Method Article

Trójwymiarowe obrazowanie tkanki nośnej guza przy użyciu iteracyjnego wybielania rozszerza podejście multipleksywalne

DOI:

10.3791/67869

⸱

April 25th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Surgical Oncology Program, NCI, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions (IDEAS), NIBIB, NIH, 3Center for Immuno-Oncology, NCI, NIH

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł opisuje protokół immunofluorescencji multipleksowej zoptymalizowany pod kątem charakterystyki trójwymiarowej architektury przerzutów otrzewnowych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrzenna heterogeniczność mikrośrodowiska guza (TME) jest krytycznym wyznacznikiem odpowiedzi terapeutycznej, szczególnie w przypadku leków immunoonkologicznych, gdzie sukces zależy od rozmieszczenia określonych subpopulacji komórek odpornościowych. W ciągu ostatniej dekady wprowadzono wiele zaawansowanych technologii w celu uzyskania szczegółowej rozdzielczości TME przy użyciu dwuwymiarowych przekrojów tkanek utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie (FFPE) lub utrwalonych. Chociaż te cienkie skrawki są łatwiejsze do pozyskania i analizy, brakuje im trójwymiarowej architektury potrzebnej do wiarygodnego i kompleksowego scharakteryzowania guza. Aby rozwiązać ten problem, opracowano technikę montowania i obrazowania tkanek, która umożliwia trójwymiarową analizę zmian nowotworowych w ich naturalnym stanie in vivo. Protokół ten określa pobieranie ludzkiej tkanki nowotworowej, montaż próbek na specjalnie wydrukowanych platformach oraz procedury barwienia próbek po utrwaleniu. Technika multipleksowanej immunofluorescencji, IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity), została zaadaptowana do scharakteryzowania trójwymiarowego TME za pomocą maksymalnie 15 markerów dla komórek nowotworowych, immunologicznych i zrębu przy użyciu dostępnych na rynku przeciwciał. Głębokość obrazowania do 100 μm uzyskano przy użyciu odwróconego laserowego mikroskopu konfokalnego ze światłem białym z specjalnie wydrukowanym adapterem do obrazowania i dostępnymi na rynku naczyniami ze szklanym dnem, aby zapewnić optymalną orientację tkanki. Protokół ten podkreśla potencjał metody IBEX w zakresie rozszerzania multipleksowanych badań immunofluorescencyjnych, zapewniając bardziej kompleksowe zrozumienie składu TME.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guzy lite są bardzo zmienne, ze skomplikowanym składem typów komórek (złośliwe i niezłośliwe), białek macierzy zewnątrzkomórkowej i czynników rozpuszczalnych1,2. Ostatecznie to wysoce złożone, heterogenne mikrośrodowisko guza (TME) decyduje o podatności na leczenie takie jak immunoterapia3,4. W związku z tym technologie takie jak wysoce multipleksowana immunofluorescencja5,6 i transkryptomika przestrzenna7 zostały zastosowane do scharakteryzowania złożoności TME w sekcjach o grubości warstwy komórki (~4 μM).

W przeciwieństwie do metod dyspersji komórek, takich jak sekwencjonowanie pojedynczych komórek i cytometria przepływowa8,9,10, techniki te zachowują relacje przestrzenne, dostarczając krytycznych informacji o przesłuchach komórkowych i mogą być wykorzystane do identyfikacji potencjalnych biomarkerów do przewidywania odpowiedzi na leczenie11,12,13. Jednak zmiany nowotworowe są z natury strukturami trójwymiarowymi (3D), a podejścia 2D, takie jak te wymienione powyżej, nie oddają odpowiednio złożonego krajobrazu komórkowego. Znaczenie biologii 3D zostało docenione w tej dziedzinie, czego dowodem jest szerokie wykorzystanie kultur organoidów nowotworowych pochodzących od pacjentów14. Jednak organoidy nie zachowują złożoności komórkowej oryginalnego TME in vivo, co ogranicza możliwość zastosowania w lekach immunomodulujących lub do charakteryzowania różnych populacji komórek TME.

Chociaż możliwe jest przeprowadzanie analiz na seryjnych przekrojach 2D i obliczeniowe "zszywanie" obrazów w celu renderowania 3D, technika ta jest zbyt kosztowna i trudna do osiągnięcia przy wysokiej wierności15. Aby w opłacalny sposób scharakteryzować tkanki 3D (np. nowotwory) w powtarzalny sposób, opracowano unikalną metodę przygotowania i barwienia/analizy immunofluorescencji multipleksowej, którą zademonstrowano przy użyciu zmian nowotworowych otrzewnej od pacjenta z pierwotnym rakiem otrzewnej.

Oparty na adaptacji dobrze znanej techniki IBEX (Iterative Bleaching Extends Multiplexity)16,17, ten protokół szczegółowo opisuje druk 3D uchwytu tkankowego i adaptera do obrazowania, pobieranie i montowanie tkanki otrzewnej, wielokrotne cykle barwienia różnymi markerami nowotworowymi i komórkowymi oraz konfokalne obrazowanie 3D w wysokiej rozdzielczości.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało przeprowadzone za zgodą National Institutes of Health Institutional Review Board na podstawie protokołu NCT01915225. Tkanka ludzka została pobrana za pisemną świadomą zgodą w czasie laparoskopii diagnostycznej. Wszystkie tkanki były zawierające guz, co stwierdzono na podstawie widocznej oględzin i potwierdzono końcowym badaniem histopatologicznym. Szczegółowe informacje na temat wszystkich używanych odczynników i sprzętu są wymienione w Tabeli Materiałów. Schematyczna ilustracja całego przepływu pracy znajduje się w Rysunek 1.

1. Platformy drukujące, adapter do obrazowania i płyta inkubacyjna

  1. Krojenie/ Druk 3D/ procedury obróbki końcowej dla platformy i 9-dołkowych części płytki (opisane w Rysunek 2A-C)
    1. Krojenie: Otwórz oprogramowanie do krojenia i zaimportuj pliki projektu w formacie . Format STL (plik uzupełniający 1 i plik uzupełniający 2). Zorientuj modele, aby uzyskać optymalne drukowanie i dodaj podpory. Wybierz drukarkę klasy medycznej, wybierz przezroczystą żywicę i wysokość warstwy 50 μm. Sprawdź możliwość wydrukowania i wyślij zadanie do drukarki.
    2. Drukowanie 3D: Sprawdź, czy drukarka jest gotowa (odpowiedni wkład z żywicą, zbiornik i platforma na miejscu). Na ekranie dotykowym drukarki wybierz przesłane zadanie z oprogramowania slicera, aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania użyj narzędzia do usuwania, aby odłączyć wydrukowaną część od platformy.
    3. Obróbka końcowa: Płucz część w jednostce myjącej wypełnionej 99% alkoholem izopropylowym (IPA) przez 15 minut. Wyjmij części z jednostki myjącej i zanurz ją w świeżym IPA przez 5 minut.
    4. Utwardzaj część przez 60 minut w temperaturze 60 °C. Usuń podpory za pomocą noży do spłukiwania. W razie potrzeby zeszlifuj wszelkie ślady podparcia za pomocą drobnoziarnistego papieru ściernego.
  2. Krojenie/ Druk 3D/procedury przetwarzania końcowego dla regulatora wysokości i zewnętrznej pokrywy (przedstawione w Rysunek 2A-C)
    1. Krojenie: Otwórz oprogramowanie do drukowania i zaimportuj pliki projektu w formacie . Format STL (plik uzupełniający 3 i plik uzupełniający 4). Zorientuj modele i przypisz materiały. Wybierz żądany tryb drukowania (Wysoki poziom mieszania, Duża szybkość) i ustaw ustawienia modelu na wykończenie na Matowy. Sprawdź możliwość wydrukowania i wyślij zadanie do drukarki.
    2. Drukowanie 3D: Upewnij się, że drukarka ma załadowane odpowiednie materiały, a taca robocza jest czysta. W interfejsie monitora drukarki wybierz przesłane zadanie, aby rozpocząć drukowanie. Po zakończeniu drukowania użyj skrobaka, aby delikatnie wyjąć wydrukowaną część z tacy roboczej.
    3. Obróbka końcowa: Umieść wydrukowane elementy w urządzeniu do czyszczenia strumieniem wody lub systemie czyszczenia mieszanego, aby usunąć materiał podporowy. W razie potrzeby wykonaj ręczne usuwanie podpory za pomocą narzędzi takich jak pęseta lub szczypce.
  3. Laserowe cięcie suwaka platformy (pokazane w Rysunek 2A,C)
    1. Przygotowanie projektu: Zaimportuj plik *. Plik projektowy DWG w oprogramowaniu wektorowym (plik uzupełniający 5). Ustaw kolory linii na czerwony (RGB) dla cięcia wektorowego. Wyślij zadanie do wycinarki laserowej.
    2. Konfiguracja wycinarki laserowej: Otwórz oprogramowanie wycinarki laserowej i zaimportuj plik projektowy. Wybierz rodzaj materiału i dostosuj ustawienia mocy, szybkości i rozdzielczości akrylu o grubości 1/32". Umieść materiał na stole laserowym, upewnij się, że jest prawidłowo wyrównany i ustaw ostrość laser.
    3. Cięcie laserowe: Rozpocznij proces cięcia laserowego i monitoruj, aby upewnić się, że materiał jest prawidłowo cięty.

2. Montaż tkanek na platformach drukowanych

  1. Przygotowanie podłoża do zbioru i stołu przygotowawczego
    1. Uzupełnij 100 ml DMEM (o niskiej zawartości glukozy) środkiem Anti-Anti i umieść w inkubatorze o temperaturze 37 °C do czasu uzyskania potrzebnego (podłoże do zbiorów).
    2. Ustaw "stół przygotowawczy" na sali operacyjnej z następującymi przedmiotami: autoklawizowane platformy drukowane w 3D, paczka jedwabnych opasek do szwów 2-0, płyta grzewcza, kubek na próbkę z 50 ml podgrzanego podłoża do zbiorów, 15-centymetrowa płytka hodowlana zawierająca 30 ml podgrzanej pożywki do zbioru i 24-dołkowa płytka z 4 dołkami zawierającymi 1,5 ml pożywki do zbioru (umieść wszystko na płycie grzewczej), 1 para kleszczy i 1 para nożyc chirurgicznych.
  2. Resekcja i montaż tkanek
    UWAGA: Tkanka pobierana jest z sali operacyjnej. Obszary otrzewnej z ogniskami guza o grubości i średnicy mniejszej niż 0,5 mm są identyfikowane podczas oględzin (Rysunek 2D). Warto zauważyć, że do przygotowania jednej platformy potrzebne jest ~ 2cm2 tkanki (otrzewnej).
    1. Ostrożnie oddziel otrzewną zawierającą guz od leżącej poniżej mięśni ściany brzucha i powięzi (wykonywane przez chirurga). Przenieś powstałe arkusze tkanek do kubka na próbkę zawierającego ciepłe podłoże do zbioru i umieść na płycie grzewczej (stół przygotowawczy).
    2. Zamontuj tkankę na platformach w 15-centymetrowej płytce zawierającej pożywkę do pożywki. Ostrożnie ułóż tkankę zawierającą guz (strona międzybłonka skierowana do góry) na małej stronie otworu platformy i zabezpiecz ją na miejscu za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Umieść przygotowaną platformę tkankową odwrotnie (zanurzoną) w 24-dołkowej płytce zawierającej pożywkę do pobierania (Rysunek 2E-G).
      UWAGA: Zamontuj tkankę na tyle nauczoną, aby zapobiec fałdom na powierzchni platformy, ale nie generuj napięcia, ponieważ wywoła to niepożądane zmiany biomechaniczne i fizjologiczne.

3. Procedura utrwalania/barwienia/wybielania

UWAGA: Zmiany w stosunku do oryginalnego protokołu dostosowane do cienkiego FFPE 4 μm lub stałych sekcji zamrożonych są opisane w Rysunek 3. Tabela 1 zawiera listę przeciwciał (z rozcieńczeniami) stosowanych w rundach IBEX 1-6.

  1. Utrwalenie
    1. Przygotować 40 ml buforu utrwalającego, dodając 10 ml bulionu utrwalającego do stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml zimnego 1x PBS.
    2. Za pomocą kleszczy przenieść tkankę zamontowaną na platformach do buforu utrwalającego i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
    3. Zdekantować utrwalacz i zastąpić go 40 ml zimnego 1x PBS i inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Barwienia
    1. Dodaj 1 ml buforu blokującego (1% BSA, 0,3% Triton-X-100, 1% Fc Block w 1x PBS przefiltrowany filtrem strzykawkowym 0,22 μm) do każdej studzienki i wprowadź platformy tkankowe. Blokuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej na kołysce ustawionej na niską prędkość (30 obr./min).
      UWAGA: Upewnij się, że wycięcie na platformie i rowek w studni są wyrównane. Ten etap nie jest wrażliwy na czas i można go wykonać przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Przygotować 0,8 ml roztworu przeciwciała/barwnika w probówce do mikrowirówki i odwirować przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść 0,75 ml do czystego dołka na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej i włożyć umytą platformę.
    3. Zawiń płytkę w folię aluminiową i inkubuj przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej na bujaku ustawionym na niską prędkość (30 obr./min).
    4. Umyć platformę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml z 40 ml 1x PBS przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Platforma jest teraz gotowa do włożenia do adaptera do obrazowania.
  3. bielenie
    1. Po każdej rundzie barwienia i obrazowania należy wybielić fluorofory za pomocą środka redukującego estry borowodorku litu (LiBH4). Zabieg ten wyeliminuje sygnały fluorescencyjne z Alexa Fluor (AF)488, AF647 i AF750, ale nie z AF594 i barwnika jądrowego Hoechst.
      UWAGA: Borowodorek litu jest wyjątkowo reaktywny z wodą. Łatwopalne gazy wodorowe uwalniają się w kontakcie z wodą; Zużyty borowodorek litu i materiały jednorazowego użytku zanieczyszczone borowodorkiem litu należy utylizować jako odpady niebezpieczne.
    2. Przygotować 5 ml roztworu LiBH4 o stężeniu 1,5 mg/ml w wodzie destylowanej (w kapturze chemicznym) i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwór LiBH4 straci swoją skuteczność redukcyjną/wybielającą, jeśli zostanie przygotowany >4 godziny przed użyciem.
    3. Przenieść 1 ml roztworu LiBH4 do czystego dołka na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej i włożyć umytą platformę na 60 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Umyj platformę krótko w 20 ml 1x PBS w stożkowej probówce i sprawdź, czy pozostały sygnał fluorescencyjny przy użyciu najwyższego ustawienia lasera dla kompensacji Z w poprzedniej rundzie obrazowania przed przystąpieniem do kolejnych rund barwienia.
    5. Powtórzyć blokowanie próbki przez 2 godziny w temperaturze pokojowej przed przejściem do następnego etapu inkubacji przeciwciał.

4. Procedura obrazowania

  1. Montaż adapterów/platform do obrazowania
    1. Dodaj 0,1 ml 1x PBS na środek szklanego dna 3,5 cm naczynia do obrazowania i odstaw na bok. Przykręć luźno pierścień regulacji wysokości zgodnie z ruchem wskazówek zegara do zewnętrznej pokrywy i zamontuj platformę w wewnętrznym plastikowym uchwycie (wyrównanie wycięcia). Zabezpiecz platformę za pomocą suwaka.
    2. Umieść zmontowany adapter do obrazowania na naczyniu ze szklanym dnem i ostrożnie opuść pierścień regulacji wysokości, aż tkanka dotknie bufora. Unikaj obracania platformy na szklanym dnie.
    3. Po osiągnięciu optymalnej odległości od szkła dodaj 0,2 ml 1x PBS na tkankę (teraz dolną stroną do góry), aby uniknąć odwodnienia tkanek podczas obrazowania.
  2. Obrazowanie konfokalne
    1. Włącz wszystkie elementy odwróconego mikroskopu konfokalnego, w tym komputer, mikroskop, laser i źródło światła LED do użytku z okularem. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazów.
    2. Wybierz odpowiedni obiektyw (np. 20x lub 40x) i dodaj odpowiedni medium immersyjne. Na przykład w tym badaniu używany jest obiektyw z 20-krotnym powiększeniem wody; Do obiektywu dodaje się ~200 μl wody, aby uniknąć wysuszenia podczas długich akwizycji obrazu.
    3. Umieść zmontowaną miskę do obrazowania w uchwycie próbki na stoliku mikroskopu i upewnij się, że próbka jest bezpieczna (nie porusza się).
      UWAGA: Umieszczając zmontowaną próbkę na stoliku mikroskopu, zwróć uwagę na położenie wycięcia i używaj tej samej pozycji w cyklach iteracyjnych, aby ułatwić wyrównanie obrazu. Ważne jest, aby adapter obrazowania był ustawiony na optymalną wysokość podczas kolejnych rund.
    4. Wyśrodkuj preparat za pomocą regulatora XY i przyłóż obiektyw do szkła nakrywkowego. Patrząc przez okular i używając sygnału Hoechsta jako punktu odniesienia, przesuń obiektyw, aby uzyskać precyzyjną ostrość na tkance.
    5. Dobierz odpowiednie linie laserowe lub dostosuj WLL do widm wzbudzenia i emisji fluoroforów używanych do barwienia próbki tkanki. Wyeliminuj nakładanie się kanałów, dostosowując ustawienia i dodając sekwencje, jeśli fluorofory mają podobne widma wzbudzenia.
    6. Wybierz następujące parametry akwizycji obrazu: szybkość skanowania 600 Hz, rozdzielczość XY 1024 x 1024, średnie 3-liniowe i skanowanie dwukierunkowe.
    7. Wybierz następujące parametry stosu Z: (1) użyj rozmiaru kroku Z zoptymalizowanego pod kątem używanego celu, (2) zdefiniuj początek i koniec stosu, (3) dostosuj parametry kompensacji Z, aby uzyskać równą jasność w całym stosie i (4) uzyskaj stos testowy 1 kafelka z jedną średnią.
    8. Zdefiniuj obszar, który ma być obrazowany, i uzyskaj stos kafelków Z o wysokiej rozdzielczości.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Otrzewna to błoniasta struktura o grubości mniejszej niż 1 mm, która wyściela powierzchnię ściany brzucha i przylega do powierzchni narządów jamy brzusznej. Składa się z mezotelium powierzchniowego i leżącej pod nim tkanki łącznej, która jest przeplatana komórkami tłuszczowymi, limfocytami, makrofagami i fibroblastami, a także naczyniami krwionośnymi i limfatycznymi. Nowotwory otrzewnej najczęściej wynikają z przerzutów do guza jamy brzusznej (np. raka jajnika lub raka żołądka)18 lub, rzadziej, mogą być pierwotnymi nowotworami otrzewnej (np. międzybłoniak)19. Te często małe (<1 cm) zmiany nowotworowe są bardzo złożone, ale można je scharakteryzować w 3D przy użyciu opisanej techniki. Maksymalny rzut pięciu sekcji konfokalnych jest używany do wyświetlenia całej próbki zamontowanej na platformie (Rysunek 4, wstawka w lewym górnym rogu). Trzy pierwszorzędowe sprzężone przeciwciała (AF488-CD44, AF594-CD45 i AF647-Podoplanina) wraz z barwnikiem jądrowym Hoechst zastosowano w pierwszej rundzie IBEX (IBEX1, Figura 4). Zmiany nowotworowe uwidaczniają się w strukturach przypominających rozety, które są podwójnie dodatnie dla CD44 i podoplaniny i wykazują układ jąder charakterystyczny dla międzybłoniaka brodawkowatego.

Komórki nowotworowe zostały zidentyfikowane za pomocą morfologii komórek i dwóch przeciwciał, ponieważ zarówno anty-Podoplanina, jak i anty-CD44 rozpoznają komórki nienowotworowe, czego dowodem jest wykrycie naczyń limfatycznych za pomocą anty-Podoplaniny i wiązanie przeciwciała CD44 z podzbiorami komórek odpornościowych. Mniejsze obszary zainteresowania (ROI) są następnie przechwytywane przy użyciu formatu skanowania kafelków w wyższej rozdzielczości przy zoptymalizowanych rozmiarach kroku Z do renderowania projekcji 3D (Rysunek 5A). Platformy poddano iteracyjnym procedurom barwienia, a te same ROI zobrazowano w cyklach IBEX 1-6. Reprezentatywne obrazy dla interfejsów guza (żółta ramka) i guza-trzeciorzędowej struktury limfoidalnej (TLS) (niebieska ramka) są zebrane w Rysunek 5B-M.

Obecność TLS i gęstość komórek CD3-dodatnich wskazują na znaczącą infiltrację komórek odpornościowych20 i prawdopodobnie reakcję na leki immunomodulujące21. Warto zauważyć, że TLS i większość zmian nowotworowych są obecne w różnych głębokościach Z tkanki, jak wykazano w porównaniu projekcji stosu różnych sekcji optycznych w Rysunek 6, podkreślając korzyści płynące z obrazowania 3D i potencjalną utratę biologii, gdy obrazowanie 2D jest stosowane do struktur 3D. Trójwymiarowy charakter tych zmian staje się bardziej widoczny w plikach filmowych (Film 1-12), które przedstawiają renderowanie objętości poszczególnych zmian w Rysunek 5.

figure-results-1
Rysunek 1: Przejście od druku 3D do obrazowania 3D guzów otrzewnej. Protokół składa się z sekwencji pięciu kroków mających na celu przygotowanie multipleksowanych obrazów 3D z tkanki otrzewnej zawierającej guz. (1) Drukowanie platform do przyjmowania tkanek, części adapterów do obrazowania i płytek inkubacyjnych. (2) Procedury pobierania i łączenia tkanek. (3) Utrwalanie za pomocą paraformaldehydu. (4) Cykle barwienia i obrazowania IBEX. (5) Rekonstrukcja 3D za pomocą oprogramowania do obrazowania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Komponenty sprzętowe z interfejsem tkankowym do obrazowania 3D. (A) Schemat ideowy montażu platformy w adapterze do obrazowania. (B) 9-dołkowa płytka inkubacyjna. (C) Fotografie elementów adaptera obrazu wraz z montażem. (D) Otrzewna zawierająca międzybłoniaka obserwowana podczas laparoskopii diagnostycznej. (E) Montaż tkanki na platformie. (F,G) Otrzewna nowotworowa zamontowana na platformach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat osi czasu cykli IBEX. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przegląd platformy po inkubacji z panelem IBEX1. Maksymalna projekcja całej platformy po inkubacji z panelem IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 i AF647-Podoplanin). Przerywane koło podkreśla guz. Wstawka: Zdjęcie otrzewnej nośnej guza zamontowanej na platformie obrazowania. Podziałka: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Obrazy immunofluorescencyjne w wysokiej rozdzielczości wybranych regionów platformy. (A) Maksymalna projekcja scalonego 56-kafelkowego obrazu stosu Z uzyskanego po inkubacji z panelem IBEX1 (Hoechst, AF488-CD44, AF594-CD45 i AF647-Podoplanin). Żółty prostokąt: zmiana nowotworowa pokazana na panelach (B-G). Niebieski prostokąt: interfejs struktury limfatycznej guza i trzeciorzędowej pokazany w (H-M). (B-G) Jedna pojedyncza zmiana nowotworowa z panelem IBEX 1-6 w renderowaniu objętościowym. (B) IBEX1, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanina. (C) IBEX2, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3. (D) IBEX3, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK. (E) IBEX4, zielony: CD31, cyjan: CD68. (F) IBEX5, zielony: CD206, cyjan: kalretynina. (G) IBEX6, zielony: Vimentin, czerwony: HLADR. (H-M) Jeden indywidualny interfejs struktury limfatycznej guza i trzeciorzędu z panelem IBEX 1-6 w renderowaniu objętościowym. (H) IBEX1, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanina. (I) IBEX2, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3. (J) IBEX3, zielony: CD4, czerwony: panCK, cyjan: CD8. (K) IBEX4, zielony: CD31, czerwony: SMA, cyjan: CD68. (L) IBEX5, zielony: CD206, cyjan: kalretynina. (M) IBEX6, zielony: HLADR, cyjan: Vimentin. Wszystkie panele, niebieskie: Hoechst. Podziałka liniowa: (A, 1 mm); (B-M, 250 μm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Symulowane obrazowanie 2D. Porównanie ograniczonych (10 odcinków optycznych) i pełnych (102 sekcje optyczne) projekcji potwierdza utratę kontekstu tkankowego w symulacji 2D. (A) Maksymalny rzut sekcji 30-40 (10 μm). (B) Maksymalny rzut sekcji 85-95 (10 μm). (C) Maksymalny rzut przekrojów 1-102 (~100 μm). Wszystkie panele, IBEX2 (Hoechst, AF488-CD20, AF647-CD3, AF790-falloidyna). Podziałka skali: 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przeciwciała użyte w poszczególnych panelach IBEX. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Film 1: Animowane renderowanie objętości pojedynczej zmiany za pomocą panelu IBEX 1 (niebieski: Hoechst, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanina). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 2: Animowane renderowanie objętości pojedynczej zmiany za pomocą panelu IBEX 2 (niebieski: Hoechst, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 3: Animowane renderowanie objętości pojedynczej zmiany za pomocą panelu IBEX 3 (niebieski: Hoechst, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 4: Animowane renderowanie objętości pojedynczej zmiany za pomocą panelu IBEX 4 (niebieski: Hoechst, zielony: CD31, cyjan: CD68). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 5: Animowane renderowanie objętości pojedynczej zmiany za pomocą panelu IBEX 5 (niebieski: Hoechst, zielony: CD206, cyjan: kalretynina). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 6: Animowane renderowanie objętości poszczególnych zmian za pomocą panelu IBEX 6 (niebieski: Hoechst, zielony: Vimentin, czerwony: HLADR). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 7: Animowane renderowanie objętości trzeciorzędowej struktury limfoidalnej i interfejsu zmian chorobowych z panelem IBEX 1 (niebieski: Hoechst, zielony: CD44, czerwony: CD45, cyjan: Podoplanina). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 8: Animowane renderowanie objętości trzeciorzędowej struktury limfoidalnej i interfejsu zmian chorobowych z panelem IBEX 2 (niebieski: Hoechst, zielony: CD20, czerwony: F-aktyna, cyjan: CD3). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 9: Animowane renderowanie objętości interfejsu trzeciorzędowej struktury limfoidalnej i zmian chorobowych z panelem IBEX 3 (niebieski: Hoechst, zielony: CD8, czerwony: CD4, cyjan: panCK). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 10: Animowane renderowanie objętości interfejsu trzeciorzędowej struktury limfoidalnej i zmian chorobowych z panelem IBEX 4 (niebieski: Hoechst, zielony: CD31, czerwony: SMA, cyjan: CD68). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 11: Animowane renderowanie objętości trzeciorzędowej granicy między strukturą limfoidalną a uszkodzeniem za pomocą panelu IBEX 5 (niebieski: Hoechst, zielony: CD206, cyjan: kalretynina). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Film 12: Animowane renderowanie objętości interfejsu trzeciorzędowej struktury limfoidalnej i zmian chorobowych za pomocą panelu IBEX 6 (niebieski: Hoechst, zielony: Vimentin, czerwony: HLADR). Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Plik uzupełniający 1: Wydrukuj plik na płytkę inkubacyjną. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Drukuj plik dla 36 indywidualnych platform. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Wydrukuj plik dla pierścienia regulacji wysokości. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Wydrukuj plik na zewnętrzną pokrywę. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Laserowo wycięty plik dla suwaka. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne techniki multipleksowe do obrazowania fluorescencyjnego są ograniczone do cienkich przekrojów i nie zapewniają kontekstu 3D. W niniejszym badaniu opisano protokół zastosowania metody obrazowania IBEX16,17 do nienaruszonych guzów zamontowanych na specjalnie zaprojektowanych platformach. Zmiany nowotworowe otrzewnej zostały wybrane w celu podkreślenia techniki, ponieważ u pacjentów często występuje wiele złogów guza o idealnej wielkości, które są pobierane wraz z otaczającą normalną otrzewną w ramach standardowej operacji cytoredukcji przeprowadzanej w większości ośrodków referencyjnych trzeciego stopnia na całym świecie22,23. Protokół ma jednak zastosowanie zarówno do przerzutów miąższowych, jak i guzów mysich przy użyciu plastrów guza, jak opisano wcześniej24,25. Co więcej, średnica pierścienia montażowego na platformach może być dostosowana do potrzeb eksperymentalnych/tkankowych, chociaż większe obszary są podatne na zwiotczenie tkanek i wydłużony czas obrazowania. Niezależnie od źródła i wielkości tkanki, czas między pobraniem a konserwacją musi być minimalny, aby zapewnić optymalną jakość26. Ustawienie stołu przygotowawczego na sali operacyjnej gwarantuje szybką obsługę w przypadku zaangażowania pacjentów. Należy odnotować czas od pobrania do utrwalenia tkanki w celu zapewnienia porównywalności między doświadczeniami.

Próbki tkanek są pobierane za pomocą protokołu IBEX, ponieważ wykonuje się całe mocowania, tj. etapy fiksacji i obrazowania, a także wybielania, z nienaruszoną tkanką przymocowaną do platformy. Gwarantuje to zachowanie próbki w iteracyjnych cyklach barwienia/obrazowania/wybielania, ponieważ nie ma półtrwałego interfejsu sekcja-szkło i nie ma potrzeby wielokrotnego umieszczania/usuwania szkła nakrywkowego z tkanki, co może prowadzić do utraty tkanki. Aby zaoszczędzić na odczynnikach, specjalnie zaprojektowana 9-dołkowa płytka gwarantuje optymalne dopasowanie platformy przy minimalnej "martwej objętości". Wszystkie przeciwciała używane do barwienia są pierwotnymi przeciwciałami sprzężonymi, a wszystkie użyte koniugaty fluoroforowe (z wyjątkiem barwnika Hoechsta) to barwniki Alexa Fluor, które zostały wybrane ze względu na ich doskonałą jasność27. Inne panele przeciwciał fluoroforowych zostały zaprojektowane zgodnie z danymi zdeponowanymi przez społeczność obrazowania IBEX, otwarte, globalne repozytorium gromadzące zestawy danych, protokoły i informacje zwrotne od międzynarodowej grupy naukowców korzystających z IBEX (https://ibeximagingcommunity.github.io/ibex_imaging_knowledge_base/). Sekwencja paneli przeciwciał została starannie dobrana. Ogólnie rzecz biorąc, cele o niskiej liczebności umieszczono we wcześniejszych cyklach. Cykl IBEX 1 (CD45, CD44 i Podoplanina) jest wyjątkiem, ponieważ te trzy markery zostały wykorzystane do identyfikacji zmian nowotworowych w początkowej rundzie barwienia.

Panele przeciwciał są porównywalnie małe, aby zmniejszyć przesłuchy kanałowe przy wysokich ustawieniach intensywności lasera, co jest niezbędne do zobrazowania tkanki głębiej za pomocą mikroskopu konfokalnego. Tam, gdzie to możliwe, włączono koniugaty AF750, aby rozszerzyć panel z 2 do 3 przeciwciał. Warto zauważyć, że nie ma wielu koniugatów AF750 dostępnych na rynku, a fakt, że cel dla tego kanału powinien być bardzo obfity, ogranicza stosowanie tego fluoroforu. Przykładem jest przeciwciało anty-SMA sprzężone z AF750, które zostało użyte w tym protokole. Chociaż jest to klon, który działa niezawodnie skoniugowany z AF488 lub AF594, intensywność sygnału dla tego przeciwciała sprzężonego z AF750 jest znacznie niższa, co utrudnia generowanie wysokiej jakości stosów Z.

Inkubacje przeciwciał trwające 3 godziny w temperaturze pokojowej są krótkie w porównaniu z oryginalnym protokołem i najprawdopodobniej odzwierciedlają niższą gęstość komórek w próbkach tkanki otrzewnej. Natomiast etap wybielania z użyciem 1,5 mg/ml borowodorku litu przez 60 minut był bardziej rygorystyczny. Parametry te zostały określone empirycznie i mogą się różnić w zależności od użytej tkanki i przeciwciał. Warto zauważyć, że w wyniku inkubacji w reaktywnym roztworze wybielającym małe pęcherzyki powietrza mogą zostać uwięzione w tkance. Za każdym razem, gdy stawało się to widoczne na etapie obrazowania procedury, próbki odgazowywano, wystawiając platformę na 9-dołkowej płytce inkubacyjnej na działanie próżni za pomocą kanistra ssącego. Proste rejestracje próbek ITK, często stosowane w badaniach IBEX, nie mogły być wykonane ze względu na przytłaczającą ilość danych wprowadzanych do oprogramowania do analizy obrazu. Niemniej jednak identyczne populacje komórek można łatwo zidentyfikować, porównując poszczególne zestawy danych. Ogólnie rzecz biorąc, cykle iteracyjne były tak rozłożone w czasie, że jeden cykl można było ukończyć w ciągu jednego dnia, przy czym obrazowanie zajmowało większość całego cyklu (~ 8 godzin).

Technika ta ma ograniczenia, o których warto wspomnieć. Wymóg czasowy określony w protokole sprawia, że jest mało prawdopodobne, aby metoda ta została przyjęta na szeroką skalę, ale raczej w wybranych okolicznościach. Przewidujemy, że protokół ten najlepiej wykorzysta się do scharakteryzowania zmian w mikrośrodowisku immunologicznym guza przed i po leczeniu (np. Przeciwciała bispecyficzne do immunoterapii raka) lub do przewidywania ogólnych wyników leczenia. Chociaż protokół ten oferuje charakterystykę 3D, nie wiadomo, jak duży obszar musi zostać zbadany, aby skutecznie opisać guz, w tym jego złożone populacje komórek28. Dostęp do świeżych tkanek ludzkich może być również utrudniony w niektórych ośrodkach, ale przewidujemy, że protokół ten ma zastosowanie również do modeli zwierzęcych29.

Zastosowania tego protokołu są różnorodne, od badań podstawowych analizujących skład TME w wielu guzach litych po biopsje tkanek przed / po biopsjach u pacjentów włączonych do badań klinicznych. Chociaż dane możliwe do uzyskania z przekroju tkanki o grubości pojedynczej warstwy komórkowej są ogromne, biologię 3D można łatwo przeoczyć. Postrzegamy obrazowanie 3D jako dodatek do innych technik biologii przestrzennej, prawdopodobnie pomagając w wyborze przekrojów 2D do późniejszych analiz. Ponadto aktywnie trwa opracowywanie protokołu włączającego komponent obrazowania na żywo przez wiele godzin przy użyciu opisanej konfiguracji montażu i obrazowania tkanki.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez Intramural Research Program of the National Institutes of Health i National Cancer Institute (NCI). Badania te były również częściowo wspierane przez CAT-I, współpracę badawczą między NIAID i NCI, kierowaną przez Ronalda Germaina. Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność Andrei Radtke za jej entuzjastyczne, wspólne wysiłki. Jej wiedza specjalistyczna bardzo pomogła w tym badaniu.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor Plus 750 PhalloidinInvitrogenA30105Barwnik F-aktynowy
Alexa Fluor 488 przeciwciało antyludzkie CD206 (MMR)Przeciwciało BioLegend321114Przeciwciało
Alexa Fluor 488 anty-ludzkie CD31PrzeciwciałoBioLegend303110
Alexa Fluor 488 przeciwciało antyludzkie CD4Przeciwciało BioLegend300519
Alexa Fluor 488 przeciwciało anty-ludzkie HLA-DRPrzeciwciało BioLegend307656Przeciwciało
Alexa Fluor 488 przeciwko myszy/ludzkiemu CD44PrzeciwciałoBioLegend103016
Przeciwciało Alexa Fluor 594 przeciwko ludzkiemu CD45PrzeciwciałoBioLegend304060
Przeciwciało przeciw kalretyninie Alexa Fluor 647 [EP1798]Przeciwciało Abcamab214244
Przeciwciało antyludzkie CD3 Alexa Fluor 647Przeciwciało BioLegend300416
Przeciwciało anty-ludzkie przeciwko CD8 Alexa Fluor 647PrzeciwciałoBioLegend344726
Przeciwciało przeciw ludzkiej podoplaninie Przeciwciało przeciw ludzkiej podoplaniniePrzeciwciało BioLegend337007
Przeciwciało anty-Vimentin Alexa Fluor 647Przeciwciało677807 BioLegend
Przeciwciało Alexa Fluor 647 CD68 (KP1)Santa Cruzsc-20060AF647
przeciwciało Alexa Fluor 750 Cytokeratyna, pan Przeciwciało (AE-1 / AE-3)PrzeciwciałoNovusNBP2-33200AF750
Alexa Fluor 750 Ludzkie przeciwciało alfa-aktynowe mięśni gładkichR& Przeciwciało IC1420S D
Przeciwciało monoklonalne Alexa Fluor 488 CD20 (L26) eBioscienceThermo Fisher53-0202-82
Antybiotykowo-przeciwgrzybiczepodłoże do zbioruGibco15240096
BioMed Clear Resin (forma 3)Żywica FormLabsRS-F2-BMCL-01używana do platformy + płytki inkubacyjnej
BSASigmaA7906-500gBlokowanie składnika rozwiązania
Odlew akrylowy o grubościużywany do cięcia suwaka
CleanStation DT3 StratasysDT3dla regulatora wysokości i pojemnika na pokrywę zewnętrzną
, próbka McKesson870203przenoszeniu tkanki ze stołu do stołu przygotowawczego
CorelDraw CorelDRAWOprogramowanie do przygotowania wektorowego pliku projektowego do cięcia laserowego
CytofixBD Bioscience554655utrwalacz
Talerz 15 cmFalcon353025talerz używany podczas montażu
Talerz 35 mm nr 1.5 Szkiełko nakrywkowe 14 mm Średnica szkła NiepowlekanyMatekP35G-1.5-14-CTalerz obrazowy
DMEM (bez glukozy)Gibco11966025pożywka do zbioru
Fc BlockBD Bioscience564220składnik roztworu blokującego
Form 3B+FormlabsForm 3B+drukarka używana do platformy + płytki inkubacyjnej
Form CureFormlabsFH-CU-01obróbka końcowa dla platformy + płytki inkubacyjnej
Form WashFormlabsFH-WA-01obróbka końcowa dla platformy + płytki
GrabCAD PrintGrabCAD GrabCAD Oprogramowaniedo drukowania do przygotowywania modeli do drukarek Stratasys
Hoechst 33342 10 mg/mLBiotium40046barwnik jądrowy
J826 Prime Drukarka 3DStratasysJ826używana do regulatora wysokości i zewnętrznej pokrywy
LAS XLeicaLAS XConfocal
System cięcia laserowego Uniwersalne systemylaserowe ULS PLS6.150DCO2 Cięcie laserowe używane do suwaka
Borowodorek lituSTREM Chemikalia93-0397substancja wybielająca
PBS, pH 7,410010023 GibcoBufor do mycia, blokowania, barwienia
PreFormOprogramowaniePreForm do przygotowania modeli do drukarek Formlab
Szwy jedwabne  2-0 EthiconA305. Tkankaprzymocowana do platformy
Mikroskop konfokalny Stellaris 8 WLLObrazowanieSTELLARIS 8Obrazowanie konfokalne 
Filtr strzykawkowyFiltr ab roztwór
Triton X-100American BioAB02025-00100odczynnik permeabelizujący, składnik roztworu blokującego
Vero ContactClearStratasysCTT610, żywica 4 KGużywana do regulatora wysokości i pokrywy zewnętrznej
Taca grzewczaSpring USAST-1220utrzymuje ciepło podłoża i tkanek
Woda, destylowanaGibco15230-170rozcieńczalnik do LiBH4
suplementu 1/32" Obróbka końcowa inkubacyjnej Oprogramowanie Baza konfokalne Leica

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, N. M., Simon, M. C. The tumor microenvironment. Curr Biol. 30 (16), R921-R925 (2020).
  2. Li, Z., Li, J., Bai, X., Huang, X., Wang, Q. Tumor microenvironment as a complex milieu driving cancer progression: A mini-review. Clin Transl Oncol. , (2024).
  3. Fridman, W. H., Zitvogel, L., Sautes-Fridman, C., Kroemer, G. The immune contexture in cancer prognosis and treatment. Nat Rev Clin Oncol. 14 (12), 717-734 (2017).
  4. Roma-Rodrigues, C., Mendes, R., Baptista, P. V., Fernandes, A. R. Targeting tumor microenvironment for cancer therapy. Int J Mol Sci. 20 (4), 840(2019).
  5. Sheng, W., et al. Multiplex immunofluorescence: A powerful tool in cancer immunotherapy. Int J Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).
  6. Bollhagen, A., Bodenmiller, B. Highly multiplexed tissue imaging in precision oncology and translational cancer research. Cancer Discov. 14 (11), 2071-2088 (2024).
  7. Jin, Y., et al. Advances in spatial transcriptomics and its applications in cancer research. Mol Cancer. 23 (1), 129(2024).
  8. Kashyap, A., et al. Quantification of tumor heterogeneity: From data acquisition to metric generation. Trends Biotechnol. 40 (6), 647-676 (2022).
  9. Chang, Q., Hedley, D. Emerging applications of flow cytometry in solid tumor biology. Methods. 57 (3), 359-367 (2012).
  10. Zhang, L., et al. Single-cell analyses inform mechanisms of myeloid-targeted therapies in colon cancer. Cell. 181 (2), 442-459.e29 (2020).
  11. Wang, X. Q., et al. Spatial predictors of immunotherapy response in triple-negative breast cancer. Nature. 621 (7980), 868-876 (2023).
  12. Maestri, E., et al. Spatial proximity of tumor-immune interactions predicts patient outcome in hepatocellular carcinoma. Hepatology. 79 (4), 768-779 (2024).
  13. Wang, Q., et al. Role of tumor microenvironment in cancer progression and therapeutic strategy. Cancer Med. 12 (10), 11149-11165 (2023).
  14. Veninga, V., Voest, E. E. Tumor organoids: Opportunities and challenges to guide precision medicine. Cancer Cell. 39 (9), 1190-1201 (2021).
  15. Lin, J. R., et al. Multiplexed 3d atlas of state transitions and immune interaction in colorectal cancer. Cell. 186 (2), 363-381.e19 (2023).
  16. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  17. Radtke, A. J., et al. Ibex: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).
  18. Van Baal, J. O., et al. The histophysiology and pathophysiology of the peritoneum. Tissue Cell. 49 (1), 95-105 (2017).
  19. Bridda, A., Padoan, I., Mencarelli, R., Frego, M. Peritoneal mesothelioma: A review. MedGenMed. 9 (2), 32(2007).
  20. Demuytere, J., Ernst, S., Van Ovost, J., Cosyns, S., Ceelen, W. The tumor immune microenvironment in peritoneal carcinomatosis. Int Rev Cell Mol Biol. 371, 63-95 (2022).
  21. Wang, Q., et al. Heterogeneity of tertiary lymphoid structures predicts the response to neoadjuvant therapy and immune microenvironment characteristics in triple-negative breast cancer. Br J Cancer. , (2024).
  22. Kepenekian, V., et al. Peritoneal mesothelioma: Systematic review of hyperthermic intraperitoneal chemotherapy (HIPEC) protocol outcomes. Indian J Surg Oncol. 14 (Suppl 1), 39-59 (2023).
  23. Mcquade, C., Renton, M., Chouhan, A., Macdermott, R., O'brien, C. Review of imaging peritoneal disease and treatment. Can Assoc Radiol J. , (2024).
  24. Kenerson, H. L., et al. Tumor slice culture as a biologic surrogate of human cancer. Ann Transl Med. 8 (4), 114(2020).
  25. Arrizabalaga, L., et al. Tumor slice culture system for ex vivo immunotherapy studies. Methods Cell Biol. 189, 55-69 (2024).
  26. Neumeister, V. M., et al. Quantitative assessment of effect of preanalytic cold ischemic time on protein expression in breast cancer tissues. J Natl Cancer Inst. 104 (23), 1815-1824 (2012).
  27. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes: A series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), 1179-1188 (1999).
  28. Rajaram, S., et al. Sampling strategies to capture single-cell heterogeneity. Nat Methods. 14 (10), 967-970 (2017).
  29. Bella, A., et al. Mouse models of peritoneal carcinomatosis to develop clinical applications. Cancers (Basel). 13 (5), 963(2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tumor MicroenvironmentMultiplex ImmunofluorescenceThree Dimensional ImagingIterative BleachingIBEX MethodConfocal MicroscopyImmune Cell InfiltrationTumor Lesion AnalysisTertiary Lymphoid StructuresTissue Mounting

Related Articles