Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67870

⸱

7 lutego 2025

 , 
1College of Medicine, Department of Biochemistry, Microbiology, and Immunology, University of Saskatchewan

W tym artykule

Podsumowanie

Montaż in vivo to metoda klonowania niezależna od ligacji, która opiera się na wewnętrznych enzymach naprawy DNA u bakterii w celu złożenia fragmentów DNA przez rekombinację homologiczną. Protokół ten jest zarówno czasochłonny, jak i opłacalny, ponieważ wymagana jest niewielka liczba odczynników, a skuteczność klonowania może sięgać nawet 99%.

Streszczenie

Montaż in vivo (IVA) to metoda klonowania molekularnego, która wykorzystuje wewnętrzne enzymy obecne u bakterii, które promują międzycząsteczkową rekombinację fragmentów DNA w celu złożenia plazmidów. Metoda ta polega na przekształcaniu fragmentów DNA z regionami homologii 15-50 pz w powszechnie stosowane laboratoryjne szczepy Escherichia coli, a bakterie wykorzystują niezależny od RecA szlak naprawczy do składania fragmentów DNA w plazmid. Metoda ta jest szybsza i bardziej opłacalna niż wiele metod klonowania molekularnego, które opierają się na składaniu plazmidów in vitro przed przekształceniem w szczepy E. coli. Dzieje się tak dlatego, że metody in vitro wymagają zakupu specjalistycznych enzymów i przeprowadzenia sekwencyjnych reakcji enzymatycznych, które wymagają inkubacji. Jednak w przeciwieństwie do metod in vitro, nie wykazano eksperymentalnie, aby IVA składało liniowe plazmidy. Tutaj dzielimy się protokołem IVA używanym przez nasze laboratorium do szybkiego składania plazmidów i subklonowania fragmentów DNA między plazmidami o różnym pochodzeniu replikacji i markerami oporności na antybiotyki.

Wprowadzenie

Klonowanie molekularne obejmuje szereg technik laboratoryjnych potrzebnych do produkcji plazmidów zawierających specyficzne rekombinowane DNA1. Te wszechobecne techniki często działają jako wąskie gardło w eksperymentalnym przepływie pracy2. Wiele technik klonowania molekularnego opiera się na składaniu fragmentów DNA in vitro przy użyciu serii reakcji enzymatycznych przed przekształceniem w szczep gospodarza (np. Escherichia coli DH5a) w celu amplifikacji3,4,5,6,7. Ponieważ metody składania plazmidów in vitro opierają się na enzymach, zakup lub oczyszczanie enzymów może być zarówno kosztowne, jak i czasochłonne.

Montaż in vivo (IVA) to metoda klonowania molekularnego, która opiera się na międzycząsteczkowej rekombinacji fragmentów DNA w odpowiednim gospodarzu8,9,10,11,12. Podstawą tej metody była obserwacja, że powszechnie stosowane szczepy klonowania E. coli mogą pośredniczyć w międzycząsteczkowej rekombinacji jednoniciowego startera z plazmidem rozszczepionym przez enzymy restrykcyjne13. Zastosowanie PCR do generowania homologicznych końcówek DNA do składania plazmidu u E. coli zostało opisane w latach 90., a metoda ta została nazwana rekombinacją PCR3,14. Skuteczność rekombinacji PCR wyniosła około 50%14. Jednak metoda ta nie została powszechnie przyjęta, prawdopodobnie ze względu na wysoki koszt starterów i ryzyko wprowadzenia niepożądanych mutacji przy użyciu polimeraz o niskiej wierności do amplifikacji dużych fragmentów DNA. Wady te były znaczące w latach dziewięćdziesiątych XX wieku i można było ich uniknąć, stosując metody klonowania in vitro, takie jak klonowanie za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych.

W ostatnich latach koszt starterów spadł, a nowe komercyjne polimerazy zwiększyły wierność amplifikacji PCR. W rezultacie, rekombinacja PCR została ponownie przeanalizowana jako szybka i opłacalna technika klonowania molekularnego i przemianowana na IVA2,9,15,16. Wraz ze wzrostem wykonalności, IVA było dalej badane, a metoda została zoptymalizowana pod kątem osiągnięcia wydajności klonowania do 99%16. Optymalizacje pozwoliły zidentyfikować cechy homologicznego DNA, takie jak liczba par zasad i temperatura topnienia, które maksymalizują wydajność rekombinacji in vivo2,16. Dalsza analiza wykazała, że do 6 fragmentów DNA o wielkości od 150 pz do 7 kpz może być efektywnie złożonych przez IVA15. Ponadto, nasza grupa niedawno użyła IVA do złożenia serii plazmidów z różnymi kasetami oporności na antybiotyki i pochodzeniem replikacji17. W tym badaniu klonowanie IVA było bardzo skuteczne (71-100%) przy niewielkiej liczbie klonów testowanych dla każdego plazmidu (n = 2)17. Poniżej opisujemy protokół IVA stosowany przez nasze laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Zaprojektuj startery lub fragmenty DNA z homologicznymi końcami

  1. Użyj edytora tekstu lub specjalistycznego oprogramowania do analizy DNA, aby sztucznie złożyć żądany plazmid.
    UWAGA: Często pomocne jest kodowanie kolorami fragmentów DNA z różnych źródeł i podkreślanie regionów homologicznych, które będą używane na dalszych etapach montażu. Ponadto pomocne jest również kodowanie kolorami homologicznego DNA, aby zapewnić montaż kierunkowy.
  2. Zaprojektuj startery, które wiążą się z każdym fragmentem DNA i zawierają 15-50 pz homologicznej sekwencji DNA (Rysunek 1)2,15.
    1. Aby zwiększyć wydajność IVA, upewnij się, że homologiczne fragmenty DNA mają temperaturę topnienia 47-52 °C2.
      UWAGA: Temperaturę topnienia można określić za pomocą oprogramowania online18 lub wzoru: Temperatura topnienia = 64,9 + 41 * (nG + nC - 16,4)/(nA + nT + nG + nC), gdzie n = liczba G, C, A lub T w sekwencji6,19.
    2. Unikaj starterów z bardzo powtarzającymi się sekwencjami, takich jak CATCATCATCATCATCATCAT, które kodują dla znacznika HIS, ponieważ mogą one wprowadzać niestabilność20. Jeśli do zastosowań takich jak wstawienie znacznika poli-HIS potrzebna jest końcowa powtarzalna sekwencja aminokwasów, użyj alternatywnych kodonów, takich jak CATCACCATCATCACCAC, aby zmniejszyć powtarzalność sekwencji kwasu nukleinowego.
      UWAGA: Podkłady można zamówić u dowolnego preferowanego dostawcy. Jeśli fragmenty DNA mają być syntetyzowane, do zsyntetyzowanego fragmentu DNA powinny zostać włączone końce homologiczne.

2. Amplifikacja produktów DNA zawierających homologiczne końce

  1. Wyizoluj plazmidowe DNA lub genomowe matryce DNA za pomocą standardowych dostępnych na rynku zestawów do izolacji DNA lub lizy alkalicznej6,17.
  2. Użyć matrycy DNA (z kroku 2.1) i starterów zawierających regiony homologiczne (krok 1.2) w reakcji PCR z dostępną w handlu polimerazą o wysokiej wierności. Aby ograniczyć przenoszenie matrycy DNA w dalszych reakcjach, należy użyć małej ilości matrycowego DNA (20 pg-1 ng) w każdej reakcji. Zapoznaj się z zaleceniami producenta dotyczącymi składników mieszaniny do reakcji PCR specyficznych dla enzymów i zalecanych warunków cyklicznych PCR. Kontynuuj reakcję PCR.
    1. Ustaw reakcje PCR (50 μL) w celu amplifikacji fragmentów DNA pokazanych na Rysunek 2 tak, aby zawierały 100 μM dNTP, 0,2 μM każdego startera DNA, matrycę DNA (50 pg pSU19 i 1 ng pSU18mCherry), 1x mieszaninę buforu reakcyjnego PCR zawierającą Mg2+ (2 mM stężenie końcowe) i 1 U polimerazy DNA o wysokiej wierności.
    2. Użyj programu cyklicznego PCR z przyłożeniem, aby wzmocnić pSU19 i mCherry (Rysunek 2). Ustawić początkowy etap denaturacji na 95 °C na 5 minut, następnie 10 cykli po 95 °C przez 15 s, 55 °C -0,5 °C na cykl przez 15 s i 72 °C przez 1 minutę, a następnie 20 dodatkowych cykli po 95 °C przez 15 s, 50 °C przez 15 s, i 72 °C przez 1 min. Zakończyć cykl PCR ostatnim etapem przedłużania w temperaturze 72 °C przez 10 min.
      UWAGA: Jeśli szkielet plazmidowy ma być amplifikowany, dostosuj ilość matrycy DNA w oparciu o masę cząsteczkową: z ~20 pg/1 kbp plazmidowego DNA na 50 μL reakcji PCR (50 pg DNA dla pSU19 (pokazano)). Ponadto należy dostosować cykle PCR, aby zminimalizować liczbę mutacji wprowadzanych podczas amplifikacji: do amplifikacji szkieletów plazmidowych wystarczy zaledwie 20-25 cykli PCR.
  3. Po zakończeniu reakcji PCR usuń podwielokrotność (2 μl) reakcji PCR, połącz z barwnikiem ładującym (do stężenia 1x) i oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym21. Użyj transiluminatora ultrafioletowego (UV) lub LED, aby uwidocznić fragmenty DNA, które migrowały w żelu agarozowym. Określ, czy produkty PCR są unikalne i porównaj produkty z drabiną DNA, aby sprawdzić, czy mają oczekiwaną masę cząsteczkową (Rysunek 2). Jeśli nie zostaną uwidocznione żadne produkty PCR o prawidłowej masie cząsteczkowej, należy zapoznać się z zaleceniami producenta dotyczącymi optymalizacji reakcji PCR.
    UWAGA: Gdy produkty PCR nie są unikalne, ale występuje obfity fragment DNA odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej, można uniknąć dodatkowej reakcji PCR.
  4. Jeżeli w żelu agarozowym znajduje się wiele fragmentów DNA, należy wyciąć fragment DNA odpowiadający oczekiwanej masie cząsteczkowej z żelu agarozowego i użyć zestawu do ekstrakcji żelu agarozowego w celu odzyskania fragmentu DNA.
  5. Aby usunąć metylowany matrycowy DNA z reakcji PCR, dodaj 1 μl DpnI bezpośrednio do probówki reakcyjnej. Reakcje inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut do nocy.
    UWAGA: Ten opcjonalny krok jest wysoce zalecany w celu ograniczenia ilości matrycowego DNA, które jest przenoszone w dalszych reakcjach. Jednak ten krok można pominąć, jeśli w reakcji PCR stosuje się bardzo niskie stężenia matrycowego DNA.
  6. Użyj zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych, aby usunąć pozostałości enzymów, soli, dimerów starterów i innych niepożądanych niskocząsteczkowych produktów DNA powstałych w wyniku testów enzymatycznych.
    UWAGA: Kroki 2.1-2.6 można pominąć, jeśli syntetyzowane są fragmenty DNA.
  7. Określić ilościowo stężenie DNA w oczyszczonych fragmentach DNA za pomocą spektrofotometrii lub oceny żelu.

3. IVA (Rysunek 3)

  1. Oblicz ilość DNA wymaganą do każdej reakcji IVA (zalecane jest 25-50 ng plazmidowego DNA). Użyj większych ilości plazmidowego DNA dla plazmidów o większej masie cząsteczkowej (np. dla plazmidów o wielkości 2,3 kpz użyj 25 ng plazmidu, ale gdy plazmidy mają 9 kbp, użyj 50 ng w każdej reakcji). Obliczyć objętość insercji DNA potrzebną do reakcji; użyj stosunku molowego plazmidu 1:3 lub 1:5:wstaw DNA.
    UWAGA: Kalkulatory biologiczne online lub poniższe wzory mogą być używane do obliczenia ilości molowej dwuniciowego fragmentu DNA i określenia stosunku molowego każdego fragmentu DNA.
    Do obliczenia ilości molowej dwuniciowego fragmentu DNA używamy następującego wzoru: pmol = (waga w ng) × 1,000 / (pary zasad × 650 daltonów). Ponadto stosunki molowe można obliczyć ze wzoru: wstawka masowa (g) = pożądany stosunek molowy wstawienia do plazmidu × masy plazmidu (g) × stosunek długości wstawki do plazmidu6.
  2. Połączyć obliczoną objętość plazmidu i wprowadzić DNA do wstępnie schłodzonej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i trzymać na lodzie.
  3. Przenieść plazmid i wstawić mieszaninę DNA z kroku 3.2 do podwielokrotności (25-100 μL) rozmrożonego chemicznie kompetentnego E. coli (np. E. coli DH5a;22).
    UWAGA: Objętość użytych kompetentnych komórek zależy od objętości mieszaniny plazmidu i wstawienia DNA; Ta mieszanina nie powinna przekraczać 10% objętości właściwych komórek.
  4. Kontynuuj transformację szoku cieplnego23.
    1. Mieszaninę chemicznie kompetentnych bakterii E. coli i DNA inkubować na lodzie przez 30 minut.
    2. Przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 42 °C na 1 minutę, a następnie umieścić probówkę w lodzie na 2 minuty.
    3. W asepcie przenieść LB do probówki, aby uzupełnić objętość do 1 ml.
    4. Przenieść objętość 1 ml do szklanej probówki hodowlanej i umieścić w inkubatorze do wytrząsania ustawionym na 37 °C, 220 obr./min lub w temperaturze zalecanej dla odzyskania szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu (typowy zakres od 25 °C do 37 °C) i umożliwić wytworzenie markera selekcji antybiotyku kodowanego przez plazmid.
  5. Po odzyskaniu komórek przez 30 minut do 1 godziny, umieścić podwielokrotność (100 μl z 1 000 μl) reakcji przemiany na stałym pożywce selekcyjnej i użyć sterylnego rozsiewacza komórek do rozproszenia podwielokrotności na płytce hodowli agarowej. Zebrać resztę przekształconych komórek przez odwirowanie (13 000 × g przez 1 minutę), wyrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórkowy w 100 μl sterylnego podłoża i umieścić na stałym pożywce selekcyjnej, jak powyżej. Pozwól cieczy wchłonąć się w podłoże stałe przez 30 minut, odwróć płytki hodowlane. i umieścić je na noc w inkubatorze w temperaturze zalecanej dla szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu.

4. Badania przesiewowe pod kątem prawidłowego montażu plazmidu

  1. Po inkubacji (etap 3.5) wyjąć płytki hodowlane z inkubatora i policzyć kolonie przez bezpośrednie zliczenie, jeśli na każdej płytce hodowlanej znajduje się kilka izolowanych kolonii bakterii. Wybierz kilka kolonii (1-10) do badań przesiewowych, aby określić, czy zawierają one pożądany złożony plazmid.
    1. Przenieś sterylne pożywki wzrostowe uzupełnione odpowiednimi antybiotykami do sterylnych probówek hodowlanych (szklanych lub plastikowych). Zaszczepić pożywkę hodowlaną, dotykając 1 kolonii sterylną igłą lub pętlą transferową i przenieść komórki do pożywki z probówką hodowlaną za pomocą igły do przenoszenia. Umieścić probówki hodowlane w inkubatorze z wytrząsaniem i inkubować przez 16-18 godzin w temperaturze zalecanej dla szczepu bakteryjnego i/lub plazmidu (typowy zakres od 25 °C do 37 °C).
  2. Następnego dnia wyizoluj plazmidowe DNA z kultur bakteryjnych metodą alkalicznej lizy6 lub za pomocą dostępnego na rynku zestawu do izolacji plazmidu zgodnie z instrukcjami producenta.
  3. Ustal, czy plazmidy są prawidłowo złożone.
    1. Określić ilościowo stężenie DNA w izolowanych plazmidach za pomocą spektrofotometrii lub oceny żelu.
    2. Użyć podwielokrotności (50-150 ng) plazmidowego DNA do diagnostycznej reakcji trawienia restrykcyjnego (10 μl końcowej objętości). Wybierz enzymy restrykcyjne na podstawie miejsca, w którym oczekuje się, że rozszczepią złożone plazmidowe DNA.
      UWAGA: Zalecamy dwie oddzielne reakcje: (1) traktowanie plazmidowego DNA enzymem restrykcyjnym, który ma rozszczepić plazmid w jednym miejscu oraz (2) traktowanie plazmidowego DNA dwoma enzymami restrykcyjnymi, które mają wyciąć całość lub część wstawionego fragmentu DNA. Enzymy restrykcyjne są dostępne w handlu i należy je stosować zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Po zakończeniu reakcji enzymu restrykcyjnego połącz z barwnikiem ładującym (do stężenia 1x), załaduj całą mieszaninę na żel agarozowy i oddziel fragmenty DNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym21. Użyj transiluminatora UV lub LED, aby uwidocznić fragmenty DNA, które migrowały w żelu agarozowym. Porównaj ograniczone fragmenty DNA z drabinką masy cząsteczkowej, aby określić, czy są to oczekiwane masy cząsteczkowe (Rysunek 4). Zwróć uwagę na plazmidy z oczekiwanymi wzorcami ograniczenia enzymów (zwane klonami dodatnimi); Wyrzuć probówki zawierające plazmidy, które nie mają oczekiwanego wzorca restrykcji (zwane klonami ujemnymi).
  4. Aby upewnić się, że dodatnie klony mają oczekiwaną sekwencję nukleotydów, wyślij podwielokrotność dodatnich klonów plazmidu do sekwencjonowania.
    UWAGA: Zalecane jest sekwencjonowanie całego plazmidu (np. sekwencjonowanie nanoporowe).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy, jako przykład zastosowania metody IVA, przeprowadzono proces re-klonowania otwartej ramki odczytu mCherry do miejsca wielokrotnego klonowania plazmidu pSU19 w celu otrzymania plazmidu identycznego z pSU19mCherry (Rysunek 3)17. Startery odpowiednie dla metody IVA zaprojektowano zgodnie z krokami 1.1 i 1.2 protokołu. Następnie, przy użyciu zestawu do izolacji plazmidów, wyizolowano pSU19 oraz pSU18mCherry, które posłużyły odpowiednio jako matryce w r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Najważniejszym krokiem do udanego klonowania IVA jest projekt fragmentu DNA i startera. Wydajność IVA ulega znacznej poprawie, gdy fragmenty homologiczne są zaprojektowane tak, aby miały długość co najmniej 15 pz i temperaturę topnienia około 47–52 °C. Opublikowano szczegółowe badanie dotyczące optymalizacji projektowania fragmentów IVA16. Kolejnym ważnym krokiem do uzyskania wysokiej wydajności klonowania jest użycie jak najmniejszej ilości matrycowego DNA na etapach amplifikacji PCR. Aby jeszcze...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

HGB jest finansowany przez Canada Graduate Scholarships - program magisterski od Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) oraz Dziekanat Doktorat (University of Saskatchewan). Prace te były wspierane przez NSERC Discovery Grant (RGPIN-2021-03066), fundusze na rozpoczęcie działalności (dla JLT) z University of Saskatchewan oraz Canada Foundation for Innovation John R. Evans Leaders Fund (numer grantu 42269 dla JLT). Autorzy dziękują panu Ericowi Toombsowi za dostarczenie zdjęcia przedstawiającego kwantyfikację DNA za pomocą spektroskopii UV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 kb Plus Drabinka DNAFroggaBioDM015-R500Marker masy cząsteczkowej DNA
AccuReady M Pojedynczy kanał 0,5-10 &mikro; LBulldog BioBPP020Pipety do przenoszenia cieczy
AccuReady M Zestaw pipet jednokanałowychBulldog BioBPK100Pipety do przenoszenia cieczy
AgarBioShop CanadaAGR003.1Środek zestalający do podłoża wzrostowego
AgarozaBiobasicD0012Wytwarzanie żeli agarozowych do elektroforezy DNA
Biometra TOne Analytikjena846-2-070-301Termocykler
Nakrętki do szklanych probówekhodowlanych Fisher Scientific14-957-91Nakrętki wielokrotnego użytku do szklanych probówek hodowlanych
Startery DNAZintegrowane technologie DNANie dotyczyWiązanie i amplifikacja matrycowego DNA w reakcji PCR
DpnI New England BiolabsR0176SRozszczepienie metylowanego matrycy DNA po amplifikacji PCR
EcoRINew England BiolabsR3101LEnzym restrykcyjny, dostarczany z odpowiednim buforem
Mikroprobówki Eppendorf 1,5 mlSarstedt72.690.300Mikroprobówka, 1,5 mL, stożkowa podstawa, PP, dołączona płaska nasadka, formowane podziałki i matowa przestrzeń do pisania
Bromek etydynyFisher ScientificAAL0748203Wizualizacja/czynnik interkalacyjny DNA, toksyczny
EZ-10 Kolumna spinowa Plazmid DNA Miniprep KitBiobasicBS614Izoluj plazmidowe DNA z nocnych kultur bakteryjnych
System GelDoc Go-GelBio-Rad12009077Obrazowanie Żele DNA
Szklane probówkihodowlane Fisher Scientific14-925ESzklane probówki
hodowlane myGel  Mini system do elektroforezySigma-AldrichZ742288 System używany do elektroforezy żelowej
NanoDrop OneThermo FisherND-ONE-WOkreślanie stężenia DNA
PCR Oczyszczanie do sekwencjonowania DNABiobasicBT5100Purify PCR produkty 
Szalka PetriegoSarstedt82.1473.011Szalka Petriego 92 x 16 mm, PS, przezroczysta, z krzywkami wentylacyjnymi
Końcówka do pipet, 1000 &mikro; LSarstedt70.305Końcówki do pipet 100-1000 i mikro; L
Końcówka do pipet, 2,5 i mikro; LSarstedt70.3010.265Końcówki do pipet do 2,5 i mikro; L
Końcówka do pipet, 20 i mikro; LSarstedt70.3020.200Końcówki do pipet do 20 i mikro; L
Końcówka do pipet, 200 i mikro; LSarstedt70.3030.020Końcówki do pipet 1-200 i mikro; L
Sól (NaCl)Fisher ScientificS271-10Składnik pożywki bakteryjnej (10 g/L)
Pojedyncza 0,2 ml probówka PCR z płaską nakrętkąFroggaBioTF-1000Probówki PCR
Trypton (bakteriologiczny)BioShop CanadaTRP402.5Składnik pożywki bakteryjnej (10 g/L)
VeriFi DNA polimerazaPCR BiosystemsPB10.42-01Polimeraza o wysokiej wierności, bufor PCR zawierający Mg2+ i dNTPs jest dostarczany z zakupem
Xba INew England BiolabsR0145S, dostarczany z odpowiednim buforem
EkstraktBioShop CanadaYEX401.205Składnik pożywki bakteryjnej (5 g/L)
Enzym restrykcyjny drożdżowy

Bibliografia

  1. Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).
  2. Garcia-Nafria, J., Watson, J. F., Greger, I. H. IVA cloning: A single-tube universal cloning system exploiting bacterial in vivo assembly. Sci Rep. 6, 27459(2016).
  3. Bubeck, P., Winkler, M., Bautsch, W. Rapid cloning by homologous recombination in vivo. Nucleic Acids Res. 21 (15), 3601-3602 (1993).
  4. Avilan, L. Assembling multiple fragments: the Gibson assembly. Methods Mol Biol. 2633, 45-53 (2023).
  5. Stukenberg, D., et al. The Marburg Collection: A Golden Gate DNA assembly framework for synthetic biology applications in Vibrio natriegens. ACS Synth Biol. 10 (8), 1904-1919 (2021).
  6. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
  7. Engler, C., Marillonnet, S. Golden Gate cloning. Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).
  8. Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. Plasmid construction by homologous recombination in yeast. Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).
  9. Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus. Plasmid. 76, 40-46 (2014).
  10. Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).
  11. Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).
  12. Sung, W. L., Zahab, D. M. Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids. DNA. 6 (4), 373-379 (1987).
  13. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  14. Jones, D. H., Howard, B. H. A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction. Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).
  15. Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies. PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).
  16. Chen, F., et al. Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly. BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).
  17. Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae. J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).
  18. Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res. 35 (Web Server issue), W43-W46 (2007).
  19. Wallace, R. B., et al. Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch. Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).
  20. Bzymek, M., Lovett, S. T. Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).
  21. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), e3923(2012).
  22. Sambrook, J., Russell, D. W. The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: "ultra-competent" cells. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  23. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  24. Fürste, J. P., et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene. 48 (1), 119-131 (1986).
  25. Bäumler, A. J., et al. Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi. Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).
  26. Godiska, R., et al. Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).
  27. Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning. J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Klonowanie molekularneskładanie fragmentów DNAEscherichia coliamplifikacja PCRelektroforeza w żelu agarozowymtransformacja szokiem termicznymselekcja antybiotykowatrawienie restrykcyjne
Zastosowanie montażu in vivo do wysokowydajnej budowy plazmidu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.