Artykuł metodologiczny

Izolacja i identyfikacja szczepów bakteryjnych ze skóry lądowych

DOI:

10.3791/67862

⸱

17 czerwca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life, Health, and Environmental Sciences (MeSVA), University of L'Aquila

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To jest metoda pobierania próbek i izolowania bakterii hodowlanych z mikrobioty skórnej europejskich salamander pletodontycznych (rodzaj Speleomantes). W tym miejscu przedstawiamy protokół pobierania próbek skóry salamandry za pomocą wymazów i przetwarzania ich przy użyciu metod hodowlanych. Opisujemy pobieranie próbek, izolację i założenie hodowli aksenicznej z charakterystyką szczepu bakteryjnego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobiota jest istotnym elementem organizmów wyższych, a mikrobiota skórna znacząco przyczynia się do obrony organizmu przed czynnikami zewnętrznymi. Nie ma standardowej metody pobierania próbek od społeczności mikroorganizmów skóry Speleomantes (Amphibia: Plethodontidae) w ramach podejścia opartego na hodowli drobnoustrojów. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy praktyczny protokół izolowania bakterii ze skóry poszczególnych osób oraz najlepsze praktyki w zakresie obchodzenia się z próbkami i ich przechowywania. Kroki są proste: waciki są przechowywane w fizjologicznym roztworze soli fizjologicznej uzupełnionym glicerolem po pobraniu próbki. Po przeniesieniu do laboratorium wymazówki można przechowywać w temperaturze +4 °C przez maksymalnie 10 dni, aby zapewnić integralność społeczności drobnoustrojów. Badanie to dostarcza interesujących informacji na temat badań mikrobioty skórnej gatunków lądowych, takich jak te należące do rodzaju Speleomantes. Podejście to przyczynia się do wdrażania, monitorowania i ochrony zagrożonych gatunków i może przyczynić się do poszerzenia wiedzy na temat funkcji mikrobioty w zdrowiu i ekologii. Protokół ten może mieć również szersze znaczenie dla badań nad mikrobiomem w wielu scenariuszach ochrony dzikiej przyrody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie organizmy posiadają różne symbionty mikrobiologiczne na swoich powierzchniach nabłonków, tkankach i organach1. Skóra jest głównym interfejsem między gospodarzem a jego środowiskiem, zapewniając siedlisko dla różnych mikroorganizmów2. Skóra jest największym organem kręgowców i stanowi barierę dla agresji mechanicznej, chemicznej i mikrobiologicznej3. Jednak to szerokie narażenie skóry na warunki środowiskowe prawdopodobnie sprawia, że jest to najbardziej krytyczna granica ekologiczna, która pośredniczy w interakcji organizmu z zewnętrznymi czynnikami biotycznymi i abiotycznymi4.

Mikrobiota skóry była intensywnie badana w ciągu ostatniej dekady, a związek między tą społecznością drobnoustrojów a jej gospodarzem został dogłębnie zbadany5,6,7,8,9,10. Bioróżnorodność mikrobioty skóry jest w dużej mierze determinowana przez typ gospodarza (tj. zbiorowisko specyficzne dla gatunku), ale inne czynniki środowiskowe mogą sprzyjać większej różnorodności międzygatunkowej11. Mikrobiota skóry ma skład charakterystyczny dla innych zwierząt. Wiadomo, że mają wzajemny związek z mikroorganizmami skóry, będąc w stanie biosyntetyzować związki przeciwdrobnoustrojowe lub chronić swojego gospodarza przed pojawiającymi się chorobami zakaźnymi12.

Izolacja bakterii ze skóry jest zwykle osiągana po wykonaniu różnych kroków. Pierwszym krokiem jest uzyskanie reprezentatywnego pobrania próbki poprzez pobranie wymazu i unikanie zanieczyszczenia zewnętrznego. Próbki drobnoustrojów zawiesza się w sterylnym roztworze soli fizjologicznej lub buforze. Uzupełnienie cieczy zawiesinowych środkami ochronnymi (np. glicerolem) może poprawić integralność społeczności bakteryjnej podczas transferu laboratoryjnego13,14. Po przeniesieniu do laboratorium próbki mogą być przetwarzane natychmiast lub po krótkim czasie, aby zachować integralność społeczności drobnoustrojów. Klasyczne podejście mikrobiologiczne polega na przetwarzaniu próbek przez seryjne rozcieńczanie w celu zmniejszenia gęstości mikrobiologicznej i zapewnienia lepszej separacji kolonii na płytkach Petriego. Rozcieńczenia próbki i serii są następnie rozcieńczane na niespecyficznych, nieselektywnych podłożach, takich jak agar Luria-Bertani (LBA)15, soja tryptyczna (TSA)16, Ekstrakt drożdżowy tryptonowy Agar (TYEA)17,18,19, lub Składnik odżywczy (NA)20 które wspomagają rozwój szerokiej gamy bakterii. Stosuje się nieselektywne wzbogacanie podczas pobierania próbek i przetwarzania, ponieważ konieczne jest hodowanie szerokiej gamy drobnoustrojów. Metody smugowe lub płytkowe rozprowadzają zawiesinę mikrobiologiczną równomiernie na powierzchni agaru21. Równomierny rozkład pozwala różnym gatunkom drobnoustrojów obecnym w próbce tworzyć odrębne kolonie. Po inkubacji w temperaturze 20-37 °C przez 2-7 dni kolonie drobnoustrojów są liczone i rozróżniane na podstawie morfologii. Charakterystykę morfologiczną kolonii bakteryjnej przeprowadzono na podstawie pigmentacji, formy, wysokości, marginesu, krycia i powierzchni. Dobrze wyizolowane kolonie w najwyższych rozcieńczeniach są subhodowane na świeże płytki agarowe w celu oczyszczenia kultur drobnoustrojów. Czystość kolonii jest zapewniona w oparciu o jednorodność komórek i powinowactwo do barwienia metodą Grama. Można również przeprowadzić kilka testów biochemicznych lub molekularnych, aby sprawdzić czystość kolonii22. Czyste kultury wyizolowanych szczepów mogą być przechowywane na skosach agarowych w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego użytku lub konserwowane długoterminowo w temperaturze -80°C w krioprotektantach (np. stosunek glicerolu do podłoża 20:80 lub 50:50)23.

W tym protokole przedstawiamy najlepsze praktyki izolowania bakterii z mikrobioty skóry salamander jaskiniowych Speleomantes, wyłącznie lądowych, które mogą żyć zarówno w środowisku powierzchniowym, jak i podziemnym24. Biorąc pod uwagę brak powszechnie stosowanych protokołów w literaturze, badanie to miało na celu opracowanie najlepszych praktyk w zakresie pobierania próbek i przechowywania próbek mikrobioty skórnej od tych lądowych. Aby przetestować ten protokół, użyliśmy włoskiej salamandry jaskiniowej (Speleomantes italicus) jako modelu, pobierając próbki od 12 osobników z populacji jaskiniowej znajdującej się w Abruzji (Włochy). Osobniki zbierano ręcznie i wielokrotnie pobierano od nich wymazy (co najmniej 5 razy) po stronie grzbietowej, brzusznej i bokach. Zużyte waciki nasączono sterylną wodą destylowaną. Waciki zanurzono następnie w fizjologicznym 0,9% roztworze soli fizjologicznej z suplementacją glicerolu i bez niej. Po przeniesieniu do laboratorium konserwacja próbki była testowana w różnych warunkach: niekontrolowana temperatura pokojowa, 4 °C i -20 °C przez 10 dni. Zbiorowiska drobnoustrojów zdolnych do hodowli porównano przy użyciu metod opartych na kulturach na pożywkach generycznych i półselektywnych (LBA, TSYEA, TSA, NA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia najlepsze praktyki pozyskiwania i obchodzenia się z próbkami skóry Speleomantes dla mikrobiologicznego podejścia do hodowli szczepów bakterii. Materiał przydatny w kolejnych krokach jest wymieniony w Tabeli materiałów. Protokół jest zgodny z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami zawartymi w art. 11 DPR 357/97 za zgodą włoskiego Ministerstwa Środowiska (PNM 74554 z 22.04.2024 r.).

1. Przygotowanie mediów

  1. Oblicz i zważ ilość składników w proszku (zapoznaj się z instrukcjami producenta, aby uzyskać informacje na temat ilości proszku używanego do LBA, TSYEA, TSA, NA lub innych mediów).
  2. Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby rozpuścić składniki w wodzie destylowanej. W zależności od podłoża i zakupionego produktu mogą być wymagane etapy gotowania.
  3. Doprowadź podłoże do końcowej objętości, gdy składniki całkowicie się rozpuszczą i kontroluj pH. Jeśli wartość jest wyższa lub niższa niż oczekiwana, dostosuj ją, korzystając z rozwiązań sugerowanych w instrukcjach producenta. Roztwory HCl i NaOH są powszechnie stosowane odpowiednio do obniżania i zwiększania pH.
  4. Dodać agar (2% w/v), podgrzewać do 95 °C i gotować przez około 1 minutę, aby rozpuścić agar przed autoklawowaniem.
  5. Wysterylizuj pożywkę przez autoklawowanie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Typowe procesy autoklawowania obejmują 121-134 °C przez 15-30 minut obróbki.
  6. Po autoklawowaniu schłodzić podłoże agarowe do około 45-50°C i wlać je do sterylnych szalek Petriego pod uprzednio wysterylizowanym kapturem z przepływem laminarnym
  7. Po zestaleniu oznacz płytki zgodnie z rodzajem podłoża i datą przygotowania.

2. Pobieranie próbek

  1. Opłucz skórę salamandry (rodzaj Speleomantes) w sterylnej wodzie destylowanej, aby usunąć przejściowe zbiorowiska drobnoustrojów.
  2. Zbierz wymazy ze skóry za pomocą sterylnych wacików z bawełnianą końcówką w probówce. Delikatnie pocieraj wacikami powierzchnię skóry, aby pobrać próbki drobnoustrojów bez szkody dla osoby.
    1. Przełóż wacik nasączony sterylną wodą destylowaną z każdej strony całego ciała, w tym wszystkich kończyn, pięć razy (pięć ruchów w przód iw tył), aby pobrać próbki od osób.
      UWAGA: Suplementacja dodatkami nie jest zalecana, ponieważ może to zaszkodzić osobom.
    2. Umieść waciki w probówkach zawierających roztwór soli fizjologicznej (0,9% NaCl) uzupełniony glicerolem (20%).
  3. Wymieszaj próbkę z roztworem, popychając wacik w kierunku ścianek probówki, jednocześnie ściskając probówkę i dokładnie obracając wacik (10 razy zgodnie z ruchem wskazówek zegara i 10 razy przeciwnie do ruchu wskazówek zegara).
  4. Po wymieszaniu zamknij wacik wewnątrz probówki i przenieś próbki mikrobiologiczne do laboratorium, utrzymując próbkę w temperaturze 4 °C do czasu analizy mikrobiologicznej.
    UWAGA: Wszystkie czynności są wykonywane przy użyciu nowego sterylnego materiału i rękawic dla każdej osoby, aby uniknąć zanieczyszczenia i narażenia operatora na zanieczyszczenia biologiczne i chemiczne.

3. Inokulacja i inkubacja

  1. Próbkę mikrobiologiczną należy dokładnie wymieszać przed przetworzeniem.
  2. Przygotować seryjne rozcieńczenia próbki skórnej roztworem soli fizjologicznej (0,9% NaCl), w zakresie od 10-1 do 10-6.
  3. Zaszczepić 100 μl próbki w stanie nieobecnym i seryjnie rozcieńczyć przygotowane płytki agarowe. Za pomocą sterylnej pętli w kształcie litery L rozprowadź próbkę po powierzchni podłoża agarowego, rozprowadzając ją równomiernie bez wywierania nadmiernego nacisku, aby uniknąć uszkodzenia agaru.
  4. Odwrócić zaszczepione płytki w inkubatorze w temperaturze 20-25 °C przez 3-5 dni. Ten zakres temperatur sprzyja rozwojowi wielu środowiskowych bakterii mezofilnych i psychotropowych, które zasiedlają skórę.
    UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane przy użyciu sterylnego materiału pod uprzednio wysterylizowanym kapturem laminarnym. Dla każdej jednostki doświadczalnej przygotowuje się pięć niezależnych powtórzeń. Ponieważ gęstość początkowa jest nieznana i nieprzewidywalna, zawsze pomocne jest uwzględnienie szerokiego zakresu rozcieńczeń.

4. Oczyszczanie i identyfikacja szczepu

  1. Wybierz kolonie bakterii o odrębnej morfologii do dalszej analizy po inkubacji.
    1. Po pierwsze, wybierz dobrze odizolowane kolonie, aby uniknąć zanieczyszczenia lub nakładania się oraz unikać zatłoczonych obszarów, w których kolonie mogą się łączyć. Ponadto należy wybierać kolonie o różnym wyglądzie (np. kolorze, rozmiarze, kształcie, krawędzi, powierzchni lub fakturze), aby zapewnić pobieranie próbek potencjalnie różnych gatunków lub szczepów.
      UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla wyboru różnych szczepów bakterii nadających się do uprawy w mikrobiocie skóry.
  2. Subkultura wybranych kolonii.
    1. Przenieść dobrze odizolowaną kolonię oryginalnej płytki agarowej w aseptyki na świeżą płytkę agarową za pomocą pętli zaszczepiającej. Smuguj kolonię, aby ją wyizolować, a następnie odpowiednio ją wysiaduj.
    2. Powtórz ten krok kilka razy na świeżych płytkach agarowych, aby uzyskać czyste kultury z każdego izolatu bakteryjnego, aż wyizolowane kolonie będą wyglądać podobnie. Powtórz subkulturację przy użyciu pożywek selektywnych i ogólnych.
      UWAGA: Połączenie aseptycznej obsługi, badania wizualnego i mikroskopowego oraz identyfikacji molekularnej zapewnia szczep wolny od zanieczyszczeń.
  3. Sprawdź czystość kultur drobnoustrojów poprzez obserwacje mikroskopowe (obiektywy od 5x do 100x), powinowactwo do barwienia metodą Grama (utrwalanie kolonii, barwienie i obserwacja) oraz testy biochemiczne (np. katalaza, oksydaza, ureaza i test fermentacji cukru)21,25.
    UWAGA: Czyste kultury powinny wykazywać jednolitą morfologię kolonii, spójne cechy mikroskopowe i cechy biochemiczne.
  4. Wykonaj identyfikację molekularną.
    1. Wyodrębnij DNA z oczyszczonych kolonii bakteryjnych i wykonaj sekwencjonowanie genu 16S rRNA w celu identyfikacji gatunku bakterii. Wykonaj amplifikację PCR genu 16S rRNA przy użyciu uniwersalnych starterów bakteryjnych, a następnie sekwencjonowanie i porównanie ze znanymi sekwencjami w bazach danych, takich jak GenBank26.
  5. Założenie hodowli w biobanku.
    1. Przetestuj akseniczne (lub czyste) kultury pod kątem sterylności, zaszczepiając je w nieselektywnej pożywce i sprawdzając brak wzrostu zanieczyszczeń. Przechowuj kultury akseniczne do użytku średnio- i długoterminowego.
      UWAGA: Standardowe metody obejmują smugowanie kolonii na skosach agaru w pożywce selektywnej i przechowywanie w temperaturze pokojowej, zawieszenie kultury w roztworach podstawowych przygotowanych z mieszaniną pożywki selektywnej i glicerolu (20:80 lub 50:50) lub liofilizację kultur bulionowych (liofilizacja) i zamrożenie w temperaturze -80 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg pracy eksperymentalnego podejścia jest zilustrowany w Rysunek 1.

figure-results-1
Rysunek 1: Przebieg procesu pobierania próbek, obsługi i przetwarzania próbek skóry. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy protokół najlepszych praktyk w celu uzyskania społeczności bakterii hodowlanych z mikrobioty skóry i zademonstrowaliśmy to na Speleomantes italicus. Jak wykazano w powyższym wniosku, należy podjąć kilka kroków, aby zapewnić skuteczną izolację mikrobiologiczną ze skóry. Pobranie, przy użyciu delikatnej techniki wymazowej i sterylnych materiałów, jest bardzo ważne, aby zebrać wystarczającą ilość materiału mikrobiologicznego i uniknąć zanieczyszczenia. Transport i przechowywanie w temperaturz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie finansowe od Uniwersytetu L'Aquila w ramach projektów "Progetti di Ateneo per la Ricerca di base 2024 UNIVAQ: Ekotoksykologia zagrożonych europejskich salamander jaskiniowych" oraz "Analisi delle divergenze inter- e intraspecifiche del microbiota dei pletodontidi europei - FFORIC24.35" przez Biodiversa+, Europejskie Partnerstwo na rzecz Bioróżnorodności, w ramach Sub-BioMon - Opracowywanie i testowanie podejść do monitorowania podziemnych projekt bioróżnorodność w krasie w ramach wspólnego zaproszenia BiodivMon na lata 2022–2023 oraz Krajowego Planu Odbudowy i Zwiększania Odporności (KRR), Misja 4, Komponent 2, Inwestycja 1.1, Zaproszenie do składania ofert nr 1409 opublikowane 14.9.2022 r. przez włoskie Ministerstwo Szkolnictwa Wyższego i Badań Naukowych (MUR), finansowane przez Unię Europejską - NextGenerationEU- Kod projektu: P2022CYF9L, Tytuł projektu Czy fakultatywne gatunki jaskiniowe są czynnikami powodującymi przedostawanie się metali do środowisk podziemnych? (METALCAVE) - KUBEK E53D23015380001.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar Lauria-BertaniMerk MilliporeL3027
Agar sojowy tryptycznyMerk Millipore22091
Ekstrakt z drożdży tryptonowych sojowych AgarMerk Millipore17221
Agar odżywczyMerk Millipore70148
Roztwór gliceroluMerk Millipore49781

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. McFall-Ngai, M., et al. Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3229-3236 (2013).
  2. Belkaid, Y., Tamoutounour, S. The influence of skin microorganisms on cutaneous immunity. Nat Rev Immunol. 16 (6), 353-366 (2016).
  3. Kligman, A. M. What is the 'true' function of skin. Exp Dermatol. 11 (2), 159-187 (2002).
  4. Ross, A. A., Rodrigues Hoffmann, A., Neufeld, J. D. The skin microbiome of vertebrates. Microbiome. 7 (1), 79(2019).
  5. Kueneman, J. G., et al. Community richness of amphibian skin bacteria correlates with bioclimate at the global scale. Nat Ecol Evol. 3 (3), 381-389 (2019).
  6. Rebollar, E. A., MartínezUgalde, E., Orta, A. H. The amphibian skin microbiome and its protective role against chytridiomycosis. Herpetologica. 76 (2), 167(2020).
  7. Wuerthner, V. P., HernándezGómez, O., Hua, J. Amphibian skin microbiota response to variable housing conditions and experimental treatment across space and time. J Herpetol. 53 (4), 324(2019).
  8. HernándezGómez, O., Wuerthner, V., Hua, J. Amphibian host and skin microbiota response to a common agricultural antimicrobial and internal parasite. Microb Ecol. 79 (1), 175-191 (2020).
  9. SotoCortés, E., et al. Host species and environment shape the skin microbiota of Mexican axolotls. Microb Ecol. 87 (1), 98(2024).
  10. Cramp, R. L., McPhee, R. K., Meyer, E. A., Ohmer, M. E., Franklin, C. E. First line of defence: the role of sloughing in the regulation of cutaneous microbes in frogs. Conserv Physiol. 2 (1), cou012-cou012 (2014).
  11. Colston, T. J., Jackson, C. R. Microbiome evolution along divergent branches of the vertebrate tree of life: what is known and unknown. Mol Ecol. 25 (16), 3776-3800 (2016).
  12. Rebollar, E. A., et al. The skin microbiome of the neotropical frog Craugastor fitzingeri: inferring potential bacterialhostpathogen interactions from metagenomic data. Front Microbiol. 9, 466(2018).
  13. Li, X., Ricke, S. C. Comparison of cryoprotectants for Escherichia coli lysine bioavailability assay culture. J Food Process Preserv. 28 (1), 39-50 (2004).
  14. Patra, J. K., Das, G., Das, S. K., Thatoi, H. Isolation, Culture, and Biochemical Characterization of Microbes. In A Practical Guide to Environmental Biotechnology. , Springer. Singapore. (2020).
  15. Bertani, G. Studies on lysogenesis i. J Bacteriol. 62 (3), 293-300 (1951).
  16. Forbes, B. A., Sahm, D. F., Weissfeld, A. S. Diagnostic Microbiology. , Mosby. St Louis. (2007).
  17. O'Reilly, T., Niven, D. F. Tryptoneyeast extract broth as a culture medium for Haemophilus pleuropneumoniae and Haemophilus parasuis to be used as challenge inocula. Can J Vet Res. 50 (3), 441(1986).
  18. O'Reilly, T., Rosendal, S., Niven, D. F. Porcine haemophili and actinobacilli: characterization by means of API test strips and possible taxonomic implications. Can J Microbiol. 30 (10), 1229-1238 (1984).
  19. Niven, D. F. The cytochrome complement of Haemophilus parasuis. Can J Microbiol. 30 (6), 763-773 (1984).
  20. Lapage, S., Shelton, J. E., Mitchell, T. Methods in Microbiology. , Academic Press. London. (1970).
  21. Smibert, R. M. General Characterization. Manual of Methods for General Bacteriology. , American Society for Microbiology. Washington, DC. (1981).
  22. Sharma, N., Sharma, N., Sharma, S., Sharma, P., Devi, B. Identification, Morphological, Biochemical, and Genetic Characterization of Microorganisms. Basic Biotechniques for Bioprocess and Bioentrepreneurship. , Elsevier, Academic Press. (2023).
  23. Hubálek, Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms. Cryobiology. 46 (3), 205-229 (2003).
  24. Lanza, B., Pastorelli, C., Laghi, P., Cimmaruta, R. A review of systematics, taxonomy, genetics, biogeography and natural history of the genus Speleomantes Dubois, 1984 (amphibia caudata plethodontidae). Atti Museo Civ St Natl, Trieste. 52, 5-135 (1984).
  25. Cappuccino, J. G., Welsh, C. T. Microbiology: A Laboratory Manual, Global Edition. , Pearson Education Limited: Pearson. Essex, England. (2017).
  26. Farda, B., et al. The "Infernaccio" gorges: microbial diversity of black deposits and isolation of manganesesolubilizing bacteria. Biology (Basel). 11 (8), 1204(2022).
  27. Lunghi, E., et al. Thermal equilibrium and temperature differences among body regions in European plethodontid salamanders. J Therm Biol. 60, 79-85 (2016).
  28. Woodhams, D. C., et al. Hostassociated microbiomes are predicted by immune system complexity and climate. Genome Biol. 21 (1), 23(2020).
  29. Stolp, H., Starr, M. P. Principles of Isolation, Cultivation, and Conservation of Bacteria. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (1981).
  30. El Baz, S., et al. Resistance to and accumulation of heavy metals by actinobacteria isolated from abandoned mining areas. Sci World J. 2015 (1), 761834(2015).
  31. Le Pioufle, O., Declerck, S. Reducing water availability impacts the development of the arbuscular mycorrhizal fungus Rhizophagus irregularis MUCL 41833 and its ability to take up and transport phosphorus under in vitro conditions. Front Microbiol. 9, 1254(2018).
  32. Freitas, F., Alves, V. D., Reis, M. A. M. Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications. Trends Biotechnol. 29 (8), 388-398 (2011).
  33. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J Vis Exp. (63), e3064(2012).
  34. De Paoli, P. Biobanking in microbiology: from sample collection to epidemiology, diagnosis and research. FEMS Microbiol Rev. 29 (5), 897-910 (2005).
  35. Dal Pizzol, M., et al. Antifungal efficacy and safety of cycloheximide as a supplement in OptisolGS. Drug Des Devel Ther. 15, 2091-2098 (2021).
  36. Overmann, J. Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Prokaryotes. The Prokaryotes. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2013).
  37. Madhuri, R. J., et al. Recent Approaches in the Production of Novel Enzymes from Environmental Samples by Enrichment Culture and Metagenomic Approach. Recent Developments in Applied Microbiology and Biochemistry. , Elsevier, Academic Press. (2019).
  38. BaichmanKass, A., Song, T., Friedman, J. Competitive interactions between culturable bacteria are highly nonadditive. Elife. 12, e83398(2023).
  39. Cevallos, M. A., et al. Genomic characterization of antifungal Acinetobacter bacteria isolated from the skin of the frogs Agalychnis callidryas and Craugastor fitzingeri. FEMS Microbiol Ecol. 98 (12), fiac126(2022).
  40. Lauer, A., Simon, M. A., Banning, J. L., Lam, B. A., Harris, R. N. Diversity of cutaneous bacteria with antifungal activity isolated from female fourtoed salamanders. ISME J. 2 (2), 145-157 (2008).
  41. Niederle, M. V., et al. Skinassociated lactic acid bacteria from North American bullfrogs as potential control agents of Batrachochytrium dendrobatidis. PLoS One. 14 (9), e0223020(2019).
  42. MuletzWolz, C. R., et al. Antifungal bacteria on woodland salamander skin exhibit high taxonomic diversity and geographic variability. Appl Environ Microbiol. 83 (9), e00186-e00217 (2017).
  43. Woodhams, D. C., et al. Antifungal isolates database of amphibian skin-associated bacteria and function against emerging fungal pathogens. Ecology. 96 (2), 595-595 (2015).
  44. Woodhams, D. C., et al. Interacting symbionts and immunity in the amphibian skin mucosome predict disease risk and probiotic effectiveness. PLoS One. 9 (4), e96375(2014).
  45. Pessier, A. P. An overview of amphibian skin disease. Sem Avian Exot Pet Med. 11 (3), 162-174 (2002).
  46. HernándezGómez, O., Hua, J. From the organismal to biosphere levels: environmental impacts on the amphibian microbiota. FEMS Microbiol Rev. 47 (1), fuad002(2023).
  47. Stevens, E. J., Bates, K. A., King, K. C. Host microbiota can facilitate pathogen infection. PLoS Pathog. 17 (5), e1009514(2021).
  48. Kostanjšek, R., Prodan, Y., Stres, B., Trontelj, P. Composition of the cutaneous bacterial community of a cave amphibian, Proteus anguinus. FEMS Microbiol Ecol. 95 (3), fiz007(2019).
  49. Indriani, S., Karnjanapratum, S., Nirmal, N. P., Nalinanon, S. Amphibian skin and skin secretion: an exotic source of bioactive peptides and its application. Foods. 12 (6), 1282(2023).
  50. Gao, Y., et al. Targeted modification of a novel amphibian antimicrobial peptide from Phyllomedusa tarsius to enhance its activity against MRSA and microbial biofilm. Front Microbiol. 8, 628(2017).
  51. Wang, Y., Zhang, Y., Lee, W., Yang, X., Zhang, Y. Novel peptides from skins of amphibians showed broad-spectrum antimicrobial activities. Chem Biol Drug Des. 87 (3), 419-424 (2016).
  52. Barra, D., Simmaco, M. Amphibian skin: a promising resource for antimicrobial peptides. Trends Biotechnol. 13 (6), 205-209 (1995).
  53. RollinsSmith, L. A. The importance of antimicrobial peptides (AMPs) in amphibian skin defense. Dev Comp Immunol. 142, 104657(2023).
  54. RomeroContreras, Y. J., et al. Bacteria from the skin of amphibians promote growth of Arabidopsis thaliana and Solanum lycopersicum by modifying hormonerelated transcriptome response. Plant Mol Biol. 114 (3), 39(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikrobiota sk ry p az wizolacja bakteriispo eczno mikrobiologicznarozcie czanie seryjneszalki Petriegoprzechowywanie w glicerolu solnymmorfologia koloniibakterie mezofilneywotno drobnoustroj wmikrobiom dzikich zwierz t

Powiązane artykuły