Generowanie hodowli pierwotnych do obrazowania żywych komórek keratinocytów

Podsumowanie

Protokół ten określa hodowlę świeżo pozyskanych (przepustka 0) keratynocytów do wykorzystania w obrazowaniu żywych komórek.

Streszczenie

Śledzenie komórek macierzystych i zachowań zakorzenionych progenitorów na poziomie pojedynczych komórek w ludzkiej skórze stanowiło wyzwanie zarówno in vivo , jak i in vitro. Obrazowanie żywymi komórkami umożliwiło znaczący postęp w rozpoznawaniu różnic między komórkami macierzystymi keratynocytów a zachowaniami zadeklarowanych progenitorów. Obrazowanie żywymi komórkami to ewoluująca i nieco wymagająca metoda badania zachowań keratinocytów in vitro. Protokół ten został opracowany do hodowli keratynoocytów o niskiej gęstości zasiewniczej, co umożliwia stosunkowo długoterminową fotografię poklatkową i monitorowanie zachowania poszczególnych komórek. Keratynocyty przepustkowe 0 są hodowane przy gęstości klonalnej, a fotografia poklatkowa pozwala dokumentować poszczególne podziały komórkowe i czas ich wystąpienia. Dla maksymalnej istotności biologicznej, świeżo wyizolowane ludzkie keratynocyty umieszcza się in vitro. To podejście koncentruje się na proliferacji. Jednak protokół ten można dostosować do innych zastosowań obrazowania żywych komórek, które mierzą zachowanie poszczególnych komórek, takie jak migracja komórek, gojenie się ran czy ruchliwość.

Wprowadzenie

Celem tego protokołu jest umożliwienie śledzenia pojedynczych keratinocytów w hodowli przez stosunkowo długi czas (kilka tygodni), co jest możliwe dzięki niskiej gęstości zasiewów i fotografii poklatkowej. Obrazowanie żywych komórek przy niskiej gęstości daje badaczom możliwość wizualizacji zachowania komórek in vitro na poziomie pojedynczych komórek. Chociaż nie jest to możliwe w konwencjonalnej hodowli komórkowej, obrazowanie żywych komórek umożliwia tworzenie drzew linii w czasie rzeczywistym, bez użycia oznakowania, dzięki czemu można uzyskać informacje o kinetyce podziału, takie jak czas trwania cyklu komórkowego oraz udział podziałów proliferacji i różnicowania w kolonii. Umożliwia także badanie migracji i ruchliwości komórek. Może być technicznie wymagający, z aspektami wymagającymi optymalizacji, w zależności od typu komórki i danych, które mają być zebrane. Inne laboratoria wykorzystały neonatalne keratinocyty i/lub przechodzone keratynycy, które łatwiej hodować¹.

Jednak linie komórkowe podlegające powtarzającemu się passingowi różnią się znacząco pod względem zachowania i morfologii od stanu in vivo ². Aby uzyskać największe biologiczne znaczenie i uzyskać najbliższe zachowanie in vivo , stosuje się komórki o przejściu 0. W populacjach keratynocyta możliwe jest rozróżnienie komórki macierzystej od zaangażowanego progenitora bez sortowania czy etykietowania, ponieważ istnieją wyraźne różnice w zachowaniu podziału, które można zaobserwować za pomocą obrazowania komórek żywych³.

Wykorzystujemy obrazowanie żywych komórek do badania kinetyki proliferacji keratinocytów. Podobne podejście zastosowano do badania ruchliwości komórek czerniaka skórnego współhodowanych z keratinocytami⁴, adherentnej migracji komórek testów scratch⁵ oraz wpływu inhibitorów ROCK na proliferację keratinocytów⁶. Protokół ten jest specjalnie zaprojektowany do hodowli komórek, aby ułatwić śledzenie linii za pomocą obrazowania komórek żywych, choć może być dostosowany do innych celów.

Protokół ten opisuje izolację keratynocytów przejścia 0 do celów obrazowania komórek żywych, omawia komplikacje, które mogą się pojawić, oraz zawiera kwestie wymagające zmian w protokole (Rysunek 1).

Protokół

Na wykorzystanie tkanek ludzkich wymagana jest zgoda Komitetu ds. Badań Ludzkich instytucji. Próbki ludzkie do badań często pozyskuje się z komercyjnych źródeł (na przykład ATCC, technologii komórek Lifeline oraz Zen-Bio). Nasze badania wykorzystują odrzuconą tkankę podczas operacji lub pobrane próbki biopsji skóry specjalnie do celów badawczych. W takich sytuacjach wymagana jest odmienna zgoda i procedury uzyskania zgody. Wszystkie tkanki są pobierane po zatwierdzeniu przez Komisję ds. Badań Ludzkich UCSF, wykorzystując pisemną świadomą zgodę i zgodnie z zasadami Deklaracji Helsińskiej.

1. Oddzielenie naskórka od skóry

1. Upewnij się, że uzyskano odpowiednie zgody na wykorzystanie ludzkiej tkanki do badania.
2. Pobierz próbkę skóry i przetransportuj ją w izolowanym pojemniku z okładem z lodu. Umieść próbkę w pożywce zawierającej 5-krotną koncentrację penicyliny, streptomycyny i amfeterycy.
   UWAGA: Wymagana ilość zależy od zastosowania. Z naszego doświadczenia wynika, że około 1 000 000 keratynocytów na^cm2 pochodzi ze skóry dorosłych i starszych. Jednak może się to znacznie różnić w zależności od próbki.
   1. Umieść napletek noworodka w pożywce komórkowej i rozpocznij procedurę izolacji keratinocytów nie później niż 48 godzin po obrzezaniu, aby zminimalizować śmierć komórek. Przechowuj tkankę w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia. Przetwarzanie próbek dorosłych i starszych zazwyczaj rozpoczyna się w ciągu kilku godzin od pobrania.
3. Uzyskaj dostęp do szafy biobezpieczeństwa z wyposażeniem poziomu BS2, zaprojektowaną do pracy z czynnikami powodującymi choroby przez spożycie, ekspozycję błon śluzowych lub przezskórną⁷. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego jest sterylizowana UV przez co najmniej 15 minut oraz że wszystkie powierzchnie są spryskane alkoholem 70% przed użyciem.
4. Załóż rękawiczki, spryskaj pojemnik 70% alkoholem i włóż pojemnik do okapu oparowego. Umieść podkładkę chłodzącą pod tkanką, aby zapobiec jej nagrzewaniu się do temperatury pokojowej i zachować jej integralność. Jeśli tkanka jest bardzo duża, odetnij część do obróbki, a resztę trzymaj wilgotną w pojemniku do zbierania.
   UWAGA: Ponieważ wiele starych okazów to duże skóry brzucha lub piersi po operacjach, cięcie i przetwarzanie tkanek zajmuje trochę czasu. Tkanka nigdy nie powinna być nakładana bezpośrednio na podkładkę, ponieważ ekstremalne zimno może spowodować jej zamarznięcie. Zamiast tego powinien być umieszczony na powierzchni pośredniej, takiej jak marmurowa płyta.
5. Umieść w kapturze dwie szalki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm oraz sterylny skalpel chirurgiczny #23.
6. Otwórz szalki Petriego i umieść je na powierzchni szafki tak, aby wewnętrzne powierzchnie każdej misy były skierowane do góry. Dodaj 10 ml 10% chlorheksydyny glukonianu do jednej z szalek Petriego. Dodaj 10 ml 5x penicyliny/streptomycyny/amfeteryny/gentamycyny w roztworze Hank's Balanced Salt Solution (HBSS; 5x) do 2 innych połówek szalki Petriego (patrz Tabela materiałów).
7. Przygotuj płytkę z 6 dołkami do etapu Dispase. Do tkanek noworodkowych należy stosować 3 ml Dispase na dołek. Do próbek tkanek starzonych użyj 4 mL. Stosowanie niewystarczającej ilości Dispase dla objętości tkanek może utrudniać oddzielenie naskórka od skóry.
8. Użyj skalpela, aby pociąć tkankę na mniejsze kawałki, aby lepiej przeniknęła ją Dispase. Dyspas przenika tylko do 5 mm od krawędzi tkanki, dlatego tnij długie paski tkanki o szerokości 0,5-1 cm. Jeśli nie zostanie przycięta wystarczająco na drobno, nie nastąpi oddzielenie naskórka od skóry skórnej.
   1. Tnij grubszą tkankę na mniejsze kawałki. Pokrój napletek noworodka na 3 lub 4 części (~5 mm x 7 mm). Używaj maksymalnie dwóch całych napletków na dołek Dispase. Powierzchowne płaty brzuszne są zazwyczaj znacznie cieńsze, z minimalną lub żadną tkanką podskórną, pociń je na dłuższe paski (~5 mm x 15 mm).
   2. Umieść maksymalnie cztery paski na studnię Dispase. Jeśli pobrana tkanka zawiera dużo tłuszczu podskórnego, przytnij tkankę podskórną, aby pomóc Dispase w pełni przeniknąć tkankę. Jeśli tkanka zostanie przecięta zbyt mało, może być potrzebne zastosowanie mikroskopu rozcinającego, aby określić, która strona jest naskórna, a która skórna, podczas odklejania naskórka. Uszkodzenie niewłaściwej strony skóry może spowodować dodatkowe urazy tkanek.
9. Umieść stronę naskórną tkanki w pierwszej szalce Petriego przygotowanej w kroku 1.6, zawierającej 10% glukonianu chlorheksydyny, przez 10-20 sekund. Następnie przenieś stronę naskórną tkanki do drugiej szalki Petriego, zawierającej 5x penicyliny/streptomycyny/amfoceryny (PSA) z HBSS, i mieszaj przez 10-20 sekund. Przenieś stronę naskórną tkanki do trzeciej szalki Petriego, ponownie zawierającej 5x PSA z HBSS, i pomieszaj przez kolejne 10 sekund. Przetwarzanie wielu próbek tym samym roztworem jest akceptowalne.
10. Przenieś stronę naskórną tkanki na 6-dołkową płytkę Dispase przygotowaną w kroku 1.7.
    UWAGA: Polecamy stronę epidermalną na naszej konwencji. Inne protokoły zalecają obniżenie skóry skórnej⁸. Nie wszystkie Dispase są równie skuteczne. Złuszczanie naskórka od starzejącej się skóry okazało się wyzwaniem przy niektórych produktach, nawet w stężeniach przekraczających 4x zalecany przez producenta. Spowodowało to utratę czasu i okazów. Firmy używają niestandaryzowanych jednostek dla Dispase, co utrudnia rozpoznanie, jak różnią się stężenia między markami. Ze względu na te wyzwania zaleca się stosowanie jednej z marek Dispase wymienionych w Tabeli Materiałów .
11. Oznacz płytkę z 6 dołkami zawierającą Dispase i próbki, a następnie przenieś do 4 °C. Inkubuj próbki noworodków przez 16-18 godzin w Dispase oraz próbki dorosłych/starszych przez 24 godziny.
    UWAGA: Istnieje alternatywny protokół 2 godzin, który można stosować dla próbek, gdzie próbka jest umieszczana w fazie dyspozycyjnej w 37 °C przez 2 godziny, a następnie naskórek jest obierany. Niestety, nie zawsze się to sprawdza, a integralność tkanki może zostać osłabiona po inkubacji, co skutkuje utratą próbki. Inkubacja nocna jest preferowana, gdy tylko jest to możliwe.

2. Izolacja keratynocytów

1. Umieść 0,05% Trypsin-EDTA (lub TrypLE), roztwór neutralizujący trypsynę oraz podłoże keratinoctowe w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C 20 minut przed rozpoczęciem kolejnych kroków
2. Wyjmij płytkę z 6 dołkami z temperatury 4 °C, spryskaj ją 70% etanolem i umieść w przygotowanej szafce na zabezpieczenia biologicznego (patrz krok 1.3).
3. Umieść sterylne i bezząbkowe kleszcze w stożkowej rurce 50 mL zawierającej 20 mL etanolu 70%. Jeśli na początku jesteś poza maską, spryskuj kleszczem 70% etanolu przed włożeniem do maski.
4. Używając chemicznie sterylizowanych kleszczy, chwyć kawałek tkanki i połóż go na sterylnej powierzchni naskórkiem do góry (użyj szalki Petriego lub wnętrza górnej połowy płytki z 6 dołkami). Trzymaj skórną część tkanki za pomocą ząbkowanych kleszczy za pomocą niedominującej ręki i jednocześnie mocno chwyć naskórek nieząbkowymi kleszczami i ściągnij ją od krawędzi do krawędzi. Powinno wyjść gładko jak jedna całość.
5. Umieść naskórek na wewnętrznej stronie wargi stożkowej rurki o pojemności 15 mL. Każda stożkowa rurka o pojemności 15 mL powinna mieć naskórek składający się maksymalnie z dwóch napletków.
   1. Pracuj efektywnie; jeśli tkanka wyschnie, wydajność zostanie osłabiona. Jeśli Dispase nie przeniknął właściwie do tkanki, może wystąpić trudności z odklejeniem naskórka. W takim przypadku oderwij lub zeskrobaj naskórek z podskórnej skóry. To również skutkuje znacznie niższym plonem i nie jest zalecane.
6. Dodaj 4 mL 0,05% trypsyny-EDTA do stożkowej probówki o pojemności 15 mL, a następnie zamknij i odwróć rurkę, aby upewnić się, że cała naskórka jest zawieszona w trypsinie, a nie przyklejona do boku tubki/pokrywki. Umieść w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Pobudzaj komórki co 2 minuty ręcznie.
   UWAGA: Trypsynizacja przez więcej niż 10 minut może skutkować niższą wydajnością komórek. Jeśli niepokój dotyczy integralności białek powierzchniowych komórek, należy stosować TrypLE, ponieważ jest bardziej specyficzny dla miejsca rozszczepienia, co powoduje mniejsze uszkodzenia komórek i wykazano, że nie zmniejsza istotnie ekspresji antygenów powierzchniowych w porównaniu z Trypsin-EDTA⁹. Ponadto kąpiel wodna jest częstym źródłem zanieczyszczenia, dlatego dbaj o jej regularne czyszczenie. Regularnie wymieniaj wodę z wodą dejonizowaną zawierającą roztwór aquaguard-2.
7. Włóż stożkową probówkę o pojemności 50 ml do szafki zabezpieczeń biologicznych. Odkręć pokrywkę i umieść sitko ogniwa 100 μm na otworze stożkowej rurki.
8. Wyjmij stożkową probówkę o pojemności 15 mL zawierającą strawioną próbkę z kąpieli wodnej, dokładnie wysusz i spryskuj alkoholem 70% przed ponownym umieszczeniem jej w szafce zabezpieczeń biologicznych. Stukaj stożkową rurką 3 razy w powierzchnię okapu, a potem odwróć 6 razy. Powtarzaj cykl stukania i odwracania 3 razy.
9. Dodaj 6 ml roztworu neutralizującego trypsynę do stożkowej rurki. Przelej przez sitko do 50 mL stożkowej rurki od kroku 2,7.
10. Przepłucz stożkową probówkę o pojemności 15 mL z próbką 5 ml roztwórów neutralizujących trypsynę (TNS). Przelej przez sitko do komórki do stożkowej rurki o pojemności 50 mL. Wiruj w 300 x g przez 5 minut.
11. Natychmiast wyjmij z wirówki i pipetuj supernatant, aby zapobiec utracie komórek do medium. Powinien pozostać tylko granulek z niewielką ilością płynu. Może być trudno dostrzec granulkę z mniejszych próbek tkanek.
    UWAGA: W supernatancie obecna jest trypsyna, dlatego najlepiej usunąć jej jak najwięcej, nie tracąc przy tym granulatu.
12. Ponownie zawiesij pellet keratinocytów w 2 mL podłoża keratinocytowego.
    UWAGA: Są tu dwie kwestie. Po pierwsze, jakich mediów użyć. W tym celu zaleca się stosowanie medium bez surowicy bez kolagenu. Historycznie standardem hodowli komórek keratinocytów był Zmodyfikowany Medium Orła (DMEM) Dulbecco +10% płodowej surowicy bydła (FBS) + F-12 Hama na warstwie fibroblastowej (3t3-J2s)¹⁰. Jednak wraz z pojawieniem się mediów wolnych od surowicy i dostępnością kolagenu, wiele innych możliwości pozostaje realnych (zobacz dyskusję)¹¹. Drugą kwestią jest to, czy stosowanie antybiotyków w pożywce hodowlowej jest odpowiednie do obrazowania żywych komórek. To zależy od czasu trwania obrazowania oraz doświadczenia z systemem obrazowania. Kolonie są obrazowane przez kilka tygodni za pomocą wspólnego systemu obrazowania, co sprawia, że stosowanie antybiotyków jest preferowanym rozwiązaniem mimo potencjalnego wpływu na hodowle (patrz dyskusja). Podczas rezawiesji stosuje się penicylinę, streptomycynę, amfotericynę B oraz keratynocyny zawierające gentamynę, a po początkowej zmianie podłoża na nośnik zawierający penicylinę/streptomycynę. Metoda ta skutecznie zapobiegła skażeniu podczas długotrwałego obrazowania żywych komórek.
13. Policz komórki i zasiewaj płytkę (zobacz dyskusję na temat wyboru gęstości siewu). Aby zapewnić równomierny rozkład nasiew, przed powlekaniem ponownie zawiesij komórki keratynocytów w całkowitej ilości podłoża do pokrycia. Po delikatnym poruszeniu przez inwersję lekko przewij przez 1-2 sekundy i wybierz płytę. Następnie przesuwaj mikropłytkę w wzorze krzyżowym (góra-dół, lewo-prawo) 3 razy w inkubatorze.
14. Po 24 godzinach umieść płytkę w inkubatorze systemu obrazowania żywych komórek. Wykonuj obrazowanie komórek na żywo 10 razy, z obrazami robionymi co 20 minut. Umieszczaj próbki w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 w inkubatorze podłączonym do mikroskopu.

Wyniki

Biorąc pod uwagę wiele zmiennych, które mogą być manipulowane w tej metodzie, a które ostatecznie prowadzą do różnych rezultatów, przedstawiamy tutaj typowe błędy i ich skutki, a także przedstawiamy przykładowe wyniki i okoliczności ich istnienia.

Jak w przypadku każdej techniki hodowli komórek, możliwe jest skażenie (Wideo uzupełniające 1). Oprócz starannych technik sterylnych, rozważ stosowanie antybiotyków w podłożu, zwłaszcza jeśli hodowla jest stosowana przez dłuższy czas...

Dyskusja

Tutaj szczegółowo przedstawiliśmy metodę pierwotnej hodowli ludzkich keratinocytów w celu obrazowania żywych komórek. Metoda ta adaptuje istniejące techniki hodowli komórkowych, wykorzystując płytkowanie o niskiej gęstości i hodowlę długoterminową, co umożliwia skuteczne badania obrazowania żywych komórek. Preferowana metoda dysocjacji tego typu komórek polega na dwustopniowym trawieniu enzymatycznym, które wykazano, że skutkuje powstawaniem keratynocytów, z których 3%-4% jest zdolnych do tworzenia kolonii

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,05% trypsyna-EDTA (1X), 100 mL	Gibco	25300-054
Filtr ogniwa 100 um	Corning	352360
15 cm³ Falcon	Corning	352096
50 cm³ stożkowy Falcon	Corning	352070
Mikropłytka 6-dołkowa	Corning	3516
70% alkoholu odczynnikowego, 4 litry	VWR Chemicals	BDH1164-4LP	Możesz też rozcieńczyć własne
Amfocerycyna B, 50 ml	Corning	30-003-CF	Rozcieńcz do 5X (50 ug/mL)
Dipaza, 100 ml	Corning	354235	Rozcieńcz 1:1 HBSS, dodaj 1x gentamycyny, filtruj sterylizację
Epilife, 50 mL	Gibco	MEP1500CA	Dodaj HKGS, rozważ antybiotyki
Płodowa wartość surowicy bydła z inaktywowanym cieplem FBS, 500 ml	Gibco	A52568-01	FBS
Kleszcze
Gentamicyna, 10 ml	Gibco	15750-060	Rozcieńcz do 50 ug/ml dla 5X
Zrównoważony roztwór soli Hanka (1X), 500 ml	Gibco	14170-112	(HBSS)
HBSS 5X PSAG			To jest HBSS + 5X stężenia Pen/Streptokoka/Ampho/Gent
Hibiclens, galon	Molnlycke	57591	Rozcieńcz do 10% za pomocą dejonizowanego H2O
Ludzkie serum wzrostu keratinocytów, 5 mL	Gibco	S-001-5	Dodane do epilife
Penicylina/Streptomycyna, 100 ml	Corning	30-002-Cl	Rozcieńcz do 5X (dostępny w 100x fabryczny) dla 5X PSA - 1X do wymiany mediów
Szalka Petriego 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
Ostrze skalpelowe nr 23	VWR	76457-480
TrypLE	Gibco	12604021	Mniej alternatywa dla zwykłej trypsyny
Roztwór neutralizujący trypsynę			(TNS), to HBSS z 10% FBS (niektórzy używają mniej surowicy, 5%)