Method Article

Wykorzystanie rzeczywistości wirtualnej do immersyjnej segmentacji i analizy danych z tomografii krioelektronowej

DOI:

10.3791/67849

⸱

January 24th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Stony Brook University, 2Simons Electron Microscopy Center, New York Structural Biology Center, 3Department of Physiology and Cellular Biophysics, Columbia University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) umożliwia wizualizację 3D ultrastruktury komórkowej w rozdzielczości nanometrów, ale ręczna segmentacja pozostaje czasochłonna i skomplikowana. Przedstawiamy nowatorski przepływ pracy, który integruje zaawansowane oprogramowanie rzeczywistości wirtualnej do segmentacji tomogramów krio-ET, pokazując jego skuteczność poprzez segmentację mitochondriów w komórkach ssaków.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) to potężna technika wizualizacji ultrastruktury komórek w trzech wymiarach (3D) w rozdzielczości nanometrów. Jednak ręczna segmentacja komponentów komórkowych w danych krio-ET pozostaje znaczącym wąskim gardłem ze względu na swoją złożoność i czasochłonny charakter. W tej pracy przedstawiamy nowatorski przepływ pracy segmentacji, który integruje zaawansowane oprogramowanie rzeczywistości wirtualnej (VR) w celu zwiększenia zarówno wydajności, jak i dokładności segmentacji zestawów danych cryo-ET. Ten przepływ pracy wykorzystuje wciągające narzędzie VR z intuicyjną interakcją 3D, umożliwiając użytkownikom nawigację i opisywanie złożonych struktur komórkowych w bardziej naturalnym i interaktywnym środowisku. Aby ocenić skuteczność przepływu pracy, zastosowaliśmy go do segmentacji mitochondriów w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE1). Mitochondria, niezbędne do produkcji energii komórkowej i sygnalizacji, wykazują dynamiczne zmiany morfologiczne, co czyni je idealną próbką testową. Oprogramowanie VR ułatwiło precyzyjne wytyczenie błon mitochondrialnych i struktur wewnętrznych, umożliwiając dalszą analizę segmentowanych struktur błonowych. Wykazaliśmy, że ten oparty na VR przepływ pracy segmentacji znacznie poprawia wrażenia użytkownika przy jednoczesnym zachowaniu dokładnej segmentacji skomplikowanych struktur komórkowych w danych krio-ET. Podejście to daje nadzieję na szerokie zastosowania w strukturalnej biologii komórki i edukacji naukowej, oferując przełomowe narzędzie dla badaczy zajmujących się szczegółową analizą komórkową.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tomografia krioelektronowa (cryo-ET) zrewolucjonizowała naszą zdolność do wizualizacji komponentów komórkowych w ich stanie zbliżonym do natywnego w wysokiej rozdzielczości1,2. Ta potężna technika pozwala naukowcom scharakteryzować ultrastrukturę komórkową, dostarczając bezprecedensowych informacji na temat architektury i funkcji komórkowych. Jednak cryo-ET nie jest pozbawiony ograniczeń, z których najważniejszym jest wymóg, aby próbki były wystarczająco cienkie, aby były przezroczyste dla elektronów (zwykle <0,5 μm) do obrazowania w standardowych krioskopach transmisyjnych elektronowych. Ostatnie postępy w mieleniu wiązki jonów skupionej kriogenicznie umożliwiły rozrzedzenie grubych próbek do analizy cryo-ET3,4.

Typowe przepływy pracy cryo-ET rozpoczynają się od zbioru serii tilt, gdzie próbka jest obrazowana pod różnymi kątami, od +60° do -60°. Obrazy te są następnie wyrównywane obliczeniowo i rzutowane wstecznie w celu utworzenia trójwymiarowej (3D) objętości lub tomogramu5,6,7. Tomogram ten służy jako szczegółowa mapa 3D krajobrazu komórkowego, oferująca zarówno przestrzenne, jak i czasowe informacje o strukturach komórkowych. Dalsze udoskonalanie poprzez uśrednianie subtomogramowe, w którym wiele kopii tej samej struktury jest wyrównywanych i uśrednianych, może jeszcze bardziej przesunąć granice rozdzielczości, czasami osiągając rozdzielczość poniżej nanometra7,8,9,10.

Kluczowym krokiem w wydobyciu istotnych informacji biologicznych z tych tomogramów jest segmentacja. Proces ten polega na opisywaniu określonych struktur komórkowych, takich jak błony, w objętości 3D. Segmentacja umożliwia zaawansowane analizy, w tym obliczanie odległości międzybłonowych i krzywizny błony, dostarczając cennych informacji na temat procesów komórkowych11,12. Chociaż dostępnych jest kilka pakietów oprogramowania do tego zadania, w tym Dragonfly, Amira, MemBrain, EMAN2 i tomomemsegtv13,14,15,16,17, proces segmentacji pozostaje znaczącym wąskim gardłem w analizie danych cryo-ET. Często jest to pracochłonny i czasochłonny proces ręczny, który może trwać od tygodni do miesięcy. Wiele z tych pakietów oferuje funkcje automatycznej segmentacji, ale często wymagają rozległej ręcznej korekty w celu usunięcia fałszywych alarmów, procesu, który może być pracochłonny i nieintuicyjny, gdy jest wykonywany kawałek po plasterku lub w 3D.

Proponujemy alternatywne podejście, wykorzystując technologię wirtualnej rzeczywistości (VR) do sprostania tym wyzwaniom. VR oferuje wciągającą i interaktywną metodę wizualizacji danych, umożliwiając użytkownikom poruszanie się po objętości tomograficznej tak, jakby znajdowały się w samym środowisku komórkowym. Podejście to stanowi również cenną platformę dla edukacji naukowej oraz eksploracji naukowej i odkrywania danych krio-ET in situ, zapewniając wciągające i wyjątkowo wciągające doświadczenie. W tej pracy przedstawiamy protokół segmentacji danych cryo-ET za pomocą syGlass18, oprogramowania VR przeznaczonego do wizualizacji naukowej. To oprogramowanie zapewnia kompleksowy zestaw narzędzi do analizy danych krio-ET, w tym ręcznej segmentacji, udoskonalania automatycznie generowanych segmentacji, a nawet wybierania cząstek w tomogramach. Nasze badanie pokazuje przydatność VR jako potężnego narzędzia do czyszczenia segmentacji, wybierania cząstek i ręcznej segmentacji w analizie danych cryo-ET.

Aby zilustrować użyteczność oprogramowania VR do segmentacji cryo-ET, skupiamy się na analizie morfologii mitochondriów w komórkach nabłonka barwnikowego siatkówki (RPE1). Mitochondria służą jako doskonały przypadek testowy dla segmentacji ze względu na ich złożoną strukturę i obecność łatwych do zmierzenia cech, takich jak odległość między zewnętrznymi i wewnętrznymi błonami mitochondrialnymi. Cechy te można dokładnie zmierzyć za pomocą narzędzi do analizy morfometrii powierzchni12, co zapewnia solidne wskaźniki do oceny jakości segmentacji. Protokół ten zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące segmentacji danych cryo-ET za pomocą syGlass, demonstrując jego użyteczność w potoku segmentacji cryo-ET. Włączając segmentację opartą na VR do przepływu pracy cryo-ET, dążymy do poprawy zarówno wydajności, jak i dokładności ręcznej analizy strukturalnej w biologii komórkowej.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie danych cryo-ET do segmentacji

  1. Konwertuj surowe tomogramy Cryo-ET na format danych zgodny z syGlass, taki jak stosy TIFF. Ustaw sygnał tak, aby cząstki były białe na czarnym tle i wykonaj korekcję histogramu za pomocą ImageJ19.
    UWAGA: Aby zwiększyć stosunek sygnału do szumu, zaleca się, aby tomogramy zostały odszumione za pomocą oprogramowania takiego jak Warp20, Topaz Denoise21, cryoCARE22,23 lub IsoNet24 przed zaimportowaniem do oprogramowania.
  2. Uruchom oprogramowanie VR na komputerze. Przejdź do menu Plik i wybierz pozycję Utwórz projekt.
  3. Kliknij Utwórz nowy projekt | Dodaj pliki. Przejdź do lokalizacji, w której zapisywane są pliki TIFF, i zaimportuj je do oprogramowania.
  4. Po wyświetleniu monitu o potwierdzenie, czy pliki są szeregami czasowymi, kliknij przycisk Nie.
  5. Nazwij projekt, a następnie kliknij przycisk Zapisz, aby utworzyć nowy projekt na liście projektów.
  6. Kliknij dwukrotnie projekt, aby otworzyć tomogram i załadować go do interaktywnego środowiska wirtualnej rzeczywistości oprogramowania.

2. Konfiguracja wirtualnej rzeczywistości (VR)

  1. Podłącz gogle VR i kontrolery ręczne do komputera.
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie, aby skalibrować środowisko VR.
    UWAGA: Kalibracja odnosi się do trójwymiarowej przestrzeni, w której zostanie wykonana segmentacja. Parametry (długość, szerokość i wysokość) przestrzeni roboczej muszą zostać zdefiniowane przed wyświetleniem projekcji VR. Projekcja VR będzie widoczna tylko w tych parametrach.
  3. Segmentacja będzie wykonywana tylko w obrębie zdefiniowanej roboczej przestrzeni trójwymiarowej. Upewnij się, że pole widzenia zawiera obszar, nad którym chcesz pracować w środowisku VR.

3. Optymalizacja wizualizacji 3D

  1. Kliknij przycisk Wizualizacja w interfejsie oprogramowania. Dostosuj różne opcje wizualizacji, takie jak kontrast, okna, jasność i suwaki progowe, aby wzmocnić sygnał i zminimalizować szumy.
  2. Użyj kontrolerów ręcznych, aby przyciągnąć tomogram bliżej lub odepchnąć go w razie potrzeby.
  3. Aktywuj narzędzie Tnij za pomocą lewego kontrolera, aby wizualnie sprawdzić różne plastry w tomogramie.

4. Proces segmentacji

  1. Przejdź przez tomogram do żądanego wycinka, w którym rozpocznie się segmentacja.
  2. Aktywuj opcję Region zainteresowania (ROI) w menu adnotacji za pomocą kontrolerów ręcznych. Na tomogramie pojawi się zielone pole.
  3. Dostosuj rozmiar i położenie zielonego pola, przesuwając je do obszaru, który ma zostać podzielony na segmenty.
  4. Zablokuj zwrot z inwestycji za pomocą kontrolera po lewej stronie i rozpocznij segmentację. Po zablokowaniu ROI narzędzie automatycznie przełącza się w tryb malowania, który umożliwia segmentację danych wolumetrycznych.
  5. Powiększ lub pomniejsz tomogram, aby uzyskać precyzyjną segmentację.
  6. Dostosuj rozmiar pędzla, obracając go zgodnie z ruchem wskazówek zegara lub przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aby uzyskać optymalną kontrolę.
  7. Ostrożnie podziel ROI (np. błony mitochondrialne) na segmenty w wybranym obszarze 3D. Jeśli podczas segmentacji wystąpi błąd, naciśnij i przytrzymaj spust dodatkowego kontrolera, aby włączyć tryb usuwania, a następnie usuń błąd, wykonując ten sam ruch, co segmentacja.
  8. Powtarzaj ten proces region po regionie, aż cały tomogram zostanie podzielony na segmenty.

5. Eksport danych segmentowych i analiza

  1. Po zakończeniu segmentacji wybierz projekt, klikając na niego, aby upewnić się, że jest podświetlony.
  2. Kliknij kartę Projekty w lewym górnym rogu, a następnie wybierz opcję ROI.
  3. Wybierz, czy chcesz wyeksportować cały wolumin, czy określony zwrot z inwestycji. Określ lokalizację eksportu dla danych podzielonych na segmenty.
  4. Załaduj i przeanalizuj posegmentowane dane za pomocą wybranego oprogramowania i wygeneruj dane do publikacji.

6. Importowanie maski binarnej do oprogramowania w celu oczyszczenia

  1. Wykonaj kroki 1.1-1.6.
  2. Kliknij projekt prawym przyciskiem myszy i kliknij Dodaj dane maski. Następnie przejdź do miejsca, w którym zapisana jest początkowa segmentacja i zaimportuj ją w ramach tego samego projektu.
  3. Korzystaj z adnotacji ROI, aby wprowadzić zmiany w początkowej segmentacji.
  4. Dodaj/usuń segmentację, aby wyczyścić początkową segmentację.
  5. Dostosuj ROI maski w opcji ROI na karcie masek. Aby zmienić zwrot z inwestycji maski z jednego na drugi, włącz jedyną opcję nadpisywania maski i przejdź do trybu malowania za pomocą kontrolera ręcznego. Ten tryb nadpisze tylko te dane maski, które są widoczne.
  6. Wyeksportuj skorygowane zwroty z inwestycji maski, wykonując czynności opisane w krokach 5.1-5.3.

7. Wybieranie współrzędnych cząstek za pomocą oprogramowania VR

  1. Utwórz projekt za pomocą tomogramu (stosu TIFF), wykonując czynności opisane w sekcji 1.
  2. Kliknij Adnotacja | Liczba, która otwiera okno z opcjami ręcznymi lub automatycznymi.
    1. W przypadku opcji ręcznej wybierz kolor zliczeń i zacznij oznaczać współrzędne.
    2. W przypadku opcji automatycznej wybierz rozmiar komórki i wprowadź rozdzielczość. Kliknij Uruchom automatyczne liczenie, edytuj zliczania (zachowaj dobre wybory i odrzuć złe) i zapisz postęp.
  3. Wyeksportuj współrzędne zliczenia, klikając zakładkę projektu | adnotacje.
    1. Jako początek opisu wybierz opcję Lewy dolny róg, a w polu Jednostki opisu wybierz opcję Woksele.
    2. Kliknij komórkę zliczania punktów, aby podświetlić komórkę.
    3. Kliknij Eksportuj wybrane, aby zapisać współrzędne zaznaczenia w pliku .csv.
      UWAGA: Ten plik może być używany do wyodrębniania subtomogramów z tomogramu w celu uśrednienia subtomogramu

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu podzieliliśmy tomogramy zawierające mitochondria i dodatkowe błoniaste organelle (np. pęcherzyki, retikulum endoplazmatyczne) za pomocą syGlass. Tomogramy zostały początkowo zrekonstruowane w Warp przy użyciu projekcji z obciążeniem wstecznym na poziomie 16,00 A/piksel i zostały poddane korekcji brakującego klina i odszumianiu za pomocą oprogramowania IsoNet. Następujące tomogramy zostały poddane dodatkowej obróbce w celu importu, jak pokazano na Rysunek 1A (zobacz również Dodatkowe wideo S1, Uzupełniające wideo S2, Uzupełniające wideo S3 i Uzupełniające wideo S4).

Po wstępnym przetworzeniu, tomogramy w formacie MRC zostały przekształcone w stosy TIFF za pomocą ImageJ, z zastosowaniem odwrócenia kontrastu, aby membrany wydawały się białe na czarnym tle. Następnie przeprowadzono wyrównanie histogramu, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast; Pozwala to również na skuteczniejsze progowanie. Stosy TIFF zostały zaimportowane i zobrazowane w 3D w immersyjnym środowisku VR, zapewniając szczegółową inspekcję struktur błoniastych za pomocą narzędzia do cięcia w oprogramowaniu pokazanym na Rysunek 1B.

Ręczna segmentacja została przeprowadzona w oprogramowaniu, z oknami ustawionymi na auto i dostosowaniem jasności/progu w celu optymalizacji widoczności funkcji komórkowych. Obszary ROI wokół mitochondriów i innych struktur zostały zdefiniowane za pomocą kontrolerów VR. Narzędzie do segmentacji umożliwiło precyzyjne wyznaczenie granic membrany, a błędy zostały skorygowane za pomocą funkcji wymazywania. Nawigacja plasterek po plasterku lub w 3D za pomocą narzędzia ROI do boksowania regionów na całym tomogramie, w połączeniu z regulowanym pędzlem malarskim, zapewniła dokładną segmentację błon mitochondrialnych i innych organelli, jak pokazano na Rysunek 1C.

Segmentowane dane zostały zwizualizowane poprzez wygenerowanie siatki za pomocą opcji powierzchni narzędzia ROI, z iteracjami wygładzania ustawionymi na 12 i poziomem rozdzielczości ustawionym na 3. Końcowe renderingi 3D wyraźnie pokazują struktury mitochondrialne, w tym błony zewnętrzne i wewnętrzne, grzebienie i złoża fosforanu wapnia, jak pokazano na Rysunek 1D (zobacz również Dodatkowe wideo S5, Dodatkowe wideo S6, Dodatkowe wideo S7 i Uzupełniające wideo S8).

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg pracy wizualizacji tomogramu, segmentacji i renderowania 3D za pomocą syglassu. (A) Tomograficzne wycinki cienkich krawędzi komórek RPE1. Tomogramy z korektą IsoNet zrekonstruowane w Warp i użyte do segmentacji za pomocą syGlass, wizualizowane za pomocą IMOD25. Tomogramy pobrano pod mikroskopem Titan-Krios o napięciu 300 keV wyposażonym w detektor K3 i skupiono na cienkich krawędziach komórek nabłonka siatkówki. Każdy tomogram zawiera co najmniej jedno mitochondrium wraz z różnymi innymi organellami związanymi z błoną. Te obrazy są nieruchomymi obrazami z filmów wyświetlanych w Dodatkowym filmie S1, Dodatkowym filmie S2, Dodatkowym filmie S3 i Dodatkowym filmie S4. (B) Odpowiednie tomogramy zwizualizowane w oprogramowaniu. Wycinek tomograficzny utworzony za pomocą narzędzia do cięcia w oprogramowaniu VR po zoptymalizowaniu progowania, jasności i okienkowania, odsłaniając wyraźne struktury komórkowe. (C) Tomogramy wizualizowane w oprogramowaniu z segmentowymi membranami. Wycinek tomograficzny utworzony za pomocą narzędzia do cięcia w oprogramowaniu VR, pokryty odpowiednią segmentacją. Złogi fosforanu wapnia są pokazane na żółto, błony mitochondrialne na niebiesko, a inne błony, takie jak pęcherzyki i błona plazmatyczna na fioletowo. (D) Renderowanie 3D segmentowych membran w syGlass. Błony mitochondrialne, w tym błony mitochondrialne, zewnętrzne i wewnętrzne, są pokazane w kolorze cyjanu. Złogi fosforanu wapnia są w kolorze żółtym lub zielonym, pęcherzyki i błona plazmatyczna są w kolorze fioletowym, a retikulum endoplazmatyczne jest w kolorze brązowym. Te obrazy są nieruchomymi obrazami z filmów wyświetlanych w dodatkowych filmach wideo S5, Uzupełniających filmach S6, Dodatkowych filmach S7 i Dodatkowych filmach S8. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Tomogram próbki RPE-1_1 użyty do segmentacji w tym badaniu. Ten tomogram jest rekonstruowany przy 16 A/piksel za pomocą Warp, a następnie odszumiany i korygowany pod kątem brakującego klina za pomocą IsoNet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S2: Tomogram próbki RPE-1_2 użyty do segmentacji w tym badaniu. Ten tomogram jest rekonstruowany przy 16 A/piksel za pomocą Warp, a następnie odszumiany i korygowany pod kątem brakującego klina za pomocą IsoNet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S3: Tomogram próbki RPE-1_3 użyty do segmentacji w tym badaniu. Ten tomogram jest rekonstruowany przy 16 A/piksel za pomocą Warp, a następnie odszumiany i korygowany pod kątem brakującego klina za pomocą IsoNet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S4: Tomogram próbki RPE-1_4 użyty do segmentacji w tym badaniu. Ten tomogram jest rekonstruowany przy 16 A/piksel za pomocą Warp, a następnie odszumiany i korygowany pod kątem brakującego klina za pomocą IsoNet. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S5: Wynikowa segmentacja próbki RPE-1_1 po wygenerowaniu powierzchni. Błony mitochondrialne są pokazane w kolorze cyjanu; fosforany wapnia w mitochondriach są przedstawione na żółto; retikulum endoplazmatyczne jest pokazane w kolorze tan; a inne membrany są wyświetlane na fioletowo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S6: Wynikowa segmentacja próbki RPE-1_2 po wygenerowaniu powierzchni. Błony mitochondrialne są pokazane w kolorze cyjanu; fosforany wapnia w mitochondriach są przedstawione na żółto; retikulum endoplazmatyczne jest pokazane w kolorze tan; a inne membrany są wyświetlane na fioletowo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S7: Wynikowa segmentacja próbki RPE-1_3 po wygenerowaniu powierzchni. Błony mitochondrialne są pokazane w kolorze cyjanu; fosforany wapnia w mitochondriach są przedstawione na żółto; retikulum endoplazmatyczne jest pokazane w kolorze tan; a inne membrany są wyświetlane na fioletowo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S8: Wynikowa segmentacja próbki RPE-1_4 po wygenerowaniu powierzchni. Błony mitochondrialne są pokazane w kolorze cyjanu; fosforany wapnia w mitochondriach są przedstawione na żółto; retikulum endoplazmatyczne jest pokazane w kolorze tan; a inne membrany są wyświetlane na fioletowo. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej pracy pokazaliśmy, w jaki sposób VR, w szczególności przy użyciu syGlass, można zintegrować z potokiem cryo-ET w celu efektywnej segmentacji struktur komórkowych. Chociaż skupiliśmy się przede wszystkim na błonach, nie ma nieodłącznych ograniczeń uniemożliwiających segmentację innych struktur komórkowych, takich jak włókna lub rybosomy, ponieważ można dostosować kształt i rozmiar pędzla oraz progowanie, aby zapewnić, że oznaczone są tylko woksele odpowiadające pożądanym obiektom komórkowym. Jedną z głównych zalet VR w segmentacji jest intuicyjna, praktyczna interakcja z danymi, dzięki czemu użytkownicy mogą wizualizować i manipulować objętościami tak, jakby fizycznie się w nich znajdowali. Tradycyjne metody ręcznej segmentacji lub czyszczenia początkowych masek segmentacji zazwyczaj obejmują pracę bezpośrednio na komputerze, który może być mniej wciągający i wolniej dodawać adnotacje.

Włączając VR do przepływu pracy cryo-ET, użytkownicy mogą nie tylko szybko wchodzić w interakcje z maskami segmentacji generowanymi przez inne oprogramowanie, ale także używać VR do kierowania segmentacją częściowo segmentowanych struktur i skutecznego usuwania fałszywych alarmów. Obecnie ręczna segmentacja jest nadal wymagana w większości przypadków użycia adnotacji, a prezentowany przepływ pracy umożliwia użytkownikom generowanie segmentacji, które są odpowiednie do dalszej analizy z większą łatwością i szybkością. Do tego badania użyliśmy gogli HTC Vive VR, ale oprogramowanie jest kompatybilne z urządzeniami obsługującymi SteamVR lub OculusVR.

W celu optymalnego zastosowania tego protokołu, dane cryo-ET powinny spełniać określone kryteria, takie jak wysokiej jakości tomogramy o wysokim stosunku sygnału do szumu (SNR). SNR jest istotnym parametrem, ponieważ przejrzystość cech strukturalnych bezpośrednio wpływa na skuteczność ręcznej segmentacji w VR. Etapy przetwarzania wstępnego, takie jak korekcja brakującego klina i odszumianie, są kluczowymi elementami przepływu pracy; w tym protokole wykorzystaliśmy do tych celów IsoNet. Tomogramy powinny zostać zrekonstruowane w odpowiedniej rozdzielczości - przy użyciu rozmiaru woksela, który zapewnia wystarczającą szczegółowość strukturalną i wystarczającą separację między strukturami komórkowymi, aby umożliwić efektywną segmentację między strukturami, przy jednoczesnym utrzymaniu możliwych do opanowania rozmiarów danych do wizualizacji VR. Dodatkowo należy zastosować odwrócony kontrast ze strukturami komórkowymi pojawiającymi się na białym tle na czarnym tle oraz wyrównanie histogramu, aby poprawić widoczność błon i innych struktur w środowisku syGlass.

Aby zapewnić powodzenie tego protokołu, należy wziąć pod uwagę kilka krytycznych punktów. Po pierwsze, podczas wstępnego przetwarzania danych niezbędne jest dokładne zastosowanie odwrócenia kontrastu i wyrównania histogramu; niewłaściwe korekty mogą skutkować nieoptymalną wizualizacją w VR, co utrudnia segmentację. Po drugie, w oprogramowaniu VR odpowiednie regulacje ustawień okien, jasności i progów są niezbędne do optymalnej wizualizacji konstrukcji. Użytkownicy powinni eksperymentować z tymi ustawieniami, aby osiągnąć najlepsze wyniki dla swoich określonych zestawów danych i konfiguracji VR.

Jeśli chodzi o rozwiązywanie problemów, użytkownicy mogą napotkać problemy, takie jak ograniczenia wydajności systemu VR, zwłaszcza podczas obsługi dużych zestawów danych tomogramu. Jeśli środowisko VR staje się opóźnione lub nie odpowiada, rozważ zmniejszenie próbkowania danych lub segmentację tomogramu na mniejsze sekcje, dostosowując obwiednię w narzędziach ROI w syGlass i przesuwając ją wzdłuż tomogramu podczas wykonywania segmentacji. Suwak wydajności w menu wizualizacji można również dostosować, aby zmniejszyć opóźnienia podczas procesu segmentacji. Dodatkowo, aby złagodzić chorobę lokomocyjną, użytkownicy mogą dostosować ustawienia VR, aby zredukować efekty ruchu lub robić regularne przerwy podczas sesji segmentacji.

Nasz protokół segmentacji oparty na VR oferuje znaczące korzyści dla obecnych przepływów pracy segmentacji cryo-ET. Konwencjonalne metody segmentacji ręcznej często obejmują adnotacje 2D na poszczególnych warstwach, co może być czasochłonne i może nie uchwycić w pełni ciągłości trójwymiarowej13. Ponadto segmentacja oparta na VR wprowadza znacznie bardziej wciągający widok struktur komórkowych, pomagając w wizualizacji. Zautomatyzowane segmentacje oparte na uczeniu maszynowym stają się potężną metodą uzyskiwania segmentacji z tomogramów komórkowych 14,16,17, chociaż wysoki poziom szumów i złożone struktury obecne w danych krio-ET prowadzą do luk i wyników fałszywie dodatnich, które wymagają ręcznej interwencji. Protokół ten oferuje alternatywne podejście do ręcznej segmentacji tomogramów krioelektronowych, generowania początkowych segmentacji, które mogą być potencjalnie wykorzystane jako dane treningowe dla innego oprogramowania sieci neuronowych, lub do czyszczenia początkowych segmentacji generowanych przez inne zautomatyzowane podejścia.

Podsumowując, badanie to podkreśla, że segmentacja oparta na VR jest obiecującym narzędziem do analizy danych i edukacji krio-ET, oferującym zwiększoną wydajność i bardziej wciągające doświadczenie użytkownika. Wraz z dalszym rozwojem, technologia VR ma potencjał, aby zrewolucjonizować sposób, w jaki interpretujemy i rozpowszechniamy odkrycia naukowe złożonych struktur komórkowych w zestawach danych cryo-ET, stanowiąc cenną alternatywę dla tradycyjnych metod segmentacji i edukacji.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została wykonana w National Center for CryoEM Access and Training (NCCAT) oraz Simons Electron Microscopy Center znajdującym się w New York Structural Biology Center, wspieranym przez NIH (Common Fund U24GM129539, U24GM139171 i NIGMS R24GM154192), Fundację Simonsa (SF349247) i Zgromadzenie Stanowe Nowego Jorku.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Format danych: stos TIFF, TIFF
HTC VIVE CosmosHTC99HARL000-00https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/
Intel(R) Core™ i7-10870H CPU @ 2,20 GHz 2,21 GHzIntelhttps://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html
NVIDIA GeForce RTX 3070 Laptop GPUNVIDIAhttps://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/
syGlass OprogramowaniesyGlassSyGlass zainstalowane na kompatybilnym komputerze z systemem Windows
Kontrolery ręczne VIVE CosmosHTC99HAFR001-00https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/
Windows 11 HomeMicrosoftMicrosoft Windows 11 Strona główna
CryoET

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. Structural biology outside the box-inside the cell. Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).
  2. Beck, M., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail. Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).
  3. Lam, V., Villa, E. Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography. Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).
  4. Berger, C., et al. Cryo-electron tomography on focused ion beam lamellae transforms structural cell biology. Nat Methods. 20 (4), 499-511 (2023).
  5. Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics. Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).
  6. Pyle, E., Zanetti, G. Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).
  7. Wan, W., Briggs, J. A. G. Cryo-electron tomography and subtomogram averaging. Methods Enzymol. 579, 329-367 (2016).
  8. Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity. Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).
  9. Obr, M., et al. Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs. J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).
  10. Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells. Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).
  11. Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography. PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).
  12. Barad, B. A., et al. Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline. J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).
  13. Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography. J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).
  14. Heebner, J. E., et al. Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms. J Vis Exp. (189), e64435(2022).
  15. Garza-López, E., Robles-Flores, M. Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira. Cells. 11 (1), 65(2021).
  16. Chen, M., et al. Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms. Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).
  17. Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. bioRxiv. , (2024).
  18. Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. arXiv. , (2018).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  21. Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET. Nat Commun. 11, 5208(2020).
  22. Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data. Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).
  23. Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. Content-aware image restoration for electron microscopy. Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).
  24. Liu, Y. -T., et al. Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning. Nat Commun. 13, 6482(2022).
  25. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryo Electron TomographyVirtual Reality SegmentationImmersive Data AnalysisMitochondrial Membranes3D Cell UltrastructureManual SegmentationRetinal Pigment EpitheliumROI AnnotationHistogram EqualizationMembrane Visualization

Related Articles