Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/67892

⸱

7 lutego 2025

 , 
1Department of Systems Biology, UMass Chan Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje, jak używać metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określenia efektu regulacji śmierci każdego nokautu genu. Zawiera instrukcje dotyczące określania warunków eksperymentalnych, które optymalizują czułość, oraz samouczek krok po kroku dotyczący wykonywania analizy.

Streszczenie

Systematyczne badania przesiewowe zaburzeń genetycznych związanych z zyskiem lub utratą funkcji mogą być wykorzystane do scharakteryzowania genetycznych zależności i mechanizmów regulacji dla zasadniczo każdego interesującego procesu komórkowego. Eksperymenty te zazwyczaj obejmują profilowanie z puli zaburzeń pojedynczych genów i tego, jak każde zaburzenie genetyczne wpływa na względną sprawność komórki. Metody te, stosowane w kontekście badań skuteczności leków, często nazywanych profilowaniem chemogenetycznym, powinny być skuteczne w identyfikacji mechanizmów działania leków. Niestety, badania nad profilowaniem chemogenetycznym opartym na dopasowaniu są nieskuteczne w identyfikowaniu wszystkich składników odpowiedzi na lek. Na przykład, badania te na ogół nie są w stanie określić, które geny regulują śmierć komórek wywołaną przez leki. Kilka kwestii przyczynia się do zaciemnienia regulacji zgonów w badaniach przesiewowych opartych na sprawności, w tym mylące skutki zmienności tempa proliferacji, różnice w indukowanej przez lek koordynacji między wzrostem a śmiercią oraz, w niektórych przypadkach, niezdolność do oddzielenia DNA od żywych i martwych komórek. MEDUSA jest metodą analityczną służącą do identyfikacji genów regulujących śmierć w konwencjonalnych danych z profilowania chemogenetycznego. Działa poprzez wykorzystanie symulacji obliczeniowych do oszacowania wskaźników wzrostu i śmiertelności, które stworzyły obserwowany profil sprawności, a nie ocenianie samej sprawności. Skuteczne zastosowanie metody zależy od optymalnego domiaru warunków eksperymentalnych, w tym dawki leku, początkowej wielkości populacji i długości testu. W tym manuskrypcie opiszemy, jak skonfigurować badanie profilowania chemogenetycznego do analizy opartej na MEDUSA, a także pokażemy, jak wykorzystać tę metodę do ilościowego określenia śmiertelności w danych z profilowania chemogenetycznego.

Wprowadzenie

W profilowaniu chemogenetycznym, systematyczne zaburzenia genetyczne są wykorzystywane do zrozumienia wkładu każdego genu w daną odpowiedź na lek1,2,3. Eksperymenty te są cenne i mogą dostarczyć ważnych informacji na temat reakcji na leki, w tym celu wiązania leku oraz mechanizmów napływu/odpływu leku. Ponieważ jednak eksperymenty te są zwykle przeprowadzane w sposób zbiorczy, który ocenia wszystkie geny jednocześnie, generowanie mechanistycznych spostrzeżeń na podstawie danych z profilowania chemogenetycznego może być trudne.

Mechanizmy kontroli i genetyczne zależności dla śmierci komórek wywołanej przez lek wydają się być trudne do rozwiązania w danych profilowania chemogenetycznego. Istnieje kilka przyczyn tego problemu, ale wiele z nich wynika z wpływu zmian w proliferacji komórek4. Na przykład, ponieważ komórki proliferują wykładniczo, wpływ zaburzeń genetycznych na tempo proliferacji ma większy wpływ na wielkość populacji niż zmiana wskaźników umierania komórek. Ponadto, ponieważ ta stronnicza czułość nasila się z czasem, a eksperymenty te są zwykle przeprowadzane przez kilka tygodni, większość badań jest zoptymalizowana tak, aby były wysoce wrażliwe na defekty proliferacji i zasadniczo niewrażliwe na zmiany w śmierci komórki wywołanej przez lek. Inne kwestie związane z proliferacją obejmują zróżnicowaną koordynację między proliferacją a śmiercią (np. jak szybko każdy klon rośnie, jednocześnie umiera i czy różni się to w zależności od perturbacji genetycznych) oraz różnice w tempie proliferacji dla każdego klonu przy braku leku, co zmienia oczekiwaną liczbę komórek, które powinny/mogłyby zostać odzyskane, gdyby lek nie był skuteczny. Najważniejsze jest to, że eksperymenty z profilowaniem chemogenetycznym na ogół oceniają wpływ zaburzeń genetycznych za pomocą pomiarów, które są proporcjonalne do względnej wielkości populacji, porównując populacje leczone i nieleczone. Ponieważ wielkość populacji jest wypadkową zarówno tempa wzrostu komórek, jak i ich śmiertelności, z perspektywy śmierci komórki proliferacja stanowi czynnik zakłócający.

Aby zaradzić tym problemom, stworzyliśmy Metodę Oceny Śmierci za pomocą Podejścia Wspomaganego Symulacją (MEDUSA)5. Działanie MEDUSA polega na interpretacji obserwowanych danych dotyczących względnej wielkości populacji przez pryzmat symulacji obliczeniowych w celu wywnioskowania kombinacji wskaźników wzrostu i śmiertelności wywołanych przez leki, które wygenerowały zaobserwowaną odpowiedź na lek dla każdego klonu genetycznego. Wcześniejsze dane sugerują, że metoda może dokładnie wywnioskować, w jaki sposób zaburzenia genetyczne wpływają na śmiertelność wywołaną przez lek, ale dokładność tej metody zależy od szczegółowego zrozumienia, w jaki sposób proliferacja komórek i śmierć komórki są koordynowane przez lek i jak te wskaźniki zmieniają się w czasie5,6. Dodatkowo, wnioski oparte na MEDUSA wymagają, aby lek był testowany w dawce, która powoduje znaczną śmierć komórki. Co ważne, te warunki stosowania leków stwarzają dodatkowe obawy dotyczące początkowej wielkości populacji i długości testów, które powinny być dokładnie rozważone i zoptymalizowane. W niniejszym protokole opisujemy, jak skonfigurować badanie profilowania chemogenetycznego do analizy opartej na MEDUSA i szczegółowo opisujemy zastosowanie tej metody analitycznej. Ogólnym celem projektu MEDUSA jest określenie, w jaki sposób delecja każdego genu wpływa na wskaźniki wzrostu i śmiertelności wywołane przez leki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Optymalizacja dawki leku w celu wywołania śmierci komórki

UWAGA: Poniższy protokół służy do optymalizacji jednej kombinacji linii komórkowej, leku i dawki za pomocą testu FLICK7,8. Przykładowe dane dla tego protokołu opisują optymalizację i badania przesiewowe etopozydu 5 μM w komórkach U2OS, ale te same kroki optymalizacji można zastosować do dowolnej innej pożądanej kombinacji linii komórkowej i leku/dawki. Protokół ten nie wymaga pobierania ani analizy martwych komórek. Protokół ten może być stosowany do hodowli zawiesinowych, pod warunkiem, że martwe komórki zostaną usunięte. W przypadku kultur zawiesinowych martwe komórki można sortować/oddzielać za pomocą markera żywotności lub markera specyficznego dla śmierci komórki.

  1. Przed wykonaniem testu FLICK zoptymalizuj liczbę komórek, przepuszczalność Triton-X, stężenie SYTOX i ustawienia akwizycji czytnika płytek, korzystając ze szczegółowego protokołu opisanego w8.
  2. Komórki płytkowe w czarnych, przezroczystych 96-dołkowych płytkach. Typowe gęstości wysiewu wynoszą 1500-5000 komórek na studzienkę, a liczba ta powinna być zoptymalizowana na linię komórkową. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i wilgotnością przez 16-24 godziny.
  3. Przygotować rozcieńczenia leku w pożywce zawierającej stężenie SYTOX, które zostało zidentyfikowane jako optymalne w kroku (1.1). Leki są zazwyczaj testowane w serii rozcieńczeń logarytmicznych zawierających 8-12 biologicznie lub klinicznie istotnych dawek.
    UWAGA: Niektóre leki mogą emitować fluorescencję na tej samej długości fali co SYTOX, co uniemożliwia kwantyfikację za pomocą tego testu. W takich przypadkach korzystne może być wykorzystanie wariantów SYTOX, które emitują fluorescencję na różnych długościach fal. Ponadto test ten nie może ocenić reakcji na leki, które wpływają na fluorescencję SYTOX lub uniemożliwiają wiązanie się SYTOX z DNA.
  4. Lizować jedną płytkę (T0) przy użyciu Triton-X w stężeniu zoptymalizowanym w kroku (1.1). Po lizie komórek użyj czytnika płytek, aby zmierzyć fluorescencję SYTOX i określić całkowitą początkową liczbę komórek na podstawie empirycznie ustalonej zależności między fluorescencją a liczbą komórek (patrz protokół FLICK7,8).
  5. Zmierzyć fluorescencję SYTOX na płytkach eksperymentalnych w T0 za pomocą czytnika płytek, z ustawieniami zoptymalizowanymi w kroku (1.1).
  6. Monitoruj sygnał SYTOX w czasie przez trzy dni. Aby ograniczyć wynikowe dane kinetyczne, należy użyć co najmniej trzech punktów czasowych dziennie, każdy w odstępie 4 godzin.
    UWAGA: Ten protokół ocenia śmierć i wzrost komórki w ciągu 3 dni. Ten czas jest zwykle wystarczający dla leków powodujących śmierć; Jednak test można skrócić lub wydłużyć, aby uwzględnić leki o alternatywnej kinetyce śmierci.
  7. Po ostatnim punkcie czasowym poddaj lizę płytki eksperymentalnej za pomocą Triton-X, aby określić ostateczną wielkość populacji każdego stanu.
  8. Oblicz ułamkową żywotność (FV) i dopasuj dane końcowe do krzywych dawki, zgodnie z opisem w protokole FLICK7,8.
  9. Zidentyfikuj dawki leków, które indukują około 50% śmierci komórek, oceniając krzywe dawki FV.
    UWAGA: Identyfikacja martwych komórek za pomocą SYTOX wymaga zarówno pęknięcia błony plazmatycznej, jak i rozpadu otoczki jądrowej. Błony te wymagają ciągłej konserwacji, więc SYTOX będzie identyfikować martwe komórki niezależnie od mechanizmu śmierci komórki indukowanego przez lek. Procesy te nie zachodzą jednak z taką samą skutecznością w przypadku wszystkich form śmierci komórkowej, co może mieć wpływ na zdolność SYTOX do precyzyjnego pomiaru martwych komórek. Dodatkowo, różne mechanizmy śmierci komórkowej będą wytwarzać zwłoki komórkowe o różnej stabilności. Odkryliśmy jednak, że wszystkie testowane do tej pory formy śmierci komórki skutkują DNA związanym z SYTOX (albo wewnątrz permeabilizowanego jądra, albo w pożywce do hodowli komórkowej). Ten sygnał SYTOX jest na ogół stabilny przez 72 godziny testu, ale może być monitorowany, oceniając całkowitą liczbę komórek na początku i na końcu testu.

2. Wybór długości testu

  1. Korzystając z danych FLICK zebranych w kroku 1, oblicz frakcję śmiertelną (LF) każdego warunku w czasie, zgodnie z opisem w protokole FLICK7,8. Dopasuj dane kinetyczne LF do modelu opóźnionej śmierci wykładniczej (LED), jak opisano wcześniej9.
  2. Wykreślić LF w czasie dla każdej dawki śmiertelnej określonej w kroku 1. Wybierz dawkę i punkt czasowy, które wytwarzają ~50% LF.
    UWAGA: Śmiertelna frakcja ~50% wzbogaca silne, specyficzne dla śmierci sygnały w danych przesiewowych CRISPR, pozostawiając wystarczająco dużo żywych komórek, aby utrzymać reprezentację biblioteki5. Jednak niektóre leki będą ograniczone przez pierwszeństwo w literaturze lub wąski zakres dawek, które indukują określony pożądany fenotyp. Jeśli dawka jest ograniczona, punkt końcowy testu powinien zostać skrócony lub rozszerzony, aby zapewnić, że pożądana dawka osiągnie ~50% LF. Jeśli 50% śmiertelność nie jest możliwa, może być konieczne zwiększenie liczebności populacji wyjściowej.

3. Określanie początkowej wielkości populacji

  1. Wybierz żądaną dawkę leku, aby jeszcze bardziej zoptymalizować badania przesiewowe w oparciu o powyższą optymalizację.
  2. Płytki komórkowe na 10 cm szalkach w kompletnych podłożach. Każdy warunek powinien być posiany technicznymi trzema powtórzeniami i wystarczającą liczbą powtórzeń biologicznych, aby komórki można było liczyć co 12-24 godziny na długości ekranu, w tym punkt czasowy T = 0.
    UWAGA: Dodatkowa liczba komórek może wymagać osobnej optymalizacji dla komórek nieleczonych i poddanych działaniu substancji chemicznej, biorąc pod uwagę tempo wzrostu populacji netto i wielkość komórek. Komórki powinny być zasadniczo posiane w gęstościach, które powodują zbieg, który nie zagraża zdrowiu komórek w punkcie końcowym testu (tj. dla wielu typów komórek < 80% zlewa). Komórki poddane działaniu substancji i niepoddane działaniu substancji mogą być również ponownie posiane podczas badania, jeśli to konieczne, o ile zachowana jest reprezentacja biblioteki.
  3. Inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  4. Dodaj lek w pożądanym stężeniu do płytek zabiegowych. Równolegle zbierz komórki z 3 nietraktowanych płytek i policz liczbę żywych komórek za pomocą hemocytometru. Wybarwić martwe komórki błękitem trypanowym (lub porównywalnym barwnikiem żywotności), aby upewnić się, że liczone są tylko żywe komórki. Dane te określają liczbę komórek w punkcie czasowym T = 0.
  5. Po 12-24 godzinach zbierz komórki z 3 niepoddanych działaniu i 3 poddanych działaniu środka płytek i policz liczbę żywych komórek. Powtarzać zbiór aż do osiągnięcia punktu końcowego testu. Aby w pełni zrozumieć kinetykę leku i śmierci komórki, zaleca się monitorowanie żywych komórek przez 24-48 godzin po punkcie czasowym określonym w kroku (2.2).
  6. Wizualizacja zmian żywotności poprzez wykreślenie wielkości populacji (oś y) w czasie (oś x).
    UWAGA: Na podstawie maksymalnej obserwowanej liczby komórek i ostatecznej wielkości populacji można w przybliżeniu oszacować frakcję śmiertelną w punkcie końcowym. Należy to porównać z danymi dotyczącymi żywotności frakcyjnej i frakcji letalnej wygenerowanymi za pomocą testu FLICK (etap 1.9 i etap 2.2), aby zapewnić osiągnięcie oczekiwanej wielkości śmierci komórki.
  7. Zidentyfikuj punkt czasowy o najmniejszej wielkości populacji. W zależności od wielkości wzrostu, który występuje w obecności leku, będzie to na początku lub na końcu ekranu CRISPR.
  8. Wybierz początkową wielkość populacji. Upewnij się, że początkowa liczba komórek jest zoptymalizowana, aby utrzymać pokrycie biblioteki co najmniej 500x-1000x na całym ekranie.
    UWAGA: Na przykład biblioteka TKOv3 zawiera 70 948 sgRNA. Aby przedstawić tę bibliotekę przy 500-krotnym pokryciu, przez cały czas trwania testu należy utrzymać nie mniej niż 35 474 000 komórek na powtórzoną próbę. Ta wielkość populacji z wąskim gardłem jest często spotykana na początku testu lub po trypsynizacji i zmniejszeniu próbki w przypadku chorób nieleczonych lub proliferujących. W przeciwieństwie do tego, wielkość populacji z wąskim gardłem jest często podyktowana wielkością populacji w punkcie końcowym testu dla leczenia farmakologicznego, które wywołują znaczną śmiertelność.
  9. W razie potrzeby powtórz powyższą optymalizację na płytkach, które będą używane do ekranu CRISPR (np. Płytki 15 cm), aby potwierdzić, że skuteczność leku skaluje się prawidłowo.

4. Wykonywanie ekranu CRISPR

UWAGA: Komórki mogą być badane przy użyciu sprawdzonych metod przesiewowych CRISPR po optymalizacji dawki leku i długości testu. Uznane protokoły, takie jak protokół przesiewowy TKO z Moffat lab10,11, mogą być używane do przygotowania biblioteki przesiewowej CRISPR, produkcji wirusów, przeprowadzenia badania przesiewowego CRISPR i przygotowania bibliotek do sekwencjonowania (Rysunek 1A-B). Poniższy protokół opisuje etapy specyficzne dla analizy MEDUSA, które należy przeprowadzić na danych na poziomie zliczania po sekwencjonowaniu.

  1. Oblicz eksperymentalnie zaobserwowane zmiany fałdowania dla każdego sgRNA (Rysunek 1C), jak opisano poniżej.
    1. Wygeneruj tabelę zliczeń na poziomie sgRNA, aby przygotować dane sekwencjonowania do analizy. Przycinanie i mapowanie bibliotek sekwencjonowania przy użyciu standardowych potoków, zgodnie z opisem5,12.
    2. Normalizacja głębokości biblioteki sekwencjonowania. Biblioteki można normalizować ręcznie lub za pomocą wbudowanych funkcji, takich jak te w DESeq2, na przykład w 5,12. Normalizacja względem wszystkich prowadnic lub przy użyciu rozkładu prowadnic niedocelowych.
    3. Losowo przypisz nieukierunkowane sgRNA do genów niedocelowych. Na przykład biblioteka z czterema sgRNA na gen powinna mieć cztery niedocelowe sgRNA na gen nieukierunkowany.
    4. Dla każdego interesującego porównania (nieleczone/T0 i/lub poddane obróbce/nieleczone) obliczyć log2 (krotna zmiana). Zaleca się, aby zostało to obliczone przy użyciu dopasowania parametrycznego w DESeq2, chociaż można również przeprowadzić ręczne obliczenia zmiany zagięcia.
    5. Przytnij sgRNA z małą liczbą zliczeń. Prawidłowa strategia przycinania będzie zależeć od poziomu szumu między powtórzeniami i od tego, jak zmienia się on w zależności od zliczeń. Te funkcje będą się różnić w zależności od biblioteki CRISPR i będą testować wiele odcięć równolegle dla nowych danych. Typowe strategie odcięcia oparte na precedensach literaturowych obejmują usuwanie najniższych 5% prowadnic lub usuwanie prowadnic poniżej pewnego nominalnego progu13.
  2. Określ wpływ każdego pojedynczego nokautu genu na tempo wzrostu, jak opisano poniżej.
    1. Oblicz tempo wzrostu populacji netto (NPG) nieleczonych komórek (tj. obserwowany czas podwojenia populacji, Rysunek 1D). Można to wyodrębnić z danych FLICK w kroku 1, liczby żywych komórek w czasie w kroku 3 lub wcześniejszych pomiarów eksperymentalnych dla linii komórkowej będącej przedmiotem zainteresowania.
    2. MEDUSA wymaga trzech parametrów do modelowania nieleczonego stanu: NPG: Net Population Growth Rate, w podwojeniach/h; T start: Punkt początkowy, w godz. Jest to ustawione na wartość domyślną 0; Tendunt: Końcowy punkt czasowy dla nieleczonego schorzenia, w godz.
    3. Zasymuluj wszystkie możliwe perturbacje kursu NPG. Użyj pętli for, aby ocenić zakres możliwych wartości NPG. Dla każdej względnej szybkości wzrostu oblicz log2 (krotna zmiana), która zostałaby zaobserwowana w punkcie końcowym testu.
    4. Dla każdego eksperymentalnego sgRNA w kroku 4.1.5 zidentyfikuj symulowaną zmianę krotności najbliższą obserwowanym danym. Przypisz względną szybkość wzrostu, która spowodowała symulowaną zmianę fałdowania, do tego sgRNA.
  3. Scharakteryzuj koordynację między wzrostem a śmiercią w sposób opisany poniżej.
    UWAGA: Parametry wymagane dla MEDUSA można wyodrębnić z danych w stylu FLICK podczas analizy za pomocą metody analizy GRADE14. Można do tego wykorzystać dane z (1) i (2) lub przeprowadzić dodatkowy eksperyment parametryzacji.
    1. MEDUSA wykorzystuje cztery parametry do scharakteryzowania koordynacji między wzrostem a śmiercią w obecności leku: GRlek1: Tempo wzrostu wywołane lekiem przed wystąpieniem śmierci, w podwojeniach/h; DO: Czas nadejścia śmierci, w h; GRlek2: Tempo wzrostu wywołane lekiem po wystąpieniu zgonu, w podwojeniach/h; Lek DR: Śmiertelność spowodowana lekiem, w jednostkach frakcji śmiertelnej/h. Aby sparametryzować DO, użyj kinetyki LF. Wyodrębnij czas początku śmierci z pasowania diody LED.
  4. Określlek DR za pomocą kinetyki LF. Określ średnią śmiertelność, dzieląc końcową LF przez czas następujący po wystąpieniu zgonu (w godzinach).
  5. Określ GRlek1 na podstawie danych zliczania żywych komórek w kroku 3. Przed wystąpieniem zgonu należy określić tempo wzrostu wywołane lekiem, dopasowując dane do prostego równania wykładniczego.
    1. Określ GRlek2 za pomocą kombinacji danych z kroku 3 i leku GRADE14. Oblicz i wykreśl GRADE dla wybranej dawki leku na wykresie GRADE. Jeśli GRADE = 0, załóżmy, że GRlek2 wynosi 0; Jeśli GRADE > 0, użyj funkcji GRADE, aby określić średnie tempo wzrostu populacji. Na podstawie eksperymentalnie wyznaczonej wartości dla GRleku1 określ wartość dla GRleku2, która daje obserwowaną średnią szybkość wzrostu.
      UWAGA: Średnią szybkość wzrostu indukowaną lekiem można wywnioskować z wykresu GRADE, obliczając odległość parami między obserwowanym punktem danych (tj. parą danych GR i FV dla leku) a każdym punktem tworzącym przestrzeń GRADE i identyfikując najbliższy punkt. Szczegółowe instrukcje można znaleźć w ref14. Tempo wzrostu i śmiertelność wywołane przez lek nie są stałymi wartościami dla każdego leku i są specyficzne dla leku w danej dawce w danym kontekście komórkowym.
  6. Wygeneruj symulowane zmiany fałdowania dla wszystkich możliwych kombinacji szybkości wzrostu i śmiertelności, jak opisano poniżej.
    1. Korzystając z eksperymentalnie ustalonej koordynacji tempa wzrostu i śmiertelności wywołanej lekiem, zbuduj model, który symuluje wielkość populacji wywołanej przez lek w czasie (Rysunek 1D). Model ten może być zbudowany jako funkcja odcinkowa, która łączy dwie niezależne fazy odpowiedzi na lek (czas przed i po śmierci).
    2. Aby uzyskać pełny model MEDUSA, uwzględnij te osiem parametrów: NPG: Tempo wzrostu populacji netto, w podwojeniach/h; GRlek1: Tempo wzrostu wywołane lekiem przed wystąpieniem zgonu, w podwojeniach/h; DO: Czas nadejścia śmierci, w h; GRlek2: Tempo wzrostu wywołane lekiem po wystąpieniu zgonu, w podwojeniach/h; Lek DR: Śmiertelność wywołana przez lek, w jednostkach frakcji śmiertelnej/h; T start: Punkt początkowy, w godz. Jest to ustawione na wartość domyślną 0; Tendunt: Końcowy punkt czasowy dla nieleczonego schorzenia, w h; Tendtr: Końcowy punkt czasowy dla leczonego stanu, w h.
    3. W przypadku modelu bazowego należy zasymulować wszystkie możliwe perturbacje związane ze wzrostem i śmiertelnością. Dla każdej kombinacji oblicz log2 (krotna zmiana), która byłaby obserwowana.
      UWAGA: W przypadku MEDUSA zakłada się, że zaburzenia tempa wzrostu są proporcjonalne dla NPG, GRlek1 i GRleku2. Na przykład 80-procentowe zmniejszenie wskaźnika NPG powoduje również 80-procentowe zmniejszenie obu wskaźników wzrostu wywołanych przez leki.
  7. Wywnioskuj współczynnik śmiertelności każdego nokautu (Rysunek 1D-E), jak opisano poniżej.
    1. Dla każdego sgRNA dokonaj triangulacji śmiertelności wywołanej lekiem, która spowodowałaby obserwowaną zmianę fałdowania. Najpierw wyodrębnij względną szybkość wzrostu określoną w kroku (4.2.4).
    2. Określ stawki dla GRlek1 i GRlek2. Zastosuj względną szybkość wzrostu z NPG, aby obliczyć proporcjonalną szybkość wzrostu dla GRleku1/GRleku2.
    3. Korzystając z ograniczeń do NPG, GRlek1 i GRleku2, zidentyfikuj symulowaną zmianę fałdowania najbliższą obserwowanej zmianie fałdowania dla każdego sgRNA (leczonego/nieleczonego). Wykorzystaj kombinację tych obserwacji, aby obliczyć wstecznie współczynnik śmiertelności wywołanej przez leki.
  8. Oblicz tempo wzrostu na poziomie genów i wskaźniki śmiertelności, jak opisano poniżej.
    1. Określ wskaźniki poziomu genu dla każdego genu w bibliotece. Oblicz średnią dla każdego tempa wzrostu i współczynnika śmiertelności dla wszystkich sgRNA związanych z danym genem (zwykle 4-10).
    2. Aby obliczyć empiryczne wartości p, uruchom dane na poziomie sgRNA. Wykonaj korektę FDR za pomocą procedury Benjamini-Hochberg.
      UWAGA: Instrukcje uzupełniające, a także przykładowe dane do analizy danych przesiewowych CRISPR za pomocą MEDUSA, znajdują się w naszym repozytorium GitHub (https://github.com/MJLee-Lab/MEDUSA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Korzystając z niniejszego protokołu, zbadaliśmy zależności genetyczne w procesie śmierci komórek U2OS indukowanej etoposydem. Etoposyd jest powszechnie stosowanym chemioterapeutykiem uszkadzającym DNA15. To eksperymentalne profilowanie chemiczno-genetyczne przeprowadzono z wykorzystaniem biblioteki GeCKOv216 w komórkach U2OS ekspresujących Cas95. W tego typu eksperymentach funkcję genu zazwyczaj wnioskuje się na podstawie względnej liczebności danego...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie metody analitycznej MEDUSA do ilościowego określania danych profilowania chemogenetycznego w celu oceny, w jaki sposób zaburzenia genetyczne zmieniają wskaźniki wzrostu i zgonów wywołane przez leki. Ponieważ główny wynik eksperymentu z profilowaniem chemogenetycznym jest związany z wielkością populacji, a nie ze wskaźnikami, podstawowe wskaźniki są wnioskowane za pomocą symulacji. W związku z tym krytycznymi etapami metody są dokładna eksperymentalna parametryzacja kinetyki o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim członkom Lee Lab, byłym i obecnym, za ich wkład w punkt widzenia naszego laboratorium na ocenę reakcji na leki. Prace te były wspierane przez finansowanie MJL i MEH z National Institutes of Health (U01CA265709, R21CA294000 i R35GM152194 do MJL, a F31CA268847 do MEH), finansowanie MJL z Fundacji Jayne Koskinas Ted Giovanis.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
100mm Fisherbrand TC NaczyniaFisher ScientificFB012924Do hodowli komórek i optymalizacji wielkości populacji
150mm Naczynia TC FisherbrandFisher ScientificFB012925Do hodowli komórek i optymalizacji wielkości populacji
Pakiet DESeq2Rv1.44.0Do obliczania zmiany fałdy
DMEMCorning10017CVDo siewu i odurzania komórki
DMSOFisher ScientificMT-25950CQCDo wysiewu i lekowania komórek
Fisherbrand 96-Well, Mikropłytka z dnem w kształcie litery U traktowana kulturą komórkowąFisher ScientificFB012932Do wysiewu i narkotyzacji komórek (płytka szpilkowa)
Greiner Bio-One  CELLSTAR μ Przezroczysta 96-dołkowa, poddawana hodowli komórkowej, płaska płytka do mikropłytekGreiner655090Do wysiewu i odurzania komórek
MATLABMathworks R2024aDo wykonywania FLICK, GRADE i MEDUSA
Czytnik fluorescencji mikropłytekTecanSparkDo pomiarów martwych komórek
Sytox GreenThermo Fisher ScientificS7020Do pomiarów martwych komórek
Biblioteka TKOV3 CRISPRAddgene125517Do wykonywania ekranu CRISPR
Triton-X 100Thermo Fisher ScientificJ66624-APDo przepuszczalności komórek
Błękit trypanowy CorningMT25900CIDo pomiaru żywych/martwych komórek

Bibliografia

  1. Przybyla, L., Gilbert, L. A. A new era in functional genomics screens. Nat Rev Genet. 23 (2), 89-103 (2021).
  2. Colic, M., Hart, T. Chemogenetic interactions in human cancer cells. Comput Struct Biotechnol J. 17, 1318-1325 (2019).
  3. Colic, M., Hart, T. Common computational tools for analyzing CRISPR screens. Emerg Top Life Sci. 5 (6), 779-788 (2021).
  4. Dixon, S. J., Lee, M. J. Quick tips for interpreting cell death experiments. Nat Cell Biol. 25 (12), 1720-1723 (2023).
  5. Honeywell, M. E., et al. Functional genomic screens with death rate analyses reveal mechanisms of drug action. Nat Chem Biol. 20 (11), 1443-1452 (2024).
  6. Leylek, O., Honeywell, M. E., Lee, M. J., Hemann, M. T., Ozcan, G. Functional genomics reveals an off-target dependency of drug synergy in gastric cancer therapy. Gastric Cancer. 27 (6), 1201-1219 (2024).
  7. Richards, R., et al. Drug antagonism and single-agent dominance result from differences in death kinetics. Nat Chem Biol. 16 (7), 791-800 (2020).
  8. Richards, R., Honeywell, M. E., Lee, M. J. FLICK: an optimized plate reader-based assay to infer cell death kinetics. STAR Protoc. 2 (1), 100327(2021).
  9. Forcina, G. C., Conlon, M., Wells, A., Cao, J. Y., Dixon, S. J. Systematic quantification of population cell death kinetics in mammalian cells. Cell Syst. 4 (6), 600-610.e6 (2017).
  10. Hart, T., et al. Evaluation and design of genome-wide CRISPR/SpCas9 knockout screens. G3. 3 (8), 2719-2727 (2017).
  11. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  12. Cruz-Gordillo, P., Honeywell, M. E., Harper, N. W., Leete, T., Lee, M. J. ELP-dependent expression of MCL1 promotes resistance to EGFR inhibition in triple-negative breast cancer cells. Sci Signal. 13 (658), eabb9820(2020).
  13. Parnas, O., et al. A Genome-wide CRISPR screen in primary immune cells to dissect regulatory networks. Cell. 162 (3), 675-686 (2015).
  14. Schwartz, H. R., et al. Drug GRADE: An integrated analysis of population growth and cell death reveals drug-specific and cancer subtype-specific response profiles. Cell Rep. 31 (12), 107800(2020).
  15. Montecucco, A., Biamonti, G. Cellular response to etoposide treatment. Cancer Lett. 252 (1), 9-18 (2007).
  16. Shalem, O., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. 343 (6166), 84-87 (2014).
  17. Colic, M., et al. Identifying chemogenetic interactions from CRISPR screens with drugZ. Genome Med. 11 (1), 52(2019).
  18. Olivieri, M., Durocher, D. Genome-scale chemogenomic CRISPR screens in human cells using the TKOv3 library. STAR Protoc. 2 (1), 100321(2021).
  19. Cai, X., Stringer, J. M., Zerafa, N., Carroll, J., Hutt, K. J. Xrcc5/Ku80 is required for the repair of DNA damage in fully grown meiotically arrested mammalian oocytes. Cell Death Dis. 14 (7), 397(2023).
  20. Colville, A., et al. Death-seq identifies regulators of cell death and senolytic therapies. Cell Metab. 35 (10), 1814-1829.e6 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Genomika funkcjonalnaregulacja mierci kom rkowejwska nik mierci indukowanej lekiemprzesiewowy screening nokautu gen wzmienno tempa wzrostukrzywe zale no ci dawka odpowiedwska nik fa szywych odkryanaliza wielko ci populacji
MEDUSA do identyfikacji genów regulujących śmierć w danych z profilowania chemogenetycznego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.