Wykrywanie rybosomalnego RNA specyficznego dla polimorfizmu pojedynczego nukleotydu FISH u Drosophila melanogaster

Summary

Protokół opisuje metodę hybrydyzacji in situ z uwzględnieniem polimorfizmów pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkryptów rybosomalnego RNA pochodzących z locus rybosomalnego DNA chromosomu X lub Y u Drosophila melanogaster.

Abstract

Aby zapewnić wystarczającą ilość transkrybowanego rybosomalnego RNA (rRNA) dla funkcji rybosomów, genomy zawierają setki tandemowych duplikacji sekwencji kodujących rRNA, tworząc regiony zwane loci rybosomalnego DNA (rDNA). Genomy wielu organizmów zawierają więcej niż jeden locus rDNA rozmieszczony na różnych chromosomach, a rRNA może być transkrybowane z wielu loci rDNA lub tylko jednego locus. Zmiany w źródłach transkrypcji rRNA często wskazują na zaburzenia rybosomalne. Jednak jednorodność rRNA utrudnia rozróżnienie, czy rRNA jest transkrybowane z wielu czy z jednego locus rDNA. W tym miejscu opisujemy metodę, która wykorzystuje fluorescencyjną hybrydyzację in situ wrażliwą na polimorfizm pojedynczego nukleotydu (SNP-FISH) w celu rozróżnienia transkrypcji rRNA między loci rDNA Drosophila melanogaster na chromosomach X i Y. Metoda ta wykorzystuje warianty rRNA specyficzne dla locus, aby umożliwić łatwe wykrycie źródła transkrypcji rRNA z rozdzielczością pojedynczej komórki. Test ten może być stosowany do dowolnego typu komórek Drosophila i może być dostosowany do stosowania w innych systemach.

Introduction

Rybosomalne RNA (rRNA) 18S, 5.8S i 28S wymagane do funkcjonowania rybosomów są współtranskrybowane w pojedynczym cistronie zwanym pre-rRNA 45S. Trzy rRNA są oddzielone w pre-rRNA 45S przez dwie wewnętrzne transkrybowane sekwencje dystansowe (ITS) i otoczone zewnętrznymi transkrybowanymi sekwencjami dystansowymi (ETS) na końcu 5' i 3'. Wszystkie te sekwencje dystansowe są usuwane z pre-rRNA 45S, aby dojrzałe rRNA zostały włączone do rybosomów (patrz¹). Aby sprostać wysokiemu zapotrzebowaniu na produkcję rRNA potrzebną do wspierania aktywności rybosomów, wszystkie genomy eukariotyczne zawierają setki kopii sekwencji 45S. Kopie te są grupowane razem w powtórzeniach tandemowych, tworząc regiony genomowe zwane loci rybosomalnego DNA (rDNA). Większość genomów eukariotycznych zawiera wiele loci rDNA rozmieszczonych na oddzielnych chromosomach (patrz²). Wysoka redundancja kopii 45S oznacza, że zazwyczaj jest o wiele więcej kopii 45S niż jest to konieczne do transkrypcji, a większość kopii 45S jest transkrypcyjnie cicha i zakopana w heterochromatynie³. Aktywność transkrypcyjna nie jest jednolita we wszystkich loci rDNA, a zmienność transkrypcji locus rDNA jest szeroko obserwowana w różnych organizmach^4,5,6, co wskazuje, że transkrypcja 45S jest różnie regulowana w poszczególnych loci rDNA. U roślin, bezkręgowców i kręgowców zaobserwowano wyciszenie rDNA w całym locus^7,8,9,10, co sugeruje, że wyciszanie rDNA w całym locus jest głównym mechanizmem regulacji dawki rRNA¹¹. Transkrypcja rRNA jest kluczowym etapem regulacyjnym w produkcji rybosomów, a zmiany w transkrypcji rRNA, które modulują aktywność translacyjną, są ważną cechą zarówno normalnego różnicowania, jak i stanów chorobowych¹². Zmiany w transkrypcji locus rDNA są również związane ze zmniejszeniem całkowitej liczby kopii rDNA¹³. Tak więc zmieniona transkrypcja rDNA specyficzna dla locus może być ważnym wskaźnikiem zaburzonej fizjologii komórkowej.

Podczas gdy wyciszanie specyficzne dla locus wydaje się być głównym źródłem regulacji transkrypcji rRNA, mechanizmy ustanawiające to wyciszenie i kierujące, które loci rDNA są aktywne transkrypcyjnie, są w dużej mierze nieznane. Jednorodność sekwencji rDNA utrudnia ocenę transkrypcji poszczególnych locus rDNA, uniemożliwiając powszechną analizę aktywności transkrypcyjnej rDNA specyficznej dla locus. Wyzwanie to może być możliwe do pokonania poprzez wykorzystanie strukturalnej i pojedynczej zmienności sekwencji nukleotydowej między kopiami rDNA w tym samym genomie^4,5,6,13. Niektóre z tych wariantów mogą być wspólne dla większości lub wszystkich kopii w pojedynczym locus, tworząc unikalne haplotypy locus rDNA wielu wariantów, które odróżniają locus rDNA. Rzeczywiście, niedawne mapowanie wariantów rDNA do określonych loci przez konsorcjum telomerów ujawniło wspólne warianty rDNA specyficzne dla locus w ludzkim genomie¹⁴. Takie mapy locus rDNA mogą umożliwiać identyfikację transkrypcji specyficznej dla locus na podstawie zestawów danych sekwencjonowania; Jednak dostępność tych map jest obecnie ograniczona i nie jest łatwo je wyprodukować. Ponieważ loci rDNA znajdują się tylko na chromosomach płci u Drosophila melanogaster (po jednym locus na każdym chromosomie X i Y)¹⁵, locus rDNA chromosomu Y jest nieobecny u samic XX. Ta naturalna izolacja od locus chromosomu Y oznacza, że warianty polimorfizmu pojedynczego nukleotydu (SNP) między loci rDNA X i Y można łatwo zidentyfikować w sekwencjonowaniu z krótkim odczytem jako dowolne warianty, które są obecne u mężczyzn (XY), ale nieobecne u samic (XX). Wcześniej zidentyfikowane SNP mogą być szybko testowane w niegenotypowanych szczepach Drosophila poprzez prosty PCR i sekwencjonowanie Sangera DNA od samców i samic. Co więcej, dostępność szczepów Drosophila z chromosomem X, który nie ma locus rDNA^{16 oznacza,} że poszczególne loci rDNA X i Y mogą być indywidualnie izolowane w celu jeszcze dokładniejszej charakterystyki rDNA SNP. Ta łatwa identyfikacja wariantów SNP między loci rDNA Drosophila umożliwia określenie unikalnych haplotypów rDNA X i Y SNP¹³. Loci rDNA chromosomu X są również zazwyczaj całkowicie nieme u samców Drosophila, ale oba loci chromosomu X są transkrybowane u samic ^10,17, co czyni Drosophila użytecznym systemem do badania wyciszania rDNA w całym locus.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) to potężne narzędzie do wizualizacji obecności specyficznych sekwencji RNA lub DNA w poszczególnych komórkach tkanki. Znaczniki FISH celują w sekwencje RNA lub DNA za pomocą antysensownych sond oligonukleotydowych sprzężonych z fluoroforami. Sondy FISH zazwyczaj muszą mieć długość ~ 20 nukleotydów, aby zapewnić wystarczająco stabilne wiązanie celu, aby można je było zwizualizować, ale tak długie sondy mogą również łatwo wiązać się z sekwencjami niedocelowymi, które różnią się tylko pojedynczym nukleotydem (Rysunek 1A). I odwrotnie, sondy wystarczająco krótkie, aby nadać swoistość pojedynczemu nukleotydowi, nie wiążą się wystarczająco stabilnie do wizualizacji. Aby zrównoważyć specyficzność i stabilność, wrażliwy na SNP FISH (SNP-FISH) łączy antysensowną sondę fluorescencyjną o długości ~26 nukleotydów z niefluorescencyjnym oligonukleotydem maskującym, który wiąże się ze wszystkimi oprócz końca 5' sondy¹⁸. Ta maska pozostawia tylko 10 najbardziej 5' nukleotydów sondy jednoniciowych i dostępnych do wiązania celu (Rysunek 1B). Ta krótka, jednoniciowa część sondy nadaje specyficzność celowi, ale zapobiega reaktywności krzyżowej z RNA, które mają nawet pojedynczą niezgodność z tymi 10 nukleotydami (Rysunek 1B)". Gdy końcówka 5' sondy zwiąże swój cel, przemieszczenie nici pasywnej usuwa maskę z sondy, pozwalając obszarowi 3' związać cel i tworząc stabilne oznaczenie celu (Rysunek 1B) ¹⁸. Dlatego SNP-FISH może w różny sposób wizualizować RNA, które różnią się pojedynczym SNP, używając pary sond, które mają różne fluorofory, z których każda uzupełnia inny SNP, ale ma wspólną maskę (Figura 1C). Chociaż ta metoda rekrutuje tylko pojedynczą sondę sprzężoną z fluoroforem do docelowego SNP, łączenie wielu zestawów maski sondy do kilku SNP w ramach wspólnego haplotypu rDNA może być wykorzystane do amplifikacji wrażliwego na SNP wykrywania pojedynczego rRNA (Figura 1D). Ponadto, ponieważ rRNA jest tak obficie transkrybowane, transkrypty rRNA można łatwo wizualizować w eksperymentach FISH przy użyciu niewielkiej liczby znaczników fluorescencyjnych na RNA. To niskie zapotrzebowanie na fluorofor na RNA oznacza, że SNP-FISH może wizualizować rRNA z określonego locus z zaledwie kilkoma unikalnymi SNP. Ta metoda może łatwo wykryć specyficzną dla locus transkrypcję rRNA w różnych tkankach Drosophila i stadiach rozwojowych¹⁷. Jest szczególnie skuteczny w męskich komórkach macierzystych linii rozrodczej Drosophila, które zmieniają się między wyłączną transkrypcją Y-rDNA a koekspresją loci rDNA chromosomu X i Y podczas starzenia¹³. W tym miejscu udostępniamy protokół SNP-FISH do wizualizacji odrębnych transkryptów rRNA X i Y w jądrze Drosophila, aby osiągnąć ogólny cel, jakim jest ocena wyciszenia rRNA specyficznego dla locus. Metoda ta wykorzystuje cztery SNP wcześniej scharakteryzowane między loci rDNA na chromosomach X i Y wspólnego laboratoryjnego szczepu Drosophila y¹w¹ (Rysunek 1D).

Protocol

1. Przygotowanie i odczynników

UWAGA: W krokach 1, 3 i 4 należy stosować technikę bez RNaz i należy stosować certyfikowane odczynniki wolne od RNaz.

1. W kapturze chemicznym przygotuj 40 ml 4% formaldehydu w 1x roztworze utrwalającym PBS, dodając 10 ml 16% formaldehydu i 4 ml 10 PBS bez RNaz do 26 ml wody wolnej od RNaz. Rozprowadzić w 1 ml porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C w ciągu 30 minut od przygotowania. Roztwór utrwalający można przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 6 miesięcy.
   UWAGA: Roztwór zawiera formaldehyd. Obchodź się z nimi w rękawicach i odpowiednich środkach ochrony osobistej i bezpiecznie je zutylizuj.
2. Przygotować 10 ml buforu hybrydyzacyjnego, mieszając 1 ml 20 x RNazo-wolnego cytrynianu soli fizjologicznej (SSC), 1 g siarczanu dekstranu, 100 μl 100 mg/ml tRNA Saccharomyces cerevisiae, 100 μl 200 mM kompleksu rybonukleozydów wanadylu, 1 ml 5% BSA wolnego od RNaz, 1 ml dejonizowanego formamidu w połączeniu z 6 ml wody wolnej od RNaz. Rozprowadzić do 1 ml porcji w 1,5 ml probówkach do mikrofuge i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 1 miesiąca.
3. Przygotować 50 ml buforu do płukania, dodając 5 ml 20 x SSC bez RNaz, 5 ml dejonizowanego formamidu, 50 μl Triton-X do 40 ml wody wolnej od RNaz. Przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności do 1 miesiąca.
4. Przygotuj 10 ml buforu do izolacji DNA, dodając 100 μl 1M Tris-HCl pH 7,5-8,0, 20 μl 0,5M EDTA i 50 μl 5M NaCl do 9,8 ml wody.

2. Genotypowanie próbki dla SNP rRNA specyficznych dla X i Y

1. Zebrać pojedyncze, niekryte homozygotyczne samice i samce X posiadające ten sam chromosom X w probówkach o pojemności 0,2 ml i schłodzić na lodzie.
2. Połącz 50 μl buforu do izolacji DNA z 0,5 μl 20 mg / ml proteinazy K na próbkę.
3. Dodać 50 μl buforu do izolacji DNA / proteinazy K do próbki Drosophila i homogenizować próbkę za pomocą końcówki pipety.
4. Próbki należy inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut, a następnie w temperaturze 95°C przez 2 minuty. Przenieś 40 ml próbki (unikaj odchodów zwierzęcych) do czystej probówki o pojemności 1,5 ml.
5. Oddzielnie amplifikować każdy region docelowy SNP z każdej próbki DNA metodą PCR przy użyciu stężenia 10 μM następujących par starterów: 18S SNP do przodu + do tyłu; ITS1 SNP Do przodu + do tyłu; 28S SNP do przodu + do tyłu. Sekwencja startera i oczekiwana wielkość amplikonu PCR znajdują się w Tabeli 1.
6. Użyj elektroforezy żelowej, aby oddzielić całą próbkę PCR od 1% agarozy 1x żel TAE, aby potwierdzić oczekiwany produkt PCR. Oczekiwane rozmiary produktów podano w tabeli 1.
7. Wyizolować produkt PCR z żelu za pomocą dowolnego dostępnego na rynku zestawu do ekstrakcji żelu.
8. Sekwencjonowanie produktów PCR metodą sekwencjonowania Sangera. Sekwencjonować próbki w obu kierunkach, stosując oddzielne indywidualne reakcje dla startera F i R dla każdego celu.
9. Określić wariant SNP chromosomu X w pozycjach podanych w tabeli 2 w niedopasowanej próbce DNA samicy. Oczekiwany haplotyp X opisano w tabeli 2.
10. Obserwuj pozycje SNP w chromatogramie sekwencjonowania męskiej próbki DNA. Wywnioskuj wariant SNP chromosomu Y na podstawie już określonego wariantu X SNP w każdej pozycji SNP. Przewidywany haplotyp Y opisano w tabeli 2.

powiedział:

Nazwa podkładu	kolejność	Oczekiwany rozmiar amplikonu
18S SNP F	GACTACCATGGTTGCAACGG	652 punktów bazowych
18S SNP R	TTCACCTCTCGCGTCGTAAT
ITS1 SNP F	CTTGCGTGTTACGGTTTTTTC powiedział:	955 punktów bazowych
ITS1 SNP R	ACAGCATGGACTGCGATATG powiedział:
28S SNP F	ATGCGTAGAAGTGTTTGGCG powiedział:	598 punktów bazowych
28S SNP R	GCCGACTTCCCTTACCTACA powiedział:

Tabela 1: Sekwencje starterów do sekwencjonowania SNP rDNA. Pary starterów do amplifikacji regionów rDNA, które zawierają wcześniej scharakteryzowane SNP w regionach rDNA 18S, ITS1 i 28S. Wymieniona jest sekwencja oligonukleotydów starterowych i oczekiwana wielkość amplikonu PCR.

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział:

Haplotyp	Pozycja SNP	Sekwencja
X rDNA	18S	1603-ATACTTGTATTTTTTCATATG-1625
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAATATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAGAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGCCTAACTATAT-5954
Y rDNA	18S	1603-ATACTTGTATCTTTTCATATG-1624
	ITS1-1	2873-CGTTAATAAACATTTGTAATT-2895
	ITS1-2	3115-GAAAATCGAAAAAACAAAATT-3137
	28S	5932-AACAAAAATGGCTAACTATAT-5954

Tabela 2: Oczekiwane haplotypy rDNA. Oczekiwane SNP w loci rDNA chromosomów X i Y w szczepie y¹w¹ Drosophila. SNP zaznaczone pogrubioną czcionką i podkreślone. Pozycja wymieniona na podstawie konsensusu 45S rRNA sekwencja (plik uzupełniający 1).

3. Rozwarstwienie, utrwalenie i przepuszczalność jądra

1. Wyczyść mikroskop stereoskopowy, stację roboczą, naczynie preparacyjne i kleszcze preparacyjne 70% etanolem (lub innym zabiegiem RNazy).
2. Pod mikroskopem stereoskopowym przeprowadź sekcję Drosophila, aby wyizolować jądra w 1x PBS wolnym od RNAzy. Chwyć środek brzucha zwierzęcia jedną parą kleszczy i chwyć koniec brzucha drugą parą kleszczy, aby delikatnie rozsunąć zwierzę. Jądra odłączą się od zwierzęcia i mogą być dalej oddzielone za pomocą kleszczy. Zbierz 30 - 40 jąder na próbkę.
3. Za pomocą kleszczy podnieś jądra i przenieś je z naczynia preparacyjnego do 1,5 ml probówki do mikrofuge zawierającej 0,5 ml 1x PBS wolnego od RNaz.
4. Odessać PBS i dodać 1 ml roztworu utrwalającego. Inkubować w temperaturze pokojowej na wytrząsarce nutującej przez 30 minut. Aspirować utrwalacz
.
5. Przemyć 2x 1 ml 1x PBS bez RNaz przez 5 minut każdy na wytrząsarce nutacyjnej. Odessać 1x PBS i dodać 1 ml 70% etanolu (EtOH) bez RNaz. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc na wytrząsarce do nutowania.

4. Ryba rybosomalnego RNA wrażliwego na SNP

1. Odessać etanol i dodać 1 ml buforu do płukania. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty na wytrząsarce do nutowania, a następnie 2 minuty probówki w pozycji pionowej.
2. Wymieszaj sondy i maski z buforem hybrydyzacyjnym, uzyskując 100 μl całkowitej objętości na próbkę. Sekwencje sondy, maski i etykiety fluoroforowe są wymienione w Tabeli 3. Używając wszystkich 4 SNP, przygotuj 80 μl buforu hybrydyzacyjnego, po 1 μl każdej z 10 μM Y-SNP sondy (łącznie 4 μL), po 1 μL każdej z 10 μM X-SNP sondy (łącznie 4 μL) i 3 μL po 10 μM wspólnej maski (łącznie 12 μL)
3. Odessać bufor do płukania, a następnie dodać 100 μl roztworu hybrydyzacyjnego. Na krawędzie probówki nałożyć przezroczystą folię, owinąć folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez co najmniej 24 godziny.
4. Dodać 1 ml buforu do przemywania do próbki bez zasysania roztworu hybrydyzacyjnego. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
5. Odessać bufor do przemywania się, a następnie dodać 1 ml buforu do przemywania do próbki. Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut w ciemności.
6. Odessać bufor do przemywania i dodać 50 μl podłoża montażowego. Próbki można natychmiast zamontować na szkiełkach podstawowych lub przechowywać do 1 tygodnia w temperaturze 4 °C przed montażem.

Pozycja SNP	Oligonukleotyd	Sekwencja		3' sprzężony fluorofor
18S	Sonda X SNP	AAAAAATACAAGTATTTAATCACATA		Asystent 488
	Sonda Y SNP	AAAAGATACAAGTATTTAATCACATA		Asystent 647
	maska	TATGTGATTAAATACT
ITS1-1	Sonda X SNP	AAATATTTATTAACGGTAAGGATATT		Asystent 488
	Sonda Y SNP	AAATGTTTATTAACGGTAAGGATATT		Asystent 647
	maska	AATATCCTTACCGTTA
ITS1-2	Sonda X SNP	GTTTCTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Asystent 488
	Sonda Y SNP	GTTTTTTCGATTTTCATGTTCGAAAC		Asystent 647
	maska	GTTTCGAACATGAAAA
28S	Sonda X SNP	TTAGGCATTTTTTTTTTTTACTTGAAAA		Asystent 488
	Sonda Y SNP	TTAGCCATTTTTTTTTTTTACTTGAAAA		Asystent 647
	maska	TTTTCAAGTAAAACAA

Tabela 3: Sekwencje sondy i maski dla rDNA SNP-FISH. Pozycje SNP są wyróżnione pogrubioną czcionką. Część sondy, która wiąże się z oligonukleotydem maski, jest podkreślona. Wymienione są przykłady odpowiednich fluoroforów sprzężonych 3', ale można użyć dowolnych kompatybilnych fluoroforów.

5. Przygotowanie próbek do obrazowania

1. Pracując pod stereoskopowym mikroskopem preparacyjnym, użyj pipety o szerokim otworze, aby przenieść próbkę na szkiełko mikroskopowe.
2. Za pomocą kleszczyków ułóż jądra w linii, aby ułatwić znalezienie próbek podczas obrazowania (nie jest wymagana określona orientacja). Przykryj próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Osusz krawędzie szkiełka nakrywkowego chusteczką higieniczną, aby usunąć nadmiar podłoża montażowego.
3. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełko w ciemności w temperaturze pokojowej na 10 minut, aby lakier do paznokci wyschł. Preparaty mogą być używane natychmiast do obrazowania konfokalnego lub przechowywane przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C przed obrazowaniem^.

Results

Wyniki sekwencjonowania z genotypowania SNP powinny wykryć różnice SNP między loci rDNA X i Y. Te SNP są wykrywane poprzez bezpośrednią ocenę pozycji SNP w chromatogramach sekwencjonowania (Rysunek 2)". Oczekuje się, że sekwencjonowanie próbek żeńskich będzie miało pojedynczy sygnał sekwencjonowania w pozycji SNP, wskazujący na homozygotyczność SNP między dwoma chromosomami X (Figura 2A). Oczekuje się, że wyniki sekwencjonowania próbki męskiej będą miały podwójny pik w pozycji SNP (Rysunek 2B)". Na podstawie genotypu chromosomu X określonego na podstawie sekwencjonowania próbki żeńskiej, wariant inny niż X wnioskuje się o SNP rDNA chromosomu Y (tj. X = T, Y = C dla sekwencjonowania SNP 18S w Figura 2). Alternatywnie, pojedynczy pik sekwencjonowania w pozycji SNP w próbce męskiej wskazywałby na homozygotyczność między męskimi i żeńskimi loci rDNA w tej pozycji SNP, a pozycja ta nie byłaby użyteczna dla ryb rRNA SNP.

Zgodnie z protokołem dla SNP FISH, próbki mogą być wizualizowane poprzez montaż na szkiełkach i umieszczanie pod szczelnym szkiełkiem nakrywkowym, a następnie za pomocą mikroskopii konfokalnej. Za pomocą sond wymienionych w tabeli 3 sygnał rRNA pochodzący z Y jest wykrywany przez emisję Alexa Fluor 647, a sygnał rRNA pochodzący z X jest wykrywany przez emisję Alexa Fluor 488. Oczekuje się, że sygnały rRNA zostaną zaobserwowane w jąderku, które można zidentyfikować jako dziurę w jądrze o niskim poziomie DAPI (Rysunek 3A). Jąderko jest szczególnie łatwe do zidentyfikowania w komórkach rozrodczych ze względu na ich duże jądro i jąderko (Rysunek 3A). Słaby sygnał można zwykle znaleźć również w cytoplazmie (Rysunek 3), ale jest to sygnał niespecyficzny, który można również wykryć w próbkach bez rRNA zawierających komplementarne SNP (tj. sygnał Y w komórkach bez Y rDNA lub sygnał X w komórkach bez X rDNA; Rysunek 3B-C). Co więcej, sztuczne koznakowanie X i Y rRNA można czasami wykryć w piaście somatyki, nawet w próbkach pozbawionych loci rDNA X lub Y (Rysunek 3B-C, żółte strzałki). W związku z tym do oceny transkrypcji specyficznej dla locus należy używać tylko sygnałów jądrowych. Oczekuje się, że większość komórek, szczególnie komórek somatycznych, będzie miała tylko sygnał Y rRNA, co wskazuje, że rRNA jest transkrybowane wyłącznie z locus Y rDNA (Rysunek 3A, żółte kropkowane kółko i czerwona strzałka) ^10,17. Jednak koekspresja X i Y rRNA jest często wykrywana w komórkach rozrodczych, szczególnie w komórkach macierzystych linii rozrodczej¹³ (Figura 3A, białe kropkowane kółka). Sygnały rRNA X i Y w komórkach wykazujących współekspresję mogą sąsiadować i tworzyć pojedyncze jąderko (Figura 3A górna komórka) lub mogą być oddzielone, tworząc dwa jąderka ( Figura 3A dolna komórka). Przykłady w Rysunek 3 pochodzą z rDNA SNP-FISH przy użyciu zestawów sond ukierunkowanych tylko na dwa SNP (dwa SNP ITS1), pokazując, że tylko dwa SNP są niezbędne dla rDNA SNP-FISH. Jednak bardziej niezawodne sygnały są obserwowane podczas korzystania z sond ukierunkowanych na wszystkie cztery SNPs¹³.

Kontrole ujemne są ważnym elementem tego testu, aby potwierdzić, że sondy nie reagują krzyżowo z niewłaściwym celem SNP, zwłaszcza podczas pierwszego rozwiązywania problemów z metodą. Ujemne kontrole chromosomu X obejmują każdy stan, w którym brakuje rDNA chromosomu X, taki jak mężczyźni posiadający chromosom X z delecją rDNA. Oczekuje się, że kontrole ujemne chromosomu X wykryją tylko sygnał Y rRNA i nie wykryją X rRNA (Figura 3B). Kontrole ujemne chromosomu Y obejmują każdy stan, w którym brakuje rDNA chromosomu Y. Niektóre przykłady tych stanów to dowolne tkanki żeńskie XX, tkanki mężczyzn bez chromosomu Y lub mężczyźni posiadający chromosom Y z delecją rDNA¹⁵. Oczekuje się, że kontrole ujemne chromosomu Y wykrywają tylko sygnał X rRNA i nie mają wykrywalnego sygnału Y rRNA (Rysunek 3C). Należy pamiętać, że te kontrolki są ważne nie tylko dla określenia specyficzności sondy, ale także dla określenia tła sygnału lub artefaktów. Wszelkie nowe sondy lub warunki testowe, które zapewniają swoistość w takich kontrolach, mogą być dokładnie wykorzystane do wykrywania transkrypcji rDNA specyficznej dla locus.

Różne warunki genetyczne, rozwojowe lub środowiskowe mogą zmienić prawdopodobieństwo, że rDNA jest transkrybowane wyłącznie z locus rDNA chromosomu Y^13,17. Częstotliwość transkrypcji rDNA z pojedynczego locus lub wielu loci można określić ilościowo i bezpośrednio porównać między próbkami. Aby ilościowo porównać różnice w transkrypcji locus rDNA, każda komórka musi być indywidualnie sklasyfikowana jako dominująca Y, współdominująca lub dominująca X. Komórki są klasyfikowane jako dominujące Y i X tylko wtedy, gdy zostanie wykryty odpowiedni sygnał. Każda komórka z sygnałami rRNA Y i X jest uważana za współdominującą, nawet jeśli jeden sygnał jest znacznie słabszy od drugiego. Tak więc komórki zawierające bardzo silne sygnały X i Y są jakościowo uważane za takie same jak komórki z silnymi sygnałami Y i słabymi X lub silnymi X i słabymi sygnałami Y. Całkowity procent wszystkich komórek we wszystkich próbkach w każdej kategorii można porównać między próbkami za pomocą testu chi-kwadrat. Chociaż ten test działa dobrze w celu jakościowego określenia, czy dany locus rDNA jest transkrybowany, czy nie, nie zaobserwowaliśmy spójnych ocen między próbkami podczas bezpośredniego ilościowego określania intensywności fluorescencji poszczególnych sygnałów SNP-FISH. W związku z tym nie zalecamy dokonywania ilościowych ocen intensywności sygnału FISH między próbkami lub względnej intensywności sygnałów rDNA X i Y w pojedynczej komórce. Źródło tej niespójności w intensywności fluorescencji jest niejasne, choć może to wynikać z nieefektywnego wiązania maskowanych sond, które nie wiążą się ze wszystkimi docelowymi rRNA.

Rysunek 1: Schemat metody SNP-FISH. (A) Tradycyjne antysensowne sondy oligonukleotydowe FISH reagują krzyżowo z niedocelowymi RNA, które różnią się tylko jednym nukleotydem. (B) Metoda SNP-FISH wykorzystuje komplementarny oligonukleotyd maski związany z regionem 3' sondy oligonukleotydowej. Maska pozostawia tylko 10 nukleotydów wolnych do związania się z sekwencją docelową. Niezamaskowany obszar sondy nie wiąże się stabilnie z sekwencjami niedocelowymi, które różnią się jednym lub kilkoma nukleotydami. Maska oddziela się od sondy po związaniu sondy z celem, umożliwiając stabilne wiązanie między sondą a celem. (C) Różnie znakowane sparowane sondy SNP w połączeniu ze wspólną maską specyficznie wiążą cele, które różnią się pojedynczym nukleotydem bez reakcji krzyżowej. (D) Wiele sond można połączyć ze sobą, aby specyficznie oznaczyć różne haplotypy rRNA. Scharakteryzowano cztery różnice SNP między loci rDNA X i Y w szczepie y¹w¹ Drosophila melanogaster. Jeden SNP w 18S rRNA, jeden w 28S rRNA i dwa w części ITS1 pre-rRNA. Wyświetlane są haplotypy rRNA specyficzne dla X i Y stosowane w SNP-FISH. Sondy ukierunkowane na wariant X rDNA w czterech SNP rRNA są sprzężone ze wspólnym fluoroforem (zielony), a sondy ukierunkowane na warianty Y rDNA są sprzężone z innym fluoroforem (magenta). Dla każdego SNP używana jest wspólna maska (w sumie cztery). Wiązanie sondy specyficzne dla SNP w każdej pozycji SNP na rRNA może specyficznie znakować rRNA z loci rDNA X i Y za pomocą maksymalnie czterech sond oligonukleotydowych FISH. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Przykłady wyników sekwencjonowania SNP homozygotycznego i heterozygotycznego rDNA. Przykładowe chromatogramy sekwencjonowania z sekwencjonowania 18S SNP DNA z (A) próbek żeńskich i (B) męskich. Pozycja SNP 18S oznaczona gwiazdką (*). Pojedynczy sygnał tyminy (T) dla pozycji SNP w próbce żeńskiej wskazuje na tyminę w pozycji SNP w locus rDNA chromosomu X. Podwójny sygnał w pozycji SNP podzielony między tyminę i cytozynę (C) w próbce męskiej wskazuje na cytozynę w pozycji SNP w locus rDNA chromosomu Y (wywnioskowany, wiedząc, że tymina znajduje się w locus chromosomu X). Wyniki sekwencjonowania przeglądano za pomocą ApE – edytora plazmidów¹⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Przykłady wyników SNP-FISH w jądrze Drosophila przy użyciu tylko dwóch zestawów sond SNP-FISH. Przykłady SNP FISH w jądrach zwierząt z (A) zarówno X, jak i Y rDNA, (B) tylko Y rDNA lub (C) tylko X rDNA. W tych przykładach użyto tylko zestawów sond znakujących dwa SNP rRNA ITS1, co pokazuje, że rRNA SNP FISH działa z zaledwie dwoma docelowymi SNP. Komórki rozrodcze są identyfikowane przez ich duże okrągłe jądro, a komórki somatyczne po ich mniejszym i mniej okrągłym jądrze. Komórki macierzyste linii rozrodczej identyfikuje się na podstawie ich położenia bezpośrednio przy węźle somatycznym, oznaczonego gwiazdką (*). Komórki rozrodcze, które transkrybują rDNA zarówno z loci rDNA X, jak i Y, są identyfikowane zarówno przez sygnały jądrowe FISH X, jak i Y (białe kropkowane kółka, AA''). Komórki rozrodcze, które transkrybują DNA tylko z locus Y rDNA, mają tylko Y jądrowy sygnał FISH (żółte przerywane kółko). Komórki somatyczne wykazujące ekspresję Y są oznaczone czerwoną strzałką. Sztuczne koznakowanie loci rDNA X i Y można zaobserwować w piaście somatycznym (żółta strzałka). Podziałka wynosi 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: sekwencja rRNA locus chromosomu X. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

W tym miejscu opisano metodę wykorzystania SNP-FISH do rozróżnienia transkryptów 45S rRNA pochodzących z loci rDNA chromosomów X i Y w tkankach Drosophila melanogaster . Najważniejszym krokiem w tym protokole jest dokładne genotypowanie SNP 45S, które mają być wykorzystane jako cele SNP-FISH. Zapewniamy startery i protokół do genotypu czterech znanych SNP Drosophila 45S, ale inne metody sekwencjonowania mogą ujawnić nowe SNP, które można alternatywnie wykorzystać do testu. Żadne pozycje SNP, które okazały się identyczne między loci rDNA chromosomu X i Y (tj. w próbkach męskiego DNA, występuje pojedynczy pik sekwencjonowania) nie mogą być stosowane dla SNP FISH. Może się okazać, że niektóre pozycje SNP są niejednorodne w obrębie pojedynczego locus rDNA (tj. wyniki sekwencjonowania nie dają pojedynczego wariantu SNP dla próbek XX lub tylko bardzo niewielki drugi pik sekwencjonowania w próbkach XY). SNP, które są heterogenne w obrębie pojedynczego locus rDNA, również nie nadają się do tego testu, ponieważ jeden z wariantów byłby współdzielony przez dwa loci rDNA, co sprawia, że transkrypcja z jednego locus lub wielu loci jest nie do odróżnienia. Ponadto, ze względu na magazynowanie nasienia u samic²⁰, DNA wyizolowane od pokrytych samic może zawierać rDNA chromosomu Y. Dlatego tak ważne jest, aby niekryte samice były wykorzystywane do analizy sekwencjonowania XX. Co ważne, metoda ta wymaga co najmniej dwóch SNP specyficznych dla chromosomów, aby umożliwić co najmniej dwóm sondom specyficznym dla locus związanie każdej cząsteczki rRNA w celu wykrycia, ograniczając jej zastosowanie do loci rDNA z co najmniej dwoma rozróżniającymi SNP między nimi. Dostępność większej liczby SNP pozwala na wiązanie każdego rRNA przez większą liczbę sond i może zapewnić większą skuteczność sygnału. Co ciekawe, metoda ta znakuje tylko rRNA w jąderku, pomimo dwóch par sond celujących w SNP w 18S i 28S rRNA, które są eksportowane do cytoplazmy (rRNA zawierające dwa miejsca docelowe ITS1 występuje tylko w jąderku). Brak cytoplazmatycznego sygnału FISH sugeruje dwie niewyłączne możliwości: 1) same sondy 18S i 28S są niewystarczające do wykrycia cytoplazmatycznego rRNA, być może dlatego, że rRNA jest bardziej rozproszone w cytoplazmie niż w jąderku, lub 2) istnieje niższa wydajność wiązania sondy z rRNA zintegrowanymi z dojrzałymi podjednostkami rybosomalnymi niż z nieprzetworzonym 45S rRNA. Dodatkowe SNP w obrębie 18S i 28S rRNA mogą umożliwić wrażliwe na SNP wykrywanie cytoplazmatycznych rRNA przez FISH.

Inne metody oceny transkrypcji rRNA specyficznej dla locus obejmują podejścia sekwencjonowania rRNA, które różnicują ekspresję wariantów rRNA przypisanych do określonych loci⁶. Podobnie, qPCR może w różny sposób oceniać ekspresję wariantów rRNA, które są wystarczająco wyraźne, aby umożliwić unikalne wykrycie ^5,21, chociaż nie jest jasne, czy wyciszenie tych wariantów reprezentuje wyciszenie całego locus rDNA. Chociaż metody te mogą być skuteczne w ilościowym określaniu ekspresji określonych wariantów rRNA, nie można ich wykonać w rozdzielczości pojedynczej komórki. Niejednorodność wyciszania rDNA chromosomu X w tkankach Drosophila sugeruje, że istnieje silna zmienność między komórkami w transkrypcji locus rDNA¹⁷ i podkreśla potrzebę technik, które mogą wyjaśnić tę zmienność. Cechy obrazowania związane z aktywną transkrypcją w loci rDNA, takie jak wariant histonu H3.3¹⁰ lub czynnik transkrypcyjny Pol I UBF²², zostały wykorzystane do identyfikacji transkrypcji rRNA specyficznej dla locus z rozdzielczością pojedynczej komórki. Jednak obie te metody wymagają skondensowanych chromosomów komórek mitotycznych w celu odróżnienia transkrypcji zachodzącej w dowolnym konkretnym locus rDNA. W komórkach Drosophila loci rDNA na chromosomach X i Y można zidentyfikować na podstawie kształtu chromosomu¹⁰, ale identyfikacja aktywnych transkrypcyjnie loci rDNA w komórkach ludzkich wymaga również współbarwienia z etykietami specyficznymi dla chromosomów²². Metoda SNP-FISH nie wymaga ani wspólnego znakowania specyficznego dla chromosomu, ani znakowania markerów transkrypcyjnych i może być oceniana na dowolnym etapie cyklu komórkowego lub w komórkach postmitotycznych, co zapewnia elastyczność stosowania w różnych tkankach i warunkach eksperymentalnych.

Ta metoda rRNA SNP-FISH może być zmodyfikowana do stosowania z innymi SNP, które rozróżniają rRNA Drosophila lub potencjalnie może być stosowana do SNP, które rozróżniają loci rDNA w innych organizmach. Zastosowanie tej metody do organizmów z więcej niż dwoma loci rDNA będzie wymagało, aby locus miał unikalny haplotyp wariantu rDNA zawierający co najmniej dwa SNP, które nie są obecne w żadnym innym locus rDNA i które są wspólne dla wszystkich kopii 45S w tym locus. Wymóg ten oznacza, że metoda będzie w stanie określić transkrypcję tylko z jednego określonego locus w porównaniu ze wszystkimi innymi (tj. SNP rRNA z locus 1 w porównaniu z SNP współdzielonymi przez loci 2 i 3). Jeśli jednak każdy locus rDNA ma zgodny haplotyp, wiele eksperymentów można połączyć, aby indywidualnie ocenić transkrypcję każdego locus pojedynczo. Stosunkowo niska rygorystyczność temperatury hybrydyzacji (37 °C) zastosowana w tym protokole pozwala na silne wiązanie sondy, szczególnie biorąc pod uwagę krótką, niezamaskowaną część sondy, chociaż wykazano, że hybrydyzacja w wyższych temperaturach (50-75 °C) wzmacnia sygnał niektórych sond FISH²³. Wyższe temperatury hybrydyzacji mogą zwiększyć przemieszczenie nici maski i zwiększyć wiązanie sondy, ale zbyt wysokie temperatury mogą zdestabilizować wiązanie sonda-maska i stracić specyficzność SNP. Z tego powodu nie oczekujemy, że SNP-FISH będzie specyficznie znakować DNA, ponieważ temperatury potrzebne do stopienia dwuniciowych celów DNA, aby umożliwić wiązanie sondy, zdestabilizowałyby również wiązanie sonda-maska i wyeliminowały specyficzność celu wrażliwego na SNP. Mimo to optymalizacja temperatury hybrydyzacji dla nowych sond SNP rRNA może zwiększyć sygnał, szczególnie gdy dostępne są tylko dwa miejsca SNP. Utrata wyciszenia rDNA chromosomu X wiąże się ze zmniejszeniem liczby kopii rDNA u Drosophila¹³, więc opracowanie testów SNP-FISH w celu scharakteryzowania transkrypcji rRNA specyficznej dla locus w innych systemach może służyć jako użyteczne narzędzie do oceny integralności rDNA i funkcji rybosomów. Co więcej, metoda ta została zmodyfikowana do stosowania z wariantem delecji u Drosophila, a ten pojedynczy strukturalny wariant rRNA był odpowiedni do wykrycia (być może ze względu na większe powinowactwo wiązania celu bez maski sondy)¹⁷. Zastosowanie strukturalnych wariantów rRNA potencjalnie połączonych z wariantami SNP poszerza potencjał do zastosowania w innych układach. Ponieważ mechanizmy regulujące transkrypcję locus rDNA pozostają w dużej mierze niejasne, elastyczność i potencjalna zdolność adaptacji rRNA SNP-FISH do innych systemów sprawiają, że jest to potężne narzędzie do przyszłych badań nad transkrypcją rRNA.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PTC Tempo 96 Thermal Cycler	Bio Rad	12015382	Można użyć dowolnego termocyklera
0,2 ml 8-paskowe płaskie probówki PCR	VWR	89133-912	Można użyć dowolnych kompatybilnych probówek
1 kb Drabinka DNA	NEB	N3232S	Do użycia podczas sprawdzania sekwencjonowania Wielkość amplikonu PCR za pomocą elektroforezy żelowej
1,5 ml Probówki do mikrowirówek z podziałką	USA Scientific	1615-5510	Każda certyfikowana probówka wolna od RNaz zrobi
2 mM dNTP Mix	ThermoFisher Scientific	R0241
50x TAE Buffer	Bio Rad	1610743	Służy do elektroforezy żelowej. Można użyć dowolnego bufora TAE.
5M NaCl			Każdy NaCl może być używany lub przygotowywany z dowolnego źródła
Agaroza	VWR	97064-250	Można użyć dowolnej agarozy
ApE - A Oprogramowanie do edycji plazmidów	N/A	N/A
Bezbarwny lakier			Można użyć dowolnego lakieru do paznokci z dowolnego sprzedawcy
Szkło nakrywkowe, nr 1 Grubość	Thomas Scientific	6672A38
Dejonizowany formamid	Fisher Scientific	NC9569627
Siarczan dekstranu Sód	Sigma Aldrich	D8906-10G
DreamTaq Green PCR Master Mix	Kleszcze ThermoFisher Scientific	K1081
Dumont #5	Fine Science Tools	11252-20	Służy do preparowania próbek
EDTA (0,5 M), Ph 8,0	ThermoFisher Scientific	R1021	Można użyć dowolnego porównywalnego produktu
Etanol	VWR	89125-172	Można użyć dowolnego 200-procentowego etanolu. Służy do rozcieńczania do 70% etanolu w celu przepuszczalności i czyszczenia w warunkach wolnych od rnazy
Bromek etydyny	ThermoFisher Scientific	15585011
Poziomy system elektroforezy żelowej	Fisher Scientific	14-955-170	Można użyć dowolnego systemu elektroforezy żelowej
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Naczynie do barwienia mikrotestowego	Electron Nauki mikroskopowe	71564	Służy do preparowania próbek
Wytrząsarka do nutowania	Sigma Aldrich	BMSB3D1020	Można użyć dowolnej wytrząsarki do nutowania
Parafilm	USA Scientific	3023-4526
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (10X) pH 7,4, bez RNaz	Technologies	AM9624
Pierce 16% Formaldehyd (w/v), bez metanolu	Life Technologies	28908
Precision General Purpose Water Bath	Life Technologies	TSGP02	Można użyć dowolnej kąpieli wodnej
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick	Qiagen	28704	Można użyć dowolnego zestawu do ekstrakcji żelu
Rekombinowany roztwór proteinazy K (20 mg / ml)	Invitrogen	AM2546	Można użyć dowolnego porównywalnego produktu
rnazy UltraPure BSA	ThermoFisher Scientific	AM2618
S. cerevisiae tRNA	Sigma Aldrich	R8759
SSC (20X), bez RNaz	Fisher Scientific	AM9763
Triton-X 100	Life Technologies	A16046.AE
UltaPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7,5	ThermoFisher Scientific	15567027	Można użyć
dowolnego porównywalnego produktuUltraPure DNazo/RNaz Technologie życia w wodzie destylowanej		10977023
kompleks rybonukleozydów wanadylu	Nośniki	montażowe NEB S1402S
VECTASHIELD z DAPI	Vector Laboratories	H-1200-10
Szkiełko mikroskopowe VWR Superfrost	VWR	48311-601
y[1]w[1] linia Drosophila melanogaster	Bloomington Drosophila Stock Center	1495
Mikroskop konfokalny Zeiss LSM 980	Mikroskopia		Można użyć dowolnego mikroskopu konfokalnego z kompatybilną emisją i detekcją
Mikroskop stereoskopowy Zeiss Stemi 2000-C i mikroskop źródła światła	455053	centralny	Można użyć dowolnego steromikroskopu