Artykuł metodologiczny

Generowanie 3D ludzkiej tkanki mięśnia sercowego przy użyciu elektroprzędzenia stopionego zapisu rusztowań polikaprolaktonowych i komórek serca pochodzących z hiPSC

DOI:

10.3791/67847

⸱

28 marca 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Program, Enabling Technologies Division, CIMA Universidad de Navarra, and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 2Department of Cardiology, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 3Hematology and Cell Therapy Area, Clínica Universidad de Navarra and Instituto de Investigación Sanitaria de Navarra (IdiSNA), 4Centro de Investigación Biomédica en Red de Cáncer (CIBERONC) CB16/12/00489, 5Hemato-Oncology Program, Cancer Division, CIMA Universidad de Navarra

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono powtarzalną metodę generowania 3D tkanek mięśnia sercowego, łączących rusztowania polikaprolaktonu (PCL) i hydrożele fibrynowe pochodzące z hiPSC. Technika ta zapewnia precyzyjną kontrolę nad architekturą rusztowania i może być stosowana w przedklinicznych testach leków i modelowaniu chorób serca.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój funkcjonalnych tkanek ludzkiego serca niesie ze sobą duże nadzieje na postęp zastosowań w badaniach przesiewowych leków, modelowaniu chorób i medycynie regeneracyjnej. Protokół ten opisuje stopniowe wytwarzanie tkanek mięśnia sercowego 3D z zaawansowaną mimikrą natywnej struktury serca poprzez połączenie rusztowań polikaprolaktonu (PCL) z roztopionym zapisem elektroprzędzenia (MEW) z hydrożelami fibryny i komórkami serca pochodzącymi z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Proces ten polega na osadzeniu mieszaniny kardiomiocytów (hiPSC-CM) i fibroblastów serca (hiPSC-CFs) w matrycy fibrynowej w celu stworzenia mini-tkanek, ze wsparciem strukturalnym zapewnianym przez rusztowania generowane przez MEW. Te rusztowania fibrylarne są wytwarzane w skali od mikro do nanoskali, co pozwala na precyzyjną kontrolę nad architekturą włókien, która odgrywa kluczową rolę w organizowaniu dystrybucji i wyrównania komórek. Tymczasem macierz fibrynowa wspomaga żywotność komórek i naśladuje środowisko zewnątrzkomórkowe. Charakterystyka wygenerowanych tkanek ujawnia dobrze zorganizowane sarkomery w obrębie hiPSC-CM, wraz ze stabilną aktywnością skurczową. Tkanki wykazują konsekwentne spontaniczne bicie już dwa dni po wysiewie, z utrzymującą się funkcjonalnością w czasie. Połączenie hiPSC-CF z hiPSC-CM zwiększa integralność strukturalną tkanek, jednocześnie wspierając długoterminową żywotność komórek. Podejście to oferuje powtarzalną, adaptowalną i skalowalną metodę tworzenia biomimetycznych modeli tkanek serca, zapewniając wszechstronną platformę do przedklinicznych testów leków, mechanistycznych badań chorób serca i potencjalnych terapii regeneracyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja funkcjonalnych tkanek ludzkiego serca jest bardzo obiecująca dla zastosowań o dużym wpływie. Obejmują one rozwój modelowania kardiotoksyczności leków i chorób serca u ludzi oraz generowanie tkanek terapeutycznych o odpowiednich rozmiarach1. Chociaż w ciągu ostatnich 15 lat byliśmy świadkami znacznego postępu w tej dziedzinie, wytwarzanie wysoce mimetycznego ludzkiego mięśnia sercowego jest obecnie udaremniane przez trudności w odtworzeniu złożonej struktury i mechanicznej organizacji jego naturalnego odpowiednika2.

Z biologicznego punktu widzenia, rewolucyjna technologia przeprogramowania komórek otworzyła możliwość rozwoju komórek terapeutycznych dostosowanych do potrzeb pacjenta. Obecnie ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są jedynym źródłem ludzkich kardiomiocytów w spersonalizowanym kontekście. Wysoką wydajność kardiomiocytów można uzyskać dzięki solidnym protokołom różnicowania3,4. Kluczową kwestią jest stopień dojrzałości, ponieważ obecnie stosowane ludzkie kardiomiocyty pochodzące z hiPSC (hiPSC-CM) wykazują niedojrzały fenotyp w konwencjonalnych warunkach różnicowania 2D5. Jest to związane z faktem, że organizacja strukturalna tkanki serca jest bardzo złożona, absolutnie różna od konwencjonalnych kultur 2D. Ponadto mięsień sercowy składa się z różnych komórek sercowo-naczyniowych, w tym nie-miocytów, takich jak fibroblasty serca, mięśnie gładkie i komórki śródbłonka, uporządkowanych w określonej strukturze 3D, co umożliwia wydajne pompowanie krwi6,7. W związku z tym do wytworzenia fizjologicznie istotnych tkanek biomimetycznych potrzebne są wysoce ustrukturyzowane mini tkanki ludzkiego serca złożone ze wszystkich głównych typów komórek.

Zastosowanie nowatorskich metod biofabrykacji może przełamać ten impas. Wśród nich jest topione pisanie elektroprzędzeniem (MEW), zaawansowana technologia druku 3D, która jest w stanie zapewnić wysoką precyzję i rozdzielczość. W MEW pole elektryczne jest wykorzystywane do osadzania stopionego polimeru w postaci włókien w zakresie wielkości komórki, o rząd wielkości mniejszym niż konwencjonalne modelowanie osadzania topionego (FDM) drukowanie 3D, co skutkuje wysoce zdefiniowanymi strukturami rusztowań8,9. Wykazano, że MEW jest w stanie przekształcić złożony projekt in silico w drukowaną matrycę i dostroić właściwości fizyczne w 3D, aby pasowały do właściwości tkanki serca10. Korzystając z technologii MEW, możliwe jest drukowanie siatek polimerowych o różnych kształtach i strukturach, które w połączeniu z przyjaznymi dla miękkich komórek hydrożelami generują tkanki kompozytowe naśladujące mikro- i makromechaniczne środowisko rodzimego dorosłego mięśnia sercowego11,12. Wykazano, że modyfikacja projektu rusztowania MEW 3D zmienia wynikową funkcjonalność (stany przejściowe wapnia)10, ustanawiając podstawy do zrozumienia relacji forma-funkcja w tym obiecującym systemie zaprojektowanym przez 3D.

Tutaj podano szczegółowy protokół wytwarzania kurczliwych ludzkich mini tkanek serca z hiPSC-CM i ludzkich fibroblastów serca pochodzących z iPSC (hiPSC-CFs) oraz ich kombinacji w hydrożelu fibrynowym wzmocnionym strukturami wydrukowanymi w 3D MEW. Dodatek fibroblastów był szeroko stosowany w różnych systemach inżynierii 3D w celu zwiększenia przeżywalności hiPSC-CM i utrzymania struktury tkanki, ale jego zastosowanie w systemach 3D-MEW nie zostało jeszcze zbadane13. Opisana tutaj technologia stanowi wszechstronną platformę dla badaczy dążących do opracowania dokładnych modeli tkanek serca z zastosowaniami takimi jak zrozumienie mechanizmów choroby, toksykologia przedkliniczna i badania przesiewowe leków. Model ten nadaje się do oceny kardiotoksyczności uznanych leków, takich jak antracykliny (np. doksorubicyna), inhibitory kinazy tyrozynowej i nowe terapie, takie jak limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym T (CAR-T), które są związane z dysfunkcją serca14. Co więcej, model ma znaczny potencjał w rozwoju medycyny regeneracyjnej, umożliwiając testowanie biomateriałów, biotuszy i terapii komórkowych mających na celu poprawę funkcji serca i odbudowę tkanki mięśnia sercowego w stanach takich jak zawał mięśnia sercowego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczegóły dotyczące odczynników i sprzętu użytego w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Konfiguracja pożywek i odczynników

  1. Powlekanie wstępne płytek do hodowli komórkowych
    1. Przygotuj porcje zapasów Matrigel Growth Factor Reduced (MGFr). Jedną fiolkę MGFr rozmrozić przez noc w lodówce na lodzie. W sterylnym kapturze, używając chłodzonych końcówek i trzymając bulion i probówki na lodzie przez cały czas, przygotuj porcje o odpowiedniej objętości, rozcieńczając bulion 1:1 w zimnej L-glutaminie RPMI 1640 (RPMI).
      UWAGA: Do hodowli hiPSC i wysiewu kardiomiocytów hiPSC (hiPSC-CM) stosuje się różne rozcieńczenia MGFr. Rozcieńczenie powłoki MGFr dla hiPSC różni się w zależności od konkretnej linii komórkowej. Jednak po osiągnięciu stadium kardiomiocytów stosuje się rozcieńczenie 1:80 niezależnie od linii komórkowej.
    2. W przypadku powlekania płytek do hodowli komórkowych należy powoli rozmrozić wymaganą liczbę podwielokrotności MGFr na lodzie i dalej rozcieńczyć je w zimnym RPMI, 1:180 w przypadku hodowli hiPSC (100 μl MGFr w 9 ml RPMI) i 1:80 w przypadku ponownego powlekania hiPSC-CM (100 μl MGFr w 4 ml RPMI).
      1. Natychmiast dodać rozcieńczony MGFr w objętości 1 ml na studzienkę w przypadku płytek 6-dołkowych (utrzymanie hiPSC) i 0,5 ml na dołek w przypadku płytek 12-dołkowych (ponowne powlekanie hiPSC-CM). Przed użyciem należy przechowywać płytki w temperaturze 4 °C (do 1 tygodnia).
        UWAGA: Płytki pokryte MGFr należy podgrzewać w temperaturze 37 °C przez 30 minut przed wysiewem komórek. Przed posianiem komórek należy odessać płyn z płytki pokrytej MGFr.
    3. W przypadku hodowli hiPSC-CFs, kolby T75 lub T175 należy pokryć 0,1% żelatyną przez co najmniej 15 minut w temperaturze pokojowej (RT) przed użyciem, w objętości 5 ml dla T75 lub 10 ml dla kolb T175. Po inkubacji odessać płyn przed wysiewem komórek.
  2. Pożywki do hodowli komórkowych
    1. Do hodowli hiPSC należy użyć pożywki Complete Essential 8 Medium (pożywki E8), dodając suplement Essential 8 (50x) do pożywki Essential 8 Basal Podłoże.
    2. Do różnicowania kardiomiocytów przygotuj:
      1. RPMI/B27 bez insuliny (pożywka -INS): Wymieszaj 500 ml RPMI i 10 ml witaminy B27 bez suplementu insuliny; RPMI/B27 (pożywka B27): Wymieszaj 500 ml RPMI i 10 ml suplementu B27.
    3. W celu oczyszczenia kardiomiocytów (pożywka mleczanowa) dodaj 2 ml 1 M mleczanu do 500 ml bezglukozowego RPMI 1640. Pożywka może być przechowywana w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.
    4. Do ponownego posiewu kardiomiocytów (Replating Medium) należy uzupełnić pożywkę B27 o 10% zamiennik surowicy nokautującej (KSR) i 10 μM Y27,
      UWAGA: KSR to zdefiniowany, wolny od surowicy preparat, który zastępuje FBS w protokołach hodowli ESC i iPSC.
    5. W celu różnicowania i utrzymania fibroblastów (od 11. dnia) należy przygotować kompletną pożywkę Fibroblast Growth Medium 3 (FGM3) zgodnie ze specyfikacją producenta. Dodaj opakowanie suplementów (0,1 ml/ml płodowej surowicy cielęcej, 5 μg/ml rekombinowanej insuliny ludzkiej i 1 ng/ml ludzkiego zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów, FGF2) do podłoża podstawowego FGM3.
      UWAGA: Aby pobudzić proliferację fibroblastów, zaleca się zwiększenie stężenia FGF2 do 10 ng / ml.
    6. Do generowania i konserwacji tkanki serca 3D należy przygotować:
      1. Pożywka do wytwarzania tkanek: Pożywka suplementująca B27 z 1% penicyliną/streptomycyną (P / S), 10% KSR i 10 μM Y27. Pożywka do konserwacji tkanek: Przygotuj pożywkę B27 z 1% P/S i aprotyniną (0,1% (wag./obj.); 33 μg/mL).
        UWAGA: Aprotynina umożliwia integralność żelu fibrynowego podczas pobytu w hodowli, zapobiegając jego degradacji i utrzymując komórki w hydrożelu. Dlatego zdecydowanie zaleca się, aby dodać go do pożywki w tym samym dniu, w którym wytwarzana jest tkanka.
  3. Roztwory podstawowe dla małych cząsteczek i czynników wzrostu
    1. CHIR-99021 (CHIR): Dla inhibitora GSK3 i aktywatora sygnalizacji Wnt przygotuj roztwór podstawowy 10 mM, rozpuszczając go w DMSO. Porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C do 6 miesięcy.
      UWAGA: Linie hiPSC mogą inaczej reagować na leczenie CHIR. Może być wymagana optymalizacja stężenia CHIR. Zalecane jest badanie CHIR 6-10 μM.
    2. C59, inhibitor Wnt: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM, rozpuszczając go w DMSO. Porcje należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
    3. Y-27632, inhibitor ROCK (Y27): Przygotuj zapas o pojemności 10 mM, rozpuszczając go w DMSO. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca. Końcowe stężenie zależy od docelowego typu komórki. Użyj 2 μM (1/5000) dla hiPSC i 10 μM (1/1000) dla hiPSC-CM, hiPSC-CFs i generowania tkanek.
      UWAGA: Y27 wspomaga przeżycie komórek poprzez tłumienie śmierci komórki w zawiesinie podczas odłączania. Używaj go podczas zbioru, aby uniknąć nadmiernej śmierci komórek.
    4. Kwas retinowy: Przygotuj 30 mM roztwór podstawowy, rozpuszczając go w chloroformie. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat.
    5. FGF2 (Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów, również FGF-b, wspomaga proliferację fibroblastów): Przygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 50 μg/ml, rozpuszczając go w sterylnej wodzie. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
    6. SB431542 (SB), inhibitor sygnalizacji TGFß1: Przygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM, rozpuszczając go w DMSO. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Dodaj go do pożywki fibroblastowej, aby utrzymać stan mukowiscydozy i zapobiec przejściu miofibroblastów (patologiczny fenotyp powstający podczas zwłóknienia) w hodowli 2D.
  4. Roztwory podstawowe do hydrożelu fibrynowego
    1. Fibrynogen: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 200 mg/ml. Najpierw zmiel grudki fibrynogenu na drobny proszek za pomocą sterylnych narzędzi wewnątrz kaptura komórkowego. Dodać ciepły roztwór NaCl o stężeniu 0,9% (wag./obj.) i utrzymywać w temperaturze 37 °C aż do całkowitego rozpuszczenia. Przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C przez okres do roku; w temperaturze 4 °C przez 1 tydzień.
      UWAGA: Ze względu na jego lepkość w temperaturze 4 °C, należy go rozmrozić i przechowywać w temperaturze pokojowej przez jakiś czas przed etapem tworzenia tkanki, aby można go było dokładnie odpipetować. Jeśli podwielokrotność porcji nie może być łatwo odpipetowana przy ponownym użyciu, zaleca się wyrzucenie jej i użycie nowej.
    2. Trombina: Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 100 j./ml, rozpuszczając trombinę w sterylnych 60% PBS + 40% wodzie. Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do roku w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
      UWAGA: Przed użyciem należy go rozmrozić i przechowywać na lodzie do momentu zakończenia etapu generowania tkanki.
    3. Aprotynina: Przygotuj roztwór podstawowy o stężeniu 33 mg/ml, rozpuszczając aprotyninę w sterylnej wodzie (100 mg proszku w 3,04 ml wody). Podwielokrotności należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do roku.
  5. Rozwiązania do analizy
    1. Bufor FACS (cytometria komórkowa): Przygotować roztwór PBS (wolny od Mg2+ i Ca2+) plus 2,5 mM EDTA i 5% (v / v) FBS.

2. Kultura i przejście iPSC człowieka

UWAGA: Procedury opisane tutaj zostały przeprowadzone na kilku liniach hiPSC, w tym UCSFi001-A (męska, uprzejmy dar profesora Bruce'a Conklina, David J. Gladstone Institutes), ESi044-A (męska), ESi007-A (żeńska) i ESi044-C (żeńska) zdrowe linie oraz ESi107-A (żeńska linia chora z amyloidozą serca) z niewielkimi adaptacjami dotyczącymi pożywki hodowlanej hiPSC, rozcieńczenia pasażowego i stężenia CHIR. Protokół zawiera szczegółowe informacje dotyczące korzystania z UCSFi001-A. Wszystkie inkubacje hodowli komórkowych w tym protokole przeprowadza się w warunkach 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 96%.

  1. Linia do hodowli hiPSC na wstępnie powlekanych płytkach 6-dołkowych 1:180 MGFr. Utrzymuj je na pożywce E8, aby zapewnić pluripotencję.
    UWAGA: Aby zapobiec spontanicznemu różnicowaniu, ważne jest, aby unikać nadmiernego wzrostu kultur. Dlatego należy wykonać pasaż hiPSC, gdy komórki są zlewające się w 80%-90%.
  2. W celu pasażu komórkowego odessać starą pożywkę, przemyć studzienki dwukrotnie 1 ml 0,5 mM roztworu EDTA rozcieńczonego w PBS (wolne od Mg2 + i Ca2 +) na dołek i inkubować przez 7 minut w EDTA/PBS w temperaturze pokojowej w celu przerwania zrostów międzykomórkowych.
  3. Odessać EDTA/PBS i zebrać komórki, odłączając je przez energiczne pipetowanie za pomocą mikropipety 1000 μl z 1 ml pożywki E8 po powierzchni studzienki, aż do oderwania komórek. Zbierz je do sterylnej probówki wirówkowej.
    UWAGA: Należy unikać pipetowania więcej niż 10-15 razy, ponieważ zwiększa to liczbę zgonów z powodu hiPSC.
  4. Z tej objętości wykonać rozcieńczenia w stosunku 1:15-1:20 i wysiać komórki na 6-dołkowych płytkach pokrytych MGF w pożywce E8 + 2 μM Y27. Utrzymuj Y27 tylko przez pierwsze 24 godziny po wysiewie, aby uniknąć toksyczności spowodowanej nadmierną ekspozycją.
    UWAGA: Dostosuj współczynnik podziału dla innych linii hiPSC, aby utrzymać komórki niezróżnicowane i w zdrowej morfologii przez 4-5 dni.
  5. Po 24 godzinach odessać starą pożywkę i dodać świeżą pożywkę E8 o temperaturze pokojowej wystarczającą na dwa dni (zwykle 3-4 ml). Następnie zmieniaj podłoże codziennie przez 3-4 dni.
    UWAGA: Częstotliwość pasażu zależy od każdej linii komórkowej; Unikaj osiągnięcia 100% konfluencji. hiPSC powinny rosnąć w dużych, płaskich i zwartych koloniach o wielokątnej geometrii, wygładzonych krawędziach i wysokim stosunku jądra do cytoplazmy.

3. Różnicowanie ludzkich kardiomiocytów

UWAGA: Dla generowania kardiomiocytów z hiPSC (hiPSC-CMs), opisany protokół opiera się na metodologii różnicowania monowarstwowego stosowanej przez Lian et al.3,15 i Burridge et al.4. Przy odpowiedniej konserwacji hiPSC można różnicować na 30 kolejnych przejściach z wysoką wydajnością różnicowania. Oznaki nieprawidłowego zachowania są wykrywane przez spontaniczne różnicowanie lub następujące po sobie niepowodzenie więcej niż 4 różnicowań. Zaleca się regularne kontrole, w tym badania na obecność mykoplazmy.

  1. Aby zainicjować różnicowanie serca, należy zebrać hiPSC przy zbieganiu 80%-90%, jak opisano w powyższym kroku przejścia komórkowego (krok 2). Komórki nasienne w 12-dołkowych płytkach pokrytych 1:180 MGFr, dostosowując rozcieńczenia podzielone, aby uzyskać zwarte monowarstwy komórek przy 90% zbiegu po 48-72 godzinach wysiewu. W przypadku tej linii komórkowej należy rozcieńczyć w stosunku 1:10, a komórki osiągną konfluencję po 72 godzinach. Zmieniaj pożywkę E8 codziennie.
    UWAGA: w tym protokole rozcieńczenia zostały dostosowane objętościowo, a nie według liczby komórek, aby uniknąć zmienności zależnej od użytkownika. Jeśli stan jednowarstwowy nie zostanie osiągnięty w ciągu 72 godzin po posiewaniu, istnieje duże prawdopodobieństwo, że proces różnicowania nie powiedzie się. W takim przypadku zaleca się odrzucenie próby i ponowne uruchomienie, zapewniając optymalną wydajność przejścia.
  2. Kiedy monowarstwy są ustabilizowane, rozpoczyna się proces różnicowania, uważany odtąd za dzień 0. Następnie zmień pożywkę na pożywkę -INS uzupełnioną 8 μM CHIR, aktywatorem sygnalizacji Wnt, i inkubuj płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (1 ml na studzienkę).
    UWAGA: Miareczkować stężenie CHIR w zakresie 6-12 μM dla każdej linii iPSC w celu wydajnej indukcji mezodermy. Na tym etapie oczekuje się wysokiego poziomu śmierci komórki, co jest oznaką optymalnego procesu.
  3. Dzień 1: Następnego dnia odessać pożywkę z każdej studzienki i umyć komórki RPMI bez suplementów (0,5 ml na studzienkę). Następnie dodaj 1,5 ml świeżej pożywki -INS i inkubuj komórki przez 2 dni.
    UWAGA: Etapy mycia są wykonywane podczas wszystkich zmian mediów w celu usunięcia zanieczyszczeń, martwych komórek i pozostałości suplementów.
  4. Dzień 3: Aby uzyskać specyfikację linii sercowej, zastąp pożywkę 1,5 ml pożywki -INS uzupełnionej 5 μM inhibitora Wnt C59 przez 48 godzin
    UWAGA: Tutaj powstaje kompleks GSK3, a ß-katenina ulega degradacji, co prowadzi do linii mezodermalnej serca. Po tym kroku można również zaobserwować pewną śmierć komórki.
  5. Dzień 5: Przemyj i zastąp świeżą pożywką -INS przez 48 godzin w objętości 1,5 ml na studzienkę, aby pobudzić ekspansję komórek progenitorowych serca.
  6. Dzień 7: Od tego dnia komórki są utrzymywane w pożywce B27, z wymianą pożywki co 2-3 dni.
    UWAGA: Dostosuj ilość pożywki do 2.5 ml na studzienkę, aby pominąć zmianę pożywki w weekend, ale tylko wtedy, gdy ten stan zostanie osiągnięty. Zwykle hiPSC-CM zaczynają spontanicznie bić w 7-9 dniu. Po pierwsze, kurczenie się będzie obserwowane jako izolowane i nieskoordynowane skupiska, ale w ciągu kilku dni kultury o wysokiej czystości powinny utworzyć jednolitą monowarstwę do bicia.
  7. Po uzyskaniu, te kurczliwe monowarstwy (zwykle w 10 dniu) są poddawane procesowi selekcji metabolicznej składającemu się z 2 cykli po 72 godziny w pożywce mleczanowej oddzielonych etapem posiewu w celu wyeliminowania komórek nienależących do kardiomiocytów i wzbogacenia czystości hodowli.
  8. Dzień 10, pierwszy etap oczyszczania (1mleczan): Umyj ubijające się komórki pożywką mleczanową (0,5 ml na studzienkę) i inkubuj je z 1 ml na studzienkę pożywki mleczanowej przez 72 godziny
    UWAGA: Etap płukania należy wykonać za pomocą pożywki mleczanowej lub podstawowego pożywki bezglukozowej RPMI 1640, aby całkowicie usunąć wszelkie ślady poprzedniej pożywki glukozowej (B27).
  9. Dzień 13: Umyj i pozwól komórkom zregenerować się po pierwszej rundzie oczyszczania za pomocą 1,5 ml pożywki B27 na studzienkę przez 2 dni.
  10. Dzień 15 (etap ponownego powlekania): Pomiędzy dwoma cyklami oczyszczania rozdzielić monowarstwy przez mycie EDTA/PBS i inkubację z TrypLE przez 10 minut w temperaturze 37 °C (0,5 ml na studzienkę).
    UWAGA: Czas inkubacji zależy od każdej linii komórkowej.
  11. Odłączyć komórki za pomocą mikropipety 1000 μl i odzyskać je za pomocą 0,5 ml na studzienkę pożywki B27 uzupełnionej 10% KSR (v/v) w sterylnej probówce wirówkowej.
    UWAGA: Kardiomiocyty są wrażliwe na naprężenia ścinające i silne pipetowanie, dlatego należy unikać powtarzania etapów pipetowania. Innymi opcjami dysocjacji hiPSC-CM o niższych uszkodzeniach może być użycie TrypLE 10x lub kolagenazy z DNazą. Zoptymalizuj czas inkubacji, aby upewnić się, że jest on wystarczający do oderwania komórek bez powodowania ich uszkodzenia lub konieczności nadmiernego pipetowania, co mogłoby zagrozić integralności komórek.
  12. Odwirować przez 10 minut przy 100 x g w temperaturze pokojowej i ponownie uformować je w 12-dołkowych płytkach pokrytych MGFr w skali 1:80 z pożywką do ponownego napełniania. Wysiewaj je w 1 ml na studzienkę.
    UWAGA: Spowoduje to usunięcie nadmiaru martwych komórek i macierzy zdeponowanych podczas różnicowania, ponieważ mogą one później mieć negatywny wpływ na wytwarzanie tkanek.
  13. Dzień 16: Po 24 godzinach ponownego powlekania usuń Y27 i KSR i trzymaj komórki w pożywce B27 przed kolejnym etapem oczyszczania (zwykle 48-72 h).
  14. Dzień 18: Drugi etap oczyszczania (2mleczan). Podobnie jak w pierwszym cyklu, przemyć i inkubować komórki z pożywką mleczanową przez 72 godziny (1 ml na studzienkę).
    UWAGA: Cykle oczyszczania mogą zwiększyć czystość hodowli nawet o 30%, co zaobserwowano na podstawie analizy cytometrii przepływowej markera kardiomiocytów cTNT (troponina sercowa T) (nie pokazano). Proces ten przede wszystkim redukuje fibroblasty i pozostałe zanieczyszczenie hiPSC. Chociaż minimalny dopuszczalny poziom czystości wymagany do kontynuowania wytwarzania tkanek bez uszczerbku dla wydajności nie został określony, zaleca się stosowanie kultur o czystości co najmniej 85%-90%. Ten poziom czystości wspomaga lepsze przyczepianie kardiomiocytów, zwiększa wytrzymałość skurczową końcowej tkanki i wspiera odtwarzalność między eksperymentami.
  15. Dzień 21: Po zakończeniu oczyszczania mleczanu utrzymuj oczyszczone kardiomiocyty w pożywce B27 do czasu ich użycia, z częstymi zmianami pożywki (co 2-3 dni).
    UWAGA: Opóźnienie w użyciu zmniejszy wydajność ogniw, ponieważ będą one trudniejsze do odłączenia. Dlatego zaleca się stosowanie ich między dniem, w którym kończy się drugie oczyszczanie mleczanu, a mniej niż dodatkowym tygodniem.

4. Różnicowanie fibroblastów serca u człowieka

UWAGA: Aby uzyskać ludzkie fibroblasty serca (hiPSC-CFs) z hiPSC, poniższy protokół jest oparty na dwufazowej metodologii używanej przez Zhang et al.16. Pierwszym krokiem jest uzyskanie komórek nasierdzia (hiPSC-EpiC) poprzez reaktywację szlaku sygnałowego Wnt po indukcji mezodermy kardiogennej. Następnie hiPSC-EpiC są poddawane działaniu inhibitorów rozwoju naczyń krwionośnych i FGF2 w celu uzyskania fibroblastów serca w ciągu 18 dni.

  1. Zapewnić utrzymanie, zbiór i gęstość wysiewu hiPSC zgodnie z opisem w protokole różnicowania hiPSC-CMs. Hodowla hiPSC na 12-dołkowych płytkach pokrytych MGFr w skali 1:180, aby rozpocząć różnicowanie.
  2. Po uzyskaniu zwartych monowarstw hiPSC (dzień 0), dodaj pożywkę -INS uzupełnioną 5 μM CHIR (1,5 ml na studzienkę) przez 48 godzin
    UWAGA: Miareczkować stężenie CHIR dla każdej linii hiPSC w celu efektywnej indukcji mezodermy.
  3. Dzień 2: Odessać i wyrzucić pożywkę, umyć komórki RPMI i zastąpić ją 1,5 ml świeżej pożywki -INS na 24 godziny
    UWAGA: Podobnie jak w protokole hiPSC-CMs, płucz komórki podczas każdej zmiany pożywki; W zależności od każdego etapu należy użyć odpowiedniego nieuzupełnionego podłoża podstawowego.
  4. Dzień 3: Inkubować komórki z pożywką -INS zawierającą 5 μM C59 (inhibitor Wnt) przez 48 godzin (1,5 ml na dołek).
  5. Dzień 5: W celu ponownego posiewu komórek mezodermalnych serca należy odłączyć komórki, przemywając je EDTA/PBS i inkubując z TrypLE przez 5 minut w temperaturze 37 °C (0,5 ml na dołek). Zebrać komórki w 0,5 ml na studzienkę pożywki podstawowej Advance DMEM (ADMEM) i wirować przez 5 minut przy 300 x g przy wilgotności względnej.
  6. Wysiewaj je na wstępnie powlekanych 12-dołkowych płytkach 1:180 MGFr (1 ml na dołek) o gęstości 20 000 komórek/cm2. Do ponownego powlekania należy użyć ADMEM uzupełnionego 5 μM CHIR, 2 μM kwasu retinowego, 10% KSR (v/v) i 10 μM Y27.
  7. Dzień 6: Po 24 godzinach od ponownego poszycia odświeżyć podłoże, aby usunąć Y27 i zmniejszyć KSR do 2%. Utrzymuj te same stężenia CHIR i kwasu retinowego przez kolejne 48 godzin, aby osiągnąć rozwój fenotypu nasierdziowego.
  8. Dzień 8: Hodowla komórek z uzupełnioną ADMEM plus 2% KSR przez 72 godziny w celu promowania wytwarzania monowarstw nasierdzia.
    UWAGA: hiPSC-EpiC wydają się być płaskimi lub sześciennymi dużymi komórkami zgrupowanymi w pojedyncze kolonie. W tym momencie, podczas wykonywania pierwszych rund różnicowania, typowe markery komórek nasierdzia, takie jak WT1 (antygen jądrowy), ZO1 (antygen błony cytoplazmatycznej) i TCF21 (antygen cytoplazmatyczny) można analizować za pomocą FACS (cytometria komórek przepływowych) lub IF (barwienie immunofluorescencyjne) (nie pokazano).
  9. Dzień 11: W celu ponownego posiewu komórek nasierdzia należy dysocjować płukanie hiPSC-EpiC za pomocą EDTA/PBS i inkubować z TrypLE przez 5 minut w temperaturze 37 °C (0,5 ml na studzienkę). Zebrać komórki w pożywce FGM3 (0,5 ml na studzienkę) i wirować przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze pokojowej.
  10. Ponownie umieść hiPSC-EpiC na 0,1% pokrytych żelatyną 12-dołkowych płytkach o gęstości komórek 10 000 komórek/cm2. Użyj pożywki FGM3 uzupełnionej 10 μM SB (inhibitor sygnalizacji TGFß1 w celu uniknięcia przejścia miofibroblastów, zwykle podczas hodowli na plastiku) i 10 μM Y27 (tylko przez pierwsze 24 godziny).
  11. Następnego dnia należy odświeżać pożywkę fibroblastową (FGM3 + 10 μM SB) co 2 dni, aż do uzyskania hiPSC-CFs, co daje w sumie około 18 dni na cały proces.
    UWAGA: hiPSC-CF powinny mieć morfologię wrzecionowatą. W tym przypadku ekspresja markera fibroblastów DDR2 powinna być analizowana za pomocą technik FACS i IF (patrz kroki 7.1-7.2).
  12. Po zlewaniu się hodowli hiPSC-CFs należy wykonać pasaże komórkowe w stosunku 1:3 w kolbach T75 lub T175 pokrytych żelatyną. Komórki osiągają 90% zbieżności w ciągu około 4-6 dni. Aby odłączyć hiPSC-CFs, należy użyć protokołu zbierania TrypLE opisanego dla ponownego powlekania hiPSC-EpiC; tutaj Y27 nie jest wymagany do przejścia.
  13. Utrzymuj hiPSC-CF w pożywce FGM3 + 10 μM SB do czasu ich użycia lub zamroź je przy niskim pasażu przy gęstości komórek 1-3 milionów komórek na krioprobówkę.
    UWAGA: Zaleca się utrzymanie hiPSC-CF przez maksymalnie 6 pasaży przed rozmrożeniem nowych komórek, ponieważ podczas długotrwałej hodowli w plastikowych kolbach komórki zaczynają różnicować się w bardziej kurczliwy fenotyp miofibroblastów.

5. Produkcja rusztowań do pisania elektroprzędzalnego (MEW)

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje homopolimer poli ε-kaprolaktonu (PCL) klasy medycznej do drukowania rusztowań fibrylarnych, używając drukarki MEW specjalnie zaprojektowanej do tego celu przez QUT, Queensland University of Technology10.

  1. Przygotuj materiał polimerowy PCL do druku. Granulki PCL należy umieścić w plastikowej strzykawce Luer-lock o pojemności 3 ml przymocowanej do igły o pojemności 23 G i roztopić je w temperaturze 80 °C przez 2 godziny w piekarniku, delikatnie naciskając tłok w celu usunięcia pęcherzyków podczas topienia polimeru. Przygotować kilka strzykawek i przechowywać je w temperaturze pokojowej, ponieważ PCL szybko się zestala.
  2. W dniu drukowania wprowadzić strzykawkę do komory grzewczej i podłączyć ją do przewodu zasilającego N2 pod ciśnieniem. Włącz sprzęt MEW, ustaw regulatory temperatury na 80/65 °C (komora/dysza) i przytrzymaj strzykawkę przez 30 minut, aby zapewnić prawidłowe stopienie polimeru.
  3. Pod strzykawką znajduje się płytka kolektora, zmotoryzowana i ruchoma w kierunkach XY za pomocą kompatybilnego oprogramowania (Mach3). Przesuń płytę kolektora (sterowanie kursorami komputerowymi), aż głowica drukująca zostanie umieszczona na jednej krawędzi płyty lub w dowolnym żądanym miejscu, a następnie ręcznie wyreguluj odległość między komorą grzewczą a płytą kolektora (odległość kolektora) do 10 mm (płaszczyzna Z).
    UWAGA: Odległość ta musi zostać przetestowana doświadczalnie, aby uzyskać daną średnicę włókna. Im krótsza odległość kolektora, tym grubsze włókno i na odwrót.
  4. Zamknij drzwi urządzenia, które automatycznie łączy się z zasilaniem polem elektrycznym. Ustaw napięcie na 7 kV i ciśnienie N2 na 2 bary, aby mógł wytłaczać się przez końcówkę 23 G podczas drukowania.
    UWAGA: Dostarczając wysokie napięcie, powstaje różnica potencjałów między końcówką strzykawki a płytą kolektora (wykonaną ze stali nierdzewnej). Następnie kropla zgromadzona na dyszy przez dostarczone ciśnienie zostaje naładowana elektrostatycznie, generując stożek Taylora, który kieruje się w stronę płyty kolektora. Napięcie i ciśnienie można dostroić, aby zmodyfikować końcowe wymiary światłowodu. Parametry wysokiego ciśnienia spowodują wytłaczanie grubszych włókien, wymagających zwiększonego napięcia do ustabilizowania włókna. Oprogramowanie opiera się na komputerowym sterowaniu numerycznym (CNC), więc geometrie rusztowania są zapisywane jako kod G i podawane do programu, który steruje ruchem X-Y i prędkością silnika płyty kolektora. Dlatego przed wydrukowaniem ostatecznych rusztowań zaleca się wydrukowanie dowolnego kodu G jako poprzedniego kroku, aby uzyskać stabilny strumień, który buduje zdefiniowane włókna bez zwijania lub biczowania. W tym celu optymalizuj parametry poprzez małe zmiany za każdym razem, tj. 0,1 bara dla ciśnienia powietrza, 0,1 kV dla napięcia i 60-100 mm/min dla prędkości kolektora; zapewni to zachowanie stożka Taylora odrzutowca.
  5. Wybierz zaprojektowany G-code w oprogramowaniu, aby drukować rusztowania o geometrii kwadratowego wzoru. Ten przykładowy kod G drukuje 15-warstwowe kwadratowe siatki o wymiarach 6 cm x 6 cm z kwadratowymi porami o wymiarach 0,5 mm x 0,5 mm.
  6. Aby drukować precyzyjnie osadzone włókna (tj. nakładające się włókna), ustaw prędkość kolektora na 1080 mm/min.
    UWAGA: Dostosuj parametry napięcia, ciśnienia, prędkości kolektora i odległości kolektora na każdym urządzeniu MEW, aby zdefiniować dokładne średnice włókien (μm). Poza wpływem wcześniej wymienionych parametrów, zwiększenie prędkości kolektora skutkuje cieńszymi włóknami, natomiast zmniejszenie go powoduje powstanie grubszych włókien. Ustawienia parametrów w tym protokole umożliwiają drukowanie włókien o średnicach 10-15 mikronów.
  7. Naciśnij przycisk START w oprogramowaniu, aby rozpocząć drukowanie. Ostrożnie zdejmij rusztowanie z kolektora po zakończeniu drukowania.
    UWAGA: Dla łatwiejszego przenoszenia rusztowania po wydrukowaniu zaleca się wydrukowanie go na kawałku szkła większym niż rusztowanie, przymocowanym do podstawy kolektora za pomocą taśmy klejącej.
  8. Przetnij wydrukowaną siatkę za pomocą stempla o średnicy 6 mm, aby uzyskać ostateczne rusztowania do produkcji tkanek.
  9. Ponieważ siatki PCL są wysoce hydrofobowe, należy je traktować przez 5 minut plazmąO2/argon, aby zwiększyć ich hydrofilowość i promować interakcję z fibryną i komórkami.
    UWAGA: Opcjonalnie działa również obróbka 0,1 N NaOH przez 15 minut, a następnie intensywne płukanie PBS.
  10. Siatki sterylizować przez zanurzenie w 70% etanolu przez 30 minut, dokładnie umyć sterylną wodą destylowaną przez 30 minut i pozostawić do wyschnięcia.
    UWAGA: Wykonaj ten proces na sterylnej szalce Petriego i wewnątrz sterylnego kaptura. Nie należy całkowicie wysuszać siatek, dopóki nie zostaną użyte, aby uniknąć ich przywierania do płyty i wynikającego z tego odkształcenia.

6. Wytwarzanie i utrzymanie mini tkanki fibryny

UWAGA: Generowanie ludzkich mini tkanek 3D mięśnia sercowego opiera się na enkapsulacji komórek serca pochodzących z hiPSC w hydrożelach fibrynowych w połączeniu z rusztowaniami MEW, które zapewniają wsparcie fibrylarne. Poniższy protokół został zaadaptowany z podejść do projektowania inżynierskiego stosowanych przez Breckwoldt et al.17oraz Ronaldson-Bouchard et al.18.

  1. Odłączyć hiPSC-CM zgodnie z powyższym opisem w kroku ponownego powlekania (3.10-3.11) protokołu różnicowania hiPSC-CMs (zbieranie trypLE). Ponownie zawiesić osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek, aby policzyć komórki w komorze Neubauera.
  2. Odłącz hiPSC-CFs, tak jak w kroku zbierania hiPSC-CM za pomocą TrypLE. Użyj 3 ml TrypLE dla T75, 5 ml dla kolb T175 i tej samej objętości do inaktywacji inkubacji TrypLE. Na koniec ponownie zawieś osad komórkowy w pożywce do wytwarzania tkanek, tak jak w przypadku CM, ponieważ będą one mieszane i hodowane w tym samym podłożu.
  3. Policz komórki w komorze Neubauera. Oblicz dokładną całkowitą liczbę komórek potrzebnych do zasiania wszystkich tkanek.
    UWAGA: Ten protokół wykorzystuje 1 milion komórek na tkankę, składającą się z 80% CM i 20% CF, tj. 800 000 CM i 200 000 CF. Inne ilości, takie jak sumy 1,5 i 3 miliony na tkankę, są również osiągalne w praktyce.
  4. Wymieszaj i opluj potrzebną całkowitą liczbę komórek w nowej probówce (Cell Mix), 5 minut przy 300 x g przy RT. Upewnij się, że granulka jest całkowicie sucha i trzymaj ją na lodzie aż do wysiewu. Obliczyć całkowitą objętość hydrożelu potrzebną do wysiewu wszystkich tkanek.
    UWAGA: Ten protokół wymaga 35 μl na tkankę (dla rusztowania o średnicy 6 mm) do końcowej gęstości bliskiej 30 milionów komórek/ml, ale można ją zwiększyć, jak już wspomniano w kroku 6.4 powyżej. Każdy hydrożel fibrynowy składa się z 6 mg/ml fibrynogenu plus 5 U/ml trombiny wraz z pożywką do wytwarzania tkanek, w której komórki są ponownie zawieszone. W przypadku hydrożelu o objętości 35 μl stosunek fibrynogenu do trombiny wynosi 1,05 μl/1,8 μl. Zaleca się zwiększenie końcowej objętości hydrożelu o 10%, aby uniknąć utraty objętości z powodu błędów w pipetowaniu. Przykład: dla 10 tkanek ponownie zawiesić komórki w 350 μl + 10%, tj. 385 μl jako całkowita objętość końcowa.
  5. Zawiesić mieszaninę komórkową w wymaganej objętości pożywki do wytwarzania tkanek. Dokładnie wymieszaj, unikając tworzenia się pęcherzyków.
    UWAGA: W przypadku 10 tkanek należy ponownie zawiesić 10 milionów komórek (80 CM: 20 CFs) w 374,5 μl pożywki do wytwarzania tkanek (całkowita objętość hydrożeli minus całkowita ilość fibrynogenu wymagana dla wszystkich tkanek, tj. 10,5 μL).
  6. Dodaj wymaganą objętość fibrynogenu i dokładnie wymieszaj. Na 10 tkanek dodaj 10,5 μl fibrynogenu do Cell Mix, tworząc Hydrogel Mix. Zachowaj go na RT.
    UWAGA: Istotne jest, aby unikać nadmiernie powtarzającego się pipetowania, aby siły ścinające nie wpływały na żywotność hiPSC-CM. Zaleca się odcięcie kawałka końcówki pipety za pomocą sterylnego skalpela, a następnie ponowne wymieszanie z nim mieszanki hydrożelowej w celu zmniejszenia uszkodzeń spowodowanych ścinaniem.
  7. Aby uniknąć przylegania fibryny do płytki, wymieszaj hydrożel nasion na powierzchni z politetrafluoroetylenu (PTFE). Odpipetować połowę objętości tkanki (17,5 μl), która pozostanie w postaci kropli, i zrobić to dla całkowitej liczby tkanek.
    UWAGA: Nie rób więcej niż 10 chusteczek na raz, ponieważ mogą wyschnąć.
  8. Umieść rusztowanie PCL na każdej kropli i dodaj pozostałą objętość (17,5 μl). Upewnij się, że rusztowanie jest całkowicie zanurzone.
    UWAGA: Należy być przygotowanym do pipetowania obiema rękami, ponieważ reakcja jest bardzo szybka. Jedna tkanka na raz.
  9. Dodać wymaganą ilość trombiny (1,8 μl) ręką niedominującą i szybko wymieszać hydrożel z ręką dominującą (pipetując co najmniej 2-3 razy).
    UWAGA: Zaleca się mieszanie pipetując mniejsza objętość całkowita, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków (30 μl). Jeśli utworzy się pęcherzyk powietrza, nakłuj go szybko igłą.
  10. Powtórz poprzedni krok dla każdej tkanki.
    UWAGA: Zaleca się ćwiczenie tej techniki bez komórek, dopóki nie zostanie zapewniona dobra obsługa.
  11. Inkubować tkanki w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę, aby zakończyć polimeryzację fibryny.
  12. Delikatnie podnieś każdą tkankę za krawędź sterylną pęsetą i umieść ją na 12-dołkowych płytkach z 2 ml na dołek pożywki do generowania tkanek uzupełnionej 33 μg/ml aprotyniny. Umieść jedną chusteczkę w dołku.
    UWAGA: Nie podnoś ich za środek hydrożelu, aby komórki mogły zostać uszkodzone przez siłę mechaniczną. W razie potrzeby użyj szpatułki.
  13. Inkubować tkanki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Bardzo ważne jest utrzymanie aprotyniny w pożywce do hodowli tkankowej od dnia wytworzenia, ponieważ zaobserwowano, że pominięcie aprotyniny w ciągu pierwszych 24 godzin, nawet jeśli zostanie dodana później, prowadzi do częściowego oderwania komórek od siatki i hydrożelu. Zagraża to pełnemu pokryciu komórek niezbędnemu do integralności tkanki końcowej.
  14. Następnego dnia odświeżyć pożywkę za pomocą 2 ml pożywki do konserwacji tkanek, usuwając pozostałości KSR i Y27. Od tego momentu zmieniaj podłoże co drugi dzień.

7. Systematyczna analiza potencjału różnicowania serca hiPSC i funkcji mini tkanek

  1. Analiza metodą cytometrii przepływowej
    UWAGA: Komórki są analizowane przy użyciu metody cytometrii "Sortowanie komórek aktywowanych fluorescencją" (FACS) w celu określenia skuteczności różnicowania hiPSC. Wszystkie kroki wykonywane są w warunkach temperatury pokojowej.
    1. Dysocjuj hodowle komórkowe na zawiesinę jednokomórkową (zbieranie TrypLE), oddzielnie zarówno hiPSC-CM, jak i CF.
    2. Ponownie zawiesić osad przy 250 000 komórek/ml w buforze FACS i dozować co najmniej 1 ml na probówkę. Inkubować przez 30 minut, aby uniknąć nieswoistego wiązania przeciwciał.
    3. Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut i wyrzucić supernatant.
      UWAGA: Wszystkie etapy wirowania są wykonywane w tych warunkach.
    4. Aby wykryć antygeny wewnątrzkomórkowe, utrwal i przepuszczalność błon komórkowych za pomocą zestawu do przepuszczalności komórek. Najpierw inkubować komórki z reaktywnym A (Fix) przez 30 minut i odwirować (jak w kroku 7.1.3).
    5. Następnie inkubuj komórki z reaktywnym B (Perm) i pierwszorzędowym przeciwciałem przez 30 minut. Użyj 100 μl reaktywności na probówkę.
      1. W przypadku hiPSC-CM należy użyć mysiego przeciwciała cTNT (sercowa troponina T, marker CM) w rozcieńczeniu 1/200. W przypadku hiPSC-CF należy użyć mysiego przeciwciała DDR2 (receptor kolagenowy, marker mukowiscydozy) w rozcieńczeniu 1/500.
        UWAGA: Aby zatrzymać wszystkie reakcje, dodaj 1 ml buforu FACS do każdej probówki przed odwirowaniem.
    6. Inkubować przez 15 minut z przeciwciałem drugorzędowym anty-mysim Alexa-Fluor 488 rozcieńczonym 1/100 w buforze FACS.
    7. Przemyć 3 razy PBS, odwirowując między płukaniami (zgodnie z tymi samymi warunkami, co w kroku 7.1.3), a na koniec ponownie zawiesić osad komórkowy w 400 μl PBS. Analizuj w cytometrze lub podobnym urządzeniu.
  2. Analiza barwienia immunofluorescencyjnego (IF)
    1. W przypadku hodowli komórek serca 2D, oba typy komórek należy wysiewać oddzielnie w systemie studzienek 1:80 MGFr lub 0,1% wstępnie pokrytego żelatyną. Płytka około 80 000 komórek/cm2, aby osiągnąć wystarczającą konfluencję komórek do analizy. W przypadku mini chusteczek 3D delikatnie przenieś je pęsetą do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2 ml.
    2. Odrzucić pożywkę komórkową i dwukrotnie przemyć komórki lub tkanki PBS. Utrwalić próbki za pomocą 10% formaliny (v/v) w temperaturze pokojowej; 15 min dla komory szkiełkowej i 1 h dla mini chusteczek.
      UWAGA: Formalina jest niebezpieczna w przypadku wdychania i należy z nią obchodzić się pod wyciągiem.
    3. Odrzucić bufor utrwalający i trzykrotnie przemywać przez 5 minut PBS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w PBS do czasu ich użycia.
    4. Aby przeniknąć przez błonę komórkową, inkubuj komórki z 0,1% Triton X-100 (v/v) przez 10 minut lub tkankami 3D z 1% Tween-20 przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie trzykrotnie umyj 5 minut PBS.
    5. Aby zmniejszyć nieswoiste wiązania przeciwciał, próbki należy traktować 3% (v/v) roztworem albuminy surowicy bydlęcej (BSA) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Przygotować pierwszorzędowe roztwory przeciwciał w PBS plus 1% BSA w celu zablokowania niespecyficznych wiązań i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C.
      1. W przypadku hiPSC-CM 2D należy użyć rozcieńczenia 1/400 mysiego przeciwciała przeciwsercowego α-ACTN (sarkomerycznej aktininy). W przypadku hiPSC-CF 2D należy użyć mysiego przeciwciała anty-DDR2 w rozcieńczeniu 1/500. W przypadku tkanek 3D należy połączyć dwa przeciwciała specyficzne dla CM i CF.
    7. Następnego dnia odessać roztwór przeciwciała i wykonać 3 przemywania PBS w temperaturze pokojowej po 5 minut każde.
    8. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (Alexa-Fluor 488 i Alexa-Fluor 594) w stosunku 1/200 i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT w ciemności, aby zidentyfikować odpowiednio przeciwciała pierwszorzędowe myszy i królika. Powtórz pranie PBS trzy razy.
    9. Aby przeciwdziałać barwieniu jąder, należy inkubować próbki w rozcieńczeniu 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) w stosunku 1/500 przez 20 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Powtórzyć płukanie PBS trzy razy i przechowywać próbki w temperaturze 4 °C w PBS.
    10. Zbadaj próbki za pomocą mikroskopu konfokalnego, uzyskaj obrazy i przetwórz je za pomocą odpowiedniego oprogramowania, takiego jak Fidżi.
    11. W przypadku mini chusteczek 3D należy je ostrożnie przenieść za pomocą PBS między dwoma szklanymi szkiełkami nakrywkowymi, aby umożliwić dobre obrazowanie.
      UWAGA: Zalecany jest obiektyw z 40-krotnym zanurzeniem w oleju lub wyższym, aby uzyskać obrazy Z-stack w wysokiej rozdzielczości.
  3. Analiza żywotności komórek
    UWAGA: Test Alamar Blue (AB) służy do pomiaru aktywności metabolicznej komórek, która jest bezpośrednio związana z żywotnością komórek w mini tkankach serca 3D. Wykonaj cały proces, chroniąc próbki przed światłem i w sterylnych warunkach.
    1. Przygotować 10% (v/v) roztwór AB w pożywce RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (ponieważ może to zakłócać pomiar kolorymetryczny).
    2. Ostrożnie przenieś mini tkanki serca na 48-dołkową płytkę za pomocą sterylnej pęsety. Inkubować konstrukty z 300 μl roztworu AB na tkankę przez 1 godzinę 30 minut (dostosować eksperymentalnie czas) w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Ponieważ komórki redukują resazurynę poprzez działanie enzymów metabolicznych, zostanie wygenerowana zmiana koloru w pożywce hodowlanej, która zostanie zmierzona za pomocą spektrofotometrii przy 570 nm i 600 nm.
    3. Do pomiaru należy pobrać 100 μl na tkankę metabolizowanego roztworu AB na 96-dołkowej płytce i odczytać absorbancję.
      UWAGA: Próbki można hodować po tej analizie, zmieniając pożywkę na pożywkę do konserwacji tkanek.
  4. Analiza skurczu
    UWAGA: Mini tkanki serca zaczynają spontanicznie bić, zwykle 1-2 dni po wytworzeniu tkanki.
    1. Ręcznie zmierz częstotliwość dudnienia, obserwując tkanki pod mikroskopem optycznym (uderzenia/min). Jeśli wiele tkanek jest mierzonych w tym samym czasie, utrzymuj płytki w cieple przed każdym odczytem.
      UWAGA: Wraz ze spadkiem temperatury szybkość dudnienia również zaczyna się zmniejszać.
    2. W celu rozszerzonej oceny kurczliwości serca należy uzyskać filmy z mikroskopii optycznej bijących tkanek. Przy 4x, aby uchwycić większą płaszczyznę lub przy 10x z różnych obszarów tkanki. Nagraj około 30 s na film (co najmniej 3 uderzenia).
    3. Użyj szybkości odświeżania co najmniej 30 klatek/s i zapisz wideo w .AVI formacie.
      UWAGA: W tym przypadku filmy zostały przeanalizowane za pomocą niestandardowego algorytmu śledzenia punktów opracowanego dla MATLAB10. Dzięki tej metodzie dla każdego filmu można uzyskać prędkość skurczu, maksymalne przemieszczenie (amplitudę) skurczu i kierunek skurczu.
    4. Uruchom algorytm bezpośrednio w MATLAB dla filmów zawartych w folderze analizy. Automatycznie dostarczy dokument Excel z wynikami z wartościami prędkości skurczu na klatkę, amplitudy skurczu na klatkę, kąta (kierunku) skurczu i odpowiednich odchyleń standardowych10.
    5. Pomnóż "szybkość zmniejszania na klatkę" przez rozdzielczość kamery (μm/piksel) i przez liczbę klatek na sekundę (klatki/s). W ten sposób uzyskana zostanie końcowa wartość prędkości skurczu (μm/s).
    6. Pomnóż "Amplitudę skurczu na klatkę" przez rozdzielczość kamery (μm/piksel), a otrzymasz ostateczną wartość amplitudy skurczu (μm).
      UWAGA: Możliwe byłoby bardziej dogłębne przeanalizowanie kinetyki skurczu za pomocą oprogramowania takiego jak MUSCLEMOTION, jak omówiono w innym miejscu19,20. Konfiguracja obrazowania musi rejestrować co najmniej 60 klatek/s do analizy za pomocą oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka komórek serca pochodzących z hiPSC 2D
W celu wytworzenia wielofenotypowych tkanek serca, hiPSC-CM i hiPSC-CF są niezależnie różnicowane i charakteryzowane in vitro. Przy odpowiedniej optymalizacji i ścisłej konserwacji, poniższy protokół spowoduje, że wydajność hiPSC-CMs wyniesie ponad 80% około 9 dnia różnicowania, powodując spontaniczne pokonywanie komórek (Rysunek 1A). Co więcej, wzbogacenie czystości przez selekcję metaboliczną w dużej mierze eliminuje...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby wygenerować 3D złożony model minitkanki serca, który replikuje natywne cechy ludzkiego mięśnia sercowego, należy wziąć pod uwagę kilka istotnych czynników. Można je podzielić na trzy główne punkty: (1) optymalizacja wydajności i czystości komórek do produkcji tkanek, (2) drukowanie rusztowania fibrylarnego w celu naśladowania środowiska mechanicznego 3D oraz (3) integracja hydrożelu fibrynowego w procesie wytwarzania.

Niektóre z kluczowych kroków zapewniających pomyślny proces różnicowania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania zostały sfinansowane przez program badań i innowacji H2020 na podstawie umów o dotację nr 874827 (BRAVfigure-acknowledgements-1); Ministerio de Ciencia y Universidades (Hiszpania) poprzez projekty PLEC2021-008127 (CARDIOPRINT), PID2022-142562OB-I00 (VOLVAD) i PID2022-142807OA-I00 (INVESTTRA) finansowane przez MICIU/AEI /10.13039/501100011033 oraz przez Unię Europejską NextGenerationEU/PRTR; Gobierno de Navarra Proyectos Estratégicos IMPRIMED (0011-1411-2021-000096) oraz BIOHEART (0011-1411-2022-000071); Gobierno de Navarra Proyectos Colaborativos BIOGEN (PC020-021-022) oraz Gobierno de Navarra Salud GN32/2023. Rysunki 1A, Rysunki 2A i Rysunki 4A są tworzone za pomocą BioRender.com.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
µ-Slide Szkiełko nakrywkowe z 8 dołkami (IbiTreat)IBIDI80826
0,1% roztwór żelatyny (Embryomax)Merck MilliporeES-006-B
10% formalinaSigmaAldrich HT501128
płytki 12-dołkoweCostar/Corning3513
Płytki 6-dołkoweCostar/Corning3506
Zaawansowany DMEM 1x (ADMEM)Gibco12491015
Aprotynina z płuc bydlęcychSigma AldrichA1153
B-27 SUPLEMENT PLUS INSULINA (50x) Life TechnologiesA317504044
SUPLEMENT B27, MINUS INSULINA (50x)Life TechnologiesA1895601
Stempel do biopsji (średnica 6 mm)MedycznaBP-60F
(BSA)Sigma AldrichA9647
CHIR-99021 AXON MEDCHEMAXON1386
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowyZeissLSM 800
Kolba hodowlana 175 cmKolba hodowlana Greiner Bio-One660175
75 cmCytometr Falcon353136
Beckman CoulterCytoFlex 
DAPI Sigma AldrichD9542
Przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) o wysokiej adsorpcji krzyżowej, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21202 
Przeciwciało drugorzędowe o wysokiej adsorpcji krzyżowej przeciwko królikowi IgG (H+L) osła, Alexa Fluor 594InvitrogenA-21207 
DPBS (wolne od Mg2+, Ca2+)GibcoA314190094
EDTA 0,5 M pH 8,0Life TechnologiesAM9260G
ESSENTIAL 8 MEDIUM KITLife TechnologiesA1517001
FGF2 (Rekombinowany ludzki FGF-zasadowy 154 a.a.)Peprotech100-18B
Fibrynogen z osocza bydlęcegoSigma AldrichF8630
Pożywka do wzrostu fibroblastów 3 ZESTAW (FGM3)PromoCellC-23130
Zamiennik surowicy nokautującej (KSR)Life Technologies10828028
Mleczan (L-mleczan sodu)Sigma Aldrich71718
Matrigel Growth Factor Reduced (MGFR) Matryca błony podstawnej, wolna od LDEVCorning354230
MEW 23-G DrukarkaNordson7018302
MEWQUT, Queensland University of Technology
Strzykawka MEWNordson7012072
Mysie przeciwciało monoklonalne przeciw sercowej troponinie TInvitrogenMA5-12960 
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-DDR2Sigma AldrichSAB5300116
Mysie przeciwciało monoklonalne anty-&alfa-aktyniny (sarkomeryczne)SigmaAldrich A7811 
PENICYLINA - STREPTOMYCYNALife Technologies15140122
Poly ε-kaprolakton (PCL), klasy medycznejCorbionPURASORB® PC 12
Rekombinowane przeciwciało monoklonalne anty-wimentyny królika [EPR3776] - Marker cytoszkieletuAbcamAb29547 
Kwas retinowy Inhibitor Sigma AldrichR2625
ROCK Y-27632 (10mg)Fisher ScientificHB2297
RPMI 1640 (L-glutamina)Gibco21875034
RPMI 1640 (bez czerwieni fenolowej)Gibco32404014
RPMI bez glukozyGibco11879020
SB431542SELLECK CHEMICALSS1067
Spektrofotometr BMG Labtech SPECTROstar Nano
Trombin (ludzka alfa trombina, czynnik IIa)Laboratorium Badań Enzymatycznych HT1002a
Triton X-100Sigma AldrichT8787
TrypLE ExpressLife Technologies12604021
Tween 20Sigma AldrichP2287
Wnt-C59AXON MEDCHEMAXON2287
albumina surowicy bydlęcej Igła

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, S., et al. Challenges and opportunities for the next generation of cardiovascular tissue engineering. Nat Methods. 19 (9), 1064-1071 (2022).
  2. Garbern, J. C., Lee, R. T. Heart regeneration: 20 years of progress and renewed optimism. Dev Cell. 57 (4), 424-439 (2022).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  4. Burridge, P. W., Holmström, A., Wu, J. C. Chemically defined culture and cardiomyocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Curr Protoc Hum Genet. 87 (21), 21.3.1-21.3.15 (2015).
  5. Feric, N. T., Radisic, M. Maturing human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in human engineered cardiac tissues. Adv Drug Deliv Rev. 96, 110-134 (2016).
  6. Huang, S., Yang, Y., Yang, Q., Zhao, Q., Ye, X. Engineered circulatory scaffolds for building cardiac tissue. J Thorac Dis. 10 (Suppl 20), S2312-S2328 (2018).
  7. Pinto, A. R., et al. Revisiting cardiac cellular composition. Circ Res. 118 (3), 400-409 (2016).
  8. Brown, T. D., Dalton, P. D., Hutmacher, D. W. Direct writing by way of melt electrospinning. Adv Mater. 23 (47), 5651-5657 (2011).
  9. Vernon, M. J., et al. Engineering heart valve interfaces using melt electrowriting: Biomimetic design strategies from multi-modal imaging. Adv Healthc Mater. 11 (24), 2201028(2022).
  10. Montero-Calle, P., et al. Fabrication of human myocardium using multidimensional modeling of engineered tissues. Biofabrication. 14 (4), 045017(2022).
  11. Castilho, M., et al. Melt electrospinning writing of poly-hydroxymethylglycolide-co-ε-caprolactone-based scaffolds for cardiac tissue engineering. Adv Healthc Mater. 6 (18), 1700311(2017).
  12. Castilho, M., et al. Melt electrowriting allows tailored microstructural and mechanical design of scaffolds to advance functional human myocardial tissue formation. Adv Funct Mater. 28 (40), 1803151(2018).
  13. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239-243 (2018).
  14. Palaskas, N. L., Ali, H. J., Koutroumpakis, E., Ganatra, S., Deswal, A. Cardiovascular toxicity of immune therapies for cancer. BMJ. 385, e075859(2024).
  15. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nat Protoc. 8 (1), 162-175 (2012).
  16. Zhang, H., et al. Generation of quiescent cardiac fibroblasts from human induced pluripotent stem cells for in vitro modeling of cardiac fibrosis. Circ Res. 125 (5), 552-566 (2019).
  17. Breckwoldt, K., et al. Differentiation of cardiomyocytes and generation of human-engineered heart tissue. Nat Protoc. 12 (6), 1177-1197 (2017).
  18. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556, 239(2018).
  19. Rivera-Arbeláez, J. M., et al. Automated assessment of human-engineered heart tissues using deep learning and template matching for segmentation and tracking. Bioeng Transl Med. 8 (3), e10513(2023).
  20. Sala, L., et al. MUSCLEMOTION: A versatile open software tool to quantify cardiomyocyte and cardiac muscle contraction in vitro and in vivo. Circ Res. 122 (3), e5-e16 (2018).
  21. Reyat, J. S., et al. Modeling the pathology and treatment of cardiac fibrosis in vascularised atrial and ventricular cardiac microtissues. Front Cardiovasc Med. 10, 1156759(2023).
  22. Park, J. H., et al. Materials and extracellular matrix rigidity highlighted in tissue damages and diseases: Implication for biomaterials design and therapeutic targets. Bioact Mater. 20, 381-403 (2023).
  23. Wunner, F. M., et al. Melt electrospinning writing of three-dimensional poly(ε-caprolactone) scaffolds with controllable morphologies for tissue engineering applications. J Vis Exp. 130, e55617(2017).
  24. Robinson, T. M., et al. The next frontier in melt electrospinning: Taming the jet. Adv Funct Mater. 29 (44), 1904664(2019).
  25. Kade, J. C., Dalton, P. D. Polymers for MELT electrowriting. Adv Healthc Mater. 10 (1), 2001232(2021).
  26. Inchingolo, M., et al. Polycaprolactone in bone tissue engineering: A comprehensive review of innovations in scaffold fabrication and surface modifications. J Funct Biomater. 15 (9), 243(2024).
  27. Mondadori, C., et al. Assessing the response of human primary macrophages to defined fibrous architectures fabricated by melt electrowriting. Bioact Mater. 21, 209-222 (2022).
  28. Xu, C., et al. Melt-electrowriting-enabled anisotropic scaffolds loaded with valve interstitial cells for heart valve tissue Engineering. J Nanobiotechnology. 22 (1), 378(2024).
  29. Ristovski, N., et al. Improved fabrication of melt electrospun tissue engineering scaffolds using direct writing and advanced electric field control. Biointerphases. 10 (1), 011006(2015).
  30. Puluca, N., et al. Bioprinting approaches to engineering vascularized 3D cardiac tissues. Curr Cardiol Rep. 21 (9), 1-11 (2019).
  31. Lu, T. Y., Xiang, Y., Tang, M., Chen, S. 3D printing approaches to engineer cardiac tissue. Curr Cardiol Rep. 25 (6), 505-514 (2023).
  32. Voges, H. K., et al. Vascular cells improve functionality of human cardiac organoids. Cell Rep. 42 (5), 112322(2023).
  33. Zhu, L., Liu, K., Feng, Q., Liao, Y. Cardiac organoids: A 3D technology for modeling heart development and disease. Stem Cell Rev Rep. 18 (8), 2593-2605 (2022).
  34. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nat Rev Cardiol. 17 (6), 341-359 (2020).
  35. Carlos-Oliveira, M., Lozano-Juan, F., Occhetta, P., Visone, R., Rasponi, M. Current strategies of mechanical stimulation for maturation of cardiac microtissues. Biophys Rev. 13 (5), 717(2021).
  36. Maihemuti, W., Murata, K., Abulaiti, M., Minatoya, K., Masumoto, H. Simultaneous electro-dynamic stimulation accelerates maturation of engineered cardiac tissues generated by human iPS cells. Biochem Biophys Res Commun. 733, 150605(2024).
  37. Wang, L., Serpooshan, V., Zhang, J. Engineering human cardiac muscle patch constructs for prevention of post-infarction LV remodeling. Front Cardiovasc Med. 8, 621781(2021).
  38. Matveeva, V. G., Khanova, M. U., Antonova, L. V., Barbarash, L. S. Fibrin – A promising material for vascular tissue engineering. Russ J Transplantol Artif Organs. 22 (1), 196-208 (2020).
  39. Sproul, E. P., Hannan, R. T., Brown, A. C. Controlling fibrin network morphology, polymerization, and degradation dynamics in fibrin gels for promoting tissue repair. Methods Mol Biol. 1758, 85-99 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

tr jwymiarowa tkanka sercarusztowanie z polikaprolaktonukardiocyty pochodz ce z hiPSChydro el fibrynowymodelowanie chor b sercain ynieria tkankowafibroblasty sercaorganizacja sarkomer wprzesiewanie lek w

Powiązane artykuły