Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów

1.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67877

⸱

7 lutego 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine and Pathobiology, University of Toronto, 2Centre for Innovation, Canadian Blood Services, Keenan Research Centre, 3Polytech Clermont, 4Department of Medicine, University of Toronto

W tym artykule

Podsumowanie

Opracowaliśmy ulepszenia i zaktualizowane metody dla istniejącego testu monocytytowo-monowarstwowego (MMA), w którym makrofagi są używane do lepszego przewidywania klinicznego znaczenia alloprzeciwciał krwinek czerwonych w medycynie transfuzjologicznej i immunologii. Ten test nazywa się testem monocytów-makrofagów (M-MA).

Streszczenie

Makrofagi pochodzą z monocytów w szpiku kostnym, są dużymi, wrodzonymi komórkami odpornościowymi, które odgrywają główną rolę w usuwaniu martwych komórek, gruzu, komórek nowotworowych i obcych patogenów. Zdolność fagocytarna monocytów w porównaniu z makrofagami to koncepcja, która nie jest dobrze poznana. Tutaj naszym celem jest zbadanie różnicy w fagocytozie monocytów w porównaniu z makrofagami, w szczególności makrofagami M1 / M2, przeciwko różnym opsonizowanym krwinkom czerwonym przy użyciu zmodyfikowanej i zaktualizowanej wersji ustalonego testu monocytów (MMA). Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wyizolowano z kożucha dawcy. Wykorzystując oczyszczone monocyty, zapalne makrofagi M1 i przeciwzapalne M2 wyprodukowano przez hodowlę in vitro i polaryzację. Komórki M1 / M2 zostały pobrane i wykorzystane w teście podobnym do MMA, który nazywamy M-MA, w celu rozszyfrowania klinicznie istotnej fagocytozy różnych przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym. Indeks fagocytarny (PI) > 5 uznano za klinicznie istotną fagocytozę z użyciem monocytów. Indeks fagocytarny (PI) > 12 uznano za klinicznie istotną fagocytozę z użyciem makrofagów M1/M2. Makrofagi M2 wykazują zwiększoną zdolność do fagocytozy opsonizowanych erytrocytów w porównaniu z monocytami i M1. To samo słabe przeciwciało (anty-S) daje znaczącą fagocytozę tylko z makrofagami M2 (PI = 43), ale nie M1 (PI = 2) lub monocytami (PI = 0), co wykazano wielokrotnie przy użyciu różnych przeciwciał. Zastosowanie makrofagów M2 zamiast monocytów może pozwolić na uzyskanie dokładniejszych wyników, ponieważ komórki te są bardziej fagocytarne, co ma dalsze znaczenie kliniczne dla testu. Dalsze badania z różnymi przeciwciałami przeciwko krwinkom czerwonym, w tym walidacja testu monocyty-makrofag (M-MA) z przeciwciałami o znanym znaczeniu klinicznym, mogą wykazać, że M-MA jest bardziej przydatny w przewidywaniu klinicznie istotnych alloprzeciwciał krwinek czerwonych i reakcji transfuzji. Metoda ta przyczyni się do postępu w dziedzinie transfuzjologii i immunologii.

Wprowadzenie

Przewidywanie reakcji transfuzji pozostaje poważnym wyzwaniem w dziedzinie medycyny transfuzjologicznej. W ciągu ostatnich 4 dekad test monocytów i monowarstwy (MMA), zapoczątkowany przez Tonga i Branch1,2, służył jako cenny test komórkowy in vitro do przewidywania klinicznego wyniku hemolizy u pacjentów po transfuzji krwi1. Rzeczywiście, test ten odegrał zasadniczą rolę w rozróżnieniu między klinicznie istotnymi i nieistotnymi przeciwciałami przeciwko krwinkom czerwonym (RBC)2. Podczas gdy monocyty tradycyjnie były standardowymi leukocytami stosowanymi w tym teście, nasze badania mają na celu zbadanie potencjalnych korzyści płynących ze stosowania makrofagów pochodzących z monocytów jako alternatywy. Komórki te mogą zwiększyć zdolność testów do oceny znaczenia klinicznego alloprzeciwciał krwinek czerwonych.

W historycznym MMA, monocyty, które są prekursorami makrofagów, komórek odpornościowych odpowiedzialnych za usuwanie i niszczenie czerwonych krwinek podczas niepożądanej reakcji transfuzji, są wprowadzane do testu in vitro wraz z erytrocytami i przeciwciałami1,2,3,4,5,6,7. Fagocytozę ocenia się następnie wizualnie, zliczając fagocytozowane erytrocyty w monocytach. Indeks fagocytarny (PI) wynoszący < 5 fagocytozowanych krwinek czerwonych na 100 monocytów wskazuje, że pacjent jest narażony na zmniejszone ryzyko wystąpienia niepożądanej reakcji transfuzji, a przeciwciało uznaje się za klinicznie nieistotne4,5,6,7. Wstępne eksperymenty pokazują, że użycie monocytów pochodzących z krwi obwodowej może nie być idealne do określenia znaczenia klinicznego, ponieważ mają one niższą zdolność fagocytarną niż aktywowane monocyty i niektóre makrofagi.

Monocyty to podzbiór komórek znajdujących się we krwi, śledzionie i szpiku kostnym, stanowiący 10% wszystkich leukocytów u ludzi8. Komórki te zazwyczaj krążą przez 1-2 dni, zanim zostaną zrekrutowane przez różne tkanki, gdzie następnie różnicują się w makrofagi8. Zwykle dzieje się tak podczas hematopoezy, w której szpik kostny wytwarza monocyty, które są uwalniane do krążenia, aby stać się makrofagami tkankowymi, które znajdują się w śledzionie i wątrobie2. Znane jako pierwsza linia obrony przed obcymi patogenami, makrofagi to duże fagocytarne komórki jednojądrzaste, które odgrywają rolę w odporności adaptacyjnej i wrodzonej9. Wśród skomplikowanych i złożonych ról układu odpornościowego, zrozumienie i scharakteryzowanie fenotypów makrofagów stanowi ogromne wyzwanie, które nie zostało jeszcze w pełni zrozumiane. W ciągu ostatnich dwóch dekad pojęcie polaryzacji makrofagów zyskało coraz większe uznanie, a ostatnie badania wykorzystują sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu rozpoznania spektrum, w którym te makrofagi istnieją.

Klasycznie aktywowane makrofagi M1 i M1 powstają w środowiskach zapalnych zdominowanych przez receptory Toll-podobne (TLR)10. Komórki te mogą być zaangażowane w choroby autoimmunologiczne i miażdżycę oraz prezentować markery powierzchniowe, takie jak MHC-II, CD80 i CD8611,12. Przeciwzapalne makrofagi M2 i M2 znajdują się w środowiskach zdominowanych przez odpowiedzi Th2, brak ekspresji CD80 i obecne markery powierzchniowe, takie jak CD209 i CD20611,12. Makrofagi M1/M2 mogą być hodowane in vitro z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej, z lipopolisacharydem (LPS) i cytokinami, takimi jak GM-CSF i IFNγ (M1) oraz M-CSF i IL-4 (M2), stymulując ich polaryzację10,12.

Ten manuskrypt i związane z nim badania mają na celu wykazanie, że makrofagi M2 wykazują zwiększoną wrażliwość na fagocytozę w porównaniu do makrofagów i monocytów M1. Badanie aktywności fagocytarnej makrofagów M1/M2 w porównaniu z monocytami w kontekście alloprzeciwciał krwinek czerwonych i medycyny transfuzjologicznej to obszar, który nie został jeszcze zbadany. W tym miejscu opisujemy bieżące prace nad generacją makrofagów M1/M2 i porównujemy klasyczny test monowarstwowy monocytów (MMA) z nowym testem monocytów-makrofagów, używając akronimu M-MA w celu odróżnienia tego testu makrofagów od testu monocytów, aby poprawić wartość predykcyjną testów fagocytozy in vitro.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania te zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi prowadzenia etycznych badań z udziałem ludzi. Zatwierdzenie etyczne zostało udzielone przez Kanadyjską Radę ds. Etyki Badań Krwiodawstwa (REB), zatwierdzenie CBSREB#2023.008. Wszystkie etapy tego protokołu należy przeprowadzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego w sterylnych warunkach.

1. Izolacja PBMC

  1. Pobrać pełną krew ludzką od dawcy w probówce ACD. Krew należy przechowywać w temperaturze pokojowej (18 °C–22 °C) do 36 godzin.
  2. Przenieś probówki ACD z pełną krwią do probówek wirówkowych o pojemności 50 ml (pojedyncza probówka 50 ml na każde dwie probówki ACD). Dodaj kompletną pożywkę RPMI-1640 o temperaturze pokojowej do końcowej objętości 35 ml.
  3. Dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości w temperaturze pokojowej do nowej probówki o pojemności 50 ml. Ostrożnie ułóż rozcieńczoną krew pełną na pożywce o gradiencie gęstości, minimalizując mieszanie na granicy faz w celu optymalnego oddzielenia krwi.
  4. Odwirować warstwową mieszaninę o stężeniu 700 x g przez 30 minut przy wyłączonych hamulcach. Wirowanie w gradiacji gęstości rozdzieli mieszaninę na następujące warstwy od góry do dołu: osocze, płaszcz Buffy (zawierający PBMC), materiał gradientu gęstości, granulocyty i czerwone krwinki.
  5. Odessać i wyrzucić większość górnej warstwy (osocza). Za pomocą pipety transferowej ostrożnie wyjmij warstwę kożucha (PBMCs), unikając wnoszenia dodatkowego materiału. Przenieść pobrane PBMC do nowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Umyć izolowaną warstwę kożucha 1x roztworem pH 7,4 PBS przez 10 minut przy 350 x g przy włączonych pełnych hamulcach.
  7. Użyj sitka komórkowego 70 μM, aby wyeliminować zanieczyszczenia lub niechciany materiał z PBMC przed przeniesieniem ich do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Płukać 2x roztworem pH 7,4 PBS przez 10 minut przy 350 x g przy włączonych pełnych hamulcach.
  8. Opcjonalnie: Zdaj lizę wszystkich erytrocytów przeniesionych za pomocą buforu do lizy ACK. Dodaj 5-10 ml buforu do lizy ACK, w zależności od wielkości granulek i inkubuj w temperaturze pokojowej do 3 minut. Po inkubacji uzupełnić pH 7,4 PBS i wirować przez 10 minut przy 350 x g przy włączonych pełnych hamulcach i przemyć 1x. Wykonaj ten krok, jeśli liczba erytrocytów jest zbyt duża.
    UWAGA: Zawsze lepiej jest unikać używania ACK, aby uzyskać lepsze wyniki. Alternatywnie można użyć wody do wyeliminowania niefagocytozowanych erytrocytów poprzez inkubację z wodą nie dłużej niż 15 sekund, a następnie natychmiast dodać 1X PBS do mycia.
  9. Rozpuść osad PBMC w 2-3 ml (użyć 0,5 ml na początkową probówkę ACD) kompletnego podłoża RPMI-1640. Policz PBMC za pomocą hemocytometru po przygotowaniu mieszaniny 1:1 z błękitem trypanowym. Zlicza tylko komórki, które nie są barwione błękitem trypanowym. Rozpuść PBMC do 2 x 106 komórek/ml w kompletnym pożywce RPMI-1640.

2. Hodowla makrofagów M1/M2

  1. Dzień 0 wysiewanie monocytów
    1. Przygotować kolbę o pojemności 25 ml do hodowli komórkowych dla każdej populacji makrofagów. Do każdego z nich dodać 5 ml poli-D-lizyny (50 mg/500 ml) i pozostawić w kapturze na co najmniej 1 godzinę. Przepłukać kolbę PBS, aby pozbyć się pozostałości poli-D-lizyny.
    2. Wyizoluj PBMC z sierści Buffy lub próbek pobranych od pacjenta, jak zwykle (patrz krok 1). Po wygenerowaniu osadu PBMC, zawieś go ponownie w 10 ml wstępnie podgrzanego kompletnego podłoża RPMI-1640.
    3. Określ liczbę komórek i rozpocznij izolację monocytów za pomocą zestawu do izolacji monocytów. Aby uruchomić zestaw, użyj co najmniej 50 x 106 komórek.
    4. Zawiesić komórki w temperaturze 50 x 106 komórek/ml w pożywce izolacyjnej. W zależności od uzyskanej liczby komórek użyj fioletowego (0,25-2 ml) lub szarego (0,5-8,5 ml) magnesu zalecanego w zestawie do izolacji monocytów.
    5. Postępuj zgodnie z instrukcjami zestawu i dodaj próbkę do wymaganej probówki propylenowej (5 ml lub 14 ml). Dodać koktajl wzbogacający do próbki o stężeniu 50 μl/ml.
    6. Pipetować w górę i w dół lub wirować, aby wymieszać próbkę, a następnie inkubować w temperaturze 2-8 °C przez 10 minut w wiadrze z lodem. W międzyczasie wirować cząstki magnetyczne przez 30 s. Po inkubacji dodać do próbki cząstki magnetyczne: 100 μl/ml próbki.
    7. Pipetować w górę i w dół lub wirować w celu wymieszania próbki, a następnie inkubować w temperaturze 2-8 °C przez 5 minut. Uzupełnić pożywką izolacyjną do 2,5 ml lub 10 ml, odpowiednio za pomocą pipety stopniowanej. Pipetować w górę i w dół 2x-3x, aby wymieszać.
    8. Umieść probówkę (bez pokrywki) w magnesie i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2,5 minuty. Podnieś magnes i jednym ciągłym ruchem odwróć magnes i rurkę, wlewając zawiesinę komórek do nowej probówki o pojemności 5 ml lub 14 ml.
    9. Zawieś komórki na podłożu RPMI-1640 i policz je. Wykonaj ten krok tak szybko, jak to możliwe. Wysiewać między 1 x 106 – 5 x 106 monocytów do każdej kolby o pojemności 25 ml, uprzednio wstępnie pokrytej poli-D-lizyną. W razie potrzeby doprowadź objętość do 5 ml za pomocą RPMI-1640.
    10. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny. W międzyczasie przygotuj pożywki różnicujące M1 i M2. Przygotuj się wystarczająco na dzień 0 (10 ml) i dzień 4 (2 ml) uzupełnienie.
      UWAGA: Podłoże różnicujące M1: RPMI-1640 + 2,5 ng/mL GM-CSF; Ośrodek różnicujący M2: RPMI-1640 + 50 ng/mL M-CSF.
    11. Po czasie inkubacji umyć każdą kolbę 1x PBS i 2x pełnym RPMI-1640. Dodać 10 ml pożywki różnicującej do każdej kolby w zależności od typu komórek, które mają być różnicowane.
    12. Pozwól komórkom różnicować się przez 6 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ze względu na parowanie, uzupełnić pożywką różnicującą w dniu 4.
  2. Dzień 4 - Doładowanie
    1. Dodać 2 ml każdej pożywki różnicującej do odpowiedniej kolby. Dodać pożywkę bezpośrednio do kolby.
  3. Dzień 6 - Polaryzacja makrofagów
    1. Przygotować pożywkę polaryzacyjną M1 i M2. W przypadku pożywki polaryzacyjnej M1 przygotować 5 ml pożywki polaryzacyjnej M1 i dodać ją do odpowiedniej kolby. Końcowe stężenia powinny wynosić 50 ng/ml IFNγ, 10 ng/ml LPS i 2,5 ng/ml gm-csf w RPMI-1640. Kolba na końcu będzie miała 15 ml całkowitej objętości (10 ml już w + 5 ml do dodania), wykonaj odpowiednie obliczenia.
    2. W przypadku pożywki polaryzacyjnej M2 należy przygotować 5 ml pożywki polaryzacyjnej M2 i dodać ją do odpowiedniej kolby. Końcowe stężenia powinny wynosić 20 ng/ml IL-4 i 50 ng/ml m-csf w RPMI-1640. Należy zauważyć, że kolba na końcu będzie miała 15 ml całkowitej objętości (10 ml już w + 5 ml do dodania); Wykonaj odpowiednie obliczenia.
    3. Dodać 5 ml pożywki polaryzacyjnej M1 lub M2 do każdej kolby. Pozostawić makrofagi na polaryzację przez co najmniej 2 dni i nie dłużej niż 4 dni w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Dzień 8 - Zbiory i cytometria przepływowa
    1. Przed pobraniem makrofagów M1 lub M2 należy zebrać supernatant do probówek o pojemności 1,5 ml w celu dalszego użycia (jeśli jest to konieczne). Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek do kolby i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 minut.
    2. Aby zatrzymać reakcję, dodaj 3 ml pełnego RPMI-1640. Zebrać pożywkę do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 3 ml kompletnego RPMI-1640 do kolby i użyć skrobaka do komórek, aby odłączyć komórki od dna kolby.
    3. Zbierz komórki w probówce o pojemności 15 ml. Umieścić kolbę pod mikroskopem pod kątem 10x i obserwować komórki, aby upewnić się, że żadne komórki nie są przyczepione do dna kolby.
    4. Umyj komórki w PBS 2x. Zawieś je ponownie w pełnym RPMI-1640 i policz za pomocą hemocytometru.
    5. Aby przeanalizować jakość i ilość makrofagów M1/M2, uruchom test cytometrii przepływowej. Użyj 0,5 x 106 komórek na probówkę i zabarwij w następujący sposób: M1: CD80 + CCR7 + CD209- M2: CD206 + CD209 + CD80-. Strategia bramkowania zastosowana w tym teście: #1 Forward Scatter (FSC-A) vs. Side Scatter (SSC-A) Dot Plot, #2 Forward Scatter Height (FSC-H) vs. Forward Scatter Area (FSC-A) Dot Plot dla dyskryminacji dubletowej, #3 Side Scatter (SSC-A) vs. DAPI-A Dot Plot dla dyskryminacji żywych/martwych komórek, #4 Side Scatter (SSC-A) vs. Single Parameter Dot Plot lub histogram (tj. SSC-A vs. FITC-A), #5 Wykres punktowy z podwójnym parametrem (tj. FITC-A vs. APC-A).

3. MMA z wykorzystaniem makrofagów M1/M2

  1. Po uzyskaniu makrofagów M1/M2 policz je za pomocą hemocytometru w stosunku barwienia 1:1 z błękitem trypanowym. Rozpuść M1/M2 do 1 x 106 komórek/ml w kompletnym podłożu RPMI-1640.
  2. Wysiewać 400 μl (400 000 komórek) zawiesiny komórkowej za pomocą mikropipety do każdego dołka szkiełka 8-dołkowego i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez co najmniej 1,5 godziny w całkowicie nawilżonym inkubatorze do hodowli tkankowych. Każde badanie powinno być wykonywane przy użyciu co najmniej trzech studzienek.
  3. Opsonizacja próbek testowych i czerwonych krwinek RhD+ R2R2
    1. Przemyć RhD+ R2R2 RBC w pH 7,4 PBS 3x, odwirowując przy 350 x g przez 5 minut za każdym razem. Wolimy używać RBC R2R2 RhD+ jako naszej kontroli, ze względu na to, że ma wyższą gęstość antygenu D, ale wszelkie RBC RhD+ można zastąpić. Opsonizacja próbki RBC do badania (np. pacjenta lub dawcy) RBC za pomocą przeciwciał będących przedmiotem zainteresowania. Użyj 5% zawiesiny RBC, dodając 15 μl upakowanych erytrocytów do 300 μl mieszaniny przeciwciał. Opsonizacja krwinek czerwonych R2R2 za pomocą anty-D przez dodanie 15 μl upakowanych krwinek czerwonych R2R2 do 300 μl mieszaniny przeciwciał anty-D (100 ng / ml).
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę. Przeprowadzać przerywane rozpuszczanie krwinek czerwonych osiadłych na dnie (np. wirować co 15 minut). Przemyć opsonizowane erytrocyty o pH 7,4 PBS 3x przez odwirowanie przy 350 x g przez 5 minut za każdym razem.
    3. Aby sprawdzić opsonizację RBC, wykonaj pośredni test antyglobulinowy (IAT). Dodaj drugorzędowe przeciwciało opsonizujące anty-ludzkie do pierwszorzędowego przeciwciała opsonizującego. Hemagglutynację lub zlepianie się krwinek czerwonych można zaobserwować w ciągu 30 s i zinterpretować jako udaną opsonizację13.
    4. Rozpuść przemyte opsonizowane erytrocyty RhD+ R2R2 w 1,25% (v/v) za pomocą kompletnego podłoża RPMI-1640. Dodaj 1,200 μl pożywki do 15 μl RBC, aby uzyskać 1,25% (v/v) na studzienkę.
  4. Fagocytoza zależna od receptora Fc
    1. Po 1,5 godzinnej inkubacji makrofagów M1/M2, aby umożliwić tym komórkom przyleganie do studzienek szkiełka komory, należy odessać pożywkę sklarowaną nad osadem i wyrzucić, stosując delikatną technikę, upewniając się, że końcówka pipety dotyka tylko rogu studzienek. Makrofagi należy przykleić do studzienek. Unikaj dotykania środka studzienek końcówką pipety.
    2. Delikatnie umyj studzienki 1x o pH 7,4 PBS. Dodać 400 μl odpowiedniej 1,25% (v/v) opsonizowanej mieszaniny RBC do każdego dołka potrójnego. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 2 godziny w spokoju.
    3. Po inkubacji przygotować dwie zlewki ze 100 ml pH 7,4 PBS w każdej.
    4. Wyjmij komory 8-dołkowe za pomocą adapterów producenta. Zetrzyj nadmiar na ręczniku papierowym, utrzymując szkiełka wilgotne.
    5. Zanurz szkiełko w zlewce z wyrzuconymi supernatantami i umyj je, powoli przesuwając je do przodu i do tyłu (20-30 uderzeń), aby usunąć wszelkie pozostałe niefagocytozowane erytrocytozy
      6. .
    6. Następnie zanurz szkiełko w drugiej zlewce i myj powoli przez kolejne 20-30 pociągnięć. Wyjmij szkiełko z PBS i zetrzyj jego nadmiar na ręcznik papierowy. Unikaj dotykania przedniej części komór. W tym momencie zanurz szkiełko w wodzie na 1 minutę, aby usunąć wszelkie przylegające, niefagocytozowane krwinki czerwone, ale może to nie być konieczne, jeśli możesz odróżnić fagocytozowane od przylegających krwinek czerwonych. Suszyć na powietrzu.
    7. Zanurz szkiełka w 100% metanolu na 45 sekund, aby je zamocować, a następnie wysusz na powietrzu. Zamontuj szkiełko za pomocą przygotowanego przez siebie podłoża montażowego i dodaj szkiełka nakrywkowe (24 x 75 mm). Pozostaw do wyschnięcia na noc przed oznaczaniem ilościowym.
  5. Kwantyfikacja fagocytozy
    1. Za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym, soczewki obiektywowej 40x i ręcznego licznika komórek określ ilościowo fagocytozę.
    2. Za pomocą dwóch ręcznych liczników komórek, po jednym w każdej ręce, policz fagocytozowane erytrocyty za pomocą jednego licznika, a całkowitą liczbę monocytów/makrofagów drugim. Policz 300 monocytów/makrofagów na studzienkę.
    3. Oblicz średni indeks fagocytarny (PI) na test (w trzech powtórzeniach), dzieląc liczbę fagocytozowanych erytrocytów przez liczbę wszystkich zliczonych monocytów i mnożąc przez 100. Wyrazić dane jako średnią PI ± błąd standardowy średniej (SEM).
      PI = (fagocytozowane erytrocytozy / 300 makrofagów) x 100

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wyniki przedstawione na Rysunku 1 są zgodne z literaturą i wskazują na udaną polaryzację makrofagów ze stanu M0 do późniejszego stanu M1/M2. Makrofagi M1 i M2 hodowano przez 8 dni (6 dni z czynnikami wzrostu i 2 dni polaryzacji), a następnie przetestowano RBC opsonizowane przeciwciałami anty-D lub anty-k (Rysunek 2). Makrofagi M2 wykazują wysoki indeks fagocytozy w porównaniu do makrofagów M1 w przypadku RBC opsonizowanych przeciwciałami anty-D ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby zapewnić powodzenie metody, należy przestrzegać następujących krytycznych kroków: 1) skuteczna polaryzacja M1/M2, 2) generowanie warstwy makrofagów i kontrola RhD+ 3) kwantyfikacja indeksu fagocytarnego. Podczas gdy nasze metody mówią o użyciu izolowanych monocytów do hodowli komórek, PBMC mogą być stosowane, ale zalecamy stosowanie oczyszczonych monocytów. Wiadomo, że PBMC zawierają różne typy komórek, przy czym komórki te wydzielają wiele różnych cytokin i czynników pośredniczących. Może to mieć wpływ na różnicowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana i finansowana przez Kanadyjskie Centrum Badań Krwi dla Innowacji w Toronto, ON. Badania prowadzone są w Keenan Research Centre for Biomedical Sciences w St. Michaels Hospital w Toronto, ON.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1X PBS, pH 7,4, bez Ca2+/Mg2+Bisent Bioproducts 311-425-CLPrzechowywać w temperaturze 4 stopni lub pokojowej 
Technologie AccutaseTMSTEMCELL 7920Roztwór do oddzielania komórek
ACK Bufor do lizy Technologie STEMCELL 07850, 07800Przechowywać w 4 stopniach
antyglobuliny ludzkiejNOVACLONE, Immunocor. Nie dotyczyAnty-IgG NOVACLONE do badań IAT 
Anty-Rh(D) (WinRho. SDF CDN)Saol Therapeutics 1003092Wystarczy każde komercyjne źródło immunoglobiny Rh 
Skrobak do komórekUofT Medstore83.395odłączanie komórek 
Sitko do komórek 70uM nylonFalcon352350filtr komórek 
Zjeżdżalnia komorowa Nunc. Lab-TekTM II z pokrywą, szkiełko RS Glass Sterylne Thermo Fisher Naukowy Prowadnice 154534komorowe do MMA 
Szkiełka nakrywkowe VWR48393-08124 x 50 mm
Cytiva Ficoll Paque Plus, gęstość 1,077 g/LThermo Fisher Scientific 17-1440-03oddzielenie PBMCS od krwi pełnej; średni gradient gęstości
Elvanol Podłoże montażoweN/AN/DDulbecco' s PBS (D-PBS) bez Ca2+/Mg2+, 15% (w/v) żywicy poliwinylowej i 30% (v/v) gliceryny.
Świeża krew pełna (probówka ACD) lub płaszcz BuffyCanadian Blood ServicesMoże odpoczywać w temperaturze pokojowej do 36 godzin 
Technologie rekombinowanych komórek macierzystych GM-CSF dla ludzi 78015.1Cytokina do polaryzacji makrofagów M1
Ludzkie rekombinowane IFN-gammaSTEMCELL Technologie 78020Cytokina do polaryzacji makrofagów M1
Technologie ludzkiej rekombinacji IL-4STEMCELL 78045.1Cytokina do polaryzacji makrofagów M2
Ludzkie rekombinowane komórki macierzyste M-CSFTechnologie 78057.1Cytokina do polaryzacji makrofagów M2
ID-CellStabBio-Rad005650 05740Roztwór do przechowywania/stabilizacji komórek RBC 
Medium izolacyjne Nie dotyczydotyczyPbs Wolne od Ca2+ i Mg2+ + FBS 2% + 1mM
EDTA Lipopolisaaracide (LPS)Sigma AldrichL3024-5MGCytokina do polaryzacji makrofagów M1
Metanol (100%)N/AN/AMocowanie szkiełek 
Zestaw do izolacji monocytów Zestaw do izolacji komórek macierzystych EasySep Zestaw do wzbogacania ludzkich monocytów bez wyczerpania CD16 Technologie STEMCELL 19058Izolacja monocytów z PBMC
Poli-D-yzyna Sklep UofT Medstore P6407Rozwiązanie do mocowania komórek 
Rh(D) dodatnie R2R2 RBC KanadyjskaSłużba KrwiNie dotyczyRównież dostępne komercyjnie
RPMI-1640Bioprodukty żubrów 350-000-CLuzupełniony 10% inaktywowanym termicznie FBS, 1 mM suplementem GlutaMAX, 1 mM HEPES i 1% penicyliną/streptomycyną. Przechowywać w temperaturze 4 stopni.
Roztwór błękitu trypanowego Thermo Fisher Naukowy 15250061Rozwiązanie do liczenia komórek 
nie

Bibliografia

  1. Tong, T. N., Branch, D. R. Use of a monocyte monolayer assay to evaluate Fcγ receptor-mediated phagocytosis. J Vis Exp. (119), e55039(2017).
  2. Tong, T. N., Cen, S., Branch, D. R. The monocyte monolayer assay: Past, present and future. Transfus Med Rev. 33 (1), 24-28 (2019).
  3. Frias Boligan, K., Sandhu, G., Branch, D. R. Methods to evaluate the potential clinical significance of antibodies to red blood cells. Curr Protoc. 2 (8), e504(2022).
  4. Lemay, A. S., et al. The first case of severe acute hemolytic transfusion reaction caused by anti-Sc2. Transfusion. 58 (11), 2506-2512 (2018).
  5. Tong, T. N., et al. The utility of a monocyte monolayer assay in the assessment of intravenous immunoglobulin-associated hemolysis. Transfusion. 60 (12), 3010-3018 (2020).
  6. Srivastava, K., et al. SCAR: the high-prevalence antigen 013.008 in the Scianna blood group system. Transfusion. 61 (1), 246-254 (2021).
  7. Branch, D. R., et al. Potentially clinically significant anti-Dib identified by monocyte monolayer assay before transfusion. Transfusion. 61 (1), 331-332 (2021).
  8. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation. Front Immunol. 5, 514(2014).
  9. Mills, C. M1 and M2 macrophages: Oracles of health and disease. Crit Rev Immunol. 32 (6), 463-488 (2012).
  10. Atri, C., Guerfali, F. Z., Laouini, D. Role of human macrophage polarization in inflammation during infectious diseases. Int J Mol Sci. 19 (6), 1801(2018).
  11. Bertani, F. R., et al. Classification of M1/M2-polarized human macrophages by label-free hyperspectral reflectance confocal microscopy and multivariate analysis. Sci Rep. 7, 8965(2017).
  12. Murray, J. Macrophage polarization. Annu Rev Physiol. 79, 541-566 (2017).
  13. Cohn, C., Delaney, M., Johnson, S. T., Katz, L. M., Schwartz, J. Technical Manual. , 21st Ed, American Association for the Advancement of Blood and Biotherapeutics. Maryland, USA. (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Przeciwcia a przeciwko erytrocytomtest monocytowej warstwy monowarstwowejhemoliza zapo redniczona przez przeciwcia amakrofagi M1makrofagi M2indeks fagocytarnyopsonizowane erytrocytycytometria przep ywowamononuklearne kom rki krwi obwodowej
Przewidywanie znaczenia przeciwciał przeciwko krwinkom czerwonym za pomocą testu monocytów-makrofagów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.