Artykuł metodologiczny

Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego

1.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67889

⸱

14 lutego 2025

 ,  , 
1Department of Medical Microbiology and Immunology, School of Medicine, Creighton University

W tym artykule

Podsumowanie

Brakuje metody oceny powszechnie używanych obszarów w warunkach laboratoryjnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i skutecznej dekontaminacji. Opisany tutaj protokół zawiera kluczowe podstawy do wdrożenia laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów, który można łatwo modyfikować w celu spełnienia indywidualnych potrzeb określonych laboratoriów.

Streszczenie

Przeniesienie jatrogennej choroby prionowej nastąpiło z zanieczyszczonych narzędzi neurochirurgicznych, materiałów do przeszczepów i narażenia zawodowego na narzędzia laboratoryjne skażone prionami. Priony wywołują chorobę poprzez nieprawidłowe fałdowanie normalnej formy komórkowej białka prionowego, PrPC, do nieprawidłowo sfałdowanej i patogennej formy PrPSc i są niezmiennie śmiertelne. Ograniczenie jatrogennej i zawodowej transmisji prionów jest wyzwaniem. Po pierwsze, priony mogą wiązać się z powierzchniami i utrzymywać się na nich przez długi czas. Po drugie, priony są wysoce odporne na inaktywację. Biorąc to pod uwagę, powierzchnie mogą zachować zakaźność przez długi czas po nieskutecznej dekontaminacji. Może to nie tylko stanowić potencjalne ryzyko zawodowe dla pracowników laboratoriów prionowych, ale może potencjalnie zanieczyścić krzyżowo eksperymenty laboratoryjne wykorzystujące wrażliwe techniki amplifikacji prionów. Opisany tutaj protokół laboratoryjnego testu bezpieczeństwa prionów obejmuje kroki identyfikacji i dokumentowania obszarów laboratoryjnych o dużym natężeniu ruchu, zalecane kontrole wymazów w celu zapewnienia ważności wyników, kroki mające na celu określenie właściwych reakcji na dodatnie miejsca pobierania wymazów powierzchniowych, reprezentatywne wyniki testów prionowych, a także potencjalne wyniki artefaktów. Ogólnie rzecz biorąc, laboratoryjny test bezpieczeństwa prionów może być wdrożony jako część szerszego programu bezpieczeństwa prionów w celu oceny dekontaminacji powierzchni, monitorowania przestrzeni wspólnych pod kątem zanieczyszczenia prionami i wdrożenia dokumentacji stanu dekontaminacji prionowej.

Wprowadzenie

Choroby prionowe są niezmiennie śmiertelnymi chorobami neurodegeneracyjnymi, na które nie ma znanego leczenia ani lekarstwa. Choroby prionowe są wywoływane przez PrPSc, nieprawidłowo sfałdowaną i patogenną formę normalnej komórkowej formy białka prionowego1,2,3,4,5, PrPC. Wiadomo, że choroby prionowe dotykają ludzi i kilka innych gatunków zwierząt. Jedna z ludzkich chorób prionowych, choroba Creutzfeldta-Jakoba (CJD), ma trzy znane etiologie: sporadyczną, dziedziczną i nabytą. Nabyta CJD może wystąpić w wyniku przypadkowej transmisji (jatrogennej i zawodowej) i uważa się, że jest przyczyną Kuru u ludów Fore z Papui-Nowej Gwinei6.

Transmisja prionów została powiązana z urządzeniami medycznymi skażonymi prionami i materiałami do przeszczepów7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Jatrogenne przenoszenie CJD może nastąpić przez krew, tkankę lub z powierzchni skażonych prionami18,19,20. Na przykład, jatrogenna CJD może rozwinąć się u pacjentów po elektroencefalogramie z elektrodami wcześniej stosowanymi u osoby w fazie przedklinicznej CJD, która następnie uległa CJD21. Nowsze przypadki przenoszenia zawodowego w laboratoriach miały również miejsce, gdy pracownik laboratorium zaraził się chorobą prionową poprzez nakłucie skóry kleszczami używanymi do dotykania wycinków mózgu zwierzęcia zarażonego zaadaptowanym przez owce BSE22,23. Takie scenariusze transmisji mogą wystąpić w warunkach klinicznych, laboratoryjnych i diagnostycznych, w których przetwarzane są próbki prionów.

Priony są odporne na powszechne techniki dezynfekcji i mogą utrzymywać się i pozostawać zakaźne na powierzchniach przez dłuższy czas24,25,26,27,28,29. Powszechne techniki dezynfekcji, takie jak stosowanie etanolu, fenolowych środków czyszczących, nadtlenku wodoru, różnych form promieniowania i formaldehydu, są niewystarczające do inaktywacji prionów, co pozwala powierzchniom zachować zakaźność30,31,32,33,34,35,36,37. Cechy te przyczyniają się do przenoszenia prionów podczas narażenia jatrogennego i zawodowego.

Metody wykrywania prionów środowiskowych zostały opracowane dopiero niedawno. Metoda pobierania wymazów środowiskowych w połączeniu z konwersją wywołaną wstrząsem w czasie rzeczywistym (RT-QuIC) może ocenić resztkową zakaźność prionów z powierzchni środowiskowych, a także zwykłych powierzchni laboratoryjnych po nieskutecznej dezynfekcji38,39,40,41,42. Tutaj opisujemy, w jaki sposób ta technika może zostać włączona do szerszego programu bezpieczeństwa prionowego. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta może pozwolić na monitorowanie protokołów dezynfekcji zależnych od laboratorium, badanie i właściwe dokumentowanie stanu skażenia, co może pomóc w zapewnieniu ważności eksperymentów poprzez minimalizację zanieczyszczenia krzyżowego, ocenę przestrzeni wspólnego użytku pod kątem zanieczyszczenia prionami i pozwala na kierunkowe przeszkolenie personelu w oparciu o powszechnie skażone obszary.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone i zgodne z Przewodnikiem Opieki i Użytkowania Zwierząt Laboratoryjnych przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Creighton.

UWAGA: Schematyczny przegląd testu laboratoryjnego bezpieczeństwa prionów jest pokazany w Rysunek 1.

1. Wybór miejsc pobierania wymazów i przygotowanie do pobierania wymazów powierzchniowych

  1. Zidentyfikuj i oznacz odpowiednie obszary nadzoru do pobierania wymazów. Zapoznaj się z dostarczonym szablonem w celu uzyskania dokumentacji i odniesienia (Rysunek 2 i Rysunek uzupełniający 1).
  2. Przygotuj dwie probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml dla każdego ze zidentyfikowanych obszarów. Dodać 250 μl buforowanej fosforanem soli fizjologicznej firmy Dulbecco do pierwszego zestawu probówek do mikrowirówek do użycia w kroku 3.2. Niech drugi zestaw probówek do mikrowirówek pozostanie pusty do użycia w kroku 4.3.
  3. Wyjmij waciki z piankową końcówką z przechowywania w miejscu wolnym od zanieczyszczenia prionowego.
  4. Przygotuj butelkę do wyciskania z wodą Milli-Q (MQ H2O) do użycia w kroku 2.1.

2. Przygotowanie wymazu z kontroli dodatniej i ujemnej

  1. Przygotować rozcieńczenia do kontroli wymazów dodatnich i ujemnych, stosując odpowiednie typy kontroli. Przykład: W celu kontroli pozytywnej przygotuj 1% rozcieńczenie homogenatu mózgu zakażonego prionami w buforowanym fosforanami soli fizjologicznej Dulbecco (DPBS). Do celów kontroli ujemnej należy przygotować 0,1% rozcieńczenie niezakażonego (UN) homogenatu mózgu (BH) tego samego gatunku, co kontrola pozytywna w DPBS.
  2. Używając czystych rękawiczek, wyjmij odpowiednią liczbę wacików z czystego opakowania i umieść uchwyt do dołu w stojaku na probówki, uważając, aby rozmieścić waciki piankowe tak, aby końcówki nie stykały się z innymi wacikami lub powierzchniami. Dla każdej próbki kontrolnej należy przygotować trzy waciki. Zmieniaj rękawice między każdą próbką.
  3. Trzymając za uchwyt czysty wacik piankowy, nałóż 50 μl odpowiednich próbek kontroli dodatniej i ujemnej na końcówki wacika piankowego. Upewnij się, że nakładasz na obie strony końcówki wacika, aby zapewnić całkowite wchłonięcie.
    UWAGA: Zawsze zmieniaj rękawiczki przed wyjęciem czystego wacika ze stojaka na probówki.
  4. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.
  5. Kontynuować nakładanie próbek kontrolnych po zmianie rękawiczek, aż wszystkie próbki zostaną nałożone.

3. Wymazywanie powierzchni

  1. Trzymając czysty wacik z piankową końcówką za uchwyt, zwilż piankową końcówkę MQH 2O i strząśnij nadmiar. Umieść zwilżoną piankową końcówkę wacika na obszarze wybranym do nadzoru i przetrzyj obszar w przód iw tył około dziesięć razy, jednocześnie obracając końcówkę wacika na powierzchni.
  2. Za pomocą nożyczek odetnij nadmiar uchwytu wacika (około 1/2 długości) i umieść wacik w wstępnie załadowanej probówce do mikrowirówki z piankową końcówką skierowaną w dół. Upewnij się, że piankowa końcówka jest zanurzona w DPBS i że uchwyt jest odpowiednio przycięty, aby całkowicie zamknąć pokrywę probówki mikrowirówkowej.
  3. Wyrzuć rękawice i załóż nowe rękawice przed każdym odpowiednim miejscem pobrania wymazu, aby zminimalizować prawdopodobieństwo zanieczyszczenia krzyżowego.
  4. Powtarzaj procedurę, aż wszystkie obszary wybrane do nadzoru zostaną pobrane wymazy.

4. Ekstrakcja wymazów i zagęszczenie próżni

UWAGA: Włącz koncentrator podciśnienia 30 minut przed użyciem, aby umożliwić rozgrzanie instrumentu.

  1. Umieść probówki do mikrowirówek w okrągłym stojaku na probówki. Umieść stojak na probówki do mikrofuge w łaźni wodnej z tubą kubkową. Upewnij się, że waciki piankowe w DPBS w probówkach do mikrowirówek znajdują się pod powierzchnią wody w rogu kubka (część uchwytu nie musi być zanurzona). Zastosuj następujące ustawienia: Całkowity czas pracy 15 s (5 s wł., 5 s wyłączony) przy ~75-85 watach.
  2. Po sonikacji należy odwirować probówki przez około 15 sekund, aby zebrać DPBS na dnie probówki przed przeniesieniem.
  3. Za pomocą pipety P1000 ustawionej na 250 μl ostrożnie zebrać cały płyn (ekstrakt z wacika) z dna probówki do mikrowirówki i przenieść do odpowiedniej probówki do mikrowirówki z drugiego, pustego, wstępnie oznakowanego zestawu. Użyj końcówki pipety, aby wycisnąć nadmiar płynu z końcówki piankowej. Wyrzuć puste probówki zawierające waciki.
  4. Ustaw następujące ustawienia koncentratora próżniowego: Temperatura: 45 °C, Czas nagrzewania: 15 min, Czas pracy: 2 h, Próżnia: 5.1.
  5. Umieść probówki do mikrowirówek zawierające ekstrakty wacików w koncentratorze próżniowym, upewniając się, że probówki są wyważone, a wszystkie nakrętki probówek otwarte.
  6. Po zakończeniu cyklu upewnić się, że próbki są całkowicie zagęszczone (pozostaje tylko osad). Przechowuj granulki w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania w RT-QuIC.
    UWAGA: W niektórych przypadkach może być wymagany dodatkowy czas koncentracji próżni, aby zapewnić pełne stężenie. Usunąć wszystkie skoncentrowane próbki, pozostawiając tylko probówki, które nadal zawierają płyn. Zrównoważyć pozostałe probówki w koncentratorze i pracować w dodatkowych odstępach 1-godzinnych, aż próbki zostaną całkowicie zagęszczone.

5. Przygotowanie kontroli pobierania wymazów do użycia w RT-QuIC

UWAGA: Kontrole RT-QuIC powinny być przeprowadzone przed testem ekstraktów z wymazów środowiskowych, aby upewnić się, że nie doszło do zanieczyszczenia podczas procedur pobierania wymazów, ekstrakcji lub koncentracji. Aby zapoznać się z przykładowymi układami, zobacz Rysunek 3 i Rysunek 4.

  1. Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną RT-QuIC (np. niezakażony homogenat mózgu [UN BH]) przez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1%SDS/PBS). Przygotować dodatnie rozcieńczenie kontrolne płytki, rozcieńczając homogenat mózgu zakażony prionami do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.
  2. Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika kontrolnego z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić każdy z 50 μl MQ H2O, pipetując w górę i w dół około 10 razy, a następnie krótko wirując. Pozostawić próbki w temperaturze pokojowej (RT) podczas wykonywania pozostałych kroków.
  3. Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym kontroli ujemnych na płytkach (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu).
  4. Załadować 2 μl każdej dodatniej i ujemnej ekstrakcji technicznej ekstraktu wymazu do co najmniej czterech powtórzonych dołków płytkowych RT-QuIC.
    UWAGA: Jeśli ujemne kontrole wymazu wykazują wysiewanie RT-QuIC powyżej standardu laboratoryjnego dla pozytywnego oznaczenia, oznaczałoby to, że zanieczyszczenie zostało wprowadzone podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i zagęszczania i że eksperyment z wymazem powinien zostać przeprowadzony ponownie

6. Przygotowanie próbek do użycia w RT-QuIC

  1. Przygotować odpowiednią ujemną płytkę kontrolną (np. niezakażony homogenat mózgu, niezakażony węzeł chłonny itp.) poprzez rozcieńczenie do odpowiedniego stężenia w roztworze rozcieńczania tkanek (N2-0,1% SDS/PBS). Przygotować pozytywne kontrole płytki, rozcieńczając zakażony homogenat mózgu do rozcieńczenia 10-3 w roztworze rozcieńczania tkanek.
  2. Usunąć wcześniej przechowywane granulki ekstraktu z wacika z temperatury -80 °C i ponownie zawiesić z 20-50 μl roztworu rozcieńczającego tkanki (w zależności od podejrzewanej ilości zanieczyszczenia), pipetując w górę iw dół około dziesięciu razy, a następnie krótko wirując. Pozwól próbkom usiąść w RT podczas wykonywania pozostałych kroków.
  3. Załadować 2 μl określonych kontrolnych płytek, w tym ujemnych kontroli płytkowych (sam roztwór rozcieńczający tkanki i niezakażony homogenat mózgu) oraz dodatniej kontroli płytki (zakażony homogenat mózgu) do studzienek na płytki RT-QuIC.
  4. Załadować 2 μl każdego ekstraktu z wymazu do czterech studzienek replikacji.

7. Analiza i wyniki RT-QuIC

  1. Wykonaj RT-QuIC zgodnie z indywidualnymi protokołami laboratoryjnymi (protokoły opcjonalne38,40).
  2. Zdefiniuj parametry wymagane do określenia dodatniej wartości próbki (patrz reprezentatywne wyniki, Rysunek 5).
    UWAGA: Te parametry są definiowane przez każde laboratorium.
  3. Zapisz wyniki w podanej tabeli i podejmij odpowiednie działania w oparciu o najlepsze praktyki laboratoryjne (Tabela 1 i Rysunek uzupełniający 2).

Wyniki

Opis pisemny wyników pozytywnych i negatywnych (w tym kontroli pozytywnych i negatywnych dla płytek i wymazów)

W ramach wymazów nadzorczych stosuje się wymazy kontrolne ujemne, aby monitorować potencjalne zanieczyszczenie prionami, które mogłoby wystąpić podczas procesu pobierania wymazów, ekstrakcji i zagęszczania. Pierwsza płytka RT-QuIC wykonana w ramach danego miesięcznego nadzoru powinna zawierać kontrolne wymazy dodatnie i ujemne. Prawidłowe kontrole ujemne nie przekraczają progu fluorescencji dodatniej (Rysunek 6A). Taki wynik wskazywałby, że podczas procedur eksperymentalnych nie wprowadzono zanieczyszczeń. Prawidłowe ekstrakty z wymazów kontrolnych dodatnich wykazałyby dodatnie zasiewanie we wszystkich powtórzonych studzienkach dla danej próbki (wymazy kontrolne dodatnie zanieczyszczono homogenatem mózgu z hodowlanym u chomików szczepem Hyper (HY TME) transmisyjnej encefalopatii norki). Włączenie serii rozcieńczeń kontroli dodatniej pozwala na określenie czułości detekcji prionów w danym eksperymencie (Rysunek 6A).

Podczas badania próbek z wymazów z powierzchni, powierzchnie, w których nie stwierdzono namnażania powyżej ustalonego progu fluorescencji dodatniej, można uznać za wolne od prionów (Rycina 6B). Z kolei wymazy z powierzchni zanieczyszczonych prionami wykażą zdolność do namnażania powyżej progu fluorescencji dodatniej, choć stosunek maxpoint (MPR) oraz czas do wystąpienia fluorescencji mogą różnić się w porównaniu z dołączoną dodatnią kontrolą na płytce (Rycina 6B). Zdolność tej metody do oceny prawidłowej dezynfekcji została podkreślona w przypadku powierzchni zanieczyszczonych prionami i potraktowanych wybielaczem, które obecnie nie wykazują zdolności do namnażania w teście RT-QuIC (Rycina 6B).

Warto zaznaczyć, że choć w naszym laboratorium próbkę dodatnią definiuje się jako taką, która przekracza ustalony próg fluorescencji dodatniej w co najmniej połowie powtórzeń, każde laboratorium powinno ustalić własne standardy. Szybkość tworzenia amyloidu (RAF) oraz czas do wystąpienia fluorescencji mogą również pomóc w ustaleniu specyficznych dla danego laboratorium progów dodatniości.

Zaobserwowaliśmy wyniki będące artefaktami powierzchniowymi, które przekraczały próg dodatniej fluorescencji, lecz charakteryzowały się zmienionymi krzywymi kinetycznymi oraz nienaturalnie długim czasem do wystąpienia fluorescencji w porównaniu z próbkami kontrolnymi dodatnimi (Rysunek 6C). Wyniki te należy interpretować z ostrożnością, ponieważ mogą być one spowodowane obecnością kurzu lub pozostałości chemikaliów na powierzchni. Wnioski te podkreślają konieczność zachowania ogólnej czystości laboratoryjnej, a także potrzebę ustalenia kryteriów pozwalających na rozróżnienie prawdziwego dodatniego zasiewu od wyników fałszywie dodatnich.

Utylizację stałych i ciekłych odpadów biologicznych należy przeprowadzać zgodnie z aktualnymi wytycznymi danej instytucji dotyczącymi utylizacji materiałów niebezpiecznych biologicznie. Powszechne techniki dezynfekcji prionów obejmująy traktowanie wodorotlenkiem sodu, podchlorynem sodu (wybielem) lub autoklawowanie w temperaturze 134 °C przez 18 min43,44,45,46.

Proces testu wymazowego bezpieczeństwa prionów: identyfikacja, pobieranie wymazów, analiza RT-QuIC, schemat prowadzenia dokumentacji.
Rysunek 1: Schematyczny przegląd testu wymazowego bezpieczeństwa prionów w laboratorium. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat organizacji stanowiska laboratoryjnego z opisanym sprzętem do przygotowania i analizy próbek.
Rycina 2: Układ miejsca pobierania wymazów z próbek. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat serii rozcieńczeń mikrobiologicznych z zestawem kontrolnym wymazów do analizy zanieczyszczeń.
Rycina 3: Projekt przykładowego eksperymentu dla kontroli wymazów w ramach testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów. (A) Przykładowy układ dla ujemnych i dodatnich kontroli ekstraktów z wymazów. (B) Ujemne i dodatnie kontrole ekstraktów z wymazów należy resuspendować w 50 µL H2O. 10-krotne rozcieńczenie resuspendowanego ekstraktu z wymazu powinno zostać przygotowane poprzez rozcieńczenie go w roztworze do rozcieńczania tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Układ mikro płytki do analizy ekstraktów z wymazów z powierzchni; obejmuje próbki kontrolne i instrukcje rozcieńczania.
Rycina 4: Przykładowy projekt eksperymentu dla ekstraktów z wymazów z powierzchni w ramach testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów. (A) Układ próbek dla ekstraktów z wymazów z powierzchni. (B) Próbki ekstraktów z wymazów z powierzchni należy resuspender w 20 µL roztworu do rozcieńczania tkanek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat testu wymazowego w laboratorium bezpieczeństwa prionów; wyniki RT-QuIC dla procedury dekontaminacji.
Rysunek 5: Comiesięczny test wymazowy w laboratorium bezpieczeństwa prionów. Schemat służący do interpretacji wyników i określenia odpowiedniej reakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy przedstawiające wyniki liczenia kolonii drobnoustrojów na płytkach oraz fluorescencję ThT w czasie w eksperymentach z rozcieńczeniami.
Rysunek 6: Reprezentatywny eksperyment z wymazami z powierzchni. (A) Kontrolna płytka z wymazami powierzchniowymi zawierająca w trzech powtórzeniach negatywne kontrole ekstraktów z wymazów (DPBS, homogenat mózgu chomika niezakażonego 10-4 i 10-10) oraz w trzech powtórzeniach pozytywne kontrole ekstraktów z wymazów (homogenat mózgu HY 10-3). (B) Reprezentatywne ekstrakty z wymazów z powierzchni blatu, szkła i stali nierdzewnej (S.S.), które zostały pobrane przed kontaminacją, po kontaminacji HY 10-3 oraz po traktowaniu skażonych powierzchni wybielaczem. (C) Porównanie krzywych fluorescencji dla homogenatu mózgu niezakażonego 10-4, homogenatu mózgu HY 10-3 oraz ekstraktu z wymazu z blatu pokrytego cienką warstwą kurzu. Negatywne kontrole płytek dla paneli A i B obejmują próbkę ślepą (roztwór do rozcieńczania tkanek) oraz homogenat mózgu chomika niezakażonego 10-4. Panel B zawiera dodatek homogenatu mózgu niezakażonego 10-4 oraz pozytywną kontrolę płytkową w postaci homogenatu mózgu HY 10-3. Pozytywny próg fluorescencji (oznaczony czerwoną przerywaną linią) określono na poziomie 2. Raportowany stosunek punktu maksymalnego (MPR) to maksymalna fluorescencja podzielona przez początkowy odczyt fluorescencji uzyskany za pomocą czytnika płytek. Każdy punkt reprezentuje jeden techniczny powtórzenie w studzience dla danego typu próbki. Przedstawiono średnią i odchylenie standardowe. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tabela 1: Miesięczny formularz dokumentacji miejsc pobierania wymazów z próbek. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rycina uzupełniająca 1: Szablon układu miejsc wymazowych. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca 2: Miesięczny formularz dokumentacji miejsca pobierania wymazów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Opisana metoda bezpiecznego pobierania wymazów prionowych może być wykorzystana do wzmocnienia istniejących środków bezpieczeństwa prionowego. Metoda ta może monitorować przestrzenie i sprzęt laboratoryjny prionów, a także współdzielone przestrzenie laboratoryjne, pod kątem potencjalnego zanieczyszczenia prionami. Co ważne, metoda ta może być zaadaptowana do testowania laboratoryjnych technik dezynfekcji w celu weryfikacji dekontaminacji powierzchni zanieczyszczonych prionami. Ponieważ różne szczepy prionów wykazują różną wrażliwość na techniki dezynfekcji, metoda ta może potwierdzić, że techniki te są skuteczne w obecnych eksperymentach laboratoryjnych, takich jak leczenie wodorotlenkiem sodu lub podchlorynem sodu (wybielaczem)43,44.

Kluczowe kroki w ramach tej metodologii obejmują identyfikację odpowiednich miejsc pobierania wymazów, które dostarczą próbki zarówno z obszarów o dużym natężeniu ruchu, jak i obszarów do monitorowania, które mogą być związane z dalszym zanieczyszczeniem krzyżowym eksperymentów. Ponadto laboratoria powinny stosować kontrole pozytywne i negatywne, które ściśle odzwierciedlają te powszechnie stosowane w danym laboratorium lub klinice. Na przykład, jeśli pracujesz z prionami gryzoni, kontrole pozytywne i ujemne powinny pasować do tego gatunku. Wreszcie, dane z nadzoru powinny być aktualizowane i organizowane w taki sposób, aby można było łatwo zidentyfikować tendencje w zakresie pozytywności, co pozwoli na łagodzenie skutków i ponowne szkolenie personelu laboratoryjnego w przypadku konsekwentnych pozytywnych wyników dla danego obszaru.

Jednym z ograniczeń tego protokołu jest potencjalne generowanie błędnych wyników RT-QuIC. Biorąc pod uwagę wrażliwy charakter RT-QuIC, obecność pozostałości detergentów, soli i innych substancji na powierzchniach laboratoryjnych może mieć wpływ na wynik reakcji39. Ogólnie rzecz biorąc, biorąc pod uwagę tę obserwację, korzystne jest, aby powierzchnie pozostały wolne od substancji, które mogą zakłócać działanie RT-QuIC, takich jak resztki soli, detergenty i kurz. Przewidujemy, że wraz z wprowadzaniem ulepszeń do metodologii RT-QuIC wiele z obecnych ograniczeń RT-QuIC zostanie rozwiązanych. W związku z tym zachęcamy użytkowników końcowych do śledzenia literatury w celu skorzystania z najnowszych ulepszeń w RT-QuIC.

Kluczową zaletą tej metody dla laboratoriów badających priony jest możliwość zminimalizowania zanieczyszczeń, które mogą mieć wpływ na wyniki czułych testów amplifikacji. Narzędzia do sekcji zwłok są zwykle dezynfekowane przed ponownym użyciem do przyszłych sekcji zwłok. Opisana metoda pobierania wymazów zapewnia metodę oceny narzędzi do sekcji zwłok pod kątem resztkowej zakaźności prionów, która może mieć wpływ na dalsze wyniki. Może to zapewnić dodatkowy poziom rygoru eksperymentów, aby wykluczyć możliwość, że wykrycie prionów w tkankach nie było spowodowane zanieczyszczeniem narzędziami do sekcji zwłok.

Oświadczenia

J.C.B. i Q.Y. są wynalazcami w zgłoszeniu patentowym dotyczącym technologii wymazywania powierzchni prionów.

Podziękowania

Praca została wsparta grantem z Fundacji Choroby Jacoba Creutzfeldta. Grantodawcy nie odgrywali żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Marka rybacka  Waciki piankowe PurSwab MarkaFisherKatalog #14-960-3E
Milli-Q IQ 7005 System wody ultraczystejMilliporeSigmaQ7005T0C
Mini-wirówka, 6000 obr./minSouthern LabwareMLX-306
Czytnik płytek OmegaBMG LabtechFLUOstar Czytnik
Omega Q700 sonikatorQSonicaQ700-110
Rekombinowane białko prionowe chomikaMNPROMNPROteina-chomikchomik syryjski, aminokwasy 90-231
Savant speedvac Thermo ScientificSPD1030-230
Nanosfery krzemionkowe (50 nm)nano Composix SISN50-25M
płytek

Bibliografia

  1. Prusiner, S. B. Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science. 216 (4542), 136-144 (1982).
  2. Bolton, D. C., McKinley, M. P., Prusiner, S. B. Identification of a protein that purifies with the scrapie prion. Science. 218 (4579), 1309-1311 (1982).
  3. Oesch, B., et al. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40 (4), 735-746 (1985).
  4. Caughey, B., Raymond, G. The scrapie-associated form of PrP is made from a cell surface precursor that is both protease- and phospholipase-sensitive. J Biol Chem. 266 (27), 18217-18223 (1991).
  5. Deleault, N. R., Harris, B. T., Rees, J. R., Supattapone, S. Formation of native prions from minimal components in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (23), 9741-9746 (2007).
  6. Gajdusek, D. C., Zigas, V. Degenerative disease of the central nervous system in New Guinea: the endemic occurrence of "kuru" in the native population. N Engl J Med. 257, 974-978 (1957).
  7. Centers for Disease Control. Fatal degenerative neurologic disease in patients who received pituitary-derived human growth hormone. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 34, 359-361 (1985).
  8. Duffy, P., Wolf, J., Collins, G., DeVoe, A. G., Streeten, B., Cowen, D. Letter: possible person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. N Engl J Med. 290 (12), 692-693 (1974).
  9. Brown, P., et al. Iatrogenic Creutzfeldt-Jakob disease at the millennium. Neurology. 55 (8), 1075-1081 (2000).
  10. Huillard d'Aignaux, J., et al. Incubation period of Creutzfeldt-Jakob disease in human growth hormone recipients in France. Neurology. 53 (6), 1197-1201 (1999).
  11. Marzewski, D. J., Towfighi, J., Harrington, M. G., Merril, C. R., Brown, P. Creutzfeldt-Jakob disease following pituitary-derived human growth hormone therapy: a new American case. Neurology. 38, 1131-1133 (1988).
  12. Hannah, E. L., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after receipt of a previously unimplicated brand of dura mater graft. Neurology. 56 (8), 1080-1083 (2001).
  13. Shimizu, S., et al. Creutzfeldt-Jakob disease with florid-type plaques after cadaveric dura mater grafting. Arch Neurol. 56 (3), 357-362 (1999).
  14. Antoine, J. C., et al. Creutzfeldt-Jakob disease after extracranial dura mater embolization for a nasopharyngeal angiofibroma. Neurology. 48 (5), 1451-1453 (1997).
  15. Esmonde, T., Lueck, C. J., Symon, L., Duchen, L. W., Will, R. G. Creutzfeldt-Jakob disease and lyophilised dura mater grafts: report of two cases. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 56, 999-1000 (1993).
  16. Willison, H. J., Gale, A. N., McLaughlin, J. E. Creutzfeldt-Jakob disease following cadaveric dura mater graft. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 54, 940(1991).
  17. Diringer, H., Braig, H. R. Infectivity of unconventional viruses in dura mater. Lancet. 334, 439-440 (1989).
  18. Peden, A. H., Head, M. W., Ritchie, D. L., Bell, J. E., Ironside, J. W. Preclinical vCJD after blood transfusion in a PRNP codon 129 heterozygous patient. Lancet. 364 (9433), 527-529 (2004).
  19. Will, R. G., Matthews, W. B. Evidence for case-to-case transmission of Creutzfeldt-Jakob disease. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 45, 235-238 (1982).
  20. el Hachimi, K. H., Chaunu, M. P., Cervenakova, L., Brown, P., Foncin, J. F. Putative neurosurgical transmission of Creutzfeldt-Jakob disease with analysis of donor and recipient: agent strains. C R Acad Sci III. 320 (4), 319-328 (1997).
  21. Alper, T., et al. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214, 764-766 (1967).
  22. Casassus, B. France halts prion research amid safety concerns. Science. 373 (6554), 475-476 (2021).
  23. Brandel, J. P., et al. Variant Creutzfeldt-Jakob disease diagnosed 7.5 years after occupational exposure. N Engl J Med. 383 (1), 83-85 (2020).
  24. Flechsig, E., Hegyi, I., Enari, M., Schwarz, P., Collinge, J., Weissmann, C. Transmission of scrapie by steel-surface-bound prions. Mol Med. 7 (10), 679-684 (2001).
  25. Zobeley, E., Flechsig, E., Cozzio, A., Enari, M., Weissmann, C. Infectivity of scrapie prions bound to a stainless steel surface. Mol Med. 5 (4), 240-243 (1999).
  26. Brown, P., Gajdusek, D. C. Survival of scrapie virus after 3 years' interment. Lancet. 337 (8736), 269-270 (1991).
  27. Seidel, B., et al. Scrapie agent (strain 263K) can transmit disease via the oral route after persistence in soil over years. PLoS One. 2 (5), e435(2007).
  28. Maddison, B. C., et al. Environmental sources of scrapie prions. J Virol. 84 (21), 11560-11562 (2010).
  29. Pritzkow, S., Morales, R., Lyon, A., Concha-Marambio, L., Urayama, A., Soto, C. Efficient prion disease transmission through common environmental materials. J Biol Chem. 293 (9), 3363-3373 (2018).
  30. Alper, T., Cramp, W., Haig, D., Clarke, M. Does the agent of scrapie replicate without nucleic acid. Nature. 214 (90), 764-766 (1967).
  31. Bernoulli, C., et al. Danger of accidental person-to-person transmission of Creutzfeldt-Jakob disease by surgery. Lancet. 309 (8009), 478-479 (1977).
  32. Brown, P., Rohwer, R. G., Green, E. M., Gajdusek, D. C. Effect of chemicals, heat, and histopathologic processing on high- infectivity hamster-adapted scrapie virus. J Infect Dis. 145 (5), 683-687 (1982).
  33. Brown, P., et al. Chemical disinfection of Creutzfeldt-Jakob disease virus. N Engl J Med. 306, 1279-1282 (1982).
  34. Dickinson, A. G., Taylor, D. M. Resistance of scrapie agent to decontamination. N Engl J Med. 299, 1413-1414 (1978).
  35. Hunter, G. D., Millson, G. C. Studies on the heat stability and chromatographic behavior of the scrapie agent. J Gen Microbiol. 37, 251-258 (1964).
  36. Pattison, I. H. Resistance of the scrapie agent to formalin. J Comp Pathol. 75, 159-164 (1965).
  37. Fraser, H., Farquhar, C., McConnell, I., Davies, D. The scrapie disease process is unaffected by ionising radiation. Prog Clin Biol Res. 317, 653-658 (1989).
  38. Yuan, Q., et al. Sensitive detection of chronic wasting disease prions recovered from environmentally relevant surfaces. Environ Int. 166, 107347(2022).
  39. Simmons, S. M., et al. Rapid and sensitive determination of residual prion infectivity from prion-decontaminated surfaces. mSphere. 9, e00504-e00524 (2024).
  40. Orru, C. D., et al. Sensitive detection of pathological seeds of alpha-synuclein, tau and prion protein on solid surfaces. PLoS Pathog. 20 (4), e1012175(2024).
  41. Wilham, J. M., et al. Rapid end-point quantitation of prion seeding activity with sensitivity comparable to bioassays. PLoS Pathog. 6 (12), e1001217(2010).
  42. Srivastava, A., et al. Enhanced quantitation of pathological alpha-synuclein in patient biospecimens by RT-QuIC seed amplification assays. PLoS Pathog. 20 (9), e1012554(2024).
  43. Hughson, A. G., et al. Inactivation of prions and amyloid seeds with hypochlorous acid. PLoS Pathog. 12 (9), e1005914(2016).
  44. Williams, K., Hughson, A. G., Chesebro, B., Race, B. Inactivation of chronic wasting disease prions using sodium hypochlorite. PLoS One. 14 (10), e0223659(2019).
  45. Taylor, D. M. Autoclaving standards for Creutzfeldt-Jakob disease agent [letter]. Ann Neurol. 22 (4), 557-558 (1987).
  46. Brown, P., Rohwer, R. G., Gajdusek, D. C. Newer data on the inactivation of scrapie virus or Creutzfeldt-Jakob disease virus in brain tissue. J Infect Dis. 153 (6), 1145-1148 (1986).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

zanieczyszczenie prionamiwymaz powierzchnianaliza RT-QuICinaktywacja prionówdekontaminacja prionówzawodowe ryzyko prionowedezynfekcja powierzchnidetekcja prionów
Test laboratoryjny bezpieczeństwa prionowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.