Artykuł metodologiczny

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

DOI:

10.3791/67889

⸱

14 lutego 2025

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Medicine, Creighton University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeniesienie jatrogennej choroby prionowej nastąpiło z zanieczyszczonych narzędzi neurochirurgicznych, materiałów do przeszczepów i narażenia zawodowego na narzędzia laboratoryjne skażone prionami. Priony wywołują chorobę poprzez nieprawidłowe fałdowanie normalnej formy komórkowej białka prionowego, PrPC, do nieprawidłowo sfałdowanej i patogennej formy PrPSc i są niezmiennie śmiertelne. Ograniczenie jatrogennej i zawodowej transmisji prionów jest wyzwaniem. Po pierwsze, priony mogą wiązać się z powierzchniami i utrzymywać się na nich przez długi czas. Po drugie, priony są wysoce odporne na inaktywację. Biorąc to pod uwagę, powierzchnie mogą zachować zakaźność przez długi czas po nieskutecznej dekontaminacji. Może to nie tylko stanowić potencjalne ryzyko zawodowe dla pracowników laboratoriów prionowych, ale może potencjalnie zanieczyścić krzyżowo eksperymenty laboratoryjne wykorzystujące wrażliwe techniki amplifikacji prionów. Opisany tutaj protokół laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów obejmuje kroki identyfikacji i dokumentowania obszarów laboratoryjnych o dużym natężeniu ruchu, zalecane kontrole wymazów w celu zapewnienia ważności wyników, kroki mające na celu określenie właściwych reakcji na dodatnie miejsca pobierania wymazów powierzchniowych, reprezentatywne wyniki testów prionowych, a także potencjalne wyniki artefaktów. Ogólnie rzecz biorąc, laboratoryjny test bezpieczeństwa prionów może być wdrożony jako część szerszego programu bezpieczeństwa prionów w celu oceny dekontaminacji powierzchni, monitorowania przestrzeni wspólnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i wdrożenia dokumentacji stanu dekontaminacji prionowej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby prionowe są niezmiennie śmiertelnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, na które nie ma znanego leczenia ani lekarstwa. Choroby prionowe są wywoływane przez PrPSc, nieprawidłowo sfałdowaną i patogenną formę normalnej komórkowej formy białka prionowego1,2,3,4,5, PrPC. Wiadomo, że choroby prionowe dotykają ludzi i kilka innych gatunków zwierząt. Jedna z ludzkich chorób prionowych, choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), ma trzy znane etiologie: sporadyczną, dziedziczną i nabytą. Nabyta CJD może wystąpić w wyniku przypadkowej transmisji (jatrogennej i zawodowej) i uważa się, że jest przyczyną Kuru u ludów Fore z Papui-Nowej Gwinei6.

Transmisja prionów została powiązana z urządzeniami medycznymi skażonymi prionami i materiałami do przeszczepów7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Jatrogenne przenoszenie CJD może nastąpić przez krew, tkankę lub z powierzchni skażonych prionami18,19,20. Na przykład, jatrogenna CJD może rozwinąć się u pacjentów po elektroencefalogramie z elektrodami wcześniej stosowanymi u osoby w fazie przedklinicznej CJD, która następnie uległa CJD21. Nowsze przypadki przenoszenia zawodowego w laboratoriach miały również miejsce, gdy pracownik laboratorium zaraził się chorobą prionową poprzez nakłucie skóry kleszczami używanymi do dotykania wycinków mózgu zwierzęcia zarażonego zaadaptowanym przez owce BSE22,23. Takie scenariusze transmisji mogą wystąpić w warunkach klinicznych, laboratoryjnych i diagnostycznych, w których przetwarzane są próbki prionów.

Priony są odporne na powszechne techniki dezynfekcji i mogą utrzymywać się i pozostawać zakaźne na powierzchniach przez dłuższy czas24,25,26,27,28,29. Powszechne techniki dezynfekcji, takie jak stosowanie etanolu, fenolowych środków czyszczących, nadtlenku wodoru, różnych form promieniowania i formaldehydu, są niewystarczające do inaktywacji prionów, co pozwala powierzchniom zachować zakaźność30,31,32,33,34,35,36,37. Cechy te przyczyniają się do przenoszenia prionów podczas narażenia jatrogennego i zawodowego.

Metody wykrywania prionów środowiskowych zostały opracowane dopiero niedawno. Metoda pobierania wymazów środowiskowych w połączeniu z konwersją wywołaną wstrząsem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC) może ocenić resztkową zakaźność prionów z powierzchni środowiskowych, a także zwykłych powierzchni laboratoryjnych po nieskutecznej dezynfekcji38,39,40,41,42. Tutaj opisujemy, w jaki sposób ta technika może zostać włączona do szerszego programu bezpieczeństwa prionowego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może pozwolić na monitorowanie protokołów dezynfekcji zależnych od laboratorium, badanie i właściwe dokumentowanie stanu skażenia, co może pomóc w zapewnieniu ważności eksperymentów poprzez minimalizację zanieczyszczenia krzyżowego, ocenę przestrzeni wspólnego użytku pod kątem zanieczyszczenia prionami i pozwala na kierunkowe przeszkolenie personelu w oparciu o powszechnie skażone obszary.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone i zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Creighton.

UWAGA: Schematyczny przegląd testu laboratoryjnego bezpieczeństwa prionów jest pokazany w Rysunek 1.

1. Wybór miejsc pobierania wymazów i przygotowanie do pobierania wymazów powierzchniowych

  1. Zidentyfikuj i oznacz odpowiednie obszary nadzoru do pobierania wymazów. Zapoznaj się z dostarczonym szablonem w celu uzyskania dokumentacji i odniesienia (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1).
  2. Przygotuj dwie probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego ze zidentyfikowanych obszarów. Dodać 250 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej firmy Dulbecco do pierwszego zestawu probówek do mikrowirówek do użycia w kroku 3.2. Niech drugi zestaw probówek do mikrowirówek pozostanie pusty do użycia w kroku 4.3.
  3. Wyjmij waciki z piankową końcówką z przechowywania w miejscu wolnym od zanieczyszczenia prionowego.
  4. Przygotuj butelkę do wyciskania z wodą Milli-Q (MQ H2O) do użycia w kroku 2.1.

2. Przygotowanie wymazu z kontroli dodatniej i ujemnej

  1. Przygotować rozcieńczenia do kontroli wymazów dodatnich i ujemnych, stosując odpowiednie typy kontroli. Przykład: W celu kontroli pozytywnej przygotuj 1% rozcieńczenie homogenatu mózgu zakażonego prionami w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Do celów kontroli ujemnej należy przygotować 0,1% rozcieńczenie niezakażonego (UN) homogenatu mózgu (BH) tego samego gatunku, co kontrola pozytywna w DPBS.
  2. Używając czystych rękawiczek, wyjmij odpowiednią liczbę wacików z czystego opakowania i umieść uchwyt do dołu w stojaku na probówki, uważając, aby rozmieścić waciki piankowe tak, aby końcówki nie stykały się z innymi wacikami lub powierzchniami. Dla każdej próbki kontrolnej należy przygotować trzy waciki. Zmieniaj rękawice między każdą próbką.
  3. Trzymając za uchwyt czysty wacik piankowy, nałóż 50 μl odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej na końcówki wacika piankowego. Upewnij się, że nakładasz na obie strony końcówki wacika, aby zapewnić całkowite wchłonięcie.
    UWAGA: Zawsze zmieniaj rękawiczki przed wyjęciem czystego wacika ze stojaka na probówki.
  4. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.
  5. Kontynuować nakładanie próbek kontrolnych po zmianie rękawiczek, aż wszystkie próbki zostaną nałożone.

3. Wymazywanie powierzchni

  1. Trzymając czysty wacik z piankową końcówką za uchwyt, zwilż piankową końcówkę MQH 2O i strząśnij nadmiar. Umieść zwilżoną piankową końcówkę wacika na obszarze wybranym do nadzoru i przetrzyj obszar w przód iw tył około dziesięć razy, jednocześnie obracając końcówkę wacika na powierzchni.
  2. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.
  3. Wyrzuć rękawice i załóż nowe rękawice przed każdym odpowiednim miejscem pobrania wymazu, aby zminimalizować prawdopodobieństwo zanieczyszczenia krzyżowego.
  4. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie obszary wybrane do nadzoru zostaną pobrane wymazy.

4. Ekstrakcja wymazów i zagęszczenie próżni

UWAGA: Włącz koncentrator podciśnienia 30 minut przed użyciem, aby umożliwić rozgrzanie instrumentu.

  1. Umieść probówki do mikrowirówek w okrągłym stojaku na probówki. Umieść stojak na probówki do mikrofuge w łaźni wodnej z tubą kubkową. Upewnij się, że waciki piankowe w DPBS w probówkach do mikrowirówek znajdują się pod powierzchnią wody w rogu kubka (część uchwytu nie musi być zanurzona). Zastosuj następujące ustawienia: Całkowity czas pracy 15 s (5 s wł., 5 s wyłączony) przy ~75-85 watach.
  2. Po sonikacji należy odwirować probówki przez około 15 sekund, aby zebrać DPBS na dnie probówki przed przeniesieniem.
  3. Za pomocą pipety P1000 ustawionej na 250 μl ostrożnie zebrać cały płyn (ekstrakt z wacika) z dna probówki do mikrowirówki i przenieść do odpowiedniej probówki do mikrowirówki z drugiego, pustego, wstępnie oznakowanego zestawu. Użyj końcówki pipety, aby wycisnąć nadmiar płynu z końcówki piankowej. Wyrzuć puste probówki zawierające waciki.
  4. Ustaw następujące ustawienia koncentratora próżniowego: Temperatura: 45 °C, Czas nagrzewania: 15 min, Czas pracy: 2 h, Próżnia: 5.1.
  5. Umieść probówki do mikrowirówek zawierające ekstrakty wacików w koncentratorze próżniowym, upewniając się, że probówki są wyważone, a wszystkie nakrętki probówek otwarte.
  6. Po zakończeniu cyklu upewnić się, że próbki są całkowicie zagęszczone (pozostaje tylko osad). Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania w RT-QuIC.
    UWAGA: W niektórych przypadkach może być wymagany dodatkowy czas koncentracji próżni, aby zapewnić pełne stężenie. Usunąć wszystkie skoncentrowane próbki, pozostawiając tylko probówki, które nadal zawierają płyn. Zrównoważyć pozostałe probówki w koncentratorze i pracować w dodatkowych odstępach 1-godzinnych, aż próbki zostaną całkowicie zagęszczone.

5. Przygotowanie kontroli pobierania wymazów do użycia w RT-QuIC

UWAGA: Kontrole RT-QuIC powinny być przeprowadzone przed testem ekstraktów z wymazów środowiskowych, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia podczas procedur pobierania wymazów, ekstrakcji lub koncentracji. Aby zapoznać się z przykładowymi układami, zobacz Rysunek 3 i Rysunek 4.

  1. Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną RT-QuIC (np. niezakażony homogenat mózgu [UN BH]) przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1%SDS/PBS). Przygotować dodatnie rozcieńczenie kontrolne płytki, rozcieńczając homogenat mózgu zakażony prionami do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.
  2. Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika kontrolnego z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić każdy z 50 μl MQ H2O, pipetując w górę i w dół około 10 razy, a następnie krótko wirując. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej (RT) podczas wykonywania pozostałych kroków.
  3. Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym kontroli ujemnych na płytkach (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu).
  4. Załadować 2 μl każdej dodatniej i ujemnej ekstrakcji technicznej ekstraktu wymazu do co najmniej czterech powtórzonych dołków płytkowych RT-QuIC.
    UWAGA: Jeśli ujemne kontrole wymazu wykazują wysiewanie RT-QuIC powyżej standardu laboratoryjnego dla pozytywnego oznaczenia, oznaczałoby to, że zanieczyszczenie zostało wprowadzone podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i zagęszczania i że eksperyment z wymazem powinien zostać przeprowadzony ponownie

6. Przygotowanie próbek do użycia w RT-QuIC

  1. Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną (np. niezakażony homogenat mózgu, niezakażony węzeł chłonny itp.) poprzez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1% SDS/PBS). Przygotować pozytywne kontrole płytki, rozcieńczając zakażony homogenat mózgu do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.
  2. Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić z 20-50 μl roztworu rozcieńczającego tkanki (w zależności od podejrzewanej ilości zanieczyszczenia), pipetując w górę iw dół około dziesięciu razy, a następnie krótko wirując. Pozwól próbkom usiąść w RT podczas wykonywania pozostałych kroków.
  3. Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym ujemnych kontroli płytkowych (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu) do studzienek na płytki RT-QuIC.
  4. Załadować 2 μl każdego ekstraktu z wymazu do czterech studzienek replikacji.

7. Analiza i wyniki RT-QuIC

  1. Wykonaj RT-QuIC zgodnie z indywidualnymi protokołami laboratoryjnymi (protokoły opcjonalne38,40).
  2. Zdefiniuj parametry wymagane do określenia dodatniej wartości próbki (patrz reprezentatywne wyniki, Rysunek 5).
    UWAGA: Te parametry są definiowane przez każde laboratorium.
  3. Zapisz wyniki w podanej tabeli i podejmij odpowiednie działania w oparciu o najlepsze praktyki laboratoryjne (Tabela 1 i Rysunek uzupełniający 2).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pisemny opis pozytywnych i negatywnych wyników (w tym kontrole z dodatniej/ujemnej płytki i wymazu)

Wymazy kontroli ujemnej są dołączane do wymazu nadzorującego w celu monitorowania potencjalnego zanieczyszczenia prionami, które mogłyby zostać wprowadzone podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i koncentracji. Pierwsza płytka RT-QuIC wykonana dla danego miesięcznego nadzoru powinna zawierać dodatnie i ujemne kontrole wymazu. Udane kontrole ujemne nie przekraczają progu dodatniej fluorescencji (Rysunek 6A). Wynik ten wskazywałby, że zanieczyszczenie nie zostało wprowadzone podczas procedur doświadczalnych. Udane ekstrakty wymazów kontroli pozytywnej wykazywałyby dodatnie wysiewanie we wszystkich studzienkach replikowanych dla danej próbki (wymazy kontroli pozytywnej były zanieczyszczone homogenatem mózgu przystosowanym do chomików zakaźnym szczepem encefalopatii norek Hyper (HY TME). Włączenie serii rozcieńczeń kontroli dodatniej pozwala na określenie czułości wykrywania prionów dla danego eksperymentu (Rysunek 6A).

Podczas badania próbek ekstraktu z wymazu powierzchniowego, powierzchnie, które nie wykazują zasiewu powyżej wcześniej ustalonego progu dodatniej fluorescencji, mogą być uważane za prionowe ujemne (Rysunek 6B). I odwrotnie, ekstrakty z wymazów powierzchniowych zanieczyszczone prionami będą wykazywać zdolności wysiewu powyżej dodatniego progu fluorescencji, chociaż stosunek maxpoint (MPR) i czas do fluorescencji mogą się różnić w porównaniu z dołączoną kontrolą dodatniej płytki (Rysunek 6B). Zdolność metody do oceny odpowiedniej dezynfekcji jest podkreślona przez powierzchnie zanieczyszczone prionami poddane działaniu wybielacza, które obecnie nie są w stanie zasiać RT-QuIC (Rysunek 6B).

Ważne, chociaż nasze laboratorium definiuje pozytywną próbkę jako próbkę, która przekroczy ustawiony próg dodatniej fluorescencji w co najmniej połowie docieknięć replikowanych, konieczne jest, aby każde laboratorium ustaliło swoje własne standardy. Szybkość powstawania amyloidu (RAF) i czas do fluorescencji mogą być również wykorzystane do ustalenia specyficznych dla laboratorium progów dodatniości.

Zaobserwowaliśmy wyniki artefaktów powierzchniowych, które przekraczają próg dodatniej fluorescencji, ale ze zmienionymi krzywymi kinetycznymi i po nienormalnie długim czasie do fluorescencji w porównaniu z pozytywnymi próbkami kontrolnymi (Rysunek 6C). Wyniki te należy interpretować ostrożnie, ponieważ mogą być spowodowane obecnością kurzu lub pozostałości chemikaliów obecnych na powierzchni. Wyniki te podkreślają konieczność ogólnej czystości laboratorium, a także kryteria rozróżnienia między wysiewem prawdziwie dodatnim a fałszywie dodatnim.

Usuwanie stałych i płynnych odpadów stanowiących zagrożenie biologiczne powinno odbywać się zgodnie z aktualnymi wytycznymi danej instytucji dotyczącymi usuwania zagrożeń biologicznych. Typowe techniki dezynfekcji prionów obejmują leczenie wodorotlenkiem sodu, podchlorynem sodu (wybielaczem) lub autoklawowanie w temperaturze 134 °C przez 18 min43,44,45,46.

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd testu laboratoryjnego bezpieczeństwa prionów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykładowy układ strony pobierania wymazów. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowy projekt eksperymentu dla kontroli wymazu obejmował test laboratoryjny bezpieczeństwa prionów. (A) Układ próbki dla kontroli ujemnego i dodatniego ekstraktu z wymazu. (B) Ujemne i dodatnie kontrole ekstraktu z wymazu powinny być ponownie zawieszone w 50 μlH2O. Należy uzyskać 10-krotne rozcieńczenie zawieszonego ekstraktu z wacika, rozcieńczając go do roztworu rozcieńczającego tkanki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykładowy projekt eksperymentu dla ekstraktów z wymazów powierzchniowych z testu laboratoryjnego bezpieczeństwa prionów. (A) Przykładowy układ ekstraktów z wymazów powierzchniowych. (B) Próbki ekstraktu z wymazu powierzchniowego należy ponownie zawiesić w 20 μl roztworu do rozcieńczania tkanek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Comiesięczny test laboratoryjny bezpieczeństwa prionów. Schemat blokowy służący do interpretowania wyników i określania odpowiedniej reakcji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Reprezentatywny eksperyment z wymazem powierzchniowym. (A) Płytka kontrolna z wymazu powierzchniowego zawierająca kontrolę ujemnego ekstraktu z wymazu w trzech egzemplarzach (DPBS, homogenat mózgu chomika niezakażonego 10-4 i 10-10) oraz kontrole z ekstraktem z wymazu dodatniego w trzech egzemplarzach (homogenat mózgu HY 10-3). (B) Reprezentatywne ekstrakty wacikowe do powierzchni stołowych, szklanych i ze stali nierdzewnej (SS), które zostały pobrane przed zanieczyszczeniem, po zanieczyszczeniu HY 10-3 i po poddaniu zanieczyszczonych powierzchni wybielaczem. (C) Porównanie fluorescencji niezakażonego homogenatu mózgu 10-4, homogenatu mózgu HY 10-3 i ekstraktu wacika z blatu stołu pokrytego drobną warstwą kurzu. Ujemne kontrole płytki dla paneli A i B obejmują ślepą próbę (roztwór rozcieńczenia tkanki) i niezakażony homogenat mózgu chomika 10-4. Panel B obejmuje dodanie niezakażonego homogenatu mózgu 10-4 i dodatnią kontrolę płytki homogenatu mózgu HY 10-3. Dodatni próg fluorescencji (zilustrowany czerwoną przerywaną linią) określono na poziomie 2. Podany współczynnik maxpoint (MPR) to maksymalna fluorescencja podzielona przez początkowy odczyt fluorescencji uzyskany przez czytnik płytek. Każdy punkt reprezentuje jedną replikację studni technicznej dla danego typu próbki. Przedstawiona jest średnia i odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Przykładowy formularz miesięcznej dokumentacji miejsca pobierania wymazów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Szablon układu strony pobierania szwów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Miesięczny formularz dokumentacji miejsca pobierania wymazów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana metoda bezpiecznego pobierania wymazów prionowych może być wykorzystana do wzmocnienia istniejących środków bezpieczeństwa prionowego. Metoda ta może monitorować przestrzenie i sprzęt laboratoryjny prionów, a także współdzielone przestrzenie laboratoryjne, pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia prionami. Co ważne, metoda ta może być zaadaptowana do testowania laboratoryjnych technik dezynfekcji w celu weryfikacji dekontaminacji powierzchni zanieczyszczonych prionami. Ponieważ różne szczepy prionów wykazują różną wrażliwość na techniki dezynfekcji, metoda ta może potwierdzić, że techniki te są skuteczne w obecnych eksperymentach laboratoryjnych, takich jak leczenie wodorotlenkiem sodu lub podchlorynem sodu (wybielaczem)43,44.

Kluczowe kroki w ramach tej metodologii obejmują identyfikację odpowiednich miejsc pobierania wymazów, które dostarczą próbki zarówno z obszarów o dużym natężeniu ruchu, jak i obszarów do monitorowania, które mogą być związane z dalszym zanieczyszczeniem krzyżowym eksperymentów. Ponadto laboratoria powinny stosować kontrole pozytywne i negatywne, które ściśle odzwierciedlają te powszechnie stosowane w danym laboratorium lub klinice. Na przykład, jeśli pracujesz z prionami gryzoni, kontrole pozytywne i ujemne powinny pasować do tego gatunku. Wreszcie, dane z nadzoru powinny być aktualizowane i organizowane w taki sposób, aby można było łatwo zidentyfikować tendencje w zakresie pozytywności, co pozwoli na łagodzenie skutków i ponowne szkolenie personelu laboratoryjnego w przypadku konsekwentnych pozytywnych wyników dla danego obszaru.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest potencjalne generowanie błędnych wyników RT-QuIC. Biorąc pod uwagę wrażliwy charakter RT-QuIC, obecność pozostałości detergentów, soli i innych substancji na powierzchniach laboratoryjnych może mieć wpływ na wynik reakcji39. Ogólnie rzecz biorąc, biorąc pod uwagę tę obserwację, korzystne jest, aby powierzchnie pozostały wolne od substancji, które mogą zakłócać działanie RT-QuIC, takich jak resztki soli, detergenty i kurz. Przewidujemy, że wraz z wprowadzaniem ulepszeń do metodologii RT-QuIC wiele z obecnych ograniczeń RT-QuIC zostanie rozwiązanych. W związku z tym zachęcamy użytkowników końcowych do śledzenia literatury w celu skorzystania z najnowszych ulepszeń w RT-QuIC.

Kluczową zaletą tej metody dla laboratoriów badających priony jest możliwość zminimalizowania zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na wyniki czułych testów amplifikacji. Narzędzia do sekcji zwłok są zwykle dezynfekowane przed ponownym użyciem do przyszłych sekcji zwłok. Opisana metoda pobierania wymazów zapewnia metodę oceny narzędzi do sekcji zwłok pod kątem resztkowej zakaźności prionów, która może mieć wpływ na dalsze wyniki. Może to zapewnić dodatkowy poziom rygoru eksperymentów, aby wykluczyć możliwość, że wykrycie prionów w tkankach nie było spowodowane zanieczyszczeniem narzędziami do sekcji zwłok.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.B. i Q.Y. są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym dotyczącym technologii wymazywania powierzchni prionów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca została wsparta grantem z Fundacji Choroby Jacoba Creutzfeldta. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Marka rybacka  Waciki piankowe PurSwab MarkaFisherKatalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 System wody ultraczystejMilliporeSigmaQ7005T0C
Mini-wirówka, 6000 obr./minSouthern LabwareMLX-306
Czytnik płytek OmegaBMG LabtechFLUOstar Czytnik
Omega Q700 sonikatorQSonicaQ700-110
Rekombinowane białko prionowe chomikaMNPROMNPROteina-chomikchomik syryjski, aminokwasy 90-231
Savant speedvac Thermo ScientificSPD1030-230
Nanosfery krzemionkowe (50 nm)nano Composix SISN50-25M
płytek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  3. Oesch, B., et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40 (4), 735-746 (1985).
  4. Caughey, B., Raymond, G. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J Biol Chem. 266 (27), 18217-18223 (1991).
  5. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (23), 9741-9746 (2007).
  6. Gajdusek, D. C., Zigas, V. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of "kuru" in the native population. N Engl J Med. 257, 974-978 (1957).
  7. Centers for Disease Control. Fatal degenerative neurologic disease in patients who received pituitary-derived human growth hormone. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 34, 359-361 (1985).
  8. Duffy, P., Wolf, J., Collins, G., DeVoe, A. G., Streeten, B., Cowen, D. Letter: possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med. 290 (12), 692-693 (1974).
  9. Brown, P., et al. Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium. Neurology. 55 (8), 1075-1081 (2000).
  10. Huillard d'Aignaux, J., et al. Incubation period of Creutzfeldt-Jakob disease in human growth hormone recipients in France. Neurology. 53 (6), 1197-1201 (1999).
  11. Marzewski, D. J., Towfighi, J., Harrington, M. G., Merril, C. R., Brown, P. Creutzfeldt-Jakob disease following pituitary-derived human growth hormone therapy: a new American case. Neurology. 38, 1131-1133 (1988).
  12. Hannah, E. L., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after receipt of a previously unimplicated brand of dura mater graft. Neurology. 56 (8), 1080-1083 (2001).
  13. Shimizu, S., et al. Creutzfeldt-Jakob disease with florid-type plaques after cadaveric dura mater grafting. Arch Neurol. 56 (3), 357-362 (1999).
  14. Antoine, J. C., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after extracranial dura mater embolization for a nasopharyngeal angiofibroma. Neurology. 48 (5), 1451-1453 (1997).
  15. Esmonde, T., Lueck, C. J., Symon, L., Duchen, L. W., Will, R. G. Creutzfeldt-Jakob disease and lyophilised dura mater grafts: report of two cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 56, 999-1000 (1993).
  16. Willison, H. J., Gale, A. N., McLaughlin, J. E. Creutzfeldt-Jakob disease following cadaveric dura mater graft. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 54, 940(1991).
  17. Diringer, H., Braig, H. R. Infectivity of unconventional viruses in dura mater. Lancet. 334, 439-440 (1989).
  18. Peden, A. H., Head, M. W., Ritchie, D. L., Bell, J. E., Ironside, J. W. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet. 364 (9433), 527-529 (2004).
  19. Will, R. G., Matthews, W. B. Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 45, 235-238 (1982).
  20. el Hachimi, K. H., Chaunu, M. P., Cervenakova, L., Brown, P., Foncin, J. F. Putative neurosurgical transmission of Creutzfeldt-Jakob disease with analysis of donor and recipient: agent strains. C R Acad Sci III. 320 (4), 319-328 (1997).
  21. Alper, T., et al. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214, 764-766 (1967).
  22. Casassus, B. France halts prion research amid safety concerns. Science. 373 (6554), 475-476 (2021).
  23. Brandel, J. P., et al. Variant Creutzfeldt-Jakob disease diagnosed 7.5 years after occupational exposure. N Engl J Med. 383 (1), 83-85 (2020).
  24. Flechsig, E., Hegyi, I., Enari, M., Schwarz, P., Collinge, J., Weissmann, C. Transmission of scrapie by steel-surface-bound prions. Mol Med. 7 (10), 679-684 (2001).
  25. Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M., Weissmann, C. Infectivity of scrapie prions bound to a stainless steel surface. Mol Med. 5 (4), 240-243 (1999).
  26. Brown, P., Gajdusek, D. C. Survival of scrapie virus after 3 years' interment. Lancet. 337 (8736), 269-270 (1991).
  27. Seidel, B., et al. Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years. PLoS One. 2 (5), e435(2007).
  28. Maddison, B. C., et al. Environmental sources of scrapie prions. J Virol. 84 (21), 11560-11562 (2010).
  29. Pritzkow, S., Morales, R., Lyon, A., Concha-Marambio, L., Urayama, A., Soto, C. Efficient prion disease transmission through common environmental materials. J Biol Chem. 293 (9), 3363-3373 (2018).
  30. Alper, T., Cramp, W., Haig, D., Clarke, M. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214 (90), 764-766 (1967).
  31. Bernoulli, C., et al. Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery. Lancet. 309 (8009), 478-479 (1977).
  32. Brown, P., Rohwer, R. G., Green, E. M., Gajdusek, D. C. Effect of chemicals, heat, and histopathologic processing on high- infectivity hamster-adapted scrapie virus. J Infect Dis. 145 (5), 683-687 (1982).
  33. Brown, P., et al. Chemical disinfection of Creutzfeldt-Jakob disease virus. N Engl J Med. 306, 1279-1282 (1982).
  34. Dickinson, A. G., Taylor, D. M. Resistance of scrapie agent to decontamination. N Engl J Med. 299, 1413-1414 (1978).
  35. Hunter, G. D., Millson, G. C. Studies on the heat stability and chromatographic behavior of the scrapie agent. J Gen Microbiol. 37, 251-258 (1964).
  36. Pattison, I. H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J Comp Pathol. 75, 159-164 (1965).
  37. Fraser, H., Farquhar, C., McConnell, I., Davies, D. The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog Clin Biol Res. 317, 653-658 (1989).
  38. Yuan, Q., et al. Sensitive detection of chronic wasting disease prions recovered from environmentally relevant surfaces. Environ Int. 166, 107347(2022).
  39. Simmons, S. M., et al. Rapid and sensitive determination of residual prion infectivity from prion-decontaminated surfaces. mSphere. 9, e00504-e00524 (2024).
  40. Orru, C. D., et al. Sensitive detection of pathological seeds of alpha-synuclein, tau and prion protein on solid surfaces. PLoS Pathog. 20 (4), e1012175(2024).
  41. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  42. Srivastava, A., et al. Enhanced quantitation of pathological alpha-synuclein in patient biospecimens by RT-QuIC seed amplification assays. PLoS Pathog. 20 (9), e1012554(2024).
  43. Hughson, A. G., et al. Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid. PLoS Pathog. 12 (9), e1005914(2016).
  44. Williams, K., Hughson, A. G., Chesebro, B., Race, B. Inactivation of chronic wasting disease prions using sodium hypochlorite. PLoS One. 14 (10), e0223659(2019).
  45. Taylor, D. M. Autoclaving standards for Creutzfeldt-Jakob disease agent [letter]. Ann Neurol. 22 (4), 557-558 (1987).
  46. Brown, P., Rohwer, R. G., Gajdusek, D. C. Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in brain tissue. J Infect Dis. 153 (6), 1145-1148 (1986).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

zanieczyszczenie prionamiwymaz powierzchnianaliza RT QuICinaktywacja prion wdekontaminacja prion wzawodowe ryzyko prionowedezynfekcja powierzchnidetekcja prion w

Powiązane artykuły