Artykuł metodologiczny

Izolacja i analiza zmian łuku aorty i korzeni w mysim modelu miażdżycowym

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67875

⸱

14 lutego 2025

 ,  , 
1School of Exercise and Health, Shanghai University of Sport

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza kompleksową metodologię analizy ilościowej blaszek miażdżycowych, aby ułatwić bardziej dogłębne badania nad mechanizmami i postępem miażdżycy.

Streszczenie

Miażdżyca, główna przyczyna chorób sercowo-naczyniowych, wymaga szczegółowego zbadania rozwoju i progresji zmian. Badanie to wprowadza kompleksowy protokół izolacji i analizy histologicznej zmian w łuku aorty i korzeniu u szeroko stosowanych mysich modeli miażdżycowych, myszy z nokautem receptora lipoprotein o niskiej gęstości (Ldlr-/-). Łuk aorty i korzeń są kluczowymi miejscami zmian miażdżycowych, a ich badanie ma kluczowe znaczenie dla oceny początku, progresji lub regresji miażdżycy, przewidywania ryzyka zdarzeń sercowo-naczyniowych i identyfikacji potencjalnych celów terapeutycznych. Protokół ten przedstawia metody ilościowego określania obciążenia miażdżycowego w łuku aorty i korzeniu, w tym izolację tkanek, utrwalanie, barwienie czerwienią olejową O, cięcie korzenia aorty, barwienie hematoksyliną i eozyną (HE), barwienie Verhoeffa-Van Giesona (VVG) oraz analizę obrazu. Barwienie czerwienią olejową O mierzy obszar płytki nazębnej w łuku aorty, oceniając nasilenie miażdżycy, podczas gdy barwienie HE korzenia aorty ujawnia składniki płytki nazębnej, takie jak rdzeń lipidowy i włóknista czapeczka, ułatwiając ocenę stabilności płytki nazębnej i ryzyka pęknięcia. Barwienie VVG może barwić włókna kolagenowe w tkankach, dostarczając dalszych informacji na temat składu płytki nazębnej i powiązanych informacji. Ta dokładna analiza dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów rozwoju zmian chorobowych i może pomóc w tworzeniu nowych strategii terapeutycznych w zakresie zapobiegania i leczenia miażdżycy.

Wprowadzenie

Choroby układu krążenia, szczególnie miażdżyca, stały się poważnym obciążeniem zdrowotnym i główną przyczyną zgonów na całym świecie1,2. Miażdżyca jest przewlekłą, postępującą chorobą zapalną charakteryzującą się stopniowym gromadzeniem się lipidów i tworzeniem blaszek miażdżycowych w ścianie tętnicy, co ostatecznie prowadzi do zwężenia światła tętnicy i potencjalnie do pęknięcia blaszek miażdżycowych, wywołując ostre zdarzenia sercowo-naczyniowe, takie jak zawał mięśnia sercowego i udar mózgu1,2,3. Biorąc pod uwagę jej głęboki wpływ na zdrowie człowieka, istnieje pilna potrzeba zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw miażdżycy i opracowania skutecznych strategii terapeutycznych.

W ostatnich latach modele zwierzęce odegrały kluczową rolę w pogłębieniu naszej wiedzy na temat miażdżycy. Wśród różnych gatunków myszy stały się preferowanym modelem ze względu na ich szybką reprodukcję, wygodę operacyjną i dostępność zaawansowanych technik manipulacji genetycznej4,5. W szczególności myszy z nokautem receptora LDL (Ldlr-/-) i myszy ApoE-/- są szeroko stosowane do naśladowania ludzkiej miażdżycy, ponieważ wykazują podobne cechy patofizjologiczne4,5,6,7,8,9.

Zmiany miażdżycowe u myszy mogą występować w różnych miejscach aorty, ale są szczególnie podatne na rozwój w obszarach ściśle związanych z hemodynamiką, takich jak korzeń aorty, łuk aorty i pień ramienno-głowowy, podczas gdy aorta zstępująca jest stosunkowo mniej dotknięta10. Aby dokładnie ocenić obciążenie zmianami miażdżycowymi w modelach mysich, ocenić obecność, rozmiar i stopień zaawansowania blaszek, a tym samym zbadać wpływ różnych leków lub czynników na wystąpienie, progresję i regresję miażdżycy, niezbędne jest połączenie technik barwienia histologicznego i analizy obrazowej11. Barwienie czerwienią olejową O, dobrze znana metoda, w szczególności barwi neutralne lipidy i lipoproteiny12, zapewniając bezpośrednią wizualizację tworzenia się płytki nazębnej w łuku aorty13. Tymczasem barwienie korzenia aorty hematoksyliną-eozyną (HE) nie tylko wyznacza obszar płytki nazębnej, ale także zapewnia szczegółowe cechy strukturalne, takie jak włóknista czapeczka i nekrotyczny rdzeń lipidowy. Te szczegóły są kluczowe dla oceny stabilności płytki nazębnej i przewidywania ryzyka pęknięcia płytki nazębnej11. Razem techniki te umożliwiają kompleksową ocenę nasilenia i progresji zmian miażdżycowych.

Ten protokół wziął za przykłady myszy C57BL6/J Ldlr-/- karmione dietą Chow i dietą zachodnią, mając na celu dostarczenie szczegółowego przewodnika krok po kroku do oceny obciążenia zmianami miażdżycowymi u myszy za pomocą barwienia łukiem aorty czerwienią olejową O i barwienia HE odcinków korzenia aorty zatopionych w parafinie, a następnie analizy obrazu. Protokół obejmuje wszystkie aspekty izolacji i stabilizacji aorty, zatapiania i cięcia parafiny, procedur barwienia i analizy obrazu, uwzględniając jednocześnie szczegóły operacyjne i rozważania dotyczące kluczowych kroków, zapewniając odtwarzalność i wiarygodność wyników. Postępując zgodnie z tym protokołem, naukowcy mogą dokładnie i skutecznie ocenić skuteczność interwencji terapeutycznych i uzyskać wgląd w mechanizmy leżące u podstaw miażdżycy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez Komitet Oceny Etyki ds. Eksperymentów na Zwierzętach Uniwersytetu Sportowego w Szanghaju.

1. Przygotowanie odczynników i narzędzi do preparacji

  1. Sterylizuj narzędzia preparacyjne, w tym cienkie nożyczki, kleszcze proste, kleszcze zakrzywione, nożyczki sprężynowe i szpilki, w autoklawie z wyprzedzeniem.
  2. 75% etanolu: Zmieszać 75 ml bezwodnego etanolu z 25 ml ddH2O.
  3. 1x sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS): Rozpuścić 0,01 M proszku PBS w 2 litrach ddH2O.
  4. 4% roztwór paraformaldehydu (PFA): Podgrzać 800 ml 1x PBS do około 60 °C na mieszadle magnetycznym w dygestorium. Powoli dodawać 40 g proszku paraformaldehydu, ciągle mieszając. Miareczkować 1N NaOH aż do całkowitego rozpuszczenia. Schłodzić do temperatury pokojowej, dostosować objętość do 1 l za pomocą 1x PBS, przefiltrować i dostosować pH do 7,2-7.4.
    UWAGA: PFA to niebezpieczna substancja chemiczna, która wymaga ostrożnego obchodzenia się i ścisłego przestrzegania protokołów bezpieczeństwa.
  5. Roztwór do przechowywania Oil Red O: Rozpuść 2,5 g proszku Oil Red O w 500 ml 100% izopropanolu, zamknij w brązowej butelce i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C do długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Izopropanol jest toksyczną i szkodliwą substancją chemiczną; w związku z tym, aby zapewnić zdrowie i bezpieczeństwo, konieczne jest noszenie niezbędnych środków ochrony osobistej (PPE), w tym rękawiczek.
  6. Roztwór roboczy Oil Red O: Wymieszać roztwór pończochowy i sterylny ddH2O w stosunku 3:2. Przygotuj świeży roztwór do każdego użycia i przefiltruj roztwór za pomocą sterylnego filtra strzykawkowego 0,22 μm lub dużej bibuły filtracyjnej.
  7. Roztwór barwiący Victoria Blue: Rozpuść 0,5 g Victoria Blue'B w 100 ml 70% etanolu.

2. Izolacja aorty i serca

  1. Wszystkie myszy trzymano w obiekcie SPF z klatkami IVC w kontrolowanych warunkach (23,1 ± 1 °C, 40-50% wilgotności względnej, 12 godzin cyklu światła/ciemności) i zapewniono im karmienie ad libitum i sterylną wodę. W klatce umieszczono od trzech do pięciu zwierząt i karmiono je standardową dietą typu chow (chow) lub dietą typu zachodniego (WTD) zawierającą 0,2% cholesterolu i 21,2% tłuszczu. Wybierz samce myszy C57BL6/J LDLr-/- w wieku 12 tygodni i ważące od 25 do 30 g. Masę ciała mierzono co 4 tygodnie przez 12-tygodniowy okres badania. Eutanazja myszy w komorze CO2 (wyparcie 70%/30% CO2 / O2 ).
  2. Przed sekcją umieść myszy w pozycji leżącej (brzuszną stroną do góry) na płycie piankowej pokrytej 1-2 warstwami chłonnego papieru i przymocuj kończyny szpilkami.
  3. Rozpyl 75% etanolu na brzuch myszy, aby oczyścić i zwilżyć sierść.
  4. Użyj kleszczy, aby chwycić brzuszną skórę myszy i użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć skórę od podstawy brzucha do górnej części szyi.
  5. Otwórz ścianę brzucha, a następnie użyj kleszczy, aby podnieść mostek i przeciąć zarówno przeponę, jak i żebra, aby odsłonić klatkę piersiową.
  6. Usuń przełyk i tchawicę, co umożliwi łatwiejsze oczyszczenie tętnic szyjnych. Usuń narządy, w tym wątrobę, płuca, śledzionę, przewód pokarmowy i trzustkę, zachowując nerki znajdujące się za otrzewną i aortę brzuszną obok kręgosłupa. Podczas preparowania tętnic krezkowych należy podnieść jelita i wykonać nacięcia z dala od aorty, aby uniknąć uszkodzenia aorty brzusznej.
  7. Aby zapewnić czyste pole obserwacyjne, umieść myszy pod mikroskopem stereoskopowym i wyrównaj źródło zimnego światła z obszarem sekcji.
  8. Powoli wstrzyknąć strzykawkę o pojemności 10 ml wypełnioną PBS z igłą 0,45 x 15 (II) RWLB do wierzchołka lewej komory i obserwować rozszerzenie aorty.
  9. Delikatnie zetrzyj krew i płyn w obszarze sekcji bibułą, aby w pełni odsłonić pole widzenia.
  10. Aorta piersiowa jest łatwa do odsłonięcia. Użyj go jako przełomu, używając kleszczy do uchwycenia segmentu przepony przymocowanego do końca aorty piersiowej i nożyczek sprężynowych, aby przeciąć tkankę łączną między aortą a ścianą mięśnia piersiowego.
  11. Delikatnie pociągnij serce kleszczami i unieś aortę piersiową, obserwując gałęzie łuku aorty, a następnie wypreparuj tłuszcz przybyszowy i tkankę łączną wokół łuku aorty i jej gałęzie w górę wzdłuż aorty piersiowej.
    UWAGA: Bądź ostrożny, utrzymuj aortę w stanie nienaruszonym, unikaj jej rozerwania lub uszkodzenia oraz dokładnie usuń otaczający tłuszcz i tkankę łączną. Ten krok wymaga wielokrotnej praktyki, aby osiągnąć biegłą manipulację.
  12. Rozetnij aortę brzuszną i tętnice biodrowe wspólne w dół wzdłuż aorty piersiowej.
  13. Przeciąć wspólne tętnice biodrowe 1-2 mm poniżej ich rozwidlenia, przyciąć małe gałęzie aorty wzdłuż kręgosłupa, aby ją uwolnić, odłączyć tętnice nerkowe w pobliżu nerek, odciąć trzy naczynia rozgałęzione szyi od ich dystalnych końców, a na koniec przeciąć aortę wstępującą w pobliżu serca.
  14. Przed wypreparowaniem łuku aorty umieść małą, ciemną uszczelkę o wysokim kontraście do naczyń krwionośnych pod nią i sfotografuj obszar łuku aorty.
  15. Przytnij tkankę serca i przetnij dolną połowę serca wzdłuż płaszczyzny równoległej do przedsionków. Napraw przycięte serce (Rysunek 1A).

3. Stabilizacja i wstępne leczenie łuku aorty

  1. Przygotuj wcześniej 1 ml 4% roztworu PFA w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml.
  2. Umieść aortę w rurce i mocuj ją przez co najmniej 24 godziny w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Aorta może być przechowywana w 4% PFA przez okres do 1 miesiąca bez wpływu na jakość barwienia czerwienią olejową O. Aby utrzymać jej normalną konfigurację, odpowiednią opcją może być umieszczenie chusteczki na gumie przed utrwaleniem.
  3. Przenieś aortę na szalkę Petriego zawierającą PBS, aby zapobiec jej wysychaniu. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków i nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie usunąć pozostały tłuszcz przybyszowy, który nie został całkowicie usunięty podczas sekcji, aby zmniejszyć zakłócenia w ilościowym określaniu blaszek w aorcie.
  4. Użyj nożyczek sprężynowych, aby ostrożnie rozciąć aortę wzdłuż jej wewnętrznej osi podłużnej, a następnie kolejno rozciąć trzy gałęzie łuku aorty wzdłuż bocznej strony do poziomu krzywizny łuku aorty, pozwalając mu w pełni się rozłożyć (Rysunek 1C).
  5. Na tym etapie użyj do barwienia Oil Red O lub przechowuj w 4% PFA.

4. Czerwone zabarwienie łuku aorty

  1. Umieść rozciętą aortę na 12-dołkowej płytce. Dodaj 1 ml sterylnego ddH2O do każdej studzienki i myj przez 5 minut na shakerze, powtórz 2x.
  2. Umieść 12-dołkową płytkę z usuniętym roztworem w dygestoriach i susz na powietrzu przez 20 minut, aż nie będzie widocznych śladów wodnych.
  3. Dodaj 1 ml świeżo przygotowanego roztworu roboczego Oil Red O do każdej studzienki i potrząsaj przez 20 minut na shakerze, a następnie usuń roztwór roboczy Oil Red O.
  4. Dodaj 2 ml sterylnego ddH2O do każdej studzienki i myj przez 5 minut, powtórz ten krok 3 razy. Następnie utrzymuj aortę w ddH2O.
  5. Umieść aortę na szkiełku podstawowym i rozłóż ją pod mikroskopem stereoskopowym. Aby zwiększyć kontrast, umieść czarną gumową podkładkę pod suwakiem.
  6. Umieść slajd na białym papierze, aby jeszcze bardziej zwiększyć kontrast, z linijką umieszczoną obok niego i zrób zdjęcie za pomocą aparatu. Aby utrzymać wilgotność aorty, należy przechowywać leczoną aortę w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml PBS.

5. Analiza obrazu łuku aorty

  1. Otwórz przechwycony obraz aorty na komputerze wyposażonym w oprogramowanie Image J.
  2. Zaznacz obszar z prostokątnym polem, na przykład 450 x 900 pikseli, który zawiera całą aortę, i zapisz go jako nowy obraz .tiff.
  3. Otwórz nowo zapisany obraz .tiff na obrazie J. Kliknij opcję Edytuj > Odwróć, a następnie wybierz opcję Obraz i kliknij opcję Wpisz stos RGB >.
  4. Przejdź do pozycji Obraz, kliknij pozycję Stosy > Ułóż na obrazach, a następnie wybierz opcję Zielony o najlepszym kontraście.
  5. Przejdź do Obrazu, kliknij Dostosuj > Jasność/Kontrast. Zmień wartość minimalną na około 200, zminimalizuj tło, zachowując podobne tła dla każdego obrazu, a następnie kliknij przycisk Zastosuj.
  6. Przejdź do pozycji Analizuj i wybierz opcję Ustaw pomiar. Wybierz opcję Obszar, Ułamek obszaru, Ogranicz do progu i Wyświetl etykietę, a następnie kliknij przycisk OK.
  7. Przejdź do sekcji Analizuj, wybierz opcję Pomiar i skopiuj wynik do arkusza kalkulacyjnego.
  8. Przejdź do Analizuj, kliknij Narzędzie > Menedżer ROI, a następnie wybierz część łukową aorty z prostokątnym polem. Przejdź do Menedżera zwrotu z inwestycji i wybierz Dodaj [t], a następnie Zmierz. Skopiuj zmierzone wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
  9. Przeanalizuj obszar mierzony w grupach myszy na podstawie testów normalności. A p < 0,05 wskazuje, że różnica jest istotna statystycznie.
    UWAGA: Wybierz odpowiednią metodę statystyczną zgodnie z projektem eksperymentu.

6. Parafina zatapiająca serce

  1. Usuń wierzchołek serca i upewnij się, że nacięcie jest proste i wyrównane z kierunkiem nasady zastawki (Rysunek 1B).
  2. Umieść każdą próbkę serca indywidualnie w pudełku do zatapiania parafiny i zaznacz pudełko ołówkiem.
  3. W dygestorii umieść zatopioną w parafinie kasetę z chusteczką w pustym pojemniku i płucz pojemnik do zatapiania pod bieżącą wodą przez 3 minuty.
  4. Wykonaj odwodnienie tkanek za pomocą etanolu o rosnących gradientach stężeń w następujący sposób: 50% etanolu przez 2 godziny, 75% etanolu przez 30 minut, 85% etanolu przez 30 minut, 95% etanolu przez 30 minut i 100% etanolu przez 10 minut. Powtórz kroki, zmieniając etanol na każdym kroku.
  5. Wykonaj przezroczystość tkanek za pomocą ksylenu w następujący sposób: mieszanina ksylenu i etanolu 1:1 przez 20 minut, ksylen przez 15 minut, powtórz to 1x, zmieniając ksylen.
  6. Wosk parafinowy rozpuścić wcześniej w piecu w temperaturze 60 °C. Próbki należy traktować mieszaniną ksylenu i parafiny przez 30 minut, następnie miękkim woskiem parafinowym przez 2 godziny, a następnie twardym woskiem parafinowym przez 1 godzinę
    UWAGA: Etanol jest łatwopalnym i lotnym rozpuszczalnikiem organicznym. Ksylen jest umiarkowanie toksyczny i wymaga ochrony podczas stosowania.
  7. Zatapianie parafiny
    1. Wybierz formę o odpowiednim rozmiarze, włącz ją i wcześniej ogrzej maszynę do zatapiania.
    2. Po dodaniu stopionego wosku parafinowego do formy, wyjmij tkankę z kasety do zatapiania i umieść ją, powierzchnią cięcia skierowaną w dół, na środkowym dnie formy za pomocą kleszczy, które zostały wcześniej podgrzane.
    3. Po ostygnięciu formy na stole zamrażarki i zastygnięciu znajdującej się w niej parafiny, umieść wskazaną pokrywę kasety do zatapiania na wierzchu formy i napełnij ją niezbędną ilością parafiny.
    4. Gdy wosk parafinowy ostygnie i stwardnieje, wyjmij blok z formy i przechowuj go w lodówce w temperaturze 4 °C (Rysunek 1D).

7. Skrawki parafinowe korzenia aorty

  1. Usuń nadmiar parafiny otaczającej pokrywę kasety do zatapiania, a następnie bezpiecznie przymocuj blok parafiny do clamp gniazdo znajdujące się na głowicy krajalnicy do parafiny. Ustaw blok w pozycji lekko przesuniętej od miejsca, w którym plasterek zostanie przecięty, upewniając się, że przekrój tkanki w bloku parafiny jest równoległy do krawędzi tnącej ostrza. W przypadku pierwszego przekroju ustaw grubość plastra na 10 μm, aby odsłonić położenie tkanki.
  2. Gdy pierwsze nacięcie zostanie znalezione pod mikroskopem, dostosuj grubość plastra do 6 μm i wykonaj cięcie seryjne. Wycinaj, kroij i wybieraj sekcje w krajalnicy, aż trzy nienaruszone zastawki aortalne będą widoczne pod mikroskopem, w którym to momencie rozpocznie się przygotowanie do cięcia. Pozostaw jeden plasterek w odstępach 6 μm dla każdej myszy i umieść różne pozycje plasterków na różnych szklanych nośnikach, na przykład w sekcji 1-11-21-31, aby uzyskać właściwy przegląd.
  3. Unieś skrawki na rozsiewaczu zawierającym ciepłą wodę o temperaturze 37 °C, aby rozprowadzić chusteczkę na płasko, a następnie podnieś tkankę za pomocą szkiełka. Po odczekaniu, aż woda wyschnie, ułóż kromki na tosterze ustawionym na 42 °C na noc.
  4. Średnia powierzchnia płytki nazębnej w tych 8 sekcjach reprezentuje wartość obszaru płytki nazębnej korzenia aorty u każdej myszy. Po zabarwieniu tych odcinków zmierz średnią powierzchnię płytki nazębnej i powierzchnię płytki nazębnej.

8. Barwienie hematoksyliny i eozyny

  1. Umieść plastry w suszarce w temperaturze 60 °C na 30 minut. W dygestorii za pomocą stojaka do barwienia umieść skrawki kolejno w ksylenie na 10 minut (powtórz ten krok raz, zmieniając ksylen), 100% etanolu przez 5 minut (powtórz ten krok, zmieniając etanol), 95% etanolu przez 5 minut, 85% etanolu przez 5 minut i 75% etanolu przez 5 minut.
  2. Spłukiwać pod bieżącą wodą przez 5 min. Zanurzyć skrawki w barwie z hematoksyliny na 8 min i spłukać pod bieżącą wodą.
  3. Różnicuj skrawki za pomocą 1% alkoholu kwasu solnego przez kilka sekund, spłucz bieżącą wodą i obserwuj, że skrawki zmieniają kolor na niebiesko-fioletowy pod mikroskopem.
  4. Zanurz skrawki w roztworze barwiącym eozynę na 5 minut. Umieść skrawki w 95% etanolu na 7 zanurzeń, a następnie w 100% etanolu na 30 s.
  5. Klaruj w ksylenie przez co najmniej 30 sekund. Uszczelnij szkiełka za pomocą neutralnej gumy, sfotografuj pod mikroskopem i zapisz obrazy w wysokiej rozdzielczości, najlepiej w formacie .tiff.

9. Barwienie Verhoeffa-Van Giesona (VVG)

  1. Wykonaj rutynowe odparafinowywanie i ponowne nawodnienie skrawków parafiny, wykonując te same czynności, jak opisano w sekcjach 8.1 i 8.2.
  2. Po krótkim spłukaniu w 70% etanolu zanurzyć skrawki w roztworze barwiącym Victoria Blue'B na 15 minut.
  3. Różnicuj sekcje przez kilka sekund w 95% etanolu. Umyj sekcje 2x wodą destylowaną.
  4. Zabarwić skrawki roztworem barwiącym Ponceau przez 5 minut przez aplikację kropelkową. Odróżnij i odwadniaj sekcje za pomocą 100% etanolu.
    UWAGA: Po barwieniu Pąsa należy unikać kontaktu z wodą.
  5. Klaruj w ksylenie przez co najmniej 30 s. Zamontuj szkiełka za pomocą neutralnej gumy i sfotografuj je pod mikroskopem.

10. Analiza obrazu płytki korzeniowej aorty

  1. Otwórz obraz na komputerze wyposażonym w oprogramowanie Image J. Wybierz dowolne narzędzie ramki, aby obramować płytkę.
  2. Przejdź do pozycji Obraz, kliknij opcję Nakładka > Dodaj zaznaczenie, a następnie pozycję Zmierz, aby zmierzyć obszar płytki. Skopiuj zmierzone wyniki do arkusza kalkulacyjnego.
  3. Przeanalizuj obszar mierzony w grupach myszy na podstawie testów normalności. A p < 0,05 wskazuje, że różnica jest istotna statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki pokazują zastosowanie techniki izolacji i analizy zmian w łuku aorty i korzeniach w modelu myszy miażdżycowej. Wyniki te dostarczają wyraźnych dowodów na zdolność tej techniki do identyfikacji i charakterystyki zmian miażdżycowych. Na przykład obrazy histologiczne ze specyficznymi barwnikami (np. Oil Red O) podkreślają akumulację lipidów, podczas gdy barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) ujawnia ogólną morfologię zmian miażdżycowych, w tym strukturę ściany tętnicy, obecność rdzeni lipidowych i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu podajemy szczegółowe informacje na temat metod pobierania próbek z aorty u myszy z nokautem Ldlr oraz analizy ilościowej blaszek miażdżycowych.

Precyzja procedury preparacji jest największym wyzwaniem technicznym w usuwaniu aorty in vivo w mysim modelu miażdżycy. Opierając się na naszym doświadczeniu, kluczowe punkty są następujące: (1) użyj PBS do wypłukania całej krwi w tętnicy, aby zwiększyć porównanie między gałęziami łuku aorty a tłuszczem okołonaczyniowym. (2) Uzbr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Nie ma nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Shanghai Frontiers Science Research Base of Exercise and Metabolic Health, program badawczy ćwiczeń i zdrowia publicznego (0831) na Uniwersytecie Sportu w Szanghaju, program finansowania szkolenia młodych nauczycieli w szkolnictwie wyższym w Szanghaju (A2-0213-22-0058-5) oraz plan wybitnych liderów akademickich Komitetu Miejskiego Nauki i Technologii w Szanghaju (21XD1403200) dla Longhua Liu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka mikroskopowe adhezyjne (25 i razy; 75mm)CITOTESTCat# 80312-3161
Kaseta do zatapianiaCITOTESTCat# 80106-1100-16
Roztwór do barwienia eozynyBeyotimeCat# C0109
EtanolSinopharm Chemical Reagent Co.Cat# 10009218
Roztwór do barwienia hematoksylinyBeyotimeCat# C0107
Niskoprofilowe ostrza jednorazowe LeicaCat# 14035838925
Szkło osłonowe mikroskopu (24 razy; 50mm)CITOTESTCat# 10212450C
Neutralny balsam montażowy MediumSango BiotechCat # E675007-0100
Olej czerwony o proszekSigma-AldrichCat # 1320-06-5
parafina z cerezynąSinopharm Chemical Reagent Co.Cat# 69019461
ParaformaldehydeServicebioCat# G1101
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS, proszek)ServicebioCat# G0002-2L
Ponceau S Roztwór do barwieniaEveryLabCat# FM024
Victoria Blue' BAladynKot # 2580-56-5
XyleneSigma-AldrichKot# 104-81-4

Bibliografia

  1. Libby, P., et al. Atherosclerosis. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 56(2019).
  2. Herrington, W., Lacey, B., Sherliker, P., Armitage, J., Lewington, S. Epidemiology of atherosclerosis and the potential to reduce the global burden of atherothrombotic disease. Circ Res. 118 (4), 535-546 (2016).
  3. Frostegård, J. Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease. BMC Med. 11, 117(2013).
  4. Gisterå, A., Ketelhuth, D. F. J., Malin, S. G., Hansson, G. K. Animal models of atherosclerosis-supportive notes and tricks of the trade. Circ Res. 130 (12), 1869-1887 (2022).
  5. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  6. Ilyas, I., et al. Mouse models of atherosclerosis in translational research. Trends Pharmacol Sci. 43 (11), 920-939 (2022).
  7. Liu, L., Chan, M., Yu, L., Wang, W., Qiang, L. Adipsin deficiency does not impact atherosclerosis development in ldlr(-/-) mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 320 (1), E87-E92 (2021).
  8. Liu, L., et al. Pparγ deacetylation confers the antiatherogenic effect and improves endothelial function in diabetes treatment. Diabetes. 69 (8), 1793-1803 (2020).
  9. Zahr, T., et al. Pparγ (peroxisome proliferator-activated receptor γ) deacetylation suppresses aging-associated atherosclerosis and hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (1), 30-44 (2023).
  10. Tang, C., et al. Endothelial ccrl2 induced by disturbed flow promotes atherosclerosis via chemerin-dependent β2 integrin activation in monocytes. Cardiovasc Res. 119 (9), 1811-1824 (2023).
  11. Andrés-Manzano, M. J., Andrés, V., Dorado, B. Oil red o and hematoxylin and eosin staining for quantification of atherosclerosis burden in mouse aorta and aortic root. Methods Mol Biol. 1339, 85-99 (2015).
  12. Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. Imaging of neutral lipids by oil red o for analyzing the metabolic status in health and disease. Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).
  13. Chen, P. Y., Qin, L., Simons, M. Imaging and analysis of oil red o-stained whole aorta lesions in an aneurysm hyperlipidemia mouse model. J Vis Exp. (183), e61277(2022).
  14. Lin, Y., et al. Practical assessment of the quantification of atherosclerotic lesions in apoe-/- mice. Mol Med Rep. 12 (4), 5298-5306 (2015).
  15. Bozycki, L., Łukasiewicz, K., Matryba, P., Pikula, S. Whole-body clearing, staining and screening of calcium deposits in the mdx mouse model of duchenne muscular dystrophy. Skelet Muscle. 8 (1), 21(2018).
  16. Glaudemans, A. W., et al. Molecular imaging in atherosclerosis. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 37 (12), 2381-2397 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zmiany w uku aortyzmiany w pier cieniu aortymyszy z nokautem genu LDLRbarwienie Oil Red Oanaliza histologicznailo ciowe oznaczanie blaszek mia d ycowychbarwienie hematoksylin i eozynbarwienie Verhoeffa Van Giesonask ad blaszki mia d ycowej

Powiązane artykuły