Artykuł metodologiczny

Wysokoprzepustowy pomiar mechanotypu komórkowego metodą cytometrii przepływowej w oparciu o pęknięcie i dostarczenie sond napięcia DNA do komórek

DOI:

10.3791/67852

⸱

13 czerwca 2025

 , 
1College of Biological Sciences, University of Minnesota

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta metoda mierzy skłonność komórki do pękania unieruchomionych dupleksów DNA prezentujących ligand, aby zgłosić względne siły przyciągania komórkowego. Pęknięte oligonukleotydy fluorescencyjne są dostarczane do komórki i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, rejestrując historię mechaniczną komórki. Pozwala to na wysokoprzepustowy pomiar generowania siły komórkowej w kontekście mechanofentypowania komórkowego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły mechaniczne kierują wieloma krytycznymi procesami komórkowymi, a mechaniczny fenotyp komórkowy, czyli mechanotyp, jest zaburzony w wielu chorobach. Najpowszechniej stosowaną metodą ilościowego określania sił komórkowych jest mikroskopia sił trakcyjnych, która tradycyjnie rejestruje siły, jakie komórki wywierają na swoje otoczenie za pomocą mikroskopii o wysokiej rozdzielczości komórek deformujących elastyczne podłoża zawierające kulki fluorescencyjne, odchylających mikrosłupki lub zmieniających konformację unieruchomionych czujników napięcia molekularnego. Przedstawiamy tutaj wysokoprzepustową metodę pomiaru względnych sił trakcji komórkowej przy użyciu ustalonych sond napięcia DNA i określanych ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Poniżej opisano pięć ogólnych kroków związanych z tą metodą. Po pierwsze, ekspresja i oczyszczanie ligandu integryny o wysokim powinowactwie echistatyny połączonego ze znacznikiem HUH łączącym DNA; po drugie, przygotowanie sond DNA typu duplex zawierających reportery i ligand; po trzecie, przygotowanie powierzchni i unieruchomienie sond; po czwarte, wykonanie eksperymentu "Pęknięcie i dostarczenie" z manometrem i uwięzią oraz odczytem przepływu. Na koniec opiszemy analizę danych i interpretację wyników eksperymentów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Siły mechaniczne kierują wieloma krytycznymi procesami komórkowymi, od migracji1 do różnicowania komórek macierzystych2 do zdolności limfocytu T do wiązania się i aktywacji przez właściwą komórkę prezentującą antygen3. Zmienne mechaniczne są rozregulowane w chorobie, co skutkuje mierzalnymi różnicami w komórkowym fenotypie mechanicznym lub mechanotypie komórek4,5. Mechanotyp to ogólny termin określający właściwości mechaniczne komórek i tkanek, który może obejmować takie parametry, jak kurczliwość, migracja, adhezja i odkształcalność. Sztywność komórek lub tkanek jest najczęstszym aspektem mierzonego mechanotypu, ponieważ można go zmierzyć przy dużej przepustowości. Na przykład komórki rakowe są często sztywniejsze niż normalne komórki, podczas gdy komórki przerzutowe są często bardziej zgodne6,7. Generowanie sił przez komórki jest ważnym aspektem mechanotypu zmienionego w disease8, ponieważ bada specyficzne interakcje komórka-środowisko. Mikroskopia sił trakcyjnych jest najpowszechniejszą metodą pomiaru wytwarzania siły komórkowej i polega na posiewaniu komórek na odkształcalnych elastycznych podłożach osadzonych w koralikach fluorescencyjnych lub na tablicach mikrosłupków i śledzeniu zmian w ruchu ściegu lub ugięciu po osiągnięciu celu obliczenia sił wywieranych przez komórki. Czujniki napięcia molekularnego zostały również wykorzystane do pomiaru sił trakcyjnych i oferują przewagę w postaci czułości na mniejsze wielkości siły i pomiaru sił generowanych przez określone pary ligand-receptor9,10. Jednak pomiar sił komórkowych za pomocą tradycyjnych TFM i czujników napięcia molekularnego opiera się na obrazowaniu o wysokiej rozdzielczości, co ogranicza przepustowość pomiaru.

Niedawno dostosowaliśmy sondy napięcia DNA-duplex do wysokoprzepustowego odczytu generowania siły komórkowej w kontekście mechanofenotypingu komórkowego11 (Rysunek 1). Krótko mówiąc, dupleksy DNA zaadaptowane z szeroko stosowanych sond TGT (tension-gauge-tether)12 są unieruchamiane w studzienkach 96-dołkowych płytek za pomocą chemii biotyny-neutrawidyny "kotwicy" nici "kotwicy" klasy sup13. Wymaganą siłę zrywającą dupleksów TGT można dostroić, zmieniając położenie biotyny na skręcie kotwiącym, co zmienia geometrię dupleksu, co skutkuje albo niską siłą zrywającą, konformacją rozpinającą zamek (Rysunek 2A), albo konformacją ścinającą o dużej sile zerwania (Rysunek 2B). Nić kotwiczna zawiera biotynę i wygaszacz fluorescencji, podczas gdy nić "ligandowa" DNA zawiera sondę fluorescencyjną i ligand rozpoznający receptor na powierzchni komórki zaangażowany w mechanosensację, taki jak integryna. Ligand jest kowalencyjnie połączony z DNA (Rysunek 3) za pomocą znacznika fuzyjnego łączącego DNA zwanego znacznikiem HUH połączonym z ligandem < sup class="xref">14,15. Znaczniki HUH to małe domeny endonukleazy HUH zaangażowane w replikację wirusa i inne procesy, które rozpoznają sekwencję / strukturę 9 pz jednoniciowego DNA, nacinają ją i tworzą kowalencyjny addukt fosfotyrozyny do końca 5' naciętego DNA.

Komórki pokryte tymi sondami wiążą się z ligandem i rozrywają pewien procent sond proporcjonalny do sił, które generują. Fluorescencyjna nić liganda związana ze swoim receptorem jest następnie dostarczana do komórki. W ten sposób historia mechaniczna komórek jest rejestrowana w komórkach będących przedmiotem zainteresowania poprzez wielkość ich fluorescencji. Fluorescencję można określić ilościowo za pomocą cytometrii przepływowej. Nazywamy tę metodę Rupture and Deliver-TGTS lub RAD-TGTs. Metoda ta nie tylko mierzy fluorescencję, a tym samym względną siłę generowaną przez tysiące komórek jednocześnie, ale także odczyt cytometrii przepływowej oferuje potencjał sortowania komórek według ich mechanotypu, umożliwiając dalsze odczyty -omiczne, a także CRISPR-KO lub badania przesiewowe leków, które mogą zidentyfikować geny lub leki zmieniające mechanotyp komórkowy.

W poniższym protokole pokazujemy, jak przygotować i przeprowadzić eksperyment RAD-TGT. Podkreślimy ekspresję i oczyszczanie typu HUH znanego jako WDV (z wirusa karłowatego pszenicy), który sam w sobie służy jako kontrola negatywna i łączy się z echistatyną, ligandem, który ściśle wiąże rodzinę receptorów adhezyjnych, które przenoszą siłę między komórką a środowiskiem, znaną jako integryny wiążące RGD, aby służyć jako warunek eksperymentalny. Na tej podstawie pokażemy, jak przygotować RAD-TGT do użytku eksperymentalnego. Wyjaśnimy, jak postępować z eksperymentami i jak analizować uzyskane dane. Podkreślimy również zastosowanie RAD-TGT, mierząc, w jaki sposób inhibitor ROCK zmienia siły za pośrednictwem integryny w komórkach CHO-K1 (Rysunek 4). Podsumowując, mamy nadzieję, że ten protokół posłuży jako wejście do mechanobiologii niezależnie od wcześniejszych doświadczeń; Dziedzina ta jest w początkowej fazie i wszystkie tła są niezbędne do dalszego zrozumienia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i oczyszczanie HUH

  1. Przekształć Escherichia coli za pomocą plazmidu WDV (± Echistatin), około 1,5 μl plazmidu ~50 ng / μL na transformację i rosnąć na płytkach agarowych ampicyliny.
  2. Zaszczepić 5 ml LB pojedynczą kolonią i rosnąć przez noc w temperaturze 37 °C.
  3. Zaszczep 1 L LB z nocną kulturą i rośnie, aż OD600 osiągnie ~0,8.
  4. Obniżyć temperaturę do 18 °C, indukować za pomocą 500 μM izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i inkubować przez noc.
  5. Osadzać komórki przez odwirowanie w ilości 3 750 × g przez 30 minut. Ponownie zawiesić osad za pomocą 40 ml buforu do lizy (300 mM NaCl, 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA).
  6. Liza ogniw za pomocą sonikacji 3 x 90 s na lodzie przy 70% cyklu pracy, moc 7. Odwirować w temperaturze 24 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i wlać supernatant do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Zawiesinę żywicy Ni-NTA umieścić w stożkowej probówce o pojemności 15 ml (1 ml zawiesiny perełek/l kultury), wirować z prędkością 700 × g przez 2 minuty i usunąć supernatant.
  8. Dodaj 6 ml wody do żywicy i powtórz proces prania w kroku 1.7.
  9. Powtórz pranie dwukrotnie z buforem do przemywania (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 20 mM Imidazol) zamiast wody. Ponownie zawiesić kulki w 5 ml buforu do płukania.
  10. Dodać zawiesinę perełek (krok 1.9) do zlizowanych komórek (krok 1.6) i dokładnie wymieszać. Obracać lizowane komórki i kulki przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W pozostałej części niniejszego protokołu nigdy nie pozwól, aby żywica wyschła i zbierz wszystkie próbki, które przepływają przez kolumnę.
  11. Wlać mieszaninę do kolumny o pojemności 20 ml i zebrać przepływ. Przemyć kolumnę 4 x 25 ml buforu do przemywania wodą.
  12. Eluować za pomocą 1 x 10 ml buforu elucyjnego (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 7,5], 1 mM EDTA, 250 mM Imidazolu) do świeżej probówki o pojemności 15 ml, zbierając oddzielnie wczesną i późną elucję (wczesna elucja to pierwszy 1 ml, późna elucja to ostatni 1 ml).
  13. Przeanalizować wszystkie zebrane frakcje za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE), aby upewnić się, że HUH został pobrany podczas elucji (patrz rysunek uzupełniający S1). Aby uzyskać najlepsze wyniki, załaduj żel 4-20% i uruchom go na 45 minut przy 35 W i 200 V.
  14. Dodać eluowane białko do rurki dializacyjnej i inkubować przez noc w buforze dializacyjnym (takim samym jak bufor do lizy) w temperaturze 4 °C. Aby usunąć znacznik HIS, należy dodać ULP1 bez środka redukującego bezpośrednio do eluowanego białka przed umieszczeniem białka w wężyku dializacyjnym
    15. .
  15. Następnego ranka przygotuj żywicę Ni-NTA zgodnie z opisem w krokach 1.7-1.9 i inkubuj z dializowanym białkiem. Wlać mieszaninę białka i żywicy Ni-NTA do kolumny i zebrać przepływ. Przemyć kolumnę 10 ml buforu do dializy i zebrać ewentualny przepływ.
  16. Oceń zebraną frakcję na SDS-PAGE zgodnie z powyższymi ustawieniami, aby upewnić się, że białko jest obecne, i skoncentruj do pożądanego stężenia za pomocą 15 ml filtra ultraodśrodkowego z granicą masy cząsteczkowej 10 kDa (patrz rysunek uzupełniający S1).
    UWAGA: Idealne końcowe stężenie białka wynosi od 40 μM do 100 μM.

2. Przygotowanie do RAD-TGT

  1. Złożyć dupleksy w stosunku molowym nici kotwiczącej (z wygaszaczem) do nici ligandowej (z fluoroforem) w końcowym stężeniu 40 μM nici ligandowej w roztworze 10 mM Tris (pH 7,5), 50 mM NaCl i 1 mM EDTA.
  2. Wyżarzanie przez inkubację w temperaturze 98 °C przez 5 minut, a następnie chłodzenie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę; chronić przed światłem.
    UWAGA: Próbki o małej objętości łatwo odparowują i mogą być trudne do całkowitego odzyskania. Przygotuj większą objętość niż to konieczne.
  3. Odreagować wyżarzone dupleksy z HUH (przy użyciu stężenia najmniej obfitej nici podczas wyżarzania; w tym przypadku nici liganda) w stosunku molowym 1:2 przy końcowym stężeniu 10 μM duplex i 20 μM HUH w roztworze zawierającym 1 mM MnCl2, 50 mM HEPES (pH 8), 50 mM NaCl.
  4. Inkubować reakcję przez 30 minut w temperaturze 37°C w termocyklerze lub bloku grzewczym chronionym przed światłem. Po inkubacji zdjąć z ognia i użyć minifuge stołowego, aby odwirować teraz zmontowane TGT. Albo natychmiast pokryć TGT, albo przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności.

3. Przygotowanie powierzchni

  1. Natychmiast po otwarciu 96-dołkowej szklanej płyty dennej przykryj wszystkie studzienki samoprzylepną folią PCR, aby zachować niewykorzystane studzienki do późniejszego wykorzystania. Za pomocą żyletki wyciąć folię nad interesującymi Cię studzienkami (najlepiej dołkami bez krawędzi) i dodać 100 μl zimnego PBS do żądanych dołków.
    UWAGA: Po dodaniu cieczy do studzienek nie pozwól, aby studzienki wyschły. Jeśli dojdzie do wysuszenia, niespecyficzna adsorpcja biomolekuł na powierzchni będzie miała negatywny wpływ na dane. Utrzymuj 100 μl nadmiaru objętości w studzience, aby zapobiec wysuszeniu.
  2. Dodaj 200 μl zimnego PBS do studzienek, delikatnie wymieszaj pipetą 2-5x i usuń 200 μl PBS. Powtórz w sumie trzy prania.
    UWAGA: Podczas dodawania i usuwania cieczy z dołków należy trzymać końcówkę pipety na krawędzi studzienki pod kątem 45°, aby uniknąć naruszenia powierzchni. Zrób to dla wszystkich czynności związanych z płytką, z wyjątkiem galwanizacji komórek.
  3. W przypadku studzienek doświadczalnych należy przygotować roztwór 0,1 mg/ml Biotinylated-BSA w PBS i dodać 80 μl roztworu do żądanych studzienek. W przypadku studzienek kontrolnych należy przygotować ten sam roztwór z dodatkiem 18,75 μg/ml fibronektyny i dodać 80 μl do odpowiednich studzienek. Delikatnie wymieszaj pipetą wszystkie użyte studzienki, przykryj pokrywką na płytce i przykryj folią. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Usunąć 80 μl objętości ze studzienek i umyć studzienki, powtarzając krok 3.2. Dodać 80 μl 0,1 mg/ml neutrawarydyny do roztworu PBS w taki sam sposób, jak w kroku 3.3.
  5. Po inkubacji usunąć 80 μl objętości z dołków i powtórzyć krok 3.2. Rozcieńczyć zmontowane TGT (etap przygotowania RAD-TGT 2) do 0,1 μM w PBS i 80 μl roztworu do studzienek w podobny sposób, jak w kroku 3.3. Studzienki należy przykryć folią samoprzylepną i przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C lub chronić przed światłem i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed przystąpieniem do eksperymentów.
    UWAGA: Zalecamy potraktowanie kroku 3.5 jako punktu zatrzymania i poczekanie do następnego dnia, aby kontynuować eksperymenty.

4. Protokół eksperymentalny RAD-TGT

  1. Po odpowiednim czasie na przyleganie TGT umyj studzienki (patrz krok 3.2) 3 razy PBS, a następnie dwukrotnie przepłucz je pożywką bez surowicy. Pozostaw media w studzienkach po ostatnim myciu. Dodać 200 μl PBS do studzienek obwodowych, aby złagodzić wszelkie efekty krawędziowe, a następnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C w celu wstępnego ogrzania płytki.
  2. Odzyskaj interesujące komórki przy ~ 80% zbiegu i odessaj pożywkę, a następnie dodaj i zaaspiruj PBS w celu umycia komórek. Dodać odpowiednią objętość trypsyny i umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, aż komórki się rozdzielą (~5-10 min).
  3. Po dysocjacji komórek należy dodać pierwotną objętość kompletnego podłoża komórkowego używanego do utrzymania komórek na płytce i ponownie zawiesić za pomocą pipety serologicznej. Dodać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  4. Odwirować komórki w stężeniu 300 × g przez 4 minuty, odessać pożywkę i ponownie zawiesić osad w PBS. Powtórzyć wirowanie i aspirację, a następnie ponownie zamieszać w 5 ml pożywki bez surowicy i powtórzyć wirowanie i aspirację. Ponownie zawiesić komórki w ~ 2 ml pożywki bez surowicy.
  5. Określ gęstość ponownie zawieszonych komórek i dostosuj stężenie zgodnie z potrzebami.
    UWAGA: Naszym celem jest płytkowanie ~ 15 000 komórek na studzienkę, więc przygotowujemy komórki do stężenia 150 000 komórek / ml, co pozwala na pokrycie 15 000 komórek 100 μl ponownie zawieszonych komórek.
    1. Opcjonalnie: Jeśli ma być badane działanie leków lub innych środków farmakologicznych, należy dodać odpowiednie stężenie leku do komórek i zwrócić komórki do inkubatora. Odczekaj odpowiedni czas preinkubacji przed przejściem do następnego kroku.
  6. Wyjąć płytkę z inkubatora (krok 4.1) i usunąć objętość pożywki pozostałą z płukania z dołków doświadczalnych na wstępnie podgrzanej płytce. Umyj raz żądanym nośnikiem. Ostrożnie odpipetować 100 μl zawieszonych komórek do żądanych studzienek. Przenieść posiane komórki do inkubatora na 90 min.
    UWAGA: Delikatnie odpipetuj komórki do środka studzienek, starając się utrzymać pipetę w pionie.
  7. Po inkubacji usunąć ~125-170 μl objętości z dołków. W razie potrzeby delikatnie umyj komórki 200 μl podgrzanego PBS. Dodaj 50 μl trypsyny do każdej studzienki i włóż płytkę z powrotem do inkubatora, aż komórki zaczną się dysocjować (5-10 min).
    UWAGA: Upewnij się, że studnia nigdy nie wyschnie i że nie dojdzie do nadmiernej trypsynizacji.
  8. Dodać 160 μl świeżo przygotowanego buforu przepływowego (1 mM EDTA, 2% w/v albuminy surowicy bydlęcej, w zimnym PBS) do studzienek. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby oddzielić komórki, dodać 196 μl tej zawiesiny komórek do probówek PCR, a następnie 4 μl jodku propidyny i delikatnie wymieszać. Przygotować jedną próbkę kontrolną bez jodku propidyny, która posłuży jako kontrola bramkowania żywotności.
  9. Umieść probówki w pojemniku na lód z pokrywką blokującą światło i przystąp do pomiaru intensywności fluorescencji za pomocą cytometru przepływowego.

5. Zbieranie i analiza danych

  1. Przeanalizować każdą próbkę za pomocą cytometru przepływowego. Staraj się zebrać co najmniej 2 000 żywych pojedynczych komórek na próbkę.
    UWAGA: Zminimalizuj ekspozycję na światło w przypadku próbek, które nie zostały jeszcze przeanalizowane i trzymaj je na lodzie.
  2. Po zebraniu wszystkich danych przenieś pliki do wybranego oprogramowania i zabramuj komórki.
    1. Bramka dla komórek według obszaru rozproszenia do przodu (FSC-A) vs obszaru rozproszenia bocznego (SSC-A).
    2. Bramka dla singletów w populacji komórek według FSC-A vs wysokość rozproszenia do przodu (FSC-H).
    3. Bramka dla żywych komórek z populacji singletowej poprzez ustawienie bramki pionowej na histogramie intensywności obszaru jodku propydu na najwyższą wartość dla kontroli bez jodku propydyny, przygotowaną w kroku 4.8. Wszystkie zdarzenia, które nie przekraczają bramki, są aktywnymi komórkami
    4. Ustaw bramkę pionową na histogramie intensywności obszaru Cy5 (Cy5-A) podkoszulków, aby usunąć wszelkie niefluorescencyjne zdarzenia na kanale Cy5-A spowodowane przez szczątki komórek. Upewnij się, że ta bramka pionowa ma wartość mniejszą niż analizowane nieznakowane komórki, ale większą niż 0 intensywności fluorescencji.
    5. Aby przeanalizować populacje komórek, ustaw bramkę dwusieczną na 99. percentylu każdej odpowiedniej kontroli ujemnej.
    6. Zastosować bramkę o tej samej intensywności, co odpowiednie warunki doświadczalne, i zebrać procent komórek przekraczających bramkę kontroli ujemnej dla każdego warunku.
      UWAGA: Wartości procentowe mogą być bezpośrednio porównywane między kontrpróbami biologicznymi za pomocą odpowiedniej analizy statystycznej; Zobacz dane reprezentatywne.
  3. Przeanalizuj dane za pomocą mediany fluorescencji Cy5, dzieląc medianę intensywności liganda-WDV przez medianę samego WDV i porównaj te wartości między powtórzeniami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować użyteczność i łatwość użycia RAD-TGT, przeanalizowaliśmy wpływ inhibitorów kinazy Rho (ROCK) na mechanotyp komórek CHO-K1. Szlak ROCK bierze udział w organizacji aktyny i aktywacji miozyny. Wcześniejsze badania z użyciem TGT wykazały, że hamowanie ROCK zmniejsza zerwanie ścinania TGTs16,17,18. TGT przy ścinaniu lub dużej sile informują o siłach kurczliwych wywieranych przez zrosty ogniskowe, podczas gdy TGT pr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostarczyliśmy protokoły dotyczące sposobu przygotowywania i przeprowadzania eksperymentów RAD-TGT w celu zachęcenia naukowców z różnych dziedzin nauk przyrodniczych do włączenia mechanotypowania do ich przepływu pracy. Kluczową zaletą RAD-TGT, szczególnie dla osób o zdolnościach do produkcji białek, jest zastosowanie endonukleaz HUH do ligandów do dupleksów DNA z wysoką wiernością bez chemicznego sieciowania i/lub oczyszczania. Endonukleazy HUH obejmują rodzinę nukleaz, które wiążą się z jednoniciowym DNA w sposób specy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W.R.G. dziękuje za finansowanie z NIH R35GM119483. Biorender został wykorzystany do wykonania schematów figur.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka stożkowa 15 mlSarstedt62.554.205
96-dołkowa szklana płyta dolnaCellvisP96-1.5H-N
Samoprzylepna folia do PCRThermo Fisher ScientificAB-0626
AmpicillinApex Bioresearch Products 25-530
Bio-Rad 20 ml kolumnaBio-Rad7321010
Biotynylowany BSAThermo Fisher Scientific29130
BL21 (DE3) Kompetentny E. coliNew England BiolabsC2527H
Albumina surowicy bydlęcejThermo Fisher ScientificBP9703100
Inkubator do hodowli komórkowychThermo Fisher Wirówka do51030284
Scientific Thermo Fisher Scientific75009521
CHO-K1ATCCCCL-61
Rurki dializacyjneThermo Fisher ScientificPI88242
DMSOThermo Fisher ScientificD12345
EDTAThermo Fisher ScientificS311-100
Flow CytometrBDAccuri C6 Plus
FlowJo BDFlowJo v10.10
HEPESThermo Fisher ScientificBP310-1
ImidazolThermo Fisher ScientificO3196-500
IPTGIBI ScientificIB02125
LB agarFisher ScientificBP1425-500
Stojak ligandowyZintegrowane technologie DNAzaprojektowane przez użytkownika oligoGCT ATA AAC TCA CCG TAA TTT TTT GGC CCG CAG CGA CCA CCC TTT /3Cy5Sp/
bulion lizogeniczny (LB)Thermo Fisher ScientificBP1426-500
MnCl2Thermo Fisher ScientificM87-100
NaClThermo Fisher ScientificBP358-212
Białko NeutrAwidynaThermo Fisher Scientific31000
Nikiel-NTA żywica Thermo Fisher Scientific88222
PBSCorning21-031-CV
Szalka PetriegoVWR25384-342
Roztwór jodku propidynyCayman Chemicals10008351
SDS-PAGE żelBio-Rad4561096
Serum Free MediaThermo Fisher ScientificA4124801Gibco Optimem Używane, alternatywne podłoża wolne od surowicy są w porządku w użyciu
Ścinanie nici kotwicznejZintegrowane technologie DNAzaprojektowane przez użytkownika oligo/5IAbRQ//iBiodT/G GGT GGT CGC TGC GGG CC
SonicatorThermo Fisher Scientific15-345-139
TermocyklerBio-Rad1861096
TrisThermo Fisher ScientificBP152-500
TrypinThermo Fisher Scientific12605036
ultrafiltr odśrodkowy, 10 kDa odcięcieAmikon
Unzipping Anchor StrandZintegrowane technologie DNAzaprojektowane przez użytkownika oligo/5IAbRQ/GG GTG GTC GCT GCG GGC C/3Bio/
WDV PlasmidAddGene226983
WDV-Echistatin PlasmidAdd226985
Y-27632Selleck ChemicalsS1049Rozpuszczony w DMSO
Gene

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Puleo, J. I., et al. Mechanosensing during directed cell migration requires dynamic actin polymerization at focal adhesions. J Cell Biol. 218 (12), 4215-4235 (2019).
  2. He, L., Ahmad, M., Perrimon, N. Mechanosensitive channels and their functions in stem cell differentiation. Exp Cell Res. 374 (2), 259-265 (2019).
  3. Feng, Y., et al. Mechanosensing drives acuity of αβ T-cell recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (39), E8204-E8213 (2017).
  4. Kai, F., Laklai, H., Weaver, V. M. Force matters: Biomechanical regulation of cell invasion and migration in disease. Trends Cell Biol. 26 (7), 486-497 (2016).
  5. Chapman, M., Rajagopal, V., Stewart, A., Collins, D. J. Critical review of single-cell mechanotyping approaches for biomedical applications. Lab Chip. 24 (12), 3036-3063 (2024).
  6. Swaminathan, V., et al. Mechanical stiffness grades metastatic potential in patient tumor cells and in cancer cell lines. Cancer Res. 71 (15), 5075-5080 (2011).
  7. Graybill, P. M., Bollineni, R. K., Sheng, Z., Davalos, R. V., Mirzaeifar, R. A constriction channel analysis of astrocytoma stiffness and disease progression. Biomicrofluidics. 15 (2), 024103(2021).
  8. Kraning-Rush, C. M., Califano, J. P., Reinhart-King, C. A. Cellular traction stresses increase with increasing metastatic potential. PLoS One. 7 (2), e32572(2012).
  9. Yasunaga, A., Murad, Y., Li, I. T. S. Quantifying molecular tension-classifications, interpretations and limitations of force sensors. Phys Biol. 17 (1), 011001(2019).
  10. Liu, Y., Galior, K., Ma, V. P. -Y., Salaita, K. Molecular tension probes for imaging forces at the cell surface. Acc Chem Res. 50 (12), 2915-2924 (2017).
  11. Pawlak, M. R., et al. RAD-TGTs: high-throughput measurement of cellular mechanotype via rupture and delivery of DNA tension probes. Nat. Commun. 14 (1), 2468(2023).
  12. Wang, X., Ha, T. Defining single molecular forces required to activate integrin and notch signaling. Science. 340 (6135), 991-994 (2013).
  13. Jo, M. H., Cottle, W. T., Ha, T. Real-time measurement of molecular tension during cell adhesion and migration using multiplexed differential analysis of tension gauge tethers. ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 3856-3863 (2019).
  14. Tompkins, K. J., et al. Molecular underpinnings of ssDNA specificity by Rep HUH-endonucleases and implications for HUH-tag multiplexing and engineering. Nucleic Acids Res. 49 (2), 1046-1064 (2021).
  15. Lovendahl, K. N., Hayward, A. N., Gordon, W. R. Sequence-Directed Covalent Protein-DNA Linkages in a Single Step Using HUH-Tags. J Am Chem Soc. 139 (20), 7030-7035 (2017).
  16. Kim, K. A., Vellampatti, S., Hwang, S. H., Kim, B. C. DNA-based single molecule force sensor for characterization of α 5 β 1 integrin tension required for invadopodia formation and maturation in cancer cells. Adv Funct Mater. 32 (28), 2110637(2022).
  17. Wang, X., et al. Integrin molecular tension within motile focal adhesions. Biophys J. 109 (11), 2259-2267 (2015).
  18. Ma, R., et al. Molecular mechanocytometry using tension-activated cell tagging. Nat Methods. 20 (11), 1666-1671 (2023).
  19. Pal, K., Zhao, Y., Wang, Y., Wang, X. Ubiquitous membrane-bound DNase activity in podosomes and invadopodia. J Cell Biol. 220 (7), e202008079(2021).
  20. Kim, K. A., Vellampatti, S., Kim, B. C. Characterization of integrin molecular tension of human breast cancer cells on anisotropic nanopatterns. Front Mol Biosci. 9, 825970(2022).
  21. Wang, Y., Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Optical sensor revealed abnormal nuclease spatial activity on cancer cell membrane. J Biophotonics. 12 (5), e201800351(2019).
  22. Zhao, Y., Sarkar, A., Wang, X. Peptide nucleic acid based tension sensor for cellular force imaging with strong DNase resistance. Biosens Bioelectron. 150, 111959(2020).
  23. Rashid, S. A., et al. All-covalent nuclease-resistant and hydrogel-tethered DNA hairpin probes map pN cell traction forces. ACS Appl Mater Interfaces. 15 (28), 33362-33372 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Traction Force MicroscopyTension Gauge TetherIntegrin Ligand EchistatinCell Mechanical ForcesHigh Throughput MeasurementCell IsolationFluorescence Intensity

Powiązane artykuły