Artykuł metodologiczny

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/67878

⸱

10 czerwca 2025

 ,  , 
1Department of Cardiology and Angiology, University Hospital Tübingen, University of Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Płytki krwi, czyli trombocyty, to małe bezjądrzaste komórki krwi, które odgrywają kluczową rolę w hemostazie i zakrzepicy. Zaburzenia funkcji płytek krwi mogą powodować krwawienia lub zdarzenia zakrzepowe u pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi. Dlatego ważne jest, aby scharakteryzować płytki krwi fenotypowo, aby móc przypisać subpopulacje płytek krwi do funkcji płytek krwi. Stymulacja ludzkich płytek krwi agonistami i aktywatorami płytek krwi indukuje zmiany morfologiczne i fizjologiczne w płytkach krwi, którym towarzyszą zmiany w populacji receptorów powierzchniowych. Prowadzi to do funkcjonalnie zróżnicowanych subpopulacji płytek krwi. Klasycznie zdefiniowane subpopulacje płytek krwi to płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Aby scharakteryzować wpływ agonistów na podtypy płytek krwi, ustaliliśmy test za pomocą wielokolorowej cytometrii przepływowej składającej się z 10 różnych przeciwciał i barwników (anty-CD62P, anty-CD63, anty-CD61, anty-CD41, anty-CD42b, anty-integrynaαIIbβ3 (klon: PAC-1), anty-CXCR4, anty-ACKR3, Aneksyna V, Zombie NIR). Izolowane ludzkie płytki krwi inkubowano z agonistami płytek krwi i barwiono specyficznymi przeciwciałami i barwnikami sprzężonymi z fluoroforem. Następnie zmierzono je za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala nam to na zdefiniowanie podtypów specyficznych dla agonistów w ramach klasycznych czterech subpopulacji. Podsumowując, połączenie markerów aktywacji (anty-CD62P, anty-CD63, anty-integrynyαIIbβ3 (klon: PAC-1)), markerów stanu zapalnego (anty-CXCR4, anty-ACKR3) i markerów apoptotycznych (Aneksyna V, Zombie NIR), które składają się na 10-kolorowy panel cytometrii przepływowej opisany w tym manuskrypcie, otwiera możliwość zdefiniowania dalszych podtypów płytek krwi, które można powiązać z określoną funkcją płytek krwi. Metoda ta może być stosowana w podstawowych badaniach nad funkcją i fizjologią płytek krwi, a także w definiowaniu nowych podtypów płytek krwi w modelach chorób i badaniach pacjentów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombocyty, zwane również płytkami krwi, to małe, pozbawione jąder komórki krwi niezbędne do hemostazy i rozwoju zakrzepicy1,2. Mogą być aktywowane przez różnych agonistów płytek krwi. Klasycznymi, fizjologicznymi agonistami płytek krwi są difosforan adenozyny (ADP), który wiąże się z receptorami P2Y12 i P2Y1, trombina, która aktywuje płytki krwi poprzez receptory PAR1 i PAR4 oraz kolagen, który oddziałuje z glikoproteiną VI. Kolagen może być zastąpiony w eksperymentach in vitro peptydem związanym z kolagenem (CRP-XL)3,4. Ostatnio wykazano, że hemina indukuje aktywację płytek krwi poprzez interakcję receptora lektynopodobnego typu C (CLEC-2) i glikoproteiny VI (GPVI), ustanawiając heminę jako nowy endogenny aktywator / agonista płytek krwi5,6. Kilka patologicznych sytuacji może prowadzić do hemolizy, w wyniku której dochodzi do uwolnienia wolnej heminy zawierającej żelazo żelazowe. Wszyscy ci agoniści płytek krwi zmieniają ekspresję receptorów powierzchniowych na płytkach krwi. Zmiana receptorów powierzchniowych i błony plazmatycznej zależy od siły i stężenia agonisty płytek krwi7,8,9. Dlatego ważne jest, aby fenotypowo scharakteryzować płytki krwi, aby móc przypisać subpopulacje płytek krwi do funkcji płytek krwi.

Metody wielowymiarowe, takie jak cytometria przepływowa, ujawniły, że płytki krwi tworzą subpopulacje o różnych funkcjach. Subpopulacje można klasyfikować za pomocą różnych znaczników powierzchniowych. W literaturze dobrze wiadomo, że występują dwie odrębne subpopulacje płytek krwi: prokoagulant, który charakteryzuje się eksternalizacji fosfatydyloseryny, oraz fenotyp agregacyjny, który aktywuje integrynęα IIIbβ3. Oprócz klasycznych markerów aktywacji, do dalszej kategoryzacji można zastosować barwniki fluorescencyjne, takie jak tlenek s-glutationu (GSAO), który wykrywa funkcję mitochondriów i stres oksydacyjny, np. prokoagulacyjne płytki krwi według ich stanu metabolicznego10. Pozwala to na rozróżnienie fenotypu prokoagulacyjnego płytek krwi o przepuszczalności mitochondriów i mitochondrialnej przepuszczalności (MPTP)11.

Heemskerk i wsp. wykazali, analizując ekspozycję na fosfatydyloserynę (PS) i aktywność integrynyα IIb β3, że różne populacje płytek krwi mogą kontrolować różne etapy krzepnięcia i że silne aktywatory, takie jak trombina i kolagen, są wymagane do ekspozycji na fosfatydyloserynę12. Ponadto aktywacja płytek krwi przez GPVI za pomocą kolagenu lub specyficznej agonisty GPVI konwulksyny jest przede wszystkim odpowiedzialna za tworzenie przylegających płytek krwi prokoagulantu. Podobnie kwas arachidonowy, który prowadzi do aktywacji płytek krwi poprzez wytwarzanie tromboksanu A2 przez cyklooksygenazę, indukuje ekspozycję na PS13. Jednak kwas arachidonowy jest, w porównaniu z trombiną czy kolagenem, słabym aktywatorem płytek krwi14. Van Velzen i wsp. ocenili również antygeny powierzchniowe płytek krwi (CD42a/b, CD36, CD41, CD61) i markery aktywacji (PAC-1, CD63, CD62P) w dwóch oddzielnych pomiarach15. Ponadto van Velzen i wsp. byli w stanie przeanalizować krew pacjentów z trombastenią i porównać subpopulacje między zdrowymi i chorymi pacjentami. Hindle i wsp. zmierzyli wpływ prostacykliny na subpopulacje płytek krwi po leczeniu trombiną i CRP-XL za pomocą dwóch indywidualnych paneli składających się z czterech markerów każdy (PAC-1, Aneksyna V, CD62P, CD42b lub CDCD154, CD62P, CD63, CD42b)16. Ostatnio wielobarwna cytometria przepływowa jest stosowana do definiowania spoczynkowych (CD42b+, PAC1-, CD62P-, Aneksyna V-), agregacyjnych (CD42b+, PAC1+, CD62P+, Aneksyna V-) prokoagulantów (CD42b+, PAC1-, CD62P+, Aneksyna V+) i apoptotycznych (Cd42b-, PAC1-, CD62P-, Aneksyna V+) subpopulacji płytek krwi7,17. Laspa i in. rozszerzyli/udoskonalili podejście do wielokolorowej cytometrii przepływowej poprzez dodanie przeciwciał przeciwko receptorom chemokiny CXCR4 i ACKR318. Na podstawie dostępnej literatury jest to pierwszy 10-kolorowy panel cytometru przepływowego do izolowanych ludzkich płytek krwi, który umożliwia wykrycie 10 różnych antygenów na pojedynczej płytce krwi (na poziomie pojedynczej komórki) w populacji izolowanych ludzkich płytek krwi w jednej probówce. W związku z tym możliwe jest jednoczesne mierzenie potencjału aktywacji, adhezji i agregacji, receptorów chemokiny i potencjału apoptotycznego pojedynczej komórki, aby jeszcze bardziej odróżnić istniejącą subpopulację. W ten sposób uzupełnia Johnson i wsp., którzy zdefiniowali cztery główne subpopulacje za pomocą czterech markerów (spoczynkowy, prokoagulacyjny, agregacyjny, apoptozyczny)17. Tak więc ustanowienie wielobarwnego testu cytometrii przepływowej umożliwia porównanie różnych agonistów płytek krwi pod względem ich wzorca aktywacji i tworzenia podtypów płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi.

Metoda może być wykorzystana do podstawowych badań dotyczących analizy funkcji płytek krwi i fizjologii. Co więcej, uznany test wielokolorowej cytometrii przepływowej dla ludzkich płytek krwi można przeprowadzić z płytkami krwi uzyskanymi w ramach badań z udziałem pacjentów, np. Badań nad chorobami sercowo-naczyniowymi i zdarzeniami zakrzepowymi, w celu odkodowania subpopulacji płytek krwi indukowanych przez te choroby i wpływu leczenia na te indukowane fenotypy. Na przykład Mueller i wsp. wykazali, że subpopulacje płytek krwi mogą się różnić u pacjentów ze zwężeniem zastawki aortalnej19. Zdobyta wiedza może otworzyć nowe możliwości dla interwencji farmaceutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobieranie krwi i przetwarzanie do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Komisję Etyki na Wydziale Medycznym Uniwersytetu Eberharda Karlsa i Szpitala Uniwersyteckiego w Tybindze (głosowanie w sprawie etyki 238/2018B02), a metodologie badań były zgodne ze standardami określonymi w Deklaracji Helsińskiej. Zdrowi dawcy wyrazili pisemną świadomą zgodę na pobranie krwi. Podstawowe cechy charakterystyczne dla zdrowych dawców przedstawiono w Tabeli 1. Rysunek 1 przedstawia przegląd protokołu cytometrii przepływowej.

1. Izolacja ludzkich płytek krwi z krwi pełnej

UWAGA: Wytyczne ISTH były przestrzegane w zakresie pobierania próbek, opasek uciskowych i wyboru antykoagulantu, aby zapewnić ustandaryzowany sposób izolowania płytek krwi20.

  1. Przygotowanie buforu
    1. Bufor przeciwzakrzepowy kwasu cytrynianowo-dekstrozowego (ACD): Rozpuścić 12,50 g Na3-Citrat (85 mM C6H5Na3O7 x 2 H2O), 6,82 g kwasu cytrynianowego (71 mM) i 10,00 g glukozy (111 mM) w 475 ml aqua destillata. Dostosować pH za pomocą 1 M NaOH do 4,69. Napełnij do 500 ml aqua destillata. Następnie przefiltrować, wysterylizować bufor i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Wszystkie roztwory są sterylizowane filtrem za pomocą systemu filtrów napędzanych próżnią, który wykorzystuje membranę polieterosulfonową o wielkości porów 0,22 μm o szybkim przepływie.
    2. Bufor Tyrode'a (10x): Odważyć 80,00 g NaCl, 10,15 g NaHCO 3 i 1,95 g KCl i dodać aqua destillata do 1 l. Przefiltrować, wysterylizować bufor i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    3. Bufor Tyrode's-HEPES (1x; 137 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 5 mM glukozy, 10 mM HEPES): Wymieszaj 10 ml 10x buforu Tyrode'a i 90 ml aqua destillata. Rozpuścić 0,1 g glukozy i 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dostosować pH za pomocą kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES) do 7,4. Ustawić 10 ml buforu Tyrode'a na pH 7,4 i dostosować pH pozostałych 90 ml buforu Tyrode'a do 7,4 za pomocą 1 N HCl do pH 6,5,
      UWAGA: BSA może wymiatać niektóre chemikalia, takie jak hemina. W takim przypadku ważne jest, aby przygotować bufor 1x Tyrode bez BSA. Przed użyciem wszystkie muszą rozgrzać się do temperatury pokojowej lub 37 °C.
  2. Pobieranie próbek krwi
    1. Dla każdego dawcy należy przygotować jedną strzykawkę o pojemności 10 ml z 2 ml antykoagulantu ACD i pozostawić do temperatury pokojowej lub 37 °C za pomocą inkubatora. Zachowaj współczynnik rozcieńczenia 1:5 (ACD: krew).
      UWAGA: Użyj mniejszych lub większych strzykawek do pobrania próbek krwi. Zimny bufor ACD może wstępnie aktywować płytki krwi i pogorszyć wyniki.
    2. Użyj igły motylkowej (21G), aby powoli pobrać krew dawcy do wstępnie podgrzanych strzykawek ACD. Otwórz wąż opaski uciskowej przed napełnieniem strzykawki, aby uniknąć wstępnej aktywacji.
      UWAGA: Strzykawki z igłą o większej średnicy mogą zminimalizować aktywację płytek krwi wywołaną ścinaniem.
    3. Powoli przenieś krew ACD do probówki reakcyjnej o pojemności 15 ml. Należy natychmiast zużyć krew, aby uniknąć wstępnej aktywacji płytek krwi.
  3. Izolacja płytek krwi
    1. Odwirowywać krew ACD przez 20 minut w temperaturze 209 x g (temperatura pokojowa, RT) bez hamulców. Przygotować 25 ml buforu Tyrode's-HEPES o pH 6,5 w probówce reakcyjnej o pojemności 50 ml.
    2. Delikatnie przenieś otrzymane osocze bogatopłytkowe (PRP, górna warstwa) do probówki reakcyjnej o pojemności 50 ml zawierającej bufor Tyrode's-HEPES, pH 6,5.
    3. Pozostaw około 1 ml PRP nad kożuchem i erytrocytami, aby uniknąć zanieczyszczenia innymi krwinkami.
    4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 430 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej w celu osadzenia płytek krwi. Powstały osad należy ponownie zawiesić w 200-300 μl buforu Tyrode'a o pH 7,4.
    5. Użyj licznika komórek, aby określić liczbę płytek krwi. Dostosuj liczbę płytek krwi za pomocą buforu Tyrode-HEPES pH od 7,4 do 200 x 103 płytki krwi/μl. Patrz krok 3, aby zapoznać się z dalszym przetwarzaniem barwienia płytek krwi.

2. Wybór i miareczkowanie przeciwciał do cytometrii przepływowej

  1. Dobór przeciwciał i barwników
    1. Do cytometru przepływowego należy wybrać przeciwciała i barwniki z odpowiednimi fluoroforami21. Zwróć uwagę na konfigurację filtra zalecaną przez producenta cytometru przepływowego. Przykład markerów płytkowych i konfiguracji fluoroforów podano w tabeli 2 i Rysunek 2 dla następującego cytometru: BD LSR Fortessa z konfiguracją lasera: fioletowy (402 nm), niebieski (488 nm), żółto-zielony (561 nm), czerwony (640 nm).
      UWAGA: Użyj jaśniejszych fluorochromów dla antygenów o niższej ekspresji. Na przykład jasne fluorochromy BV412 i BV650 zostały użyte dla słabo eksprymowanych receptorów chemokiny (ACKR3 i CXCR4)22,23,24.
  2. Miareczkowanie przeciwciał i barwników
    1. Miareczkować przeciwciała, aby znaleźć odpowiednie stężenie robocze. Do miareczkowania należy użyć wyizolowanych ludzkich płytek krwi z etapu 1 i serii stężeń przeciwciała.
      UWAGA: Stężenia robocze podane przez producenta są na ogół dobrym punktem wyjścia dla serii stężeń.
      1. W przypadku pracy z antygenami, które ulegają ekspresji tylko podczas leczenia, aktywuj płytki krwi przed barwieniem, aby mieć pewność, że można również wykryć komórki ujemne i dodatnie. Na przykład PAC-1 wiąże się tylko z aktywowaną integrynąα IIbβ3. Dlatego należy silnie aktywować płytki krwi, aby uzyskać jasny, dodatni sygnał, np. za pomocą 10 μg/ml peptydu związanego z kolagenem (CRP; patrz Rysunek 3).
  3. Miareczkowanie próbek
    1. Wyizolować ludzkie płytki krwi jak w kroku 1 i dostosować liczbę płytek krwi do 1 x 106 płytek krwi na próbkę.
      1. W przypadku receptorów, które nie wymagają aktywacji przed barwieniem: CD61, CD42b, CD41, CXCR7, CXCR4 należy użyć jednej niebarwionej i barwionej próbki na przeciwciało. W przypadku receptorów/markerów, które muszą być aktywowane np. 10 μg/ml CRP-XL przed barwieniem: PAC1, CD63, CD62P, Annexin V, Zombie NIR, użyj jednej aktywowanej i jednej nieaktywowanej próbki15,25,26.
    2. W razie potrzeby aktywować płytki krwi (1 x 106 płytek krwi na próbkę) na 30 minut za pomocą 10 μg/mL CRP-XL. Następnie inkubować izolowane płytki krwi (1 x 106 płytek krwi na próbkę) przez 30 minut z różnymi stężeniami przeciwciała lub barwnika sprzężonego z fluorochromem i dodać 300 μl 1x buforu wiążącego anekcynę w celu rozcieńczenia próbki (przykłady stężeń podano w tabeli 3).
    3. Zmierz 10 000 zdarzeń dla każdej próbki.
    4. Obliczyć wskaźnik barwienia, który pokazuje optymalną separację populacji dodatniej i ujemnej dla każdego przeciwciała, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.
    5. Wykreśl indeks barwienia dla każdego stężenia przeciwciała, aby znaleźć optymalne stężenie.

3. Barwienie do cytometrii przepływowej

UWAGA: Zobacz Tabelę 4 dla przykładu barwienia czterema różnymi aktywatorami płytek krwi (CRP-XL, ADP, trombina, hemin).

  1. Hemin musi być przygotowany na świeżo. Rozpuścić proszek w 1,4 M NaOH do 3 M roztworu i podgrzewać do 96 °C przez 5 minut przy 450 obr./min. Następnie rozcieńczyć go destylowanymH2Odo 3 mM roztworu podstawowego.
  2. Po dostosowaniu liczby płytek krwi (na próbkę: 1 x 106 płytek krwi), aktywuj płytki krwi w probówce z aktywatorami płytek krwi przez 30 minut w temperaturze pokojowej, jak podano w Tabeli 4.
  3. Do próbek dodać 43,3 μl koktajlu przeciwciał i inkubować płytki krwi przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  4. Po inkubacji rozcieńczyć próbki 300 μl 1x buforu wiążącego aneksynę (10 mM HEPES/NaOH, pH 7,4, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2), tak aby białko aneksyny V mogło związać się z fosfatydyloseryną po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Natychmiast zmierzyć próbki.
    UWAGA: Zmierzyć próbki natychmiast po przygotowaniu. Ponieważ próbki nie są stałe, opóźnienie przygotowania i pomiaru próbki może zwiększyć zmienność wyników. Fiksacja upośledza wiązanie Aneksyny V.

4. Ustawienie kompensacji i fluorescencja minus jeden pomiar kontrolny (FMO)

UWAGA: Przed zapisaniem danych uruchom konfigurację kompensacji. Cytometr przepływowy automatycznie oblicza ustawienia kompensacji; Zapoznaj się ze zwykłymi instrukcjami cytometru przepływowego dla konkretnej procedury kompensacji. Niemniej jednak należy używać kontroli kompensacyjnych z komórkami lub koralikami.

  1. Konfiguracja wynagrodzenia
    1. W celu kompensacji za pomocą kulek należy przygotować 150 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) dla każdego fluoroforu z jedną kroplą kulek i 1 μl przeciwciała sprzężonego z fluorescencją.
    2. Monitoruj reaktywność koralików przez gatunek. Stosować anty-mysie IgGκ i negatywną kontrolę mikrocząstek polistyrenu. Aby skompensować aneksynę V, oznacz kulki PE / Cy7 przeciwciałem PE / Cy7 anty-ludzkim CD62L, które sprzęża ten sam fluorofor co aneksyna V.
    3. Użyj kulek kompensacyjnych amino-reaktywnych dla barwnika reagującego z aminami. Użyj dwóch kropli pozytywu i jednej kropli kulek ujemnych w 150 μl PBS z 1 μl barwnika. Sprawdź, czy kulki kompensacyjne aminowo-reaktywne reagują z barwnikiem i wykazują sygnał pozytywny. Sprawdź, czy kulki ujemne nie reagują z barwnikiem reagującym z aminą i nie dają sygnału ujemnego.
      UWAGA: W przypadku Zombie NIR APC-Cy7 należy użyć ujemnych i dodatnich kulek reagujących z aminami.
    4. Próbki kompensacyjne inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
    5. Uruchom każdą rurkę kompensacyjną osobno i zablokuj populację ściegów singletowych w oparciu o FSC i SSC. Populacja koralików pojawia się jako jedna mała skoncentrowana populacja. Narysuj bramę wokół tej populacji.
    6. Wyświetl histogramy dla każdej probówki kompensacyjnej i dostosuj wartości kompensacji, aż dodatnie piki różnych przeciwciał i barwników nie będą się nakładać. Następnie zmierz każdą pojedynczą rurkę kompensacyjną i pozwól, aby rozlanie się fluoroforów zostało obliczone zgodnie z SOP producenta.
    7. Kontynuuj właściwy eksperyment barwienia na izolowanych ludzkich płytkach krwi (patrz krok 3 i Tabela 4). Dostosuj napięcie SSC/FSC przed pomiarem, aby znaleźć populację płytek krwi. Ponieważ CD61 ulega wszechobecnej ekspresji na płytkach krwi, sprawdź za pomocą tego progu fluorescencji, czy można wykryć każdy rozmiar płytki krwi.
    8. Następnie zmierz 20 000 zdarzeń na próbkę.
  2. Pomiar FMO
    1. Dla każdego markera należy przygotować kontrolę FMO zgodnie z tabelą 5. Aby móc określić nakładanie się wszystkich markerów, należy przygotować zarówno próbki niestymulowane, jak i stymulowane.

5. Analiza danych

  1. Analiza za pomocą oprogramowania do analizy danych cytometrii przepływowej (Rysunek 4)
    1. Przeciągnij i upuść pliki FSC do oprogramowania. Za pomocą kontrolki FMO należy zdefiniować populację dodatnią dla każdego markera.
      1. Określ FMO, wykreślając każdą kontrolkę FMO względem każdego znacznika na wykresie kropkowym. To sprawia, że widoczne jest rozlanie się na inne kanały. Użyj bramki FMO o najwyższym rozlaniu fluorescencji jako granicy populacji dodatniej dla próbek 10-kolorowych poddanych działaniu substancji.
  2. Analiza za pomocą analizy cytometrii przepływowej opartej na chmurze (Rysunek 5)
    1. Otwórz oprogramowanie i utwórz nowy zestaw danych. Przeciągnij i upuść FCS files uzyskane za pomocą cytometru przepływowego.
    2. Rozpocznij analizę od utworzenia przepływu pracy. Macierz wynagrodzeń jest tworzona automatycznie na podstawie plików danych pierwotnych.
    3. Uruchom analizę UMAP z następującymi ustawieniami: Sąsiedzi: 15, Minimalna odległość: 0,4; Komponenty: 2; Metryczny: euklidesowy; Tempo uczenia się: 1; Epoki: 200; Inicjalizacja osadzania: spektralna. Zaznacz wszystkie pliki i wszystkie 10 znaczników (cech).
    4. Dodaj analizę fenoprafów jako nowe zadanie i uruchom analizę z następującymi ustawieniami: K Najbliżsi sąsiedzi: 20; Odległość metryczna: euklidesowa; Biegi w Louvain: 1; Liczba wyników: 1.
    5. Dodaj zadanie bramkowania, aby wskazać wygenerowane klastry. Po przeprowadzeniu analizy możliwe jest przedstawienie danych w różnych blotach, które można wyeksportować.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieją dwie opcje analizy surowych danych zebranych przez wielokolorowy panel cytometrii przepływowej. Jedną z opcji jest ręczna analiza za pomocą oprogramowania analitycznego (Rysunek 3 i Rysunek 4). Dlatego surowe dane należy przeciągnąć i upuścić w oknie oprogramowania. Po pierwsze, komórki należy znaleźć, dostosowując skalę SSC/FSC w trybie wyświetlania wykresu rozrzutu, aby pokazać populację płytek krwi jako wyraźną chmurę punktów. Następnie dodatnie komórki dla ka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wielobarwna cytometria przepływowa pozwala na zdefiniowanie odrębnych klastrów/subpopulacji płytek krwi związanych z funkcjami dyskretnymi 12,17,18. Decydujące znaczenie dla wyników subpopulacji i ekspresji powierzchni receptora ma jakość izolowanych płytek krwi u ludzi. Dlatego jednym z kluczowych kroków w przedstawionym protokole jest przygotowanie płytek krwi. Należy je delikatnie wyizolować, aby uniknąć aktywacji przed podda...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt był wspierany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) - Numer projektu 335549539 - GRK 2381.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10x bufor wiązania   Invitrogen,
Carlsbad, Kalifornia, USA		88-8103-74Bufor 
Difosforan adenozyny (ADP)Probe & go Labordiagnostica GmbH
Lemgo, Niemcy   		70212Agonista płytek krwi 
Aneksyna V PE-cyjanina7Invitrogen,
Carlsbad, Kalifornia, USA		88-8103-74barwnik 
przeciwciało anty-CD41 AF 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303728przeciwciała 
przeciwciało anty-CD41 Alexa Fluor 700BioLegend,
San Diego, CA, USA		303727przeciwciało 
anty-CD42b PerCP/Cyjanina5.5 BioLegend,
San Diego, CA, USA		303918przeciwciała 
anty-CD61 BV605BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone 		744382przeciwciała 
przeciwciało anty-CD62P PEBeckman Coulter,
Brea, Kalifornia, USA		IM1759Uprzeciwciała 
anty-CD63 PE/Cy5 Abcam,
Cambrigde, Wielka Brytania		ab 234251przeciwciała 
przeciwciało anty-CXCR4 BV650BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		740599przeciwciała 
anty-CXCR7 BV421 BD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, Stany Zjednoczone 		566234przeciwciała 
przeciwciało anty-PAC-1 FITCBD Bioscience
Franklin Lakes, NJ, USA		340507przeciwciała 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Applichem,
Darmstadt, Niemcy		A1391-Kwas
cytrynowy Carl Roth,
Karlsruhe, Niemcy		6490.1-CRP-XL
CambCol Laboratories,
Ely, Brytyjczycy		agoniści płytek krwi CRP-XL 
D-(+)-GlucoseSigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		G7528-Dubecco
' s Solanka solankowa buforowana fosforanami (PBS)Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, USA		D8537-Hemin
 Sigma Aldrich Co.,
St. Louis, Missouri, USA		Agonista płytek krwi H9039-10G 
HEPESCarl Roth,
Karlsruhe, Niemcy		9105.3-Chlorek
potasu Carl Roth,
Karlsruhe, Niemcy		6781.3-Chlorek
sodu Carl Roth,
Karlsruhe, Niemcy		3957.1-Wodorowęglan
sodu   Sigma Aldrich Co,
St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone		401676-Trombin
 Roche 10602400001agonista płytek krwi 
Cytrynian tri-sodu-dihydrat Applichem,
Darmstadt, Niemcy		1416551211-Zombie
NIRBioLegend,
San Diego, CA, USA		423105barwnik reaktywny aminowo 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Freedman, J. E. Molecular regulation of platelet-dependent thrombosis. Circulation. 112 (17), 2725-2734 (2005).
  2. Koupenova, M., Kehrel, B. E., Corkrey, H. A., Freedman, J. E. Thrombosis and platelets: an update. Eur Heart J. 38 (11), 785-791 (2016).
  3. van der Meijden, P. E. J., Heemskerk, J. W. M. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives. Nat Rev Cardiol. 16 (3), 166-179 (2019).
  4. Li, Z., Delaney, M. K., O'Brien, K. A., Du, X. Signaling During Platelet Adhesion and Activation. Arterioscl Thrombosis Vas Biol. 30 (12), 2341-2349 (2010).
  5. Oishi, S., et al. Heme activates platelets and exacerbates rhabdomyolysis-induced acute kidney injury via CLEC-2 and GPVI/FcRgamma. Blood Adv. 5 (7), 2017-2026 (2021).
  6. Bourne, J. H., et al. Heme induces human and mouse platelet activation through C-type-lectin-like receptor-2. Haematologica. 106 (2), 626-629 (2021).
  7. Rohlfing, A. K., et al. cGMP modulates hemin-mediated platelet death. Thromb Res. 234, 63-74 (2024).
  8. Chu, Y., Guo, H., Zhang, Y., Qiao, R. Procoagulant platelets: Generation, characteristics, and therapeutic target. J Clin Lab Anal. 35 (5), e23750(2021).
  9. Sodergren, A. L., Ramstrom, S. Platelet subpopulations remain despite strong dual agonist stimulation and can be characterised using a novel six-colour flow cytometry protocol. Sci Rep. 8 (1), 1441(2018).
  10. Agbani, E. O., Poole, A. W. Procoagulant platelets: generation, function, and therapeutic targeting in thrombosis. Blood. 130 (20), 2171-2179 (2017).
  11. Agbani, E. O., et al. Coordinated Membrane Ballooning and Procoagulant Spreading in Human Platelets. Circulation. 132 (15), 1414-1424 (2015).
  12. Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
  13. Rukoyatkina, N., et al. Multifaceted effects of arachidonic acid and interaction with cyclic nucleotides in human platelets. Thromb Res. 171, 22-30 (2018).
  14. Taylor, M. L., Misso, N. L. A., Stewart, G. A., Thompson, P. J. Differential Expression of Platelet Activation Markers CD62P and CD63 Following Stimulation with PAF, Arachidonic Acid and Collagen. Platelets. 6 (6), 394-401 (1995).
  15. van Velzen, J. F., Laros-van Gorkom, B. A., Pop, G. A., van Heerde, W. L. Multicolor flow cytometry for evaluation of platelet surface antigens and activation markers. Thromb Res. 130 (1), 92-98 (2012).
  16. Hindle, M. S., Spurgeon, B. E. J., Cheah, L. T., Webb, B. A., Naseem, K. M. Multidimensional flow cytometry reveals novel platelet subpopulations in response to prostacyclin. J Thromb Haemost. 19 (7), 1800-1812 (2021).
  17. Johnson, L., Lei, P., Waters, L., Padula, M. P., Marks, D. C. Identification of platelet subpopulations in cryopreserved platelet components using multi-colour imaging flow cytometry. Sci Rep. 13 (1), 1221(2023).
  18. Laspa, Z., et al. Hemin-induced platelet activation is regulated by the ACKR3 chemokine surface receptor and has implications for passivation of vulnerable atherosclerotic plaques. FEBS J. 291 (24), 5420-5434 (2024).
  19. Mueller, K. A. L., et al. Macrophage Migration Inhibitory Factor Promotes Thromboinflammation and Predicts Fast Progression of Aortic Stenosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (9), 2118-2135 (2024).
  20. Jourdi, G., et al. Consensus report on flow cytometry for platelet function testing in thrombocytopenic patients: communication from the SSC of the ISTH. J Thromb Haemost. 21 (10), 2941-2952 (2023).
  21. Flores-Montero, J., et al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Meth. 475, 112618(2019).
  22. Clemetson, K. J., et al. Functional expression of CCR1, CCR3, CCR4, and CXCR4 chemokine receptors on human platelets. Blood. 96 (13), 4046-4054 (2000).
  23. Rohlfing, A. K., et al. ACKR3 regulates platelet activation and ischemia-reperfusion tissue injury. Nat Commun. 13 (1), 1823(2022).
  24. Rath, D., et al. Expression of stromal cell-derived factor-1 receptors CXCR4 and CXCR7 on circulating platelets of patients with acute coronary syndrome and association with left ventricular functional recovery. Eur Heart J. 35 (6), 386-394 (2014).
  25. Hashemzadeh, M., et al. A comprehensive review of the ten main platelet receptors involved in platelet activity and cardiovascular disease. Am J Blood Res. 13 (6), 168-188 (2023).
  26. Moroi, M., Farndale, R. W., Jung, S. M. Activation-induced changes in platelet surface receptor expression and the contribution of the large-platelet subpopulation to activation. Res Pract Thromb Haemost. 4 (2), 285-297 (2020).
  27. Busuttil-Crellin, X., et al. Guidelines for panel design, optimization, and performance of whole blood multi-color flow cytometry of platelet surface markers. Platelets. 31 (7), 845-852 (2020).
  28. Fink, A., et al. The Subtilisin-Like Protease Furin Regulates Hemin-Dependent Ectodomain Shedding of Glycoprotein VI. Thromb Haemost. 123 (7), 679-691 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

aktywacja p ytek krwiagoni ci p ytek krwifunkcja p ytek krwimarkery powierzchniowe p ytek krwiizolacja p ytek krwiapoptotyczne p ytki krwiagregacja p ytek krwianaliza UMAP

Powiązane artykuły