Artykuł metodologiczny

Charakterystyka zależnej od pH odwracalnej samoorganizacji koloidów złota pokrytych amyloidem beta 1-40

DOI:

10.3791/67856

⸱

21 marca 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, State University of New York Geneseo College

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy systematyczną metodę opisującą quasi-odwracalną samoorganizację agregatów złota o długości 20 nm pokrytych amyloidem beta 1-40 (Aβ 1-40). Zależna od nanorozmiaru, quasi-odwracalna sieć między peptydami została skorelowana z określonymi aminokwasami lub sekcjami monomeru Aβ 1-40.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Charakterystyka Aβ 1-40 pokrytego powierzchniami nano-złotych koloidalnych cząstek została przeprowadzona przy użyciu spektroskopii powierzchniowego rezonansu plazmonów (SPR) i transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). Obserwowane zależne od pH przesunięcie pasma SPR cząstek złota o długości fali 20 nm pokrytych Aβ 1-40 było skorelowane z naprzemiennością agregacji i dezagregacji obserwowaną na obrazach TEM. pH ~4 indukowało rozwiniętą konformację, a pH ~10 indukowało pofałdowaną konformację Aβ 1-40 na powierzchni złota. Ten odwracalny proces agregacji zaobserwowano za pomocą obrazowania ramanowskiego, gdy pH stopniowo zmieniało się z pH 4 na pH 10. Zaobserwowaliśmy zależną od pH zmianę morfologii Aβ 1-40 na powierzchni złota, gdzie przy pH 4 zaobserwowano klarowne agregaty. Zaobserwowaliśmy jednak bardzo subtelne różnice w widmie spektroskopii Ramana wzmocnionej powierzchniowo (SERS) między warunkami pH 4 i pH 10, przy czym najbardziej uderzającą różnicą jest gęstość widmowa w zakresie od 250 cm-1 do 1750 cm-1. W szczególności analiza modalna odwracalnej agregacji wykazała, że agregaty zostały utworzone przez rozwiniętą konformację Aβ 1-40, która obejmowała przekrój pierścienia benzenowego tyrozyny i fenyloalaniny. I odwrotnie, demontaż agregatów był związany ze zmianami konformacyjnymi w fałdowaniu białek Aβ 1-40 z udziałem histydyny, glutaminy, metioniny i kwasu asparaginowego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibrylogeneza peptydów beta amyloidu 1-40 (Aβ 1-40) lub 1-42 (Aβ 1-42) została dokładnie zbadana jako kluczowy składnik w tworzeniu blaszek amyloidowych, które są przyczyną choroby Alzheimera1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Kluczowym mechanizmem fibrylogenezy jest oligomeryzacja peptydów Aβ 1-40 lub Aβ 1-42 w celu utworzenia neurotoksycznego agregatu białkowego, a ponadto przeprowadzono szeroko zakrojone badania w celu zrozumienia mechanizmów tworzenia oligomerów 12,13,14. Podjęliśmy podejście polegające na zbadaniu peptydów amyloidogennych tworzących agregaty na powierzchni nano-złota i zidentyfikowaniu czynników, które są odpowiedzialne za tworzenie sieci między peptydami, które znajdują się z dala od powierzchni złota15,16,17,18,19,20,21,22.

Aβ 1-40 przyjmują konformację rozłożoną (A) w warunkach kwaśnych (pH ~4) i konformację fałdowaną (B) w warunkach podstawowych (pH ~10). Zaobserwowaliśmy rozproszone cząstki koloidu złota pokryte Aβ 1-40 o pH ~10 i duże agregaty koloidu złota pokryte Aβ 1-40 o pH ~ 4 ( Rysunek 1) < klasa sup = "xref" >23,24. Rozwinięta konformacja Aβ 1-40 w warunkach kwaśnych sprzyja tworzeniu się sieci peptydów między monomerami Aβ 1-40 na powierzchni złota-nanocząstek, co powoduje tworzenie się agregatów koloidu złota (patrz A w Rysunek 1). Gdy monomer Aβ 1-40 utrzymuje złożoną konformację na zasadowym lub obojętnym pH, Aβ 1-40, monomery nie łączą się w agregaty, a powlekane nanocząstki złota pozostają jako pojedyncze rozproszone cząstki (patrz B w Rysunek 1). Możemy zatem zbadać proces, w jaki sposób peptydy Aβ 1-40 przechodzą zmiany konformacyjne w sieci i tworzą agregaty, mierząc przesunięcie pasma SPR w zakresie warunków pH25,26,27,28,29,30,31.

Przetestowaliśmy kilka różnych rozmiarów nanocząsteczek złota i stwierdziliśmy, że koloid złota o długości fali 20 nm wykazywał najbardziej widoczny odwracalny proces samoorganizacji monomerów Aβ 1-40 w odpowiedzi na zewnętrzną zmianę pH (Rysunek 2). Jest to wyraźna wskazówka odwracalnej zmiany w konformacji peptydów, w której warunki kwasowe (A) indukują konformację rozłożoną, wzmacniając sieć i prowadząc do agregacji koloidów złota. Stwierdzono, że podstawowy warunek (B) indukuje pofałdowaną konformację monomerów26,27,28,29,30,31.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie nanocząstek złota pokrytych Aβ 1-40

  1. Dodać 1 ml objętości destylowanej wody dejonizowanej do 1 mg liofilizowanego Aβ 1-40 (MW: 4,2 kDa, czystość 98% HPLC) za pomocą igły strzykawki. Mieszać roztwór z mieszalnikiem wirowym przez około 30 s i upewnić się, że w roztworze w temperaturze pokojowej (RT; ~20 °C) nie zaobserwowano żadnych cząstek stałych.
    1. Przygotować wszystkie roztwory podstawowe, używając wody dejonizowanej i destylowanej (~18 MΩ·cm).
    2. Spektroskopowo zidentyfikuj stężenie za pomocą absorpcji tyrozyny przy 275 nm32, który ma współczynnik ekstynkcji molekularnej ε275 wynoszący 1390 cm-1·M-1.
    3. Roztwory podstawowe Aβ 1-40 należy przechowywać w temperaturze -80 °C. (Patrz tabela materiałów dla produktów handlowych Aβ 1-40).
  2. Rozmrozić podstawowy roztwór peptydowy około 5 minut przed zebraniem danych. Zmieszać 8 μl objętości roztworu peptydu z 800 μl złotych cząstek koloidalnych w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać objętość 4,2 ml dejonizowanej wody destylowanej, a następnie wirować próbkę przez 10 s30,31,33,34.
  3. Ustal stężenie peptydów Aβ 1-40 na 1,8 nmol i zakres proporcji peptydów Aβ 1-40. Liczba koloidów złota wahała się od ~500:1 do ~2000:125.

2. Iteracyjna zmiana pH i monitorowanie odpowiadającego jej przesunięcia pasma SPR

  1. Ustawić temperaturę roztworu na określoną wartość (np. 25 °C) za pomocą regulatora temperatury spektrofotometru ultrafioletowo-widzialnego i bliskiej podczerwieni (UV-Vis-NIR).
  2. Monitorować początkowe pH roztworu próbki za pomocą pH-metru i ustawić je na nieco poniżej pH 7. Zebrać widmo absorpcyjne w zakresie od 400 nm do 1000 nm.
  3. Zmienić pH próbki na ~pH 4 (tj. pH 4,0 ± 0,3) poprzez dodanie 10 μl objętości 0,1 M HCl i zebrać widmo absorpcyjne między 400 nm a 1000 nm.
  4. Zmienić pH próbki na ~pH 10 (tj. pH 10 ± 0,3) dodając 10 μl objętości 0,1 M NaOH i zebrać widmo absorpcyjne między 400 nm a 1000 nm.
  5. Zmień pH między pH 4 a pH 10 za pomocą HCl i NaOH 10 razy i zbieraj widmo absorpcyjne w sposób ciągły w temperaturze 25 ± 0,2 °C29,30.
    UWAGA: Dla wszystkich roztworów próbek gęstość optyczna piku pasma SPR została utrzymana na poziomie około 0,2. Oczekuje się efektu buforu spowodowanego pozostałym roztworem buforowym w roztworze. W ten sposób ostateczną wartość pH określono po potwierdzeniu równowagi. Wartość pH mierzono bezpośrednio w kuwecie próbki za pomocą mikroelektrody pH, która ma dokładność ±0,005 pH.
  6. Uzyskaj amerykański standardowy kod wymiany informacji (ASCII) zestaw danych długości fal w funkcji absorbancji. Wyodrębnij średnią pozycję szczytów pasma za pomocą programu Peak Fit.
    1. Wykreśl zestaw danych, aby wyświetlić gęstość optyczną w funkcji długości fali (nm) za pomocą funkcji Wykres.
    2. Oznacz początkowe szczytowe długości fal λ1, λ2 i λ3, wybierając ich przybliżone pozycje na wykreślonych danych i dopasuj dane za pomocą funkcji RUN.
    3. Uzyskać wykres zawierający centralny pik każdego (λi), XCi, wraz z obszarem każdego pasma (Ai).
  7. Wyeksportuj wyodrębnione pozycje i obszary pików do programu arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią pozycję piku przy danym pH.
    1. Określ współczynnik wagowy ai dla każdego środka piku λi, porównując obszar pasma (Ai) z całkowitym obszarem całych pasm jako: figure-protocol-1.
    2. Wyodrębnij średnią pozycję szczytu, figure-protocol-2 (pH) za pomocą równania (1).
      figure-protocol-3 (1)
  8. Wygeneruj wykres odwracalności, korzystając z następującego procesu:
    1. Tabelaryzuj średnie pozycje pików, figure-protocol-4, jako funkcję każdej liczby "operacji", n as figure-protocol-5 vs. n. Spraw, aby numer operacji, n, wynosił 1 dla próbki przed dodaniem kwasu o pH ~ 7. Za każdym razem zwiększaj liczbę operacji o 1, zmieniając pH na ~pH4 z HCl lub pH na ~pH 10 z NaOH. Spraw, aby n było parzyste w stanie kwaśnym (tj. ~pH 4) i nieparzyste jako stan podstawowy (tj. pH 10).
    2. Przeanalizuj pozycję piku przy każdym n, figure-protocol-6 (n) = λ(n), używając wzoru30
      figure-protocol-7 (2)
      UWAGA: Przedstawić początkową średnią pozycję piku przy n = 1 przez A. Wyrazić parametry B i C jako zależne od n przesunięcie pozycji piku. Ustaw parametr D jako amplitudę współczynnika tłumienia, E, powtórzenia. Użyj funkcji sinus, aby pokazać pofałdowanie pozycji piku w funkcji n.
    3. Przenieś zestaw danych (x, y) do oprogramowania Origin i wydrukuj.
    4. Utwórz niestandardową funkcję podaną w równaniu (2) w sekcji Funkcja dopasowania krzywej nieliniowej analizy. Wpisz początkowe wartości A, B, C, D i E, a następnie kliknij przycisk URUCHOM, aby zakończyć dopasowanie.
  9. Obrazowanie TEM
    1. Wykonać próbki TEM koloidów złota o długości fali 20 nm pokrytych Aβ 1-40 z siatkami miedzianymi pokrytymi Formvarem. Zbadać próbki za pomocą TEM działającego przy napięciu 80 kV.
    2. Zbieraj obrazy w nominalnym powiększeniu 28 000x lub 71 000x za pomocą 4-megapikselowej kamery cyfrowej CCD (AMT) modelu XR-40. Zbierz obrazy TEM dla złota o długości fali 20 nm pokrytego Aβ 1-40 przy każdej operacji o numerze n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 i 10 (pH 4) oraz n = 3, 5, 7 i 9 (pH 10).

3. Obrazowanie ramanowskie i badanie agregacji odwracalnej

  1. Umieścić 100 μl roztworu na krążku miki (średnica 1 cm) dla każdej próbki w operacji numer n. Suszyć próbki przez noc przed pomiarem.
  2. Zbierz obrazy światła białego przy każdej operacji o numerze n. Przygotuj oddzielną próbkę na krążku miki, ponieważ pH było stale zmieniane między ~pH 4 a ~pH 10 dla każdej operacji o numerze n (Rysunek 3).
  3. Zbierz obraz Ramana przy każdej operacji o numerze n za pomocą lasera o długości fali λ = 633 nm przy mocy 0,5 ± 0,05 mW z rozdzielczością przestrzenną ~0,43 μm w siatce składającej się ze 100 × 100 pikseli o czasie integracji 500 ms/widmo dla obszaru od ~200 cm-1 do ~2,800 cm-1 (Rysunek 4).
  4. Wykreśl reprezentatywne widmo dla każdego n wyrównanego w funkcji n i skonstruuj trójwymiarowe widmo SERS jako funkcję n dla Aβ1-40 powlekanego złotem o długości 20 nm (Rysunek 5A). Wykorzystaj widok z góry trójwymiarowego widma SERS jako mapę konturową (Rysunek 5B), aby wyodrębnić określone mody związane z określonym stanem pH (tj. ~pH 4 i ~pH 10). Wyodrębnij dowolne cechy spektralne ulepszone dla tylko nparzystych lub tylko dla nnieparzystych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po przytwierdzeniu Aβ 1-40 do powierzchni nano-koloidalnych cząstek złota, pasmo SPR wokół maksimum absorpcji 530 nm znacznie przesunęło się ku czerwieni do pozycji pikowej ~650 nm, gdy roztwór stał się bardziej kwaśny (pH 4)35. Wraz z obrazami TEM stwierdziliśmy, że cechy spektroskopowe obserwowane przy pH 4 odpowiadają tworzeniu się agregatów koloidu złota o wiarygodnie rozwiniętej konformacji i sieci z otaczającymi rozwiniętymi monomerami Aβ 1-40 zaadsorbowanymi na powierzchni złota30. Zaobserwowaliśmy, że monomery Aβ 1-40 wracają do pofałdowanej konformacji w warunkach zasadowych (pH 10), co powoduje deformację agregatów w sposób quasi-odwracalny. Ten quasi-odwracalny proces był widoczny w naprzemienności średniego piku pasma (figure-results-1(n)), który przesuwał się między krótszą a dłuższą długością fali, oraz morfologii rozproszonej i zagregowanej w obrazach TEM między warunkami zasadowymi (pH = 10) i kwaśnymi (pH = 4). Wcześniej zaobserwowano, że część monomeru Aβ 1-40 pozostaje rozwinięta nawet po przywróceniu roztworu do warunków podstawowych36. Film 1 pokazuje zależną od pH zmianę koloru koloidu Aβ 1-40 i 20 nm z gołego złota.

Dla porównania, przeprowadzono badanie pH chmielu koloidu z gołego złota o długości fali 20 nm (Rysunek 5C i D). W miarę postępu operacji zmiany pH wykazano wzrost grupizacji koloidów złota w pasmach SPR, obrazach TEM, a także obrazach w świetle białym. Co ciekawe, istniało kilka linii widmowych SERS w zależności od nnieparzystych i nparzystych. Na przykład przy nparzystym (pH ~4) intensywnie obserwowano linię na 275 cm-1, która została przypisana jako tryb związany z Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 lub tryb Au-Cl- ligand38. Z drugiej strony, dla nparzystych, przy 1008 cm-1 zaobserwowano C-N str 39 i CH2 wag39, deform2 sup class="xref">40 była szeroko obserwowana na 1291 cm-1.

W przeciwieństwie do wyraźnej morfologii agregacji zależnej od pH i odwracalnej obserwowanej przez obrazowanie światłem białym, istniały stosunkowo subtelne różnice w cechach spektralnych w widmie SERS między nnieparzystymi i nparzystymi. W pierwszym przybliżeniu gęstość linii widmowych w obszarze od 250 cm-1 do 1750 cm-1 była wyższa dla nnieparzystych niż nparzystych. Linie widmowe w obszarze odcisków palców, 1250 cm-1 i 1750 cm-1 (pasma amidu I, II i III) dla nnieparzystych wykazywały mniej rozdzielcze cechy spektralne, co sugeruje albo poszerzenie, albo wzrost gęstości widmowej. Na Rysunek 6, mapa konturowa podana w Rysunek 5B (Rysunek 6B) został zorganizowany z sygnałami SERS na 761 cm-1 (czerwony) i 1395 cm-1 (niebieski), reprezentujący akcenty odpowiednio na nnieparzystych i nparzystych (Rysunek 6C). Jako reprezentatywne widmo SERS dla nnieparzystych i nparzystych, widmo SERS przy n = 7 (czerwony) i n = 4 (niebieski) jest pokazane na górze (Rysunek 6A). W celu pokazania zgodności z przesunięciem pasma SPR dla Aβ1-40 powlekanego złotem 20 nm, wykres przesunięcia pasma w Rysunek 3 jest pokazany z boku (Rysunek 6D).

Chociaż mamy wstępne dane na temat pełnego przypisania obserwowanego widma SERS, zauważamy tutaj kilka godnych uwagi cech przesunięć Ramana. Linie widmowe i (prawdopodobne przypisania) wzmocnione w nodd znajdują się głównie w obszarze niższym niż 1000 cm-1: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (indolowe przemieszczenie NH, C-C rozciąganie Met)39, 974 cm-1 (Glu, C-COO- rozciąganie Asp, tryb związany z cytrynianem)39,48,49. Przesunięcie Ramana wzmocnione przy n wykazałonawet znaczące cechy spektroskopowe w obszarze odcisków palców (Amid I, II i III): 1166 cm-1 (N-H+ deformacja Tyr)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amid III)39,50,51, 1395 cm-1 (COO- symetryczne rozciąganie lub CH2- CH3- nożyce Glu)39,48, 1585 cm-1 (pierścieniowe rozciąganie CC Phe, asymetryczne rozciąganie karboksylanu -Au, COO- rozciąganie cytrynianu, deformacja pierścienia benzenowego)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, C=C rozciąganie Tyr, CC rozciąganie pierścienia w Phe, rozciąganie pierścienia benzenowego i COO- rozciąganie w Phe i Tyr, oraz asymetryczne rozciąganie OH)39,41,48,50,51 oraz 1628 cm-1 (Podpik amidu I charakterystyczny dla międzycząsteczkowych struktur β-arkuszowych53, C=O i sprzężone tryby drgań CN/NH szkieletu białkowego pochodzące z równoległych struktur typu β-arkuszowego, akumulacja zagregowanych Aβ54, losowe cewki, β-zwoje, β-spinki do włosów48. Sekwencje pojawiające się dla nnieparzystych lub nparzystych są pokazane w Rysunek 7. Ogólnie rzecz biorąc, dla nnawet odpowiadającego odwracalnej agregacji lub rozwiniętej konformacji Aβ 1-40, Phe/Tyr zawierający pierścień benzenowy, symetryczne rozciąganie COO-, tryb nożycowy CH2- CH3- Glu i deformacja -NH+ Tyr były istotnie zaangażowane w zmianę konformacyjną peptydu. Podczas demontażu agregacji, którą zaobserwowano, gdy peptydy przyjęły sfałdowaną konformację odpowiadającą modom widocznym w nodd, Glu, Asp, Met, His i Ala wydawały się być zaangażowane.

figure-results-2
Rysunek 1: Absorbancja i morfologia zależna od pH. Pokazano widmo absorpcyjne przy pH 4 (A) i pH 10 (B) dla nanocząstek złota pokrytych Aβ 1-40 (20 nm) oraz odpowiadające im obrazy TEM, szkice cząstek agregowanych/rozproszonych oraz zdjęcia roztworów w fiolkach. A to rozłożona konformacja monomerów Aβ 1-40 w warunkach kwaśnych, a B to konformacja złożona w warunkach podstawowych. Schematy monomerów Aβ 1-40 w każdej morfologii konformacji i agregacji/dyspersji są pokazane obok obrazów TEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2: Odwracalność samoorganizacji zależna od rozmiaru nano. Przesunięcie średniej pozycji piku pasma SPR, figure-results-4, w funkcji liczby operacji, n, dla wszystkich badanych rozmiarów cząstek koloidu złota. Przybliżone wartości pH i odpowiadający im etap agregatów pokazane są również na Rysunek 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 3: figure-results-6 i TEM/obrazy światła białego przy każdym numerze operacji. figure-results-7 w funkcji numeru operacji, n, został wykreślony razem dla Aβ 1-40 pokrytego złotem 20 nm (zamknięte okręgi) i złotego koloidu 20 nm (otwarte okręgi) i jest pokazany z reprezentatywnymi obrazami TEM (A i C)/światła białego (B i D) przy wybranych numerach operacji (n = 1, 2, 3, 7 i 8 oznaczonych odkodowanymi strzałkami) dla koloidu złota Aβ 1-40 powlekanego złotem 20 nm (A i B) oraz koloidem złota 20 nm (C i D). czcionka oznacza pH 7, niebieska czcionka oznacza pH 4, a czerwona czcionka oznacza pH 10. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rysunek 4: Reprezentatywne białe światło i obraz Ramana. Obraz światła białego, obraz Ramana i widmo SERS dla (A) n = 2 i (B) n = 3; i) obraz światła białego w szerokim polu widzenia, ii) obraz w świetle białym w obszarze, w którym pobrano obraz Ramana (oznaczony czerwonym kwadratem w i)), iii) obraz Ramana dwóch połączonych składników, iv) obraz ramanowski składnika 1 i jego v) widmo SERS iv), vi) obraz ramanowski składnika 2, oraz vii) widmo SERS vi). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-9
Rysunek 5: Mapa konturowa widma SERS dla nnieparzystych, nparzystych i nwszystkich. (A) Trójwymiarowa mapa widma SERS w zakresie 250 cm-1 i 1750 cm-1 w funkcji n dla Aβ1-40 pokryta złotem o długości fali 20 nm z mapą konturową pokazaną w (B) na górze. (C) Trójwymiarowa mapa widma SERS w zakresie 250 cm-1 i 1750 cm-1 w funkcji n dla złota o długości fali 20 nm z mapą konturową pokazaną w (D) na górze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-10
Rysunek 6: Mapa konturowa SERS Spectrum. Mapa konturowa widma SERS w funkcji n (1-10). (A) Absorbancja przy 1395 cm-1 (niebieski) i 761 cm-1 (czerwony). (B-D) Dolny panel pokazuje widmo SERS, a prawy panel pokazuje amplitudę zmiany intensywności sygnału sygnałów SERS przy każdym n. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-11
Rysunek 7: Godne uwagi sekwencje Aβ1-40. Sekwencje, którym przypisuje się znaczące zaangażowanie przy nnieparzystych (odpowiadających tworzeniu się konformacji złożonej), są oznaczone czerwonymi strzałkami skierowanymi w dół, a te przypisane do znaczącego udziału w nparzystych (odpowiadających tworzeniu konformacji rozwiniętej) są oznaczone niebieskimi strzałkami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Zależna od pH zmiana koloru koloidu Aβ1-40 i 20 nm gołego złota. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową kwestią w badaniach konformacji peptydów jest utrzymanie próbki, ponieważ próbki ulegną pogorszeniu, jeśli będą niewłaściwie przechowywane. Próbki peptydów otrzymano w postaci liofilizowanej i zaczęły się denaturować po ponownym uwodnieniu destylowaną wodą dejonizowaną, nawet gdy były przechowywane w temperaturze -80 °C. Czystość koloidów złota została zweryfikowana za pomocą analizy kontroli jakości. W celu utrzymania stabilności koloidów przechowywano je w temperaturze 4 °C i nie zamrażano. Roztwory koloidu złota były przygotowywane świeże do każdego eksperymentu, ponieważ roztwór buforowy soli destabilizowałby koloid złota. Roztwory HCl i NaOH przygotowywano świeże dla każdego eksperymentu.

Wyzwania techniczne związane z ręcznym odczytem i zapisem pH roztworu za pomocą delikatnych przyrządów przy jednoczesnej zmianie pH w zakresie od 4 do 10 ograniczają precyzję raportowanych przez nas wyników. W związku z tym nie zaobserwowaliśmy spójnych wyników w natężeniu sygnałów SERS. To prawdopodobnie wprowadziło błąd do amplitudy, która została użyta dla wykresu konturowego. Przyszłe prace mające na celu weryfikację modów związanych z nparzystymi lub nnieparzystymi mogą wprowadzić mutacje w celu zastąpienia aminokwasów w sekwencji Aβ 1-40, które, jak twierdzimy, są zaangażowane w zmianę konformacyjną białka, takie jak pojedyncze reszty tyrozyny lub asparaginy.

"Oddziaływanie między monomerem Aβ1-40 a powierzchnią złota uważa się za oddziaływanie dipolowe, a poziom wiązań wodorowych został postawiony w pracy przez H. Schmidbauera i wsp.55. W osobnej pracy badaliśmy spektroskopię SERS w funkcji ilości Aβ1-40 w warunkach kwaśnych, wyekstrahowano tworzenie adsorpcji zależnej od nanowielkości56. W przypadku złota o długości 20 nm spekulowano, że wiązanie C=C lub -C-N histydyny (His) inicjuje adsorpcję; Jednak w przypadku złota o długości fali 80 nm tryb oddychania pierścieniem benzenowym fenyloalaniny (Phe) lub tyrozyny (Tyr) dociera do powierzchni złota w celu zainicjowania adsorpcji. Uznano, że proces adsorpcji Aβ1-40 na powierzchni złota w warunkach obojętnych lub zasadowych (pH ~ 10) utrzymuje hydrofilowy koloid złota pokryty Aβ1-40 , ponieważ w stanie wodnym nie powstają żadne osady. Jednak osady obserwowano przy pH 4, co sugeruje, że agregaty były hydrofobowe.

Obrazy TEM i obrazy w świetle białym tylko pośrednio pokazują dowody agregacji. Podjęliśmy próbę przeprowadzenia spektroskopii dichroizmu kołowego (CD) w celu skorelowania morfologii obserwowanej w odwracalnej agregacji ze strukturami drugorzędowymi. Jednak rozpraszające się linie bazowe uniemożliwiły nam uzyskanie powtarzalnych sygnałów CD. Zamiast tego zastosowaliśmy spektroskopię Ramana, skupiając się bardziej na modach wzmocnionych albo gdy agregacja (rozłożona konformacja Aβ1-40) zachodziła pod pH ~4, albo gdy dezagregacja (rozwinięta konformacja Aβ1-40) pod pH ~10. W związku z tym najlepsze spekulacje na temat identyfikacji struktury drugorzędowej w tej pracy ograniczały się do monitorowania węzłów związanych ze strukturami drugorzędnymi. Wykazano to w obserwacji arkusza β na wysokości 1628 cm-1, szczególnie w warunkach pH 4.

W badaniu tym zaobserwowano tylko zmianę konformacji peptydów dla koloidów złota o średnicy 20 nm i zbadano tylko n do 10. Właściwości konformacji i agregacji peptydu Aβ 1-40 mogą być zmienione przez wielkość cząstki, do której adsorbują się do56. Dlatego potrzebne są dalsze prace, aby zrozumieć właściwości peptydów, które opierają się na połączeniu sieciowym między monomerami oraz tych, na które wpływają właściwości fizyczne powierzchni adsorpcji. W badanych przez nas warunkach tylko koloidy złota o średnicy 20 nm wykazywały odwracalność morfologii agregacji, a mechanizmy wpływu średnicy koloidu na odwracalność tej właściwości nie są znane. Zwiększenie n do 20 może dostarczyć więcej informacji na temat zależnego od modu stopnia odwracalności morfologii agregacji. Badania nad tym, w jaki sposób wielkość koloidu złota wpływa na agregację peptydów beta amyloidu, przyniosą ważne informacje na temat mechanizmów molekularnych patologii choroby Alzheimera.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych konfliktów interesów w związku z tą pracą, aby ujawnić.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.Y. jest wspierany przez NSF-MRI Grant #2117780. Fundacja Geneseo wsparła początkowy etap tego projektu. A. I. jest wdzięczna absolwentom Wydziału Chemii SUNY Geneseo Summer Research Scholarship ('19 Rhodes Award i '20 Lipkowitz Award) oraz Dreyfus Foundation Undergraduate Summer Research Scholarship za ich wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Peptyd beta amyloidu 1-40 (Aβ 1– 40 peptyd)r-peptyd (Bogart, GA, USA)A-1156-2
Aparat cyfrowyCCD AMTXR-40 4-megapikselowy CCD 
Destylowana woda dejonizowana z systemu wodnego Milli-Q- MilliporeSigma (Burlington, MA, USA)Milli-Q IQ 7000
Zamrażarka -86 oCThermo ScientificRevco Chilly Willy  Identyfikator jednostki serii RLE 187004 numer kompilacji 40.04
Złoty koloid (10 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15703-20
Złoty koloid (100 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15711-22
Złoty koloid (15 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15704-20
Złoty koloid (20 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, Stany Zjednoczone)15705-20
Złoty koloid (50 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15708-21
Złoto koloidowe (80 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15710-22
Najwyższej jakości krążki mikowe V1AFM 10 mmTed Pella Inc.#50
Kwas solny roztwór wzorcowy, 1,0 NFlukaLot# SHBB4705V        318949-2L
Makro kwitet kwarcowy Ścieżka światła 10 mmNauka o ognistej muchy Type1-MC-PathMikroelektroda pH 10mm
HORIBAModel 9618S (MFG nr 9Y8E0050)
Peak Fit ProgramOrigin (Northampton, MA, USA)OriginPro2018b (64-bit) b9.5.5.409 (Academic)
pH 4,00 Roztwór buforowy VWRNr kat. 34170-127
pH 7,00 Roztwór buforowy Fisher ChemicalSB107-4 Lot 191041
pH-metrHORIBAModel F-72G (MFG nr B27M0017)
Końcówki do pipet   Maxi Porady 1– 5 mlFisher   02-707-467
Końcówki do pipet 10 mlFisher02-717-135
Końcówki do pipet 1000 mlFisher02-717-156
Końcówki do pipet 1– 200 mlFisher02-717-143
Pikultarka Fisher Brand Elite 0.5– 5 ml
Fisher Brand Elite 100– 1000 ml
Fisher Brand Elite 10– 100 mlFisherMU10985
Pipeter Fisher Brand Elite 1– 10 mlFisherMU08178
roztwór wodorotlenku sodu 1,0 mFlukaLot#05096BPV    319511-2L
TEMFEI CoMorgagni model 268 
Probówki TempAssure PCR, płaskie nakrętki, naturalne USA Naukowypolipropylen. 0,2 ml indywidualne cienkościenne probówki z dołączonymi matowymi płaskimi nasadkami
Spektrofotometr UV-Vis-NIRVarianCARY 5000 UV1106M074
WI Tec alpha300R Konfokalny mikroskop RamanaWITec-Oxford InstrumentXMB3000-3001
Koloid złota (30 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15706-21 Złoty koloid (40 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15707-21 Złoty koloid (60 nm)Ted Pella, Inc. (Redding, Kalifornia, USA)15709-22 pipeter Fisher QU05317 pipeter Fisher QU01672

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kirschner, D. A., et al. Synthetic peptide homologous to beta protein from Alzheimer disease forms amyloid-like fibrils in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (19), 6953-6957 (1987).
  2. Lomakin, A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirshner, D. A., Teplow, D. B. On the nucleation and growth of amyloid -protein fibrils: detection of nuclei and quantitation of rate constants. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1125-1129 (1996).
  3. Walsh, D. M., Lomakin, A., Benedek, G. B., Condron, M. M., Teplow, D. B. Amyloid -protein fibrillogenesis. J Biolog Chem. 272 (3), 22364-22372 (1997).
  4. Lambert, M. P., et al. nonfibrillar ligands derived from Ab1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (11), 6448-6453 (1998).
  5. Bucciantini, M., et al. Inherent toxicity of aggregates implies a common mechanism for protein misfolding diseases. Nature. 416 (6880), 507-511 (2002).
  6. Walsh, D. M., et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature. 416 (6880), 535-539 (2002).
  7. Rocha, S., et al. Adsorption of amyloid beta-peptide at polymer surfaces: A neutron reflectivity study. ChemPhysChem. 6 (12), 2527-2534 (2005).
  8. Attanasio, F., et al. Carnosine inhibits Ab1-42 aggregation by perturbing the H-bond network in and around the central hydrophobic cluster. ChemBioChem. 14 (5), 583-592 (2013).
  9. Politi, J., Spadavecchia, J., Iodice, M., de Stefano, L. Oligopeptide-heavy metal interaction monitoring by hybrid gold nanoparticle based assay. Analyst. 140 (1), 149-155 (2015).
  10. Moshe, A., Landau, M., Eisenberg, D. Preparation of Crystalline samples of amyloid fibrils and oligomers. Methods Mol Biol. 1345, 201-210 (2016).
  11. Scarff, C. A., Ashcroft, A. E., Radford, S. E. Characterization of amyloid oligomers by electrospray ionization-ion mobility spectrometry-mass spectrometry (ESI-IMS-MS). Methods Mol Biol. 1345, 115-132 (2016).
  12. Sabaté, R., Gallardo, M., Estelrich, J. Temperature dependence of the nucleation constant rate in β amyloid fibrillogenesis. Int J Biol Macromol. 35 (1-2), 9-13 (2005).
  13. Niraula, T. N., et al. Pressure-dissociable reversible assembly of intrinsically denatured lysozyme is a precursor for amyloid fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (12), 4089-4093 (2004).
  14. Miller, A. E., et al. Behavior of β-Amyloid 1-16 at the air-water interface at varying pH by nonlinear spectroscopy and molecular dynamics simulations. J Phys Chem A. 115 (23), 5873-5880 (2011).
  15. Majzika, A., et al. Functionalization of gold nanoparticles with amino acid, -amyloid peptides and fragment. Colloids Surf B Biointerfaces. 81 (1), 235-241 (2010).
  16. Liu, L., et al. Electrochemical detectionof β-amyloid peptides on electrode covered with N-terminus-specific antibody based on electrocatalytic O2 reduction by Aβ(1-16)-heme-modified gold nanoparticles. Biosens Bioelectron. 49, 231-235 (2013).
  17. Elbassal, E. A., et al. Gold Nanoparticles as a Probe for Amyloid-β Oligomer and Amyloid Formation. J Phys Chem C Nanomater Interfaces. 121 (36), 20007-20015 (2017).
  18. Olmedo, I., et al. How changes in the sequence of the peptide CLPFFD-NH2 can modify the conjugation and stability of gold nanoparticles and their affinity for beta-amyloid fibrils. Bioconjug Chem. 19 (16), 1154-1163 (2008).
  19. Xu, Y., et al. Attenuation of the aggregation and neurotoxicity of amyloid peptides with neurotransmitter-functionalized ultra-small-sized gold nanoparticles. Eng Sci. 6, 53-63 (2019).
  20. John, T., Gladytz, A. K., Martin Clemens, L. L., Risselada, H. J., Abel, B. Impact of nanoparticles on amyloid peptide and protein aggregation: A review with a focus on gold nanoparticles. Nanoscale. 45, 20894-20913 (2018).
  21. Li, J., et al. Reduced aggregation and cytotoxicity of amyloid peptides by graphene oxide/gold nanocomposites prepared by pulsed laser ablation in water. Small. 10 (21), 4386-4394 (2014).
  22. Araya, E., et al. Gold nanoparticles and microwave irradiation Inhibit beta-amyloid amyloidogenesis. Nanoscale Res Lett. 3, 435(2008).
  23. Barrow, C. J., Yasuda, A., Kenny, P. T., Zagorski, M. G. Solution conformations and aggregational properties of synthetic amyloid beta-peptides of Alzheimer's disease. Analysis of circular dichroism spectra. J Mol Biol. 225 (4), 1075-1093 (1992).
  24. Wood, S. J., MacKenzie, L., Maleeff, B., Hurle, M. R., Wetzel, R. Selective inhibition of Ab fibril formation. J Biolog Chem. 271 (8), 4086-4092 (1996).
  25. Yokoyama, K. Nanoscale Surface Size Dependence in Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  26. Yokoyama, K. Nanoscale Protein Conjugation. Advances in Nanotechnology. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2010).
  27. Yokoyama, K. Modeling of Reversible Protein Conjugation on Nanoscale Surface in Computational Nanotechnology: Modeling and Applications with MATLAB. , CRC Press. Boca Raton. (2011).
  28. Yokoyama, K. Nano Size Dependent Properties of Colloidal Surfaces. Colloids: Classification, Properties and Applications. , Nova Science Publishers. New York, NY. (2012).
  29. Yokoyama, K. Controlling Reversible Self-Assembly Path of Amyloid Beta Peptide over Gold Colloidal Nanoparticle's Surface. Nanoscale Spectroscopy with Applications. , CRC Press, Taylor and Francis Group, LLC. (2013).
  30. Yokoyama, K., et al. Nanoscale size dependence in the conjugation of amyloid beta and ovalbumin proteins on the surface of gold colloidal particles. Nanotechnology. 19, 375101(2008).
  31. Yokoyama, K., Welchons, D. R. The conjugation of amyloid beta protein on the gold colloidal nanoparticles' surfaces. Nanotechnology. 18, 105101(2007).
  32. Edelhoch, H. Spectroscopic determination of tryptophan and tyrosine in proteins. Biochemistry. 6 (7), 1948-1954 (1967).
  33. Yokoyama, K., et al. Examination of adsorption orientation of amyloidogenic peptides over nano-gold colloidal particles surfaces. Int J Mol Sci. 20 (21), 5354-5380 (2019).
  34. Yokoyama, K., Ichiki, A. Oligomerization and Adsorption Orientation of Amyloidogenic Peptides over Nano-Gold Colloidal Particle Surfaces. Advances in Chemistry Research. , NOVA Science Publishers. New York, NY. (2020).
  35. Fan, X., Zheng, W., Singh, D. J. Light scattering and surface plasmons on small spherical particles. Light Sci Appl. 3, e179(2014).
  36. Yokoyama, K., et al. Microscopic investigation of reversible nanoscale surface size dependent protein conjugation. Int J Mol Sci. 10 (5), 2348-2366 (2009).
  37. Vishwanathan, K. Symmetry of gold neutral clusters Au3-20 and normal modes of vibrations by using the numerical finite difference method with density-functional tight-binding (DFTB) approach. Arch Chem Res. 2 (1), 4(2017).
  38. Gao, P., Weaver, M. J. Metal-adsorbate vibrational frequencies as a probe of surface bonding: halides and pseudohalides at gold electrodes. J Phys Chem. 90, 4057-4063 (1986).
  39. Stewart, S., Fredericks, P. M. Surface-enhanced raman spectroscopy of peptides and proteins adsorbed on an electrochemically prepared silver surface. Spectrochim Acta AMol Biomol Spectrosc. 55 (7-8), 1615-1640 (1999).
  40. Palings, I., et al. Assignment of fingerprint vibrations in the resonance Raman spectra of rhodopsin, isorhodopsin, and bathorhodopsin: Implications for chromophore structure and environment. Biochem. 26 (9), 2544-2556 (1987).
  41. Szekeres, G. P., Kneipp, J. SERS probing of proteins in gold nanoparticle agglomerates. Front Chem. 7, 30(2019).
  42. Lin, V. J. C., Koenig, J. L. Raman studies of bovine serum albumin. Biopolymers. 15 (1), 203-218 (1976).
  43. Hornemann, A., Drescher, D., Flemig, S., Kneipp, J. Intracellular SERS hybrid probes using BSA-reporter conjugates. Anal Bioanal Chem. 405 (19), 6209-6222 (2013).
  44. Dong, J., et al. Metal binding and oxidation of amyloid-beta within isolated senile plaque cores: Raman microscopic evidence. Biochemistry. 42 (10), 2768-2773 (2003).
  45. Carey, P. R. Biochemical Applications of Raman and Resonance Raman Spectroscopies. , Academic Press. New York, NY. (1982).
  46. Harada, I., Takeuchi, H. Raman and Ultraviolet Resonance Raman Spectra of Proteins and Related Compounds. Spectroscopy of Biological Systems : Advances in Infrared and Raman Spectroscopy. , Wiley. Chichester, UK. (1986).
  47. Overman, S. A., Thomas, G. J. Jr Raman markers of nonaromatic side chains in an α-helix assembly: Ala, Asp, GGly, Ile, Leu, Lys, Ser, and Val residues of phage fd subunits. Biochemistry. 38 (13), 4018-4027 (1999).
  48. Talaga, D., et al. Total internal reflection tip-enhanced Raman spectroscopy of tau fibrils. J Phys Chem B. 126 (27), 5024-5032 (2022).
  49. Grys, D. -B., et al. Citrate coordination and bridging of gold nanoparticles: The role of gold adatoms in AuNP aging. ACS Nano. 14 (7), 8689-8696 (2020).
  50. Guo, T., et al. Full-scale label-free surface-enhanced Raman scattering analysis of mouse brain using a black phosphorus-based two-dimensional nanoprobe. Appl Sci. 9 (3), 398-408 (2019).
  51. Walther, M., Plochocka, P., Fischer, B., Helm, H., Uhd Jepsen, P. Collective vibrational modes in biological molecules investigated by Terahertz time-domain spectroscopy. Biopolymers. 67 (4-5), 310-313 (2002).
  52. Lochocki, B., et al. label-free fluorescence and Raman imaging of amyloid deposits in snap-frozen Alzheimer's disease human brain tissue. Commun Biol. 4 (1), 474-486 (2021).
  53. Palombo, F., et al. Detection of Aβ plaque-associated astrogliosis in Alzheimer's disease brain by spectroscopic imaging and immunohistochemistry. Analyst. 143 (4), 850-857 (2018).
  54. Khoury, Y. E., et al. Raman imaging reveals accumulation of hemoproteins in plaques from Alzheimer's diseased tissues. ACS Chem Neurosci. 12 (15), 2940-2945 (2021).
  55. Schmidbaur, H., Raubenheimer, H. G., Dobrzańska, L. The gold-hydrogen bond, Au-H, and the hydrogen bond to gold Au∙∙∙H-X. Chem Soc Rev. 43 (1), 345-380 (2014).
  56. Yokoyama, K., et al. Protein corona formation and aggregation process of amyloid beta 1-40 coated gold nano-colloids. Langmuir. 40 (3), 1728-1746 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Amyloid Beta 1 40Gold ColloidsReversible AggregationPH Dependent Self AssemblySurface Plasmon ResonanceTransmission Electron MicroscopySurface Enhanced Raman SpectroscopyProtein FoldingColloidal AggregationPeptide Conformation

Powiązane artykuły