznej przepuścić strawioną tkankę przez sito do nowego stożkowego o pojemności 50 ml. Dodać objętość FBS równą objętości roztworu tkanki + kolagenazy przez sito do stożka, aby zneutralizować kolagenazę.
    UWAGA: Po przefiltrowaniu na sicie pozostanie niewielka ilość tkanki.

5. Mycie chusteczki

UWAGA: Wykonaj wszystkie poniższe kroki w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej.

  1. Przygotuj 1 x 15 ml probówkę z 10 ml ciepłej pożywki hodowlanej dla każdego stanu.
  2. Wirować probówki z kroku 4.6 przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze określonej w tabeli 1.
    UWAGA: Temperatura wirowania musi być zmodyfikowana w zależności od płci myszy, od których wyizolowano tkankę tłuszczową; temperatury te przedstawiono w tabeli 1.
  3. Upewnij się, że po wirowaniu tkanka rozdziela się na cztery warstwy (Rysunek 3A).
    UWAGA: Najwyższa warstwa to wolne lipidy, druga warstwa to dojrzała warstwa adipocytów, trzecia warstwa to kolagenaza i FBS, a czwarta warstwa to frakcja naczyniowa zrębu (SVF), która granuluje się do dna20,21.
  4. Ostrożnie wyrzuć górną warstwę wolnych lipidów za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
  5. Po usunięciu górnej warstwy użyj pipety p1000 z odciętą dolną warstwą, aby przenieść dojrzałe adipocyty do przygotowanej probówki o pojemności 15 ml z 10 ml pożywki wzrostowej (Rysunek 3B).
    1. Opcjonalnie: Aby wyizolować pierwotne komórki progenitorowe adipocytów (APC), ponownie obracaj probówki pod ciśnieniem 300 x g przez 10 minut. Następnie przejdź do izolacji komórek progenitorowych adipocytów przez Liu i wsp.22, Cho et al.23 lub podobnie.
  6. Odwróć probówki o pojemności 15 ml z dojrzałymi adipocytami delikatnie 3-5 razy, aż biała warstwa rozproszy się po pożywce.
  7. Pozostaw probówki w pozycji pionowej przez 10 minut w temperaturze wskazanej w tabeli 1, aby umożliwić oddzielenie warstw adipocytów i pożywki.
  8. Po 10 minutach odpoczynku wiruj probówki o gramaturze 100 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej, aby jeszcze bardziej ułatwić rozdzielanie warstw. Po wirowaniu próbki zostaną ponownie rozdzielone na cztery warstwy, jak pokazano na Rysunek 3A.
  9. Usuń i wyrzuć górną warstwę wolnych lipidów za pomocą pipety.
  10. Za pomocą igły 21 G dołączonej do strzykawki o pojemności 5 ml, przesuń igłę w dół krawędzi probówki, aż spód igły będzie wolny od warstwy dojrzałych adipocytów (Rysunek 3C). Upewnij się, że górna część igły i spód strzykawki nie naruszają warstwy dojrzałych adipocytów.
  11. Powoli pociągnąć strzykawkę do góry, aby usunąć pożywkę hodowlaną i wszelkie zanieczyszczenia komórkowe.
    UWAGA: Podczas usuwania pożywki upewnij się, że końcówka igły jest wolna od warstwy dojrzałych adipocytów.
  12. Delikatnie dodaj 10 ml pożywki hodowlanej do każdej probówki.
  13. Powtórz kroki 5.6-5.11. Nie dodawaj więcej pożywek hodowlanych.
  14. Używając końcówek do pipet z żelem, przesuń końcówkę pipety w dół krawędzi probówki, aby usunąć pozostałe media spod warstwy dojrzałych adipocytów.

6. Pakowanie

  1. Odwirować komórki o masie 100 x g przez 1 minutę w temperaturze wskazanej w tabeli 1. Usuń wolne lipidy (przezroczysta warstwa oleju na wierzchu komórek) za pomocą pipety. Usuń pożywkę hodowlaną poniżej adipocytów za pomocą końcówki ładującej żel. Zadbaj o to, aby zminimalizować zakłócenia warstwy adipocytów (Rysunek 4).
  2. Powtarzaj krok 6.1, aż wszystkie pożywki hodowlane i wolne lipidy zostaną usunięte (zwykle 3-5 razy). Pakiet komórek powinien być koloru białego, bez widocznych wolnych lipidów nad komórkami lub pożywki poniżej komórek (Rysunek 4).

7. Poszycie i testy funkcjonalne

  1. Posiewanie dojrzałych adipocytów do hodowli komórkowej
    1. Wyjmij wkładki do hodowli komórkowych z 24-dołkowej płytki poddanej działaniu kultur tkankowych i umieść je membraną do góry na powierzchni kaptura.
    2. Napełnij naprzemiennie dołki płytki 1 ml ciepłej pożywki hodowlanej.
    3. Używając przeciętej końcówki pipety p200, umieść 30 μl upakowanych dojrzałych adipocytów z kroku 6.2 na wierzchu wkładki transwell (Rysunek 5A, B).
    4. Ostrożnie podnieś i odwróć wkładkę transwell i umieść ją w wstępnie napełnionej studzience w 24-dołkowej płytce (Rysunek 5A). Ostrożnie umieścić płytkę w inkubatorze nastawionym na temperaturę 37 °C z 5% CO2,
      UWAGA: Prawidłowo upakowane adipocyty powinny tworzyć nieprzezroczystą warstwę bez widocznych przezroczystych wolnych kropelek lipidów, gdy są oglądane z góry (Rysunek 5C).
    5. Zmieniaj pożywkę na dojrzałych adipocytach co 2-7 dni przez okres do 14 dni.
      1. Aby usunąć pożywkę z dołków, przytrzymaj transwell na miejscu i użyj pipety p200, aby ostrożnie wyjąć medium przez małe otwory z boku wkładu transwell (Rysunek 5D).
      2. Po usunięciu pożywki, nadal trzymając transwell na miejscu, bardzo powoli dodaj 1 ml pożywki do bocznej ścianki studzienki.
        UWAGA: Należy pamiętać, aby dodawać i usuwać multimedia bardzo powoli. Adipocyty mogą łatwo zostać usunięte z błony, jeśli podłoże zostanie szybko zmienione.
  2. Test lipolizy
    1. Płytki eksplantacji tkanki tłuszczowej zgodnie z opisem w kroku 3.4 lub dojrzałe adipocyty zgodnie z opisem w kroku 7.1.
      UWAGA: Komórki lub tkanki muszą być hodowane w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej przez co najmniej 24 godziny przed przeprowadzeniem testu lipolizy.
    2. Przygotowanie roztworu: Przygotować roztwór 5% BSA w DMEM (bez czerwieni fenolowej), rozpuszczając 5 g BSA w 100 ml DMEM. Delikatnie odwróć, aby połączyć, aż BSA całkowicie się rozpuści.
      1. Przygotuj roztwory robocze dla mediów kontrolnych i stymulacyjnych. W przypadku pożywek kontrolnych należy połączyć 5% nośników BSA DMEM z pojazdem. W przypadku pożywek stymulacyjnych połącz 5% pożywki BSA DMEM z 5 μM CL-316,243. Przed użyciem podgrzać media kontrolne i stymulacyjne do temperatury 37 °C.
    3. Wyjmij pożywkę z dołków i przemyj 1 ml ciepłego DPBS. Napełnij studzienki 500 μl na studzienkę pożywki kontrolnej lub stymulującej. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    4. Po 1 godzinach, 2 godzinach, 4 godzinach i 24 godzinach od rozpoczęcia testu lipolizy zebrać 100 μl pożywki z każdej studzienki do probówki mikrowirówkowej i zastąpić ją 100 μl odpowiedniej pożywki kontrolnej lub stymulującej.
      UWAGA: W tym momencie próbki mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.
    5. Uruchom test kolorymetryczny glicerolu przy użyciu dostępnego w handlu bezpłatnego zestawu glicerolu (patrz Tabela materiałów) lub podobnego.
      1. Przygotuj odczynniki zgodnie z zaleceniami w zestawie.
      2. Rozmrozić próbki i delikatnie wymieszać pipetując.
      3. Przygotować krzywą wzorcową z siedmiopunktowym, 2-krotnym seryjnym rozcieńczeniem przy użyciu wzorcowego roztworu glicerolu.
      4. Przenieść 25 μl próbki lub wzorca do każdego dołka na 96-dołkowej płytce z przezroczystym dnem.
      5. Dodać 100 μl odczynnika do oznaczania wolnego glicerolu do każdej studzienki zawierającej próbkę lub roztwór wzorcowy.
      6. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie odczytać absorbancję przy 540 nm (Rysunek 6A-D).
  3. Obrazowania
    1. Przygotuj szkiełka do obrazowania. Aby przygotować preparaty, należy usunąć warstwę papieru podkładowego z każdego przekładki obrazowania i umieścić ją na szkiełku. Na każdym szkiełku można umieścić obok siebie dwie przekładki obrazowe.
    2. Za pomocą przeciętej końcówki pipety o pojemności 200 μl przenieś 30 μl upakowanych adipocytów z kroku 6.2 do probówki mikrowirówkowej.
    3. Przygotuj mieszankę barwiącą. Przygotować 200 μl na próbkę roztworu do barwienia błony plazmatycznej w stężeniu 5 μg/ml i Hoechst w stężeniu 4,5 μg/ml w PBS. Dodaj mieszankę bejc do próbek i delikatnie wstrząśnij.
    4. Próbki barwić przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Chronić próbki przed światłem.
    5. Po zakończeniu barwienia umyj próbki. Dodać 500 μl PBS do każdej próbki i delikatnie wstrząsnąć, aby połączyć. Odstawić na 5 minut. Wirować w ilości 100 x g przez 1 minutę, a następnie usunąć pożywkę spod komórek za pomocą końcówki do pipety z żelem.
    6. Przygotuj slajdy. Usuń przezroczystą folię z tworzywa sztucznego z górnej części przekładek obrazowania, aby odsłonić lepką warstwę.
    7. Dodaj 500 μl PBS do probówki z barwionymi adipocytami i delikatnie wymieszaj.
    8. Szybko, aby nie dać czasu dojrzałym adipocytom na wydostanie się na powierzchnię, użyj naciętej końcówki pipety p200, aby umieścić 35 μl adipocytów w przekładce na szkiełku obrazowym.
    9. Umieść szkiełko nakrywkowe na przekładce.
    10. Natychmiast przejdź do obrazowania (Rysunek 6C). Opóźnienie w obrazowaniu może spowodować krwawienie markera błonowego.

Wyniki

Jak pokazano na Rysunku 2, odpowiednie rozdrobnienie (Rysunek 2B) i trawienie (Rysunek 2C) są kluczowe dla izolacji nienaruszonych dojrzałych adipocytów. Niedostateczne rozdrobnienie i trawienie mogą prowadzić do niskiej wydajności uzyskiwania dojrzałych adipocytów ze względu na niepełne oddzielenie od tkanki łącznej. Wizualnie przejawia się to obecnością włóknistych fragmentów tkanki po rozdrobnieniu oraz widocznych grudek w roztworze kolagenazy. Ponadto nadmierne rozdrobnienie i trawienie również skutkują niską wydajnością z powodu pękania dojrzałych adipocytów. Wizualnie objawia się to zanikiem białej, mętnej warstwy i nagromadzeniem dużej, przejrzystej warstwy wolnych lipidów. Niewłaściwy stopień rozdrobnienia lub trawienia spowoduje nieefektywną izolację adipocytów.

Prawidłowe przygotowanie i trawienie tkanki tłuszczowej doprowadzi do rozdzielenia tkanki na cztery wyraźne warstwy, co przedstawiono na Rysunku 3. Pewien stopień pękania adipocytów skutkujący uwolnieniem wolnych lipidów jest nieunikniony; jednakże właściwe rozdrobnienie i trawienie zapewnią minimalną liczbę pękniętych adipocytów. Pozostała warstwa wolnych lipidów oraz medium zostaną usunięte podczas upakowywania adipocytów (Rysunek 4). Prawidłowe upakowanie adipocytów jest niezbędne do wydajnej izolacji dojrzałych adipocytów. Wszelkie pozostałości wolnych lipidów lub medium spowodują niską wydajność izolacji i negatywnie wpłyną na późniejsze testy funkcjonalne, takie jak wysiew komórek, lipoliza i obrazowanie komórkowe.

Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie czystej preparacji dojrzałych adipocytów. W celu oceny funkcji komórkowych oraz wykazania, że dojrzałe adipocyty zachowują swoją aktywność po izolacji i po hodowli trwającej do dwóch tygodni, można przeprowadzić obrazowanie komórek oraz testy lipolizy. Test lipolizy wskazuje, że dojrzałe adipocyty zachowują zdolność do odpowiedzi na sygnalizację komórkową poprzez uwalnianie wolnego glicerolu po stymulacji receptora β-3 adrenergicznego (Rycina 6A,B). Zdolność ta jest utrzymywana nawet po 2 tygodniach hodowli i jest wysoce porównywalna z aktywnością lipolityczną eksplantatów tkanki tłuszczowej hodowanych przez 24 h (Rycina 6C,D). Adipocyty słabej jakości będą wykazywać osłabioną lipolizę. Obrazowanie izolowanych adipocytów ukazuje okrągłe i nienaruszone, jednokomorowe dojrzałe adipocyty zawierające jedną dużą kroplę lipidową. W przypadku niskiej jakości izolacji adipocytów będą widoczne głównie duże, zewnątrzkomórkowe krople tłuszczu, co świadczy o pęknięciu adipocytów.

Schemat równowagi statycznej z etapami zatapiania w żelu: optymalnym, częściowym, wypadnięciem.
Rycina 1: Zatapianie eksplantatów tkanki tłuszczowej. (A) Obraz częściowo zestalonej kopułki macierzy błony podstawnej przed zatopieniem tkanki. (B) Reprezentatywne obrazy nieprawidłowego i prawidłowego zatopienia tkanki. Nieprawidłowe zatopienie objawia się tym, że tkanka wydaje się unosić częściowo lub całkowicie nad kopułką. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat procesu trawienia kolagenazą; stan tkanki przedstawiony przy różnej aktywności enzymatycznej i temperaturach.
Rycina 2: Schemat prawidłowego rozdrabniania i trawienia tkanki tłuszczowej. (A) Schematyczne przedstawienie etapów rozdrabniania i trawienia tkanki 4.2-4.6. (B) Reprezentatywne obrazy tkanki niedostatecznie, optymalnie i nadmiernie rozdrobnionej. Tkanka niedostatecznie rozdrobniona zawiera duże fragmenty, które zachowują swój pierwotny kształt. Nadmierne rozdrobnienie tkanki skutkuje widocznym wzrostem ilości wolnych lipidów otaczających tkankę, które wydają się przejrzyste i tłuste. (C) Reprezentatywne obrazy tkanki niedostatecznie, optymalnie i nadmiernie trawionej. Tkanka niedostatecznie trawiona zawiera fragmenty całej tkanki pozostające w roztworze. Tkanka nadmiernie trawiona wykazuje dużą warstwę wolnych lipidów, która szybko oddziela się od roztworu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Etapy izolacji tkanki tłuszczowej; schemat, rozdzielenie warstw w probówce, proces ekstrakcji strzykawką.
Rycina 3: Rozdzielenie warstw strawionej tkanki tłuszczowej. (A) Schemat i reprezentatywny obraz warstw obecnych po etapie 5.3. (B) Użycie ściętej końcówki pipety do usunięcia warstwy dojrzałych adipocytów z konicznej probówki 50 mL. (C) Prawidłowa technika i rozmieszczenie igły oraz strzykawki w celu usunięcia pożywki hodowlanej spod warstwy dojrzałych adipocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Proces separacji adpocytów, etapy wirowania, usuwanie lipidów, schemat oczyszczania adipocytów.
Rycina 4: Sekwencyjne upakowanie dojrzałych adipocytów. Kolejne obrazy przedstawiające upakowywanie dojrzałych adipocytów. Oznaczono warstwy wolnych lipidów, adipocytów i pożywki. Po każdym wirowaniu wolne lipidy i pożywkę usuwa się. Czynność tę powtarza się do momentu, aż po wirowaniu pożywka lub wolne lipidy nie oddzielą się od adipocytów. Ostatni obraz przedstawia reprezentatywny przykład dobrze upakowanych dojrzałych adipocytów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przygotowanie kropli lipidowych, schemat upakowania; ustawienie mikroskopowe do analizy kropli i optymalne wyniki upakowania.
Rysunek 5: Wysiew i hodowla dojrzałych adipocytów. (A) Schemat wysiewu dojrzałych adipocytów. Za pomocą odciętego końcówki pipety p200 upakowane adipocyty nanosi się na membranę wkładki do hodowli komórkowych. Wkładkę odwraca się następnie i umieszcza w wypełnionych wcześniej dołkach z pożywką hodowlaną. (B) Reprezentatywny obraz wysiewu dojrzałych adipocytów przedstawiający odciętą końcówkę pipety osadzającą adipocyty na wkładce transwell. (C) Schematy i reprezentatywne obrazy prawidłowo i nieprawidłowo upakowanych adipocytów wysianych na wkładkach transwell, widziane z góry dołków. Prawidłowo upakowane adipocyty wydają się białe i nieprzezroczyste, natomiast nieprawidłowo upakowane adipocyty prowadzą do powstania przejrzystych kropli lipidowych. (D) Schemat techniki stosowanej do wymiany pożywki hodowlanej. Koncówki pipety p200 używa się do ostrożnego usunięcia pożywki przez otwory w ścianie bocznej wkładki transwell. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy uwalniania glicerolu z adipocytów podskórnych i trzewnych w czasie, mikroskopia błon komórkowych.
Rycina 6: Obrazowanie dojrzałych adipocytów i test lipolizy. (A,B) Uwalnianie glicerolu z dojrzałych adipocytów podskórnych (A) i trzewnych (B). Adipocyty wyizolowano od 16-tygodniowych samców myszy C57BL/6 karmionych standardową dietą. 30 µL adipocytów wysiano zgodnie z opisem w kroku 7.1 i hodowano przez 1 lub 10 dni. Adipocyty traktowano 5 µM CL-316,243 przez 1 h, 2 h i 4 h, a następnie zebrano nadsączone ciecze i przeanalizowano zawartość wolnego glicerolu. (C,D) Uwalnianie glicerolu z eksplantów tkanki tłuszczowej podskórnej (C) i trzewnej (D). Tkankę tłuszczową wyizolowano od 18-tygodniowych samic myszy C57BL/6 karmionych standardową dietą. 0,1 g eksplantów tkanki tłuszczowej wysiano zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.4 i hodowano przez 24 h. Adipocyty traktowano 5 µM CL-316,243 przez 1 h, 2 h i 4 h, a następnie zebrano nadsączone ciecze i przeanalizowano zawartość wolnego glicerolu. N = 3 powtórzenia techniczne dla A-D. Wszystkie dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. (E) Reprezentatywne obrazy wyizolowanych dojrzałych adipocytów podskórnych i trzewnych. Adipocyty wyizolowano od 16-tygodniowych samców myszy C57BL/6J karmionych standardową dietą. Adipocyty barwiono barwnikiem do błony plazmatycznej (czerwony) oraz barwnikiem Hoechst do jąder komórkowych (niebieski). Pasek skali: 50 µm; powiększenie: 60x. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

PłećDietaDepozytTrudność w rozdrabnianiuKollagenaza: stosunek do tkankiSugerowany czas trawienia (min)Temp. wirowaniaTemp. prania
KobietaStandardowa karmaPodskórnieTwardy2:112RT37 °C
TrzewnyPożywka1:18RT37 °C
Dieta wysokotłuszczowaPodskórnieProste1:18RT37 °C
TrzewnyProste1:18RT37 °C
SamiecStandardowa karmaPodskórnieTwardy2:1144 °CRT
TrzewnyPożywka1:1104 °CRT
Dieta wysokotłuszczowaPodskórnieŁatwe1:1104 °CRT
TrzewnyŁatwy1:1104 °CRT (transkrypcja odwrotna)

Tabela 1: Modyfikacje specyficzne dla płci, depot i diety. Trudność rozdrobnienia każdej tkanki, opisana jako „Łatwa”, „Średnia” lub „Trudna” w odniesieniu do innych depot. Należy pamiętać, że rzeczywisty czas rozdrabniania będzie się różnić w zależności od badacza i tkanki. Stosunek kolagenazy do tkanki podano jako objętość (mL) roztworu kolagenazy + DNazy przygotowanego w kroku 4.1 do masy tkanki (g). Czas trawienia jest wartością szacunkową, jednak rzeczywisty czas trawienia będzie się różnić w zależności od stopnia rozdrobnienia i rodzaju tkanki. Badacze powinni ocenić stopień trawienia zgodnie z opisem w protokole. Temperatura wirowania i temperatura płukania różnią się w zależności od tego, czy myszy są samcami, czy samicami. RT oznacza temperaturę pokojową.

Dyskusja

Adipocyty pierwotne są notorycznie trudne do wyizolowania i hodowli, ponieważ łatwo pękają, a ich duży rozmiar wyklucza użycie powszechnych narzędzi do pierwotnej izolacji komórek, takich jak cytometria przepływowa. Opisany tutaj protokół daje czyste i funkcjonalne dojrzałe adipocyty, które mogą być wykorzystywane do różnych dalszych zastosowań. Co ważne, protokół ten pozwala na oddzielenie dojrzałych adipocytów od innych szczątków komórkowych i wolnej warstwy lipidowej, umożliwiając skuteczne obrazowanie, hodowlę i testy lipolizy. Protokół można łatwo połączyć z opublikowanymi protokołami 22,23 dotyczącymi izolacji frakcji zrębu naczyniowego i APC. Protokół ten szczegółowo opisuje również procedurę przygotowania i hodowli eksplantatów całotkankowych z tkanki tłuszczowej, które mogą być wykorzystywane do dalszych zastosowań, takich jak testy lipolizy i pobieranie wydzielanych czynników z całej tkanki tłuszczowej.

Krytyczne aspekty obejmują prawidłowe mielenie, trawienie i usuwanie wolnej warstwy lipidowej. Aby zapewnić prawidłowe mielenie, ważne jest, aby ściśle monitorować wygląd tkanki przez cały proces. Czas i wysiłek potrzebny do osiągnięcia optymalnego rozdrobnienia tkanki będzie się różnić w zależności od składu tkanki tłuszczowej, interwencji dietetycznych (takich jak dieta wysokotłuszczowa) i badacza. W razie potrzeby można zastosować inne narzędzia do mielenia, takie jak nożyczki, ale nie zostało to tutaj zbadane. Należy zauważyć, że należy unikać nadmiernego mielenia, ponieważ spowoduje to pęknięcie adipocytów, co nie tylko zmniejsza natychmiastową wydajność, ale także obniża całkowitą wydajność i jakość adipocytów ze względu na szkodliwy wpływ wolnej warstwy lipidowej na pozostałe adipocyty. Prawidłowe trawienie, podobnie jak prawidłowe mielenie, będzie zależało od składu tkanki tłuszczowej, interwencji dietetycznych, wieku myszy itp. Dodatek DNazy do kolagenazy pomaga zapobiegać agregacji adipocytów podczas trawienia, która może wynikać z resztek komórkowych. Czas trawienia tkanek jest zatem bardzo zmienny. Podane szacunki dotyczące czasu trawienia służą jako wskazówka, które można znaleźć w tabeli 1. Jednak najlepszym sposobem na zapewnienie prawidłowego trawienia tkanek jest wizualna kontrola tkanki przez cały czas trwania procesu i zgodnie z opisem w protokole. Różne temperatury wirowania i płukania wyszczególnione w tabeli 1, sugerowane na podstawie płci, są niezbędne do prawidłowego oddzielenia dojrzałych adipocytów zarówno od wolnej warstwy lipidowej, jak i innych zanieczyszczeń komórkowych i SVF; Stosowanie naprzemiennych temperatur może spowodować utratę dojrzałych adipocytów w wyniku agregacji i pękania adipocytów.

Usunięcie wolnej warstwy lipidowej na każdym etapie ma kluczowe znaczenie, a niewykonanie tego spowoduje dalsze komplikacje związane z posiewem, obrazowaniem i testem lipolizy. Co więcej, utrzymująca się obecność wolnej warstwy lipidowej przez cały czas trwania procedury spowoduje dodatkową śmierć adipocytów z powodu lipotoksyczności, co dramatycznie wpłynie na ogólną wydajność i jakość. Chociaż maksymalizacja skuteczności izolacji dojrzałych adipocytów jest ogólnie pożądana, usunięcie wolnej warstwy lipidowej, nawet kosztem niektórych dojrzałych adipocytów, spowoduje ogólny wzrost wydajności dojrzałych adipocytów pod koniec protokołu.

Do ograniczeń procedury należy liczba próbek. Ze względu na rygor i czas potrzebny na usunięcie pożywki i wolnej warstwy lipidowej, procedura jest na ogół ograniczona do sześciu próbek jednocześnie. Przetwarzanie znacznie większej liczby próbek spowoduje, że pierwotne adipocyty będą zbyt długo narażone na działanie wolnych lipidów i zmniejszą ogólną wydajność. Dodatkowy personel może jednak pozwolić na zwiększenie liczby próbek. Czas od rozdrobnienia do testu funkcjonalnego ma kluczowe znaczenie, ponieważ nadmierne opóźnienia w usuwaniu pożywki i wolnej warstwy lipidowej powodują dodatkowe pękanie dojrzałych adipocytów. Protokół jest dodatkowo ograniczony pod względem zdolności do oddzielania subpopulacji dojrzałych adipocytów.

Obecne metody badania dojrzałych adipocytów opierają się przede wszystkim na izolacji APC i późniejszym różnicowaniu tych komórek ex vivo. Zaczęto opracowywać dodatkowe metody, w tym model narządów na chipie i kokultury osób trans well18,24. Wykazano jednak, że te adipocyty zróżnicowane ex vivo różnią się transkrypcyjnie i morfologicznie od dojrzałych adipocytów w tkance tłuszczowej17. Pod względem morfologicznym adipocyty zróżnicowane ex vivo są wielopłatkowe, podczas gdy adipocyty izolowane in vivo są jednomiejscowe. Protokół ten został zmodyfikowany i zoptymalizowany w stosunku do poprzednich raportów17,25, aby skutecznie wyizolować i wyhodować dojrzałe adipocyty z zaledwie 0,5 g tkanki tłuszczowej w porównaniu z innymi protokołami, które wymagają co najmniej 5 g tkanki tłuszczowej25 . Wreszcie, badanie to miało na celu wizualne zilustrowanie pomyślnego zakończenia kluczowych kroków w protokole zamiast konkretnych czasów, temperatur wirowania i ilości kolagenazy, chociaż wytyczne znajdują się w tabeli 1. Parametry te należy dostosować do takich czynników, jak magazyn tkanki tłuszczowej, płeć i otyłość zwierzęcia, z których wszystkie mogą mieć wpływ na efektywność trawienia i czystą separację dojrzałych adipocytów w tym protokole.

W sumie zabieg trwa 3-4 godziny, w zależności od liczby zebranych myszy i ilości pojedynczych próbek tkanki tłuszczowej. Przewiduje się, że zdolność do hodowli i oceny funkcjonalnej roli dojrzałych adipocytów umożliwi wiele dalszych zastosowań w badaniu samej biologii adipocytów (np. metabolizmu, wykorzystania składników odżywczych i śledzenia) oraz interakcji adipocytów z innymi typami komórek, takimi jak APC, komórki rakowe i komórki układu odpornościowego.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za wsparcie udzielone przez 5 For The Fight and Huntsman Cancer Institute (KIH), V Foundation for Cancer Research (KIH) oraz DK133455 (KIH). Schemat protokołu utworzonego za pomocą Biorender. Ponadto autorzy chcieliby podziękować Stephanie Giagnocavo i Cell Imaging Core z University of Utah za pomoc w obrazowaniu, a także Markowi Lee za opinie na temat manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100x Poloxamer 188 roztwórSigmaP5556-100mL
15 mL stożkowyCellstar188261
21 G IgłaBD305165
5 mL StrzykawkaBD309646
50 mL StożkowaCellstar227261
6,5 mm Transwell z 0,4 &mikro; m Wkładka membrany poliwęglanowej z poramiCorning3413
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Sigma-AldrichA7906-100G
CaCl2SigmaC1016-500gm
CellMask Barwniki z błony plazmatycznejThermo Fisher ScientificC10045
CL 316243 sól disodowaTocris1499
Kolagenaza w proszkuSigmaC6885
DMEMGibco11995-040
DMEM bez feonolu CzerwonyGibcoA14430-01
DNase ISigma-Aldrich10104159001
Płodowa surowica bydlęca (FBS)GibcoA56708-01
Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Złote slajdyFisher scientific
Końcówka do pipety ładującej żelFisher scientific02-707-181
Suplement GlutaMAXZestaw
Zbilansowany roztwór soli Hanksa (HBSS)Gibco14025-092
Bufor HEPESSigma83264-100ML-F
Heraeus Wirówka Megafuge 16RThermo Scientific 
Hoechst 33342 RoztwórThermo Fisher Scientific62249
Mini wytrząsarka inkubacyjnaVWR12620-942
Medium 199Sigma-AldrichM4530
Okulary nakrywkowe do mikroskopuVWR16004-302
PBSGibco10010023
Penicylina-StreptomycynaGibco15140-122
Przekładki obrazowe SecureSealGrace Biolabs654006
Seive (sitko do koktajli SteeL o drobnych oczkach)OXO3112000https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html
1518848 do oznaczania glicerolu Gibco 35050061 Abcam AB133130 75004271

Bibliografia

  1. Ward, Z. J., et al. Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity. N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).
  2. Vishvanath, L., Gupta, R. K. Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity. J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).
  3. Longo, M., et al. Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications. Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).
  4. Funcke, J. B., Scherer, P. E. Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication. J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).
  5. Johnston, E. K., Abbott, R. D. Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity. Cells. 12 (3), 407(2023).
  6. Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction. Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).
  7. Liu, P., et al. Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates. Sci Data. 10 (1), 453(2023).
  8. Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).
  9. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).
  10. Nahmgoong, H., et al. Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics. Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).
  11. Hildreth, A. D., et al. Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity. Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).
  12. Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. Adipose tissue at single-cell resolution. Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).
  13. Gao, Y., et al. Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).
  14. Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation. Cells. 8 (9), 1100(2019).
  15. Verma, S., et al. Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis. Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).
  16. Min, S. Y., et al. Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).
  17. Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).
  18. Chaurasiya, V., et al. Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication. Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).
  19. Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice. J Vis Exp. 167, e62005(2021).
  20. Farrar, J. S., Martin, R. K. Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes. Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).
  21. You, X., Gao, J., Yao, Y. Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review. Regen Ther. 27, 120-125 (2024).
  22. Liu, Q., et al. Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction. STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).
  23. Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. J Vis Exp. 162, e61694(2020).
  24. Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. Next-generation human adipose tissue culture methods. Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).
  25. Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC). J Vis Exp. 156, e60485(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Izolacja adypocyt whodowla adypocyt wmyszy szczup e i oty etkanka t uszczowar nice mi dzy depotami t uszczowymitrawienie kolagenazkom rki progenitorowe adypocyt winserty Transwellpo ywka warunkowana

Powiązane artykuły